植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來(lái)說(shuō)是一種植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白及其制備方法，蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:1所示；制備方法包括（1）植物重組幾丁質(zhì)酶基因的克隆及測(cè)序；（2）表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定；（3）重組蛋白的融合表達(dá)；（4）重組蛋白的鑒定；（5）表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析；（6）融合蛋白的純化；（7）植物重組蛋白的生物學(xué)活性檢測(cè)。本發(fā)明利用克隆方法得到植物幾丁質(zhì)酶基因的序列，同時(shí)利用體外表達(dá)的方法，首次得到了植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白，為幾丁質(zhì)的免疫學(xué)研究及工業(yè)批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來(lái)說(shuō)是一種植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]幾丁質(zhì)酶存在于各種植物中，2002年，國(guó)外有人利用大白菜為研究對(duì)象，克隆出了大白菜幾丁質(zhì)基因片段118bp，后來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者利用克隆的辦法克隆得到大白菜基因序列，但是對(duì)于基因編碼的蛋白表達(dá)情況，至今未見(jiàn)報(bào)告，因此無(wú)法對(duì)其展開(kāi)深入的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對(duì)目前植物中幾丁質(zhì)酶蛋白未見(jiàn)報(bào)告的缺陷，提供一種植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白及其制備方法。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白，其特征在于:所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供一種植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白制備方法，包括如下步驟:
(1)植物重組幾丁質(zhì)酶基因的克隆及測(cè)序；
(2)表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定；· (3)重組蛋白的融合表達(dá)；
(4)重組蛋白的鑒定；
(5)表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析；
(6)融合蛋白的純化；
(7)植物重組蛋白的生物學(xué)活性檢測(cè)。
[0006]進(jìn)一步的:所述步驟(1)包括如下步驟:
步驟1、利用十字花科植物幾丁質(zhì)酶基因的保守序列涉及特異性引物，以白菜基因組DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1098bp的特異性DNA片段和長(zhǎng)度150的幾丁質(zhì)酶基因5’端序列片段；
步驟2、利用不同濃度的水楊酸處理苗齡為5天的白菜植株，處理濃度為I mmol/L、2.5mmol/L、5 mmol/L、7.5mmol/L,以未處理的為對(duì)照組，分別在處理后8、112、16、20小時(shí)提取粗酶液并測(cè)定酶活力，選擇其中酶活力最高的吹植株葉片提取葉片總RNA ；
步驟3、利用Trizol試劑法提取提取經(jīng)I mmol/L水楊酸處理的白菜葉片總RNA,利用3’ RACE技術(shù)擴(kuò)增得到該幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)1517bp序列；
步驟4、幾丁質(zhì)酶基因序列同源性比對(duì)和測(cè)序。
[0007]進(jìn)一步的:所述步驟4中幾丁質(zhì)酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0008]本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明利用克隆方法得到植物幾丁質(zhì)酶基因的序列，同時(shí)利用體外表達(dá)的方法，首次得到了植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白，為幾丁質(zhì)的免疫學(xué)研究及工業(yè)批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0009]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0010]植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白的制備方法；
(I)植物重組幾丁質(zhì)酶基因的克隆及測(cè)序；
步驟1、利用十字花科植物幾丁質(zhì)酶基因的保守序列涉及特異性引物，以白菜基因組DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1098bp的特異性DNA片段和長(zhǎng)度150的幾丁質(zhì)酶基因5’端序列片段；
步驟2、利用不同濃度的水楊酸處理苗齡為5天的白菜植株，處理濃度為I mmol/L、2.5mmol/L、5 mmol/L、7.5mmol/L,以未處理的為對(duì)照組，分別在處理后8、112、16、20小時(shí)提取粗酶液并測(cè)定酶活力，選擇其中酶活力最高的吹植株葉片提取葉片總RNA ；
步驟3、利用Trizol試劑法提取提取經(jīng)I mmol/L水楊酸處理的白菜葉片總RNA,利用3’ RACE技術(shù)擴(kuò)增得到該幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)1517bp序列；
步驟4、幾丁質(zhì)酶基因序列同源性比對(duì)和測(cè)序。
[0011](2)表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
在上下游引物5，分別添加EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)(SEQID NO:3 5，-CGGAATTCAACATGGCTCTCACAAAATTA-3’，SEQID NO:4 5’ -CGCTCGATTTTCTTTTAAATGGC-3’)，以 pMD19_T_ 幾丁質(zhì)酶為模板，擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶基因，回收擴(kuò)增PCR產(chǎn)物割膠純化，將純化產(chǎn)物和空載體pGEX-6p-l分別用EcoRI和XhoI雙酶切，回收純化酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4連接酶連接轉(zhuǎn)化克隆感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，涂布平板挑取單菌落與液體LB (Amp+)中搖菌，抽提質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切鑒定為陽(yáng)性菌液送往上海生工進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序準(zhǔn)確后，并將其命名為pGEX_6p_l_幾丁質(zhì)酶。
[0012](3)、重組蛋白的融合表達(dá)
將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEX-6p-l-幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)化到E.coli BL 21 (DE3)中。挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中(含SOyg/ml氨芐霉素)，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。次日按I %接種于50mlLB液體培養(yǎng)基中(含50 μ g/ml氨芐霉素)，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.6mM, 37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)后2、4、6、8小時(shí)各取菌液5mL，離心保留菌體，最后用SDS-PAGE電泳檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)情況。
[0013](4)、重組蛋白的鑒定
SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，利用目的蛋白上的GST標(biāo)簽，用抗GST鼠單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠多克隆抗體為酶標(biāo)二抗，進(jìn)行Western Blot 分析。
[0014](5)、表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析
取500ml誘導(dǎo)7小時(shí)的菌液離心收集菌體，按10: I比例重懸于PBS中，超聲破碎(300-400W,超聲3s，間5s，工作15分鐘)，然后12000rpm離心10分鐘，分別保留上清和沉淀，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析目的蛋白是否為可溶性蛋白，在菌體超聲破碎上清檢測(cè)到少量蛋白，目的蛋白大多以包涵體的形式存在。
[0015](6)、融合蛋白的純化
1000 mL上述誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，離心收集菌體后，用STE洗滌菌體，加入20 mL菌體裂解液重懸菌體，4°C作用30 min，使溶菌酶充分裂解細(xì)菌細(xì)胞壁，可以觀察到菌液變得十分粘稠，呈絲狀。超聲破碎直至菌液不再粘稠，12000 rpm離心30min,用Novagen公司ProteinRefolding Kit蛋白純化試劑盒處理包涵體后進(jìn)行透析，獲得具有生物學(xué)活性的蛋白。然后利用帶GST凝膠的柱子(上海生工)進(jìn)行純化回收目的蛋白。
[0016](7)、重組蛋白的生物學(xué)活性檢測(cè)
融合蛋白的活性檢測(cè)用薄層平皿瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法測(cè)定。分別取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種于5 mL無(wú)氨芐抗性LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。酵母菌(GS115)接種于5 mL無(wú)抗YH)液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。分別取0.5 mL上述培養(yǎng)液接種于新鮮的5 mL無(wú)氨芐抗性LB和YH)培養(yǎng)基中，分別與37°C、30°C搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。取200 μ L此細(xì)菌培養(yǎng)液，涂于無(wú)氨芐抗性LB和YH)瓊脂平板，放置片刻。待菌液稍干后，用直徑為6mm的滅菌打孔器打孔若干個(gè)，分別在孔中加入100 μ L PBS作對(duì)照，100 μ L此重組蛋白。將平板正面向上37°C培養(yǎng)2 h后，倒置繼續(xù)培養(yǎng)18 h(酵母菌培養(yǎng)40 h)，觀察抑囷效果。
[0017]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白，其特征在于:所述蛋白氨基酸序列如SEQID N0:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)植物重組幾丁質(zhì)酶基因的克隆及測(cè)序； (2)表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定； (3)重組蛋白的融合表達(dá)； (4)重組蛋白的鑒定； (5)表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析； (6)融合蛋白的純化； (7)植物重組蛋白的生物學(xué)活性檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白制備方法，其特征在于:所述步驟(1)包括如下步驟: 步驟1、利用十字花科植物幾丁質(zhì)酶基因的保守序列涉及特異性引物，以白菜基因組DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1098bp的特異性DNA片段和長(zhǎng)度150的幾丁質(zhì)酶基因5’端序列片段； 步驟2、利用不同濃度的水楊酸處理苗齡為5天的白菜植株，處理濃度為I mmol/L、2.5mmol/L、5 mmol/L、7.5mmol/L,以未處理的為對(duì)照組，分別在處理后8、112、16、20小時(shí)提取粗酶液并測(cè)定酶活力，選擇其中酶活力最高的吹植株葉片提取葉片總RNA ； 步驟3、利用Trizol試劑法提取提取經(jīng)I mmol/L水楊酸處理的白菜葉片總RNA,利用3’ RACE技術(shù)擴(kuò)增得到該幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)1517bp序列； 步驟4、幾丁質(zhì)酶基因序列同源性比對(duì)和測(cè)序。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述植物重組幾丁質(zhì)酶蛋白制備方法，其特征在于:所述步驟4中幾丁質(zhì)酶基因核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK103627687SQ201310621117
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】段升華 申請(qǐng)人:中山奈德生物科技有限公司