一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量pcr試劑盒及檢測方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及檢測方法和應(yīng)用。該方法包括標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建、特異性引物的設(shè)計(jì)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增及建立檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線、蟑螂濃核病毒DNA的提取以及有效性驗(yàn)證及結(jié)果判定步驟；其中特異性引物的正向引物的序列為：5’-CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3’，反向引物的序列為：5’-GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為250bp。本發(fā)明檢測靈敏度高，檢測時(shí)間短，可同時(shí)進(jìn)行大批量的樣本分析，具有良好的特異性和穩(wěn)定性，適用于該病毒的定性和定量的檢測。
【專利說明】—種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及昆蟲病毒生物農(nóng)藥檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該P(yáng)CR試劑盒不僅可使用目前存在市場上的所有類型熒光定量PCR儀器，更重要的是能快速地對黑胸大蠊?jié)夂瞬《具M(jìn)行定性、定量檢測，還涉及一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及檢測方法，方法簡單，易行?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]蟑螂學(xué)名蜚蠊，屬于昆蟲綱(Insecta)、直翅目(Blattaria)、蜚蠊科(Blattidae)0蟑螂是一種非常古老的昆蟲，早在3億年前就已出現(xiàn)，素有活化石之稱。同時(shí)蟑螂又是危害人類健康的重要衛(wèi)生害蟲之一，其危害不亞于蚊蟲、蒼蠅及老鼠的一類重要衛(wèi)生害蟲，已知蟑螂體內(nèi)外能攜帶霍亂弧菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等多種細(xì)菌和鉤蟲、蛔蟲、鞭蟲等十種寄生蟲卵，可在體內(nèi)貯存多天，并不斷排出體外，污染周圍環(huán)境。多年來防治蟑螂的主要方法是使用化學(xué)農(nóng)藥，造成了蟑螂抗藥性增強(qiáng)，且一年多次用藥，造成環(huán)境污染，現(xiàn)在人民生活水平逐步提高，在家庭滅蟑上都希望采用生物農(nóng)藥，而應(yīng)用微生物防治蟑螂已有很多報(bào)道，其中從自然罹病蟑螂體內(nèi)分離到的黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦胗蟹浅：玫母腥拘?，死亡率高達(dá)99%。
[0003]黑胸大爐濃核病毒(Periplanetafuliginosa densonucleosis virus, PfDNV)是武漢大學(xué)胡遠(yuǎn)揚(yáng)教授等人在國內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，是在國內(nèi)外第I個(gè)正式分類鑒定的蟑螂濃核病毒。該病毒與其他細(xì)小病毒一樣，病毒粒子無包膜，呈球狀二十面體對稱，直徑22nm基因組為單鏈線狀DNA分子(ssDNA)，沉降系數(shù)為102s，浮力密度為1.42g/ml,可以通過差速離心和密度梯度離心的方法將其分離提純。病毒粒子的SDS-PAGE顯示由5個(gè)蛋白組成，分子量分別為52KD，56KD，79KD，82KD，105KD。PfDNV基因組全長為5454bp(PfDNV基因組序列已提交Genbank，編號(hào)為:AF192260.1)?；蚪M正鏈有4個(gè)大的閱讀框(0RF)，負(fù)鏈含有3個(gè)大的閱讀框，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。ICTV第九次會(huì)議正式將其獨(dú)立列為一個(gè)屬:Pefudensovirus。黑胸大蠊?jié)夂瞬《究梢痼胧秤麥p退，行動(dòng)遲緩，后體翻仰臥不能自正，直至不動(dòng)而死去。死后蟲尸外觀體形體色不變，體軟腐，壓之流出乳白色膿液，無臭味；此病毒最顯著的病癥是嗉囊特別膨脹，呈白色魚泡狀的氣囊，氣囊一般伸達(dá)第2-4腹節(jié)，有的甚至占住整個(gè)血腔，將中、后腸擠壓至尾端一側(cè)，囊內(nèi)空而無物，破之氣消癟縮；其次是中腸稍腫脹，黑褐色，破之，流出黑褐色液體；后腸黑色，滯留有未排出的糞便。目前應(yīng)用黑胸大蠊?jié)夂瞬《局瞥傻臍Ⅲa(chǎn)品有拜樂生物殺蟑餌劑、方便貼、拜樂生物殺蟑餌盒等產(chǎn)品。而產(chǎn)品的不斷推出，需要有更快更簡單的方法對其有效成分黑胸大蠊?jié)夂瞬《具M(jìn)行定性定量檢測，才能保證產(chǎn)品的質(zhì)量。近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)以其特異性高、靈敏度高、可定量、有效解決PCR污染問題及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在生物農(nóng)藥、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、微生物和動(dòng)植物疾病檢疫方面得到了廣泛應(yīng)用(楊和平、孟小林、徐進(jìn)平等.熒光定量PCR技術(shù)檢測樣品中SeMNPV有效含量[J].中國病毒學(xué)，2006,21 (5):494-498.喬魯芹，曲良建，王玉珠等.美國白蛾核型多角體病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].昆蟲病毒，2010，53 (7):824—830.Petersen Ej Edvinsson B, Lundgren B，et al.Diagnosis ofpulmonary infection with Toxoplasma gondii in immunocompromised HIV-positivepatients by real-1me PCR[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2006，25 (6):401-4
04.;Goldschmidt P，Rosne H，Saint-jean C，et al.Effects of topical anaesthetimsand fluorescein Oil the real-time PCR used for the diagnosis of Herpesvirusesand Acanthamoeba keratitis[J].Br J ophthalmol，2006，90(II):1354-1356.;Regis Sj Grossij Laldi S，et al.Diagnosis of Pelizaeus-Merzbacher disease !detectionof proteolipid protein gene copy numher by real-time PCR[J].Neurogenetics, 2005,6(2):73-78.;Lobetti R G，Tasker S.Diagnosis of feline haemoplasma infectionusing a real-time PCR assay[J].J S Afr Vet Assoc，2004，75 (2):94-99.;Ordinaire I，Simon A，F(xiàn)realle E，et al.Real-time quantitative PCR for toxoplasmosisdiagnosis[J].Ann BiolClinj 2005, 63(I):67-73.;Ovarnstrom Y，James Cj XayavongMjet al.Comparison of real-time PCR protocols for differential laboratorydiagnosis of amebiasis[J].J Clin Microbiol,2005, 43(11):5491-5497.;Knorr Lj FoxJ Dj Tilley P A，et al.Evaluation of real-time PCR for diagnosis of Bordetellapertussis infection[J].BMC Infect Disj 2006(6):62-64.;Vanden B Rj Kuijper EJj Vancopdenraer C L，et al.Rapid diagnosis of toxinogenic Clostridium difficilein faeeal samples with internally controlled real-time PCR[J].Ciin Microbiol Infect, 2006, 12(2):184-186.;Machida U，Kami M，F(xiàn)ukuI T，et al.Real-time automatedPCR for early diagnosis and monitoring of cytomegalovirus infection after bonemarrow transplantation[J].J Clin Microbiol, 2000, 38(7):2536-2542.)
[0004] 申請人:提供的黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，旨在對黑胸大蠊?jié)夂瞬《具M(jìn)行定性和定量檢測，為生產(chǎn)及市場提供簡單、方便的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是在于提供了一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒具有操作簡單、快速、特異性好、靈敏度高、對硬件要求低等優(yōu)勢，不僅可使用目前存在市場上的所有類型熒光定量PCR儀器，更重要的是能快速地對黑胸大蠊?jié)夂瞬《具M(jìn)行定量檢測。一次可檢測48-96個(gè)(由定量檢測儀的型號(hào)決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費(fèi)。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，方法易行，操作簡便，具有靈敏度高、檢測時(shí)間短和可定量分析的特點(diǎn)，可用于蟑螂體內(nèi)的病毒的定量分析。
[0007]本發(fā)明的最后一個(gè)目的是在于提供了一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒在蟑螂病毒殺蟑餌劑檢測中的應(yīng)用，熒光定量PCR方法定量重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，而且，熒光定量PCR檢測試劑盒對樣品的檢測僅需3-4個(gè)小時(shí)就能完成，使用該試劑盒可以大大縮短檢測時(shí)間。[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0009]一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，其組分如下:
[0010]I) DEPC 水；2) SYBR Green I Master ;3)引物:正向引物
[0011]5’ -CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3’ ；反向引物 5’ -GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3’ ；4)標(biāo)準(zhǔn)陽性模板:是含有黑胸大蠊?jié)夂瞬《净?38個(gè)核苷酸片段(其序列為SEQ ID N0.3所示)的pBluesript質(zhì)粒。
[0012]在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，PCR反應(yīng)液中由:DEPC水8μ L ;2XSYBR Green IMaster 10 μ L ;正向引物 IOmM, 0.5 μ L ;反向引物 IOmM, 0.5 μ L。
[0013]所述的標(biāo)準(zhǔn)陽性模板是黑胸大蠊?jié)夂瞬《净?38個(gè)核苷酸片段構(gòu)成的pBluesript構(gòu)成的。且該載體可在大腸桿菌E.coli DH5 a中增殖。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5 a增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測A260(所測樣品在吸收波長為260nm紫外線照射下的光密度)的定量并稀釋至I X IO9拷貝/微升，-20°C保存。
[0014]一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其步驟如下:
[0015]A)用標(biāo)準(zhǔn)陽性模板制備陽性標(biāo)準(zhǔn)品，并用紫外分光光度計(jì)定量；
[0016]定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為5.4X1010拷貝/μ L，用稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍稀釋，即稀釋成濃度分別為 1.0X ΙΟ9、1.0Χ I O8、1.0Χ ΙΟ7、1.0Χ ΙΟ6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4、1.0Χ 103、1.0Χ102的稀釋液，稀釋液在_20°C條件下保存?zhèn)溆茫?br> [0017]B)提取病毒DNA:用商品化試劑盒或用常規(guī)DNA裂解液提取DNA ；
[0018]C)分別取B)步中的DNA和同樣量的系列稀釋的A)步中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品加入到含2X SYBR Green I Master、引物和DEPC水的PCR反應(yīng)體系中用熒光定量檢測儀進(jìn)行PCR檢測；
[0019]20μ L 的 PCR 反應(yīng)體系含有成分如下:DEPC 水，8μ L ;2XSYBR Green I Master,10 μ L ；10mM 正向引物，0.5 μ L ；10mM 反向引物，0.5 μ L ;模板，IyL;
[0020]正向引物5’ -CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3 ’ ；反向引物5’ -GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3’ ；
[0021]反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15sec，55°C退火15sec，72°C延伸20sec，40個(gè)循環(huán)后反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)產(chǎn)物；
[0022]D)建立檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過比較待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值而對待測樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
[0023]一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒在蟑螂病毒殺蟑餌劑檢測中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是:
[0024]取商品化的蟑螂病毒殺蟑餌劑，應(yīng)用本發(fā)明的黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒對其進(jìn)行定性定量檢測，步驟如下:
[0025]1、稱取商品化的殺蟑餌劑Ig溶解至IOmL蒸餾水中，重復(fù)6次；
[0026]2、5000r/分，離心10分鐘后，取上清液；
[0027]3、第2步收集的上清液，在30000r/分下離心I小時(shí)，取沉淀；
[0028]4、沉淀用水稀釋后DNA ；
[0029]5、提取的DNA用本發(fā)明提供的黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，檢測病毒數(shù)量，檢測其產(chǎn)品質(zhì)量是否符合要求。
[0030]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0031]1、定量準(zhǔn)確；
[0032]2、檢測速度快，僅1.5小時(shí)，加上DNA提取的制備，共僅需3 — 4小時(shí)；
[0033]3、方法易行，操作簡便；
[0034]4、可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣品檢測，準(zhǔn)確率高達(dá)98%。
[0035]5.在本發(fā)明中提供的黑胸大蠊病毒快速定量檢測黑胸大蠊病毒熒光定量PCR試劑盒可對黑胸大蠊病毒進(jìn)行定量檢測，并可替代一直沿用的傳統(tǒng)的PCR定性和電鏡計(jì)數(shù)定量檢測方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為黑胸大蠊?jié)夂瞬《局械奶禺愋云坞娪緢D。
[0037]圖2為黑胸大蠊?jié)夂瞬《镜臒晒舛縋CR的擴(kuò)增曲線示意圖。
[0038]圖3為黑胸大蠊?jié)夂瞬《镜臒晒舛縋CR的熔解曲線示意圖。
[0039]圖4為黑胸大蠊?jié)夂瞬《镜臒晒舛縋CR的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0040]圖5為利用本發(fā)明試劑盒檢測商品化殺蟑餌劑的熒光定量PCR的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如:J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。
[0042]實(shí)施例1:
[0043]本發(fā)明實(shí)施例中黑胸大蠊?jié)夂瞬《緹晒舛縋CR試劑盒所需試驗(yàn)材料及儀器:
[0044]1、黑胸大蠊?jié)夂瞬《?武漢武大綠洲生物技術(shù)有限公司提供
[0045]2、實(shí)驗(yàn)試劑:K0D 聚合酶、dNTP 及 MgS04(購于 Τ0Υ0Β0 公司)，LightCycler 480SYBRGreen I Master、DEPC 處理水(購自 Roche 公司)。
[0046]3、實(shí)驗(yàn)儀器:
[0047]離心機(jī)(Thermo)、普通PCR儀(東勝國際貿(mào)易有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler480 II Roche公司)、紫外分光光度計(jì)(島津)、冰箱(青島海爾股份有限公司)實(shí)施例2:
[0048]一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，步驟如下:
[0049]1、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建:將SEQ ID N0.3所示核苷酸序列(此序列在NCBI上進(jìn)行比對后為唯一 DNA序列)利用常規(guī)基因克隆技術(shù)克隆至載體pBluescript ；pBluescript II SK(+ )購自 Stratagen 公司。
[0050]2、特異性引物的設(shè)計(jì):以步驟I中選取的高度保守序列為基準(zhǔn)，設(shè)計(jì)一對特異性引物；設(shè)計(jì)原則為:每條引物的長度為18-25個(gè)堿基，特異性引物中的GC含量要求在40-60%，理論Tm值>50°C ;擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在100_300bp ;選用的特異性引物要求設(shè)計(jì)在蟑螂濃核病毒基因中的保守區(qū)，只對蟑螂濃核病毒特異，和其他物種無交叉反應(yīng)；所述特異性引物包含有正向引物和反向引物:
[0051]正向引物的序列為:5’-CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3’，
[0052]反向引物的序列為:5’ -GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3，。
[0053]3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增及建立檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，包括步驟:
[0054](I)模板的制備
[0055]將步驟I中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍系列梯度稀釋，以稀釋液為模板；具體如下:定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為5.4X101(I拷貝/y L，用稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍稀釋，即稀釋成濃度分別為 1.0X109、1.0X108、1.0X107、1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0XlO3 的稀釋液，稀釋液在-20°c條件下保存?zhèn)溆茫?br> [0056](2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系:
[0057]20 μ L 的 PCR 反應(yīng)體系含有成分如下:DEPC /Κ,8μ L ；2XSYBR Green I Master,10 μ L ；10mM 正向引物，0.5 μ L ；10mM 反向引物，0.5 μ L ;模板，IyL;
[0058](3)循環(huán)反應(yīng):
[0059]根據(jù)步驟(2)中的PCR反應(yīng)體系加樣，將加好樣的PCR試劑管放入熒光PCR儀中，設(shè)置相應(yīng)的熒光采集條 件后進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min，I個(gè)循環(huán)；95°C變性15sec，55°C退火15sec，72°C延伸20sec，40個(gè)循環(huán)后反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)產(chǎn)物，擴(kuò)增出的特異性片段為圖1所示，250bp ；
[0060](4)建立檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線:熒光PCR儀采集熒光信號(hào)，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)生成以起始模板數(shù)對數(shù)為X軸，CT值為y軸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖4所示)；
[0061]Log 濃度(X)與 Cp 的關(guān)系為:Cp=-3.3029X+36.058，相關(guān)系數(shù)(R2)達(dá)到 0.9987，斜率為-3.3029 ；
[0062]對圖所示的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析可見，模板的靈敏性和特異性。(見圖2、圖3)
[0063]4.重復(fù)性驗(yàn)證
[0064](I)將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成3個(gè)濃度，模板DNA含量分別為1.0 X 108、1.0 X 107、
1.0 X IO6拷貝/ μ L，對每個(gè)濃度的樣品經(jīng)熒光定量PCR進(jìn)行定量分析，分別重復(fù)3次檢測，批內(nèi)和批間重復(fù)性通過計(jì)算CT值的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)進(jìn)行評價(jià)。
CT值濃度 SDCV%

19.11 3.52E6 0.075 0.39

19,18 3.38E6
[0065]..............................................................................1-

?α 03 3 72E6


?Ακ mJfI 1MF ft M
1SJ7 I 2.58E7 0.187LW

15.65 I 3-16E7
【權(quán)利要求】
1.一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，包括序列為SEQ ID N0.1和SEQID N0.2所示的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR試劑盒由:DEPC水；2) SYBR Green I Master ;3)引物:正向引物 5’ -CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3，;反向引物5’ -GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3’ ；4)標(biāo)準(zhǔn)陽性模板:含有黑胸大蠊?jié)夂瞬《景谢虻膒Bluesript質(zhì)粒組成。
3.權(quán)利要求1所述試劑盒的檢測方法，步驟如下: A)用標(biāo)準(zhǔn)陽性模板制備陽性標(biāo)準(zhǔn)品，并用紫外分光光度計(jì)定量； B)提取病毒DNA:用商品化試劑盒或用常規(guī)DNA裂解液提取DNA ； C)分別取B)步中的DNA和同樣量的系列稀釋的A)步中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品加入到含2 X SYBR Green 1 Master、引物和DEPC水的PCR反應(yīng)體系中用熒光定量檢測儀進(jìn)行PCR檢測； 20μ? 的 PCR 反應(yīng)體系含有成分如下:DEPC 水，8PL;2XSYBR Green I Master, ΙΟμ? ；IOmM正向引物，0.5μ? ;10mM反向引物，0.5μ? ;模板，WL ； 正向引物 5’ -CCGCGACGCTTAGCTTTAAC-3’ ；反向引物 5’ -GAACGCCTTTCGGACCTTTT-3’ ； 反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15sec，55°C退火15sec，72°C延伸20sec，40個(gè)循環(huán)后反應(yīng)結(jié)束，得到反應(yīng)產(chǎn)物； D)建立檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過比較待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值而對待測樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
4.權(quán)利要求1或2所述的熒光定量PCR試劑盒在蟑螂病毒殺蟑餌劑檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103589807SQ201310614019
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】陳嬌, 尹宜農(nóng) 申請人:武漢武大綠洲生物技術(shù)有限公司