番茄斑萎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種番茄斑萎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法。本發(fā)明提供了用于液相芯片檢測或輔助檢測番茄斑萎病毒的試劑盒，包括引物組和探針，所述引物組由引物1和引物2組成。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的檢測方法能夠?qū)悠愤M(jìn)行快速檢測，從樣品處理到出結(jié)果僅需4小時左右；本發(fā)明設(shè)計的引物與番茄上常見的幾種植物病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，可降低非特異性擴(kuò)增造成的假陰性結(jié)果。
【專利說明】番茄斑萎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病毒檢測領(lǐng)域，具體涉及一種番茄斑萎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番爺斑萎病毒為布尼亞病毒科(Bunyaviridae)番爺斑萎病毒屬(Tospovirus)的代表成員。自1915年在澳大利亞首次報道番茄斑萎病，并于1930年確定其病原為病毒后，許多國家相繼有該病毒病發(fā)生和危害的報道。番爺斑萎病毒的寄主范圍很廣，包括溫帶、亞熱帶和熱帶的80多個科近千種雙子葉和單子葉植物，可引起許多重要的園藝植物和農(nóng)作物的嚴(yán)重病害，造成極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在美國，1971年在德克薩斯州的南部種植的花生上首次發(fā)現(xiàn)該病毒，至1984年其危害加重，1986年該地一個縣的花生生產(chǎn)受到嚴(yán)重影響，損失近300萬美元。在法國和西班牙等歐洲國家和地區(qū)，曾因該病毒的傳播介體的大量擴(kuò)散而引起番茄、辣椒等作物的嚴(yán)重病害，造成毀滅性損失，重病地塊損失達(dá)100%。為防止該病毒在我國的傳播擴(kuò)散，該病毒被列入我國的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》。目前在番茄斑萎病毒的檢測上，較常用的方法有兩種，一種是血清學(xué)檢測方法，常見的有DAS-ELISA ;另一種是分子生物學(xué)檢測方法，其中以RT-PCR最為常見。
[0003]液相芯片檢測技術(shù)是一種快速高通量檢測技術(shù)，是對生物芯片技術(shù)的繼承和發(fā)展，該技術(shù)集多種生化技術(shù)于一體，具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):可通過不同熒光編碼微球同時檢測上百種不同的病原分子，滿足高通量檢測需要；相對于固相芯片，反應(yīng)在液態(tài)體系中進(jìn)行，可大大縮短檢測時間；檢測所需樣本少(最少可至I μ L)。該技術(shù)已用于李痘病毒(Plum poxvirus，PPV)等植物病毒的檢測，并有一些獲得專利；到目前為止，國內(nèi)外還未見應(yīng)用該技術(shù)檢測番茄環(huán)斑病毒的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供番 茄斑萎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法，即一種操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確的番茄斑萎病毒液相芯片檢測方法及其所用到的引物，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005]本發(fā)明的一個目的是提供用于液相芯片檢測或輔助檢測番茄斑萎病毒的試劑盒。
[0006]本發(fā)明提供的試劑盒，包括引物組和探針，所述引物組由引物I和引物2組成；
[0007]所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列I ;
[0008]所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列2 ；
[0009]所述探針的序列為NH3-C12-T1，所述Tl的核苷酸序列為序列表中序列3。
[0010]上述C12與所述Tl的5’末端連接，C12為12個C原子；NH3_為氨基修飾。
[0011]上述試劑盒中，所述引物組的各條引物及所述探針均為獨(dú)立包裝。
[0012]本發(fā)明的另一個目的是提供用于液相芯片檢測或輔助檢測番茄斑萎病毒的引物組或探針。[0013]本發(fā)明提供的所述引物組由引物I和引物2組成；
[0014]所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列I ;
[0015]所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列2 ；
[0016]本發(fā)明提供的所述探針的序列為NH3-C12-T1，所述Tl的核苷酸序列為序列表中序列3。[0017]上述的試劑盒或上述的引物組或探針中，所述引物2的5’末端標(biāo)記生物素。
[0018]上述的引物組或探針在制備用于液相芯片檢測或輔助檢測番茄斑萎病毒的試劑盒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0019]本發(fā)明的第三個目的是提供用于液相芯片檢測或輔助檢測番茄斑萎病毒的試劑盒。
[0020]本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的引物組或探針；所述試劑盒中的引物組的各條引物或所述探針均為獨(dú)立包裝。
[0021]上述的試劑盒或所述的引物組或探針在用液相芯片檢測或輔助檢測番茄斑萎病毒或用液相芯片檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶番茄斑萎病毒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0022]本發(fā)明的第四個目的是提供用液相芯片檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶番爺斑萎病毒的方法。
[0023]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0024]I)提取待測樣品中的RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ；
[0025]2)生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物和交聯(lián)探針的微球的獲得:
[0026]所述生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物按照如下方法制備:以所述cDNA為模板，用上述的試劑盒中的引物組進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0027]所述交聯(lián)探針的微球按照如下方法制備:上述的試劑盒中的探針與微球(此微球?yàn)橐合嘈酒瑱z測中常用的微球)進(jìn)行共價偶聯(lián)(探針的氨基和微球表面的羧基通過酰胺鍵連接)，得到交聯(lián)探針的微球；具體采用BIO-RAD公司的Bio-PlexCOOH Bead28試劑盒進(jìn)行，產(chǎn)品目錄號為:171-506028 ;或者按照實(shí)施例2的一的3中記載的方法制備。
[0028]3)將所述生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物與所述交聯(lián)探針的微球雜交，得到的雜交產(chǎn)物再進(jìn)行液相芯片檢測，若液相芯片定性比值(樣品熒光強(qiáng)度中位值平均值與空白對照MFI的平均值的比值)大于等于2，則待測樣品中攜帶或候選攜帶番茄斑萎病毒；
[0029]若液相芯片定性比值(樣品熒光強(qiáng)度中位值平均值與空白對照MFI的平均值的比值)小于2，則待測樣品中不攜帶或候選不攜帶番茄斑萎病毒。
[0030]上述方法中，所述RT-PCR擴(kuò)增的體系中，所述引物組中的各條引物按照等摩爾比
配置；
[0031]所述RT-PCR 擴(kuò)增程序:95 °C 5min ；94 °C 30s, 50 °C 30s, 72 °C 20s, 30 個循環(huán)；72 °C 5min。
[0032]本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用了液相芯片技術(shù)。該技術(shù)是在核酸水平上的一種檢測技術(shù)，具有準(zhǔn)確性好和靈敏度高的特點(diǎn)。其原理是將編碼微球單個逐一通過檢測通道時受到雙色激光同時照射，第一束激光激發(fā)微球的分類熒光，根據(jù)熒光編碼確定微球的類別，即微球內(nèi)部的兩種熒光物質(zhì)受激發(fā)后可發(fā)射兩種不同波長的熒光，不同類別微球內(nèi)部這兩種熒光物質(zhì)比例不同，則熒光強(qiáng)度比例也不同，從而將不同的特異性反應(yīng)區(qū)分開來；第二束激光激發(fā)報告分子上的突光素，根據(jù)突光強(qiáng)度確定微球上結(jié)合的報告分子的數(shù)量從而確定目標(biāo)分子的數(shù)量。各種熒光信號經(jīng)分析軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，可獲得檢測物的種類和數(shù)量。
[0033]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的引物和探針能夠?qū)悠愤M(jìn)行快速檢測，從樣品處理到出結(jié)果僅需4小時左右；本發(fā)明設(shè)計的引物與番茄上常見的幾種植物病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，可降低非特異性擴(kuò)增造成的假陰性結(jié)果。由于液相芯片檢測技術(shù)具有特異性強(qiáng)、通量高及快速的特點(diǎn)，適合在進(jìn)境種苗量較大的口岸應(yīng)用，可以在保障安全的情況下有效的提高通關(guān)速度，從而促進(jìn)國際貿(mào)易的發(fā)展。該方法還適用于經(jīng)常發(fā)生復(fù)合侵染的塊莖類種苗的口岸檢疫及田間監(jiān)測，可以大幅提高檢測效率。這為防止番茄斑萎病毒進(jìn)入我國提供了技術(shù)儲備，也為其他同類病毒的快速高通量檢測提供了借鑒和經(jīng)驗(yàn)?？傊?，本發(fā)明引物及探針特異性好，檢測方法快速簡單，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，為可能攜帶番茄斑萎病毒植物材料的進(jìn)出口安全提供了保證。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0035]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0036]番茄斑萎病毒(TSWV):記載在“3種番茄斑萎病毒屬病毒多重RT-PCR檢測方法的建立.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，(28) 3:32-36.” 一文上，公眾可從中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院獲得，用該病毒感染番爺(Lycopersicon.esculentum)葉片。
[0037]番茄黑環(huán)病毒(TBRV):記載在“番茄黑環(huán)病毒分子生物學(xué)檢測方法及分離物序列分析.植物檢疫，2006,20 (5):275-278.”一文上，公眾可從中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院獲得，用該病毒感染番爺(Lycopersicon.esculentum)葉片。
[0038]馬鈴薯A病毒(PVA):記載在“雙引物探針RT-Real timePCR檢測馬鈴薯A病毒.植物檢疫，2009，26 (I):26-28.” 一文上，公眾可從中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院獲得，用該病毒感染本生煙(Nicotiana benthamiana)葉片。
[0039]馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd):記載在“烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的檢測與序列分析.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，19 (9):38-42.” 一文上，公眾可從中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院獲得，用該病毒感染馬鈴薯(Solanum tuberosum)葉片。
[0040]南芥菜花葉病毒(ArMV)的昆諾阿藜(Chenopodium quinoa)葉片:記載在“南芥菜花葉病毒RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠體金層析和酶聯(lián)檢測方法的建立.植物檢疫，2011，25(5):33-36.”一文上，公眾可從中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院獲得，用該病毒感染昆諾阿藜(Chenopodium quinoa)葉片。
[0041]實(shí)施例1、番茄斑萎病毒液相芯片檢測引物、探針及試劑盒的制備
[0042]根據(jù)NCBI已報道的番爺斑萎病毒的核苷酸序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物和探針，最終篩選出一對具有高特異性的引物和探針并進(jìn)行人工合成，序列如表1所示。
[0043]表1設(shè)計的引物和預(yù)期目的片段長度
[0044]
【權(quán)利要求】
1.用于液相芯片檢測或輔助檢測番茄斑萎病毒的試劑盒，包括引物組和探針，所述引物組由引物I和引物2組成； 所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列I ; 所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列2 ； 所述探針的序列為NH3-C12-T1，所述Tl的核苷酸序列為序列表中序列3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述引物組的各條引物及所述探針均為獨(dú)立包裝。
3.用于液相芯片檢測或輔助檢測番茄斑萎病毒的引物組或探針: 所述引物組由引物I和引物2組成； 所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列I ; 所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列2 ； 所述探針的序列為NH3-C12-T1，所述Tl的核苷酸序列為序列表中序列3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒或權(quán)利要求3所述的引物組或探針，其特征在于:所述引物2的5’末端標(biāo)記生物素。
5.權(quán)利要求3或4所述的引物組或探針在制備用于液相芯片檢測或輔助檢測番茄斑萎病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
6.用于液相芯片檢測或輔助檢測番茄斑萎病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求3或4所述的引物組或探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述引物組的各條引物或所述探針均為獨(dú)立包裝。
8.權(quán)利要求1或2或6或7所述的試劑盒或權(quán)利要求3或4所述的引物組或探針在用液相芯片檢測或輔助檢測番茄斑萎病毒或用液相芯片檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶番茄斑萎病毒中的應(yīng)用。
9.用液相芯片檢測或輔助檢測待測樣品中是否攜帶番茄斑萎病毒的方法，包括如下步驟: 1)提取待測樣品中的RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA； 2)生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物和交聯(lián)探針的微球的獲得: 所述生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物按照如下方法制備:以所述cDNA為模板，用權(quán)利要求1或2所述的試劑盒中的引物組進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物； 所述交聯(lián)探針的微球按照如下方法制備:權(quán)利要求1或2所述的試劑盒中的探針與微球進(jìn)行共價偶聯(lián)，得到交聯(lián)探針的微球； 3)將所述生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物與所述交聯(lián)探針的微球雜交，得到的雜交產(chǎn)物再進(jìn)行液相芯片檢測， 若液相芯片定性比值大于等于2，則待測樣品中攜帶或候選攜帶番茄斑萎病毒； 若液相芯片定性比值小于2，則待測樣品中不攜帶或候選不攜帶番茄斑萎病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述RT-PCR擴(kuò)增的體系中，所述引物組中的各條引物按照等摩爾比配置；
所述 RT-PCR擴(kuò)增程序:95V 5min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 20s，30 個循環(huán)；72°C 5min。
【文檔編號】C12N15/11GK103667529SQ201310643245
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】張永江, 劉洪義, 陳林, 辛言言, 張洪祥, 李桂芬, 劉忠梅, 朱水芳 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院