一種產(chǎn)γ-環(huán)糊精的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)γ-環(huán)糊精的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其用途，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，該突變體酶相對于未突變的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶具有高產(chǎn)γ-環(huán)糊精的功能，在以淀粉為原料生產(chǎn)γ-環(huán)糊精中具有廣泛的用途。
【專利說明】一種產(chǎn)Y-環(huán)糊精的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶學(xué)領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)Y-環(huán)糊精的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，還涉及該突變體在以淀粉為底物生產(chǎn)Y-環(huán)糊精中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CyclodextrinGlycosyltransferase,簡寫CGTase, EC2.4.1.19)是糖基水解酶家族13的重要成員，其功能是將淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精。從1891年研究者發(fā)現(xiàn)一種叫Bacillusmacerans的菌株能利用淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精至今，國內(nèi)外研究者對CGTase的研究已經(jīng)有百年歷史(李兆豐，顧正彪，堵國成等，2010，環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特征與催化機(jī)理，中國生物工程雜志，30(06):144 - 150。)。產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的微生物主要為芽孢桿菌，其中類芽孢桿菌、克雷伯氏菌、嗜熱厭氧菌、嗜熱厭氧物種和放線菌的近幾十種CGTase基因已經(jīng)被分離鑒定了(CristianeMoriwakiajGlauciane L.CostaajRubia Pazzettoajet al.2007，Production andcharacterization of a new cyclodextrin glycosyItransferase from Bacillus firmusisolated from Brazilian soil, Process Biochemistry.42 (10): 1384-1390.)。
[0003]根據(jù)催化生成環(huán)糊精的主要類型不同，環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可分為α-、β-、y-CGTase三種。目前，國內(nèi)外已經(jīng)對α-和β-CGTase進(jìn)行了廣泛深入的研究，但是對Y-CGTase的研究則是非常少的，目前只發(fā)現(xiàn)來源于Bacillusfirmus290_3,Bacillussp.G-825-6, alkalophiIicBaciIIuscIarkii7364 的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為Y-CGTase (楊東，田靖斐，陳晟等，2012，亞位點_7處突變對堿性芽孢桿菌CGT酶產(chǎn)物特異性的影響，生物工程學(xué)報，28(2):191-202。)。我國對CGTase研究較少，主要集中在通過篩選和誘變野生型菌、菌株發(fā)酵條件優(yōu)化等方面進(jìn)行研究(朱德艷，2013，產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化，湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，52(1):171-173，185。)。江南大學(xué)的王峰對高產(chǎn)Y-CGTase的Bacillus macorousWSH02-06的發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了系統(tǒng)的研究(WangF, Du G and ChenJ, 2005, Optimization of CultivationCondition for the Production of y-Cyclodextrin Glucanotransferase by Bacillusmacorous.Food Biotechnoligy, 18(2):251-264.)和曹新志對一株嗜喊芽抱桿菌BaciIlusalkalophiIusl 177進(jìn)行誘變及發(fā)酵條件優(yōu)化(曹新志，金征宇，嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件的優(yōu)化，2005，食品科學(xué)，26 (2):122-126。)。江南大學(xué)陳堅課題組對來源于Peanibacillus maceransJFB05_01的CGT酶進(jìn)行了定點突變,分別獲得了三個具有高產(chǎn)α-環(huán)糊精能力的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體和三個具有高產(chǎn)環(huán)糊精的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，并都已經(jīng)獲得了專利授權(quán)(專利號ZL200910029154.2和ZL200910029153.8)。廣西科學(xué)院的龐浩等人對一個β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行突變，獲得一個高產(chǎn)麥芽糖的突變體(專利號ZL201210387243.6)。
[0004]環(huán)糊精(cyclodextrin,⑶)是環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用于淀粉生成的一類寡糖，其一般有6-12個D-吡喃葡萄糖基以α -1, 4-葡萄糖苷鍵連接成的環(huán)狀低聚糖(Szejtli J.1998,Introduction and General Overview of Cyclodextrin Chemistry.Chem Rev，98 (5):1743 - 1753.)。其中研究最多、應(yīng)用最廣的是由6，7和8個葡萄糖殘基組成的環(huán)糊精，分別稱為 α _、β_ 和 Y -CD(RonanM.Kelly, Lubbert Dijkhuizen, HansLeemhuis.2009.The evolution of cyclodextrin glucano-transferase productspecificity.App1.Microbiol.Biotechnol., 84(1): 119-133.)。環(huán)糊精分子是內(nèi)部疏水、外部親水的呈中間圓筒型的立體結(jié)構(gòu)。其疏水空洞可與適當(dāng)大小、形狀及疏水性的分子非共價作用而形成穩(wěn)定的包合物，從而改變被包合物的形狀和反應(yīng)性能。因而可應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、紡織等許多行業(yè)(王寧，2010，α-環(huán)糊精以及Y-環(huán)糊精的酶轉(zhuǎn)化工藝研究，江南大學(xué)，碩士論文:1。)。其中Y-⑶空腔最大能夠包含更大的分子，β_⑶次之，α-⑶最小。[0005]在食品方面，環(huán)糊精被公認(rèn)為無害寡糖，在許多食物和營養(yǎng)食品吸收過程中無副作用，并廣泛作為多種食物和營養(yǎng)食品的配料或添加劑(Food Standards in AustraliaNew Zealand Final assessment report,Application A438:gamma cyclodextrin as anovel food ingredient/food additive.2003，Marchl9)。
[0006]在制藥行業(yè)，環(huán)糊精已進(jìn)行深入研究，由于其獨特性能，可以作為藥物載體。從目前環(huán)糊精的研究來看，β_⑶的應(yīng)用最常見。但是由于β_⑶的水溶性差、組織刺激大等缺點而大大限制了其應(yīng)用，而Y-CD的腔體更大，水溶性好且局部刺激小、毒性最小等有點。因此，Y-CD在改善藥物的溶解度等方面有著更顯著的優(yōu)勢(陳卉，陳燕忠，謝清春等，2012，相溶解度法研究兩種不同類型環(huán)糊精對吲達(dá)帕胺的包合作用，中國藥師，15(9):1281-1283。)。陳迪釗等人通過溶液共混法制備了青藤堿-Y-⑶包合物從而大大增加了青藤堿的溶解度(陳迪釗，朱士龍，李勇等，2013，青藤堿-Y -環(huán)糊精包合物的性質(zhì)及譜學(xué)分析，食品科學(xué)，34 (03):115-118。)。
[0007]以環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為名稱查找國家知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索數(shù)據(jù)庫，共出現(xiàn)11項發(fā)明專利。關(guān)于產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的菌株的專利有I項；關(guān)于α -或β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其應(yīng)用的專利有3項；關(guān)于環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的專利有3項(I項是突變成高產(chǎn)α -環(huán)糊精，I項是突變成高產(chǎn)β -環(huán)糊精，I項是突變成高產(chǎn)麥芽糖)；其它4項發(fā)明專利是關(guān)于環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的酶制劑及其應(yīng)用的。
[0008]以Y-環(huán)糊精為關(guān)鍵詞查找國家知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索數(shù)據(jù)庫，共出現(xiàn)61項發(fā)明專利，其中只有5項是酶法生成Y _環(huán)糊精，其他46項專利都與Y-環(huán)糊精的應(yīng)用相關(guān)。在這5項酶法生成Y-環(huán)糊精中有4項是采用野生菌株產(chǎn)生的Y-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來生成Y -環(huán)糊精，只有I項專利是缺失第155位至包括第195為氨基酸在內(nèi)的區(qū)域中的4-8個氨基酸，獲得的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體產(chǎn)Y-環(huán)糊精量在一定程度上有所提高。
[0009]尋找和克隆高產(chǎn)Y -環(huán)糊精的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的途徑有2個:一是篩選新型酶的微生物；二是對酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)工程改造。微生物菌種選育是工業(yè)生產(chǎn)和學(xué)術(shù)研究中最常用和最簡單的手段之一，但是工作量大、隨機(jī)性強(qiáng)，因此往往很難篩選到理想菌株。蛋白質(zhì)工程改造是新興的、利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的方法對蛋白進(jìn)行定向突變和理性改造，從而獲得理想蛋白或酶的方法，其優(yōu)點在于工作量相對較小和成功概率較大，但是多數(shù)突變體蛋白質(zhì)的酶學(xué)性質(zhì)沒有改變或者變得更差。因此，獲得效果更好的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體一直是本領(lǐng)域的研究熱點。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明的目的在于針對上述技術(shù)問題，通過對β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，從而獲得一種以淀粉為底物高產(chǎn)Y-環(huán)糊精的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。[0011]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:[0012]本發(fā)明提供的一種產(chǎn)Y-環(huán)糊精的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，其氨基酸序列為SEQIDN0:1，該突變體是通過對專利ZL201110171181.0中的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Pcgt進(jìn)行改造而得到的，具體是通過分子改造β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因Pcgt，將Pcgt分子上的53位的氨基酸R突變成T、將93~100位的氨基酸INYSGVNN突變成TPGGF同時將151~158位的氨基酸SSDQPSFA突變成D，改造得到一個新的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。該環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體和原酶相比，能夠以淀粉為原料高產(chǎn)Y-環(huán)糊精。[0013]本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞可以為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。[0014]本發(fā)明所述的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體在以淀粉為原料生產(chǎn)Y-環(huán)糊精中具有廣泛的用途。[0015]本發(fā)明所述的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的制備方法包括以下步驟:[0016]1)克隆獲得環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因；[0017]2)將步驟1)所獲得的基因改造得到β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體基因；[0018]3)將步驟2)所獲得的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體基因進(jìn)行表達(dá)和純化，得到β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的純化產(chǎn)物；[0019]4)測定β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體水解淀粉所得的產(chǎn)物。[0020]本發(fā)明運用蛋白質(zhì)工程改造的方法對β_環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了定向改造，獲得了高產(chǎn)Y-環(huán)糊精的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，本發(fā)明的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體在以淀粉為原料生產(chǎn)Y-環(huán)糊精中具有廣泛的用途。
【專利附圖】

【附圖說明】[0021]圖1為本發(fā)明的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體部分純化物的SDS-PAGE圖；[0022]圖2為突變前的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的淀粉水解產(chǎn)物的HPLC圖；[0023]圖3為本發(fā)明的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的淀粉水解產(chǎn)物的HPLC圖。
【具體實施方式】[0024]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和本質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。[0025]實施例1 β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的制備[0026]材料:大腸桿菌(Escherichiacoli)XLIO-Gold、載體 pSE380 購自 Invitrogen 公司、N1-NTA蛋白質(zhì)組氨酸純化介質(zhì)購自Novagen公司、聚合酶購自TaKaRa公司、修飾酶DpnI購自MBI公司。其余試劑若無特別說明，均為從市場上購得的常規(guī)試劑。[0027]I) β_環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆
[0028]使用上游引物5 ’ -TCGCCATGGTGCACCACCACCACCACCACATTACGCCAGCTTGCATGCTGCAG-3’ (包含一個NcoI酶切位點和一個6xHis標(biāo)簽在5’末端)和下游引物5’-CACAAGCTTTTAAGGCTGCCAGTTCACGTTAATG-3’ (包含一個HindIII酶切位點)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因Pcgt，用限制性內(nèi)切酶NcoI和Hindi 11酶切環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因Pcgt后，插入到經(jīng)NcoI和HindIII酶切的表達(dá)載體pSE380進(jìn)行連接。獲得的重組質(zhì)粒命名為pSE-Pcgt。
[0029]2) β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體基因Y -Pcgt的獲得
[0030]β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體基因是根據(jù)Pcgt基因序列信息通過設(shè)計三對引物依次進(jìn)行三次突變而獲得。第一次突變是利用反向PCR將53位的氨基酸R突變成T進(jìn)行的，以I)中構(gòu)建的pSE-Pcgt為模板，使用正向引物R53T1: 5’-GCACGAACCTCACTCTGTATTGCGGCGGCG-3’ 和反向引物 R53T2:5’ -CGCCGCCGCAATACAGAGTGAGGTTCGTGC-3’ 進(jìn)行 PCR，PCR反應(yīng)程序:第一步95°C 2分鐘；第二步進(jìn)行30個循環(huán)，循環(huán)為98°C 10秒，61.7°C 6.5分鐘；第三步72°C 10分鐘。PCR產(chǎn)物使用I μ LDpnI在37°C酶切一個小時，然后轉(zhuǎn)化到CaC12化學(xué)法制備的大腸桿菌XLlO-Gold感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物克隆送交華大生物公司進(jìn)行DNA測序分析確定正確的轉(zhuǎn)化子，突變子命名為R53T。第二次突變在第一次成功突變的基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR，以 R53T 為模板，使用正向引物 7D1:5’-CATACGTCGCCCGCCGATGAAAACGGCCGGCTG-3’和反向引物 7D2:5’ -CAGCCGGCCGITTTCATCGGCGGGCGACGTATG-3’ 進(jìn)行 PCR，PCR 反應(yīng)程序--第一步95°C 2分鐘；第二步進(jìn)行30個循環(huán)，循環(huán)為98°C 10秒，59°C 6.5分鐘；第三步72°C 10分鐘。PCR產(chǎn)物使用I μ LDpnI在37°C酶切一個小時，然后轉(zhuǎn)化到CaCl2化學(xué)法制備的大腸桿菌XLlO-Gold感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物克隆送交華大生物公司進(jìn)行DNA測序分析確定正確的轉(zhuǎn)化子，突變子命 名為R53T-7D。第三次突變在第二次成功突變的基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR，以R53T-7D 為模板，使用正向引物 rl:5’ -AACATCTACAGCATCACTCCTGGCGGCTTCACGGCCTATCACGGC-3’ 和反向引物 r2:5’ -GCCGTGATAGGCCGTGAAGCCGCCAGGAGTGATGCTGTAGATGTT-3，進(jìn)行 PCR，PCR反應(yīng)程序:第一步95°C 2分鐘；第二步進(jìn)行30個循環(huán)，循環(huán)為98°C 10秒，56°C 6.5分鐘；第三步72°C 10分鐘。PCR產(chǎn)物使用I μ LDpnI在37°C酶切一個小時，然后轉(zhuǎn)化到CaC12化學(xué)法制備的大腸桿菌XLlO-Gold感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物克隆送交華大生物公司進(jìn)行DNA測序分析確定正確的轉(zhuǎn)化子，將突變子命名為Y -Pcgt0
[0031]3) β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體基因Y -Pcgt的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的部分純化
[0032]將含有質(zhì)粒pSE- Y -Pcgt的重組大腸桿菌XLlO-Gold菌株接種到20mL含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，待0D600為0.6時，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG、終濃度為lOOmmol/L的L-三梨醇和終濃度為2.5mmol/L的甜菜堿，20°C誘導(dǎo)20小時。11000 轉(zhuǎn)離心 3min,收集菌體，用 4mT,裂解緩沖液(50mmol/LNaH2P04, 300mmol/LNaCl,IOmmoI/L咪唑，pH8.0)重懸菌體，超聲波破胞9min。12000轉(zhuǎn)離心lOmin，取上清進(jìn)行后面的蛋白質(zhì)純化。按每4ml上清液加入lmL50%的鎳親和層析膠體，在4°C用200轉(zhuǎn)搖60分鐘，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加Iml沖洗緩沖液(50mmOl/LNaH2P04，300mmOl/LNaCl, 20mmol/L咪唑，pH8.0)到柱子里，緩慢攪拌，收集流出物。重復(fù)沖洗步驟4次。加入洗脫緩沖液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/LNaCl，250mmol/L 咪唑，pH8.0)洗脫蛋白質(zhì)。收集洗脫的蛋白質(zhì)溶液，用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證，所得的SDS-PAGE圖如圖1所示，發(fā)現(xiàn)有目的大小的蛋白質(zhì)條帶。
[0033]4) β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Y -Pcgt水解淀粉的產(chǎn)物測定
[0034]取3 μ I β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Y -Pcgt的部分純化物，與l%(w/v)淀粉溶液(用50mmol/LpH7.0磷酸緩沖液溶解)在500 μ I的反應(yīng)體系中37°C作用3個小時。反應(yīng)時間到后，在100°C加熱10分鐘終止反應(yīng)。Y -Pcgt的產(chǎn)物用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測。HPLC檢測的結(jié)果圖如圖3所示，結(jié)果顯示:Y-Pcgt的產(chǎn)物中有葡萄糖、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和Y-環(huán)糊精存在，其中水解產(chǎn)物中Y-環(huán)糊精的產(chǎn)量占總的水解產(chǎn)物的74.63%。
[0035]HPLC條件:儀器:Agi lent 1100色譜儀，AllteCh2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器，XffK-1II無油空氣泵;色譜柱:Alltima Amino5 μ色譜柱(250X4.6mm);流動相:乙腈:水(70:30);流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量 20 μ L ;柱溫 28°C。
[0036]對照例β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Pcgt水解淀粉的產(chǎn)物測定
[0037]取3 μ I β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Pcgt的部分純化物，與l%(w/v)淀粉溶液(用50mmol/LpH7.0磷酸緩沖液溶解)在500 μ I的反應(yīng)體系中37°C作用3個小時。反應(yīng)時間到后，在100°C加熱10分鐘終止反應(yīng)。Pcgt的產(chǎn)物用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測。HPLC檢測的結(jié)果圖如圖2所示。
[0038]HPLC條件:儀器:Agi lent 1100色譜儀，AllteCh2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器，XffK-1II無油空氣泵；色譜柱:AlltimaAmino5 μ色譜柱(250X4.6mm);流動相:乙腈:水(70:30);流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量 20 μ L ;柱溫 28。。。
[0039]結(jié)果:
[0040]從圖1 了解到，環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Y-Pcgt部分純化物的分子量為74.1kDa0
[0041]圖2中的Α、B和C分別是葡萄糖、α -環(huán)糊精和β -環(huán)糊精的標(biāo)樣，D是Pcgt轉(zhuǎn)化淀粉的產(chǎn)物。從圖2的D中了解到，β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Pcgt能將淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和Y-環(huán)糊精，其中Y-環(huán)糊精的產(chǎn)量占總環(huán)糊精的9.68%，見表1所示。
[0042]表1 β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Pcgt水解淀粉的產(chǎn)物測定表
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)Y-環(huán)糊精的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于:所述產(chǎn)Y-環(huán)糊精的β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的氨基酸序列如SEQIDN0:1所示。
2.一種宿主細(xì)胞，其特征在于:所述宿主細(xì)胞為含有權(quán)利要求1所述的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)Y-環(huán)糊精的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體在以淀粉為原料生產(chǎn)Y-環(huán)糊精中的用途。
【文檔編號】C12P19/18GK103602641SQ201310589368
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】杜麗琴, 黃金群, 黃日波, 閉海, 王金佩, 張志凱, 韋宇拓 申請人:廣西大學(xué)