一種利用擬莖點霉對葡萄糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生成松脂醇和松脂醇二葡萄糖苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用擬莖點霉對葡萄糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生成松脂醇和松脂醇二葡萄糖苷的方法，包括下述步驟：1)擬莖點霉制成凍干菌體；2)將凍干菌體加入含葡萄糖的無菌水中，搖瓶振蕩進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)；3)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，離心除去菌體，將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行真空濃縮，加入乙醇醇沉過夜后過濾去除多糖及其他雜質(zhì)，蒸發(fā)至干即可得松脂醇二葡萄糖苷。本發(fā)明公開的方法能以葡萄糖為唯一底物，在簡單的反應(yīng)條件下，即可產(chǎn)生松脂醇和松脂醇二葡萄糖苷。
【專利說明】一種利用擬莖點霉對葡萄糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生成松脂醇和松脂醇二葡萄糖苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用生物技術(shù)將葡萄糖進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法，屬于微生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]松脂醇和松脂醇二葡萄糖苷是具有抗血壓、抗癌、抗氧化等多種生理活性的木脂素化合物，目前只在植物中發(fā)現(xiàn)。已有的獲得這兩種成分的方法主要包括兩種，一種是從植物中提取，這種方法需要耗費大量的植株，并且需要經(jīng)過復(fù)雜的提取純化工藝才可以獲得較高產(chǎn)量和純度的產(chǎn)品；另一種方法是半化學(xué)合成，需要經(jīng)過較為復(fù)雜的化學(xué)合成工藝路線，使用多種有機化學(xué)原料，整個制備過程存在一定的有機毒性，并且所得產(chǎn)物容易有中間雜質(zhì)摻入，影響產(chǎn)品藥學(xué)性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明公開了一種利用擬莖點霉對葡萄糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化獲得松脂醇和松脂醇二葡萄糖苷(TOG)的方法，能夠快速、有效、低成本的實現(xiàn)生產(chǎn)松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇，整個生產(chǎn)過程環(huán)保無污染，可實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，同時也可以用于對菌株的PDG合成途徑改造和調(diào)控研究。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0005]一種利用擬莖點霉對葡萄糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法，包括下述步驟:1)擬莖點霉制成凍干菌體；2)將凍干菌體加入含葡萄糖的無菌水中，搖瓶振蕩進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)；3)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，離心除去菌體，將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行真空濃縮，加入乙醇醇沉過夜后過濾去除多糖及其他雜質(zhì)，蒸發(fā)至干即可得松脂醇二葡萄糖苷。
[0006]在本發(fā)明中，所采用的`擬莖點霉名為XP-8，中國專利保藏號為Phomopsissp.CCTCC M209291,關(guān)于該菌種的來源、基金序列、分類等信息 申請人:公開于ApplMicrobiolBiotechnol 雜志，文章名為 Structure identification and fermentationcharacteristicsofpinoresinoldiglucoside produced by Phomopsissp.1solated fromEucommiaulmoidesOIiv,電子版本公開于2011年11月3日，印刷版本刊載于2012年93期P1475—1483。本領(lǐng)域技術(shù)人員可從西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院購買此菌種，同時 申請人:聲明資本發(fā)明申請日起20年內(nèi)向 申請人:可向公眾提供該菌種。
[0007]進(jìn)一步的， 申請人:發(fā)現(xiàn)在上述基礎(chǔ)上，步驟2)在將凍干菌體加入含葡萄糖的無菌水中后可加入松柏醇和/或松脂醇單葡萄糖苷從而得到松脂醇。
[0008] 申請人:對上述生物轉(zhuǎn)化過程的條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，得出了較為有效的進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的條件為:步驟2)采用的無菌水葡萄糖濃度為0.5— 5%，菌體濃度為0.1—1%，轉(zhuǎn)化時間為2 — 20小時。
[0009]通過進(jìn)一步的優(yōu)化研究， 申請人:發(fā)現(xiàn)了最優(yōu)化的生物轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)化時間12.51小時，葡萄糖濃度1.32%，菌體濃度0.29%。[0010]同樣的， 申請人:對實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化成松脂醇的條件進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)在下述濃度下能實現(xiàn)較好的轉(zhuǎn)化時間和產(chǎn)率:所用松柏醇和/或松脂醇單葡萄糖苷的濃度為
0.1 ~1 Ommol / L,最優(yōu)選為 lmmol / L。
[0011]通過本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明實現(xiàn)了以生物轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)，以葡萄糖等為原料，快速、有效地生產(chǎn)松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇的液相色譜圖，其中I為標(biāo)準(zhǔn)品松脂醇二葡萄糖苷的色譜峰，2為標(biāo)準(zhǔn)品松脂醇的色譜峰，3為樣品中松脂醇二葡萄糖苷色譜峰，4為樣品中松脂醇的色譜峰。
[0013]圖2為標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇的二級質(zhì)譜圖，其中A、B分別是標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中松脂醇二葡萄糖苷的二級質(zhì)譜；C、D分別是標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中松脂醇的二級質(zhì)譜。
【具體實施方式】[0014]1.1 材料:
[0015]囷株擬圣點霉XP-1 ;PDG標(biāo)準(zhǔn)品，購于中國藥品生物制品檢定所，松脂醇標(biāo)準(zhǔn)品，購于Sigma ;乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，購于sigma ;瓊脂(B.R)，葡萄糖(A.R),95%乙醇(A.R)等購于陜西西隴化工。
[0016]1.2 方法
[0017]1.2.1凍干菌體的制備:將保存的擬莖點霉XP-1的斜面菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基上，在28°C下培養(yǎng)活化5d ;用直徑為Icm的無菌打孔器打孔取種，接入4一6片到裝有IOOmL PDB培養(yǎng)基的250mL的搖瓶中，在28°C、180r / min下?lián)u床培養(yǎng)5d作為種子液。再以10%接種量接入新的PDB培養(yǎng)基中，裝液量IOOmL / 250mL，在28°C、180r / min下?lián)u床培養(yǎng)5d。
[0018]發(fā)酵液冷凍離心或紗布過濾棄上清液，收集菌絲體，并用無菌水進(jìn)行清洗3次，收集菌體放_80°C冰箱過夜，用真空冷凍干燥機凍干，_40°C放置備用。
[0019]1.2.2響應(yīng)面分析法優(yōu)化合成I3DG的條件:
[0020]取適量凍干的菌體細(xì)胞放入一定濃度的含葡萄糖的無菌水中，28°C，180r / min的條件下?lián)u瓶振蕩進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，取轉(zhuǎn)化液進(jìn)行檢測。選取三個因素三個水平進(jìn)行試驗，各因素的水平及編碼如表1所示。
[0021 ] 表1Box—Behnken試驗因素水平及編碼[0022]
【權(quán)利要求】
1.一種利用擬莖點霉對葡萄糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生成松脂醇和松脂醇二葡萄糖苷的方法，其特征在于包括下述步驟:1)擬莖點霉制成凍干菌體；2)將凍干菌體加入含葡萄糖的無菌水中，搖瓶振蕩進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)；3)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，離心除去菌體，將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行真空濃縮，加入乙醇醇沉過夜后過濾去除多糖及其他雜質(zhì)，蒸發(fā)至干即可得松脂醇二葡萄糖苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)進(jìn)一步包括在將凍干菌體加入含葡萄糖的無菌水中后加入松柏醇和/或松脂醇單葡萄糖苷從而得到松脂醇的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所用菌種為擬莖點霉名為XP-8，中國專利保藏號為 Phomopsis sp.CCTCC M209291。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟2)采用的無菌水葡萄糖濃度為0.5-5%，菌體濃度為0.1_1%，轉(zhuǎn)化時間為2 — 20小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟2)采用轉(zhuǎn)化時間12.51小時，葡萄糖濃度1.32%，菌體濃度0.29%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于有松柏醇和/或松脂醇單葡萄糖苷加入。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所用松柏醇和/或松脂醇單葡萄糖苷的濃度為 0.1 ~1 Ommol / L。
【文檔編號】C12P17/18GK103667386SQ201310604458
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】師俊玲, 高振紅 申請人:師俊玲