一種化妝品微生物的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種化妝品種微生物的檢測(cè)方法的改進(jìn)。用SCDLP增菌液代替生理鹽水稀釋樣品，進(jìn)行菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌檢測(cè)，SCDLP增菌后，用卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)，對(duì)糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌篩選檢測(cè)，結(jié)合生化酶反應(yīng)進(jìn)行鑒定。改良法操作簡(jiǎn)便快捷，適合化妝品日常微生物的快速檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種化妝品微生物的檢測(cè)方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及化妝品微生物檢驗(yàn)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種化妝品中細(xì)菌的檢驗(yàn)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生活水平的不斷提高，化妝品已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡谋匦杵??；瘖y品的種類(lèi)與數(shù)量與日俱增，同時(shí)其衛(wèi)生質(zhì)量倍受管理部門(mén)和消費(fèi)者的重視，而化妝品微生物學(xué)指標(biāo)(菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌、糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌)是日常化妝品檢測(cè)的必檢指標(biāo)(除少數(shù)含有75%乙醇和染發(fā)產(chǎn)品以外)。
[0003] 化妝品是人們的日常用品，化妝品因原料中存在油脂、蛋白質(zhì)、淀粉、維生素、水分等眾多營(yíng)養(yǎng)性成分，為微生物的滋生和繁殖提供了良好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。微生物會(huì)將化妝品中的營(yíng)養(yǎng)成分代謝分解，致使化妝品腐敗變質(zhì)，不僅使化妝品的色、香、味及劑型發(fā)生變化，而且可能對(duì)使用者的健康造成嚴(yán)重危害。因此，化妝品中一些有害微生物的分離與檢測(cè)是當(dāng)前化妝品衛(wèi)生質(zhì)量控制的重要問(wèn)題。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人民的生活水平不斷提高，對(duì)化妝品的需求量也越來(lái)越大。人們?cè)谑褂没瘖y品的同時(shí)，對(duì)化妝品衛(wèi)生指標(biāo)也越來(lái)越重視。由于一些工廠對(duì)化妝品生產(chǎn)過(guò)程中的微生物標(biāo)準(zhǔn)控制得不好，造成上市的部分化妝品細(xì)菌含量嚴(yán)重超標(biāo)，甚至檢出了致病菌。這種消息常見(jiàn)諸報(bào)端，引起了消費(fèi)者的恐慌。如何控制好微生物指標(biāo)，確保生產(chǎn)出衛(wèi)生指標(biāo)合格的產(chǎn)品，更好地為廣大消費(fèi)者服務(wù)，是擺在化妝品制造廠商面前一個(gè)急需解決的重要課題。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了使化妝品微生物檢測(cè)進(jìn)一步簡(jiǎn)單快捷，本發(fā)明針對(duì)目前《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》方法中對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法，對(duì)微生物的檢測(cè)方法進(jìn)行了如下的改良簡(jiǎn)單方便，更利于實(shí)際應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供了對(duì)化妝品中微生物的檢驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn)。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:針對(duì)目前《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》方法中對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法，結(jié)合日常檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌在卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)比較典型，同時(shí)也比較好辨認(rèn)，為了使化妝品微生物檢測(cè)進(jìn)一步簡(jiǎn)單快捷，本發(fā)明用S⑶LP增菌液代替生理鹽水直接稀釋樣品，用S⑶LP增菌液代替乳糖膽鹽對(duì)糞大腸菌群增菌，將SCDLP增菌液增菌后的樣品，轉(zhuǎn)種在卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上分離，直接在此培養(yǎng)基中挑取可疑的糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色和進(jìn)一步的生化鑒定，省略伊紅美蘭、乙酰胺和BP三種培養(yǎng)基對(duì)糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌三種致病菌的分離。
[0008]卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂不含有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，是廣譜培養(yǎng)基，因此，糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，在卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂上均應(yīng)生長(zhǎng)良好。本文嘗試SCDLP增菌后用卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板對(duì)三種致病菌進(jìn)行分離，試驗(yàn)表明三種菌在卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上均生長(zhǎng)良好，并伴有典型菌落特征。
[0009]有益效果:本發(fā)明化妝品中微生物的檢驗(yàn)方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，用增菌液代替生理鹽水以及糖膽鹽對(duì)糞大腸菌群增菌，將增菌后的樣品，轉(zhuǎn)種在卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上分離，直接在此培養(yǎng)基中挑取可疑的菌群、菌落進(jìn)行革蘭氏染色和進(jìn)一步的生化鑒定，省略了對(duì)糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌三種致病菌的分離。改進(jìn)后的檢驗(yàn)法簡(jiǎn)單明了，可操作性強(qiáng)，大大降低了分析成本，方法簡(jiǎn)單，無(wú)復(fù)雜步驟，易于推廣應(yīng)用，可以用于化妝品的日常快速檢測(cè)。
[0010]下面，結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明化妝品中微生物的檢驗(yàn)方法的技術(shù)特征作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0011]I備檢液制備
樣品1:10備檢液無(wú)菌操作稱(chēng)取親水性樣品稱(chēng)IOg(ml) ±0.1g(ml)加到90ml SCDLP增菌液的玻璃瓶中；疏水性樣品稱(chēng)10g(ml) ±0.1g(ml)加5ml經(jīng)滅菌的吐溫80，加到75mlS⑶LP增菌液的玻璃瓶中，經(jīng)充分混勻制成1:10的樣品制備液。
[0012]樣品1:100備檢液吸取以上樣品備檢液10ml，加到90ml S⑶LP增菌液的稀釋瓶中，制成1:100的樣品備檢液。
[0013]陽(yáng)性對(duì)照濃度為IO2的大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AMMS8099和白色念珠菌ATCC10231作為菌落總數(shù)和霉菌和酵母菌 陽(yáng)性對(duì)照。大腸埃希菌AMMS8099、金黃色葡萄球菌NICPBP26112、銅氯假單胞菌NICPBP10211標(biāo)準(zhǔn)菌株，菌液濃度為IO1混合液IOml加入90mlSCDLP增菌液中作為致病菌的陽(yáng)性對(duì)照。
[0014]2菌落總數(shù)檢測(cè)
吸取1:10和1:100備檢液及陽(yáng)性對(duì)照液各2ml分別注入標(biāo)識(shí)好的2塊無(wú)菌平皿中，每塊平皿注入Iml ;另取2塊平皿做空白對(duì)照，將平皿傾入卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂，置(36± I) V恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
[0015]3霉菌和酵母菌檢測(cè)
1:10和1:100備檢液及陽(yáng)性對(duì)照液各2ml分別注入標(biāo)識(shí)好的2塊無(wú)菌平皿中，每塊平皿注入Iml ;另取2塊平皿做空白對(duì)照，將平皿傾入虎紅瓊脂，置(28±1)°C恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)72h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
[0016]4糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)
4.1增菌將上述1:100增菌液、空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照置于(36±1) °C恒溫生化培養(yǎng)箱，增菌24h備檢。
[0017]4.2轉(zhuǎn)種將培養(yǎng)后增菌液在已制備好的卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行細(xì)菌劃線分離，置(36± I) °C培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)種后若無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng),則報(bào)告每克樣品中未檢出糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌；若有細(xì)菌生長(zhǎng)，則對(duì)所有形態(tài)不同的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，若發(fā)現(xiàn)革蘭陰性桿菌和革蘭陽(yáng)性球菌者，進(jìn)一步鑒定。
[0018]4.3鑒定方法
a.糞大腸菌群的鑒定:糞大腸菌群在卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上呈中等大小、灰白的、半透明、中間凸起有菌心，濕潤(rùn)菌落；革蘭氏染色為無(wú)芽孢陰性桿菌。將可疑菌落細(xì)菌分別接種至蛋白胨水(靛基質(zhì)試驗(yàn))和EC肉湯管中，置(44±0.5)1:培養(yǎng)2411。靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性，EC肉湯管產(chǎn)氣,則報(bào)告檢出糞大腸菌群。[0019] b.銅綠假單胞菌的鑒定:銅綠假單胞菌在卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落比糞大腸菌群小，呈白色、不透明較濕潤(rùn)，可產(chǎn)生綠色的綠膿菌素；革蘭氏染色為陰性桿菌，將可疑菌進(jìn)行五項(xiàng)生化反應(yīng)。氧化酶試驗(yàn)、綠膿菌素試驗(yàn)為陽(yáng)性；或液化明膠、硝酸鹽還原試驗(yàn)和42°C生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽(yáng)性時(shí)，均報(bào)告檢出銅綠假單胞菌。
[0020]c.金黃色葡萄球菌的鑒定:由于有卵磷脂存在，金黃色葡萄球菌在卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落周?chē)僧a(chǎn)生與Baird Parker平板相似的透明暈圈，革蘭氏染色為陽(yáng)性葡萄球菌。將可疑菌進(jìn)行甘露醇發(fā)酵和血漿凝固酶試驗(yàn)。經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌，并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性者，即報(bào)告檢出黃金色葡萄球菌。
[0021]5 結(jié)果
1:10及1:100稀釋液無(wú)菌落生長(zhǎng)時(shí)，菌落總數(shù)及霉菌和酵母菌結(jié)果報(bào)告為<10 CFU/go沒(méi)有致病菌檢出時(shí)，報(bào)告為未檢出。檢測(cè)樣品中有3件樣品菌落總數(shù)超標(biāo)，4件樣品菌落總數(shù)及霉菌和酵母菌同時(shí)超標(biāo)。1件樣品菌落總數(shù)及霉菌和酵母菌、糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均超標(biāo)。對(duì)樣品不合格率進(jìn)行X 2檢驗(yàn)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)?？瞻讓?duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均符合試驗(yàn)要求。
[0022]從上述結(jié)論我們可以看出，用S⑶LP增菌液代替生理鹽水稀釋樣品進(jìn)行菌落總數(shù)及霉菌和酵母菌檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn):同一樣品采用SCDLP增菌液為稀釋液，菌落總數(shù)在數(shù)值上稍高于生理鹽水。經(jīng)分析認(rèn)為，大多數(shù)的化妝品中均含有不同種類(lèi)和劑量的防腐劑，而SCDLP增菌液中含有卵磷脂和吐溫80，這兩種成分可以中和化妝品中的防腐劑，使處于休眠狀態(tài)下細(xì)菌修復(fù)和生長(zhǎng)，這與日常檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有的樣品菌落總數(shù)1:10稀釋度不超標(biāo)甚至未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，但在1:100稀釋度卻嚴(yán)重超標(biāo)的現(xiàn)象一致，均是防腐劑的干擾所致。因此S⑶LP增菌液作為稀釋液更為合理。用SCDLP增菌液代替乳糖膽鹽對(duì)糞大腸菌群增菌，實(shí)驗(yàn)證明對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，糞大腸菌群在SCDLP肉湯中生長(zhǎng)良好。
[0023]日?；瘖y品樣品檢測(cè)時(shí)，菌落形態(tài)不一定很典型，與本文試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)菌的菌落形態(tài)可能有一定的差別，因此增菌后，當(dāng)吐溫80 —營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，一定要對(duì)所有形態(tài)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，對(duì)符合致病菌染色特征的細(xì)菌進(jìn)行生物酶反應(yīng)，確保檢測(cè)結(jié)果正確；另外，由于使用廣譜培養(yǎng)基卵磷脂、吐溫80作為分離培養(yǎng)基，當(dāng)樣品中存在大量細(xì)菌而將糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌三種致病菌掩蓋時(shí)，本法不適用，考慮到化妝品樣品的特性，這樣的樣品極為罕見(jiàn)，因此，上述改良方法可以用于日常化妝品檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.一種化妝品中微生物的檢驗(yàn)方法，通過(guò)S⑶LP增菌液代替生理鹽水稀釋樣品，進(jìn)行菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌檢測(cè)，SCDLP增菌后，用卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)，對(duì)糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌篩選檢測(cè)，并結(jié)合生化酶反應(yīng)進(jìn)行鑒定。
2.如權(quán)利要求1所述的化妝品中微生物的檢驗(yàn)方法，其特征在于，所述的1:10備檢液制備方法為，無(wú)菌操作條件下，稱(chēng)取親水性樣品10g(ml) ±0.1g(ml)加到90ml S⑶LP增菌液的玻璃瓶中，疏水性樣品稱(chēng)IOg(ml) ±0.1g(ml)加 5ml經(jīng)滅菌的吐溫80，加到75ml SCDLP增菌液的玻璃瓶中，充分混勻制成。
3.如權(quán)利要求1所述的化妝品中微生物的檢驗(yàn)方法，其特征在于，所述菌落總數(shù)的檢測(cè)方法為傾入卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂，置(36± I) °C恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
4.如權(quán)利要求1所述的化妝品中微生物的檢驗(yàn)方法，其特征在于，所述霉菌和酵母菌的檢測(cè)方法為使用虎紅瓊脂，置(28± I) °C恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)72h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
5.如權(quán)利要求1所述的化妝品中微生物的檢驗(yàn)方法，其特征在于，所述糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法為，將樣品置于(36±1) 1:恒溫生化培養(yǎng)箱，增菌24h備檢，轉(zhuǎn)種將培養(yǎng)后增菌液在已制備好的卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行細(xì)菌劃線分離，置(36± 1) °C培養(yǎng)24h,轉(zhuǎn)種后若無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng),則報(bào)告每克樣品中未檢；若有細(xì)菌生長(zhǎng)，則對(duì)所有形態(tài)不同的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，若發(fā)現(xiàn)革蘭陰性桿菌和革蘭陽(yáng)性球菌者，進(jìn)一步鑒定。
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK103642891SQ201310620826
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】郭狄 申請(qǐng)人:中山鼎晟生物科技有限公司