一種h5n1亞型禽流感病毒ns1蛋白多克隆抗體、制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗體、制備方法及應(yīng)用，涉及生物技術(shù)及動(dòng)物免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗體及其制備方法，所述H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，其對(duì)應(yīng)的DNA序列如SEQIDNO.1所示。發(fā)明以NS1作為研究靶點(diǎn)，通過(guò)對(duì)NS1基因的克隆、原核和真核載體的構(gòu)建，重組蛋白的表達(dá)、純化和鑒定，制備NS1抗體，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)診斷NS1的ELISA檢測(cè)試劑盒做準(zhǔn)備，為進(jìn)一步深入研究流感病毒致病的分子機(jī)制以及研發(fā)治療H5N1感染的NS1功能抑制劑奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】—種H5N1亞型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗體、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)及動(dòng)物免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人類感染高致病性禽流感病毒H5N1 (簡(jiǎn)稱人禽流感)是人類在接觸該病毒感染的病禽/死禽或暴露在被H5N1病毒污染的環(huán)境后發(fā)生的急性呼吸道傳染病。1997年,我國(guó)香港特別行政區(qū)首次發(fā)生H5N1亞型人高致病性禽流感病例，并致6人死亡，在世界范圍內(nèi)引起了廣泛的關(guān)注。2003年下半年，世界上多個(gè)國(guó)家暴發(fā)家禽和野生禽類的H5N1病毒感染，其中有14個(gè)國(guó)家出現(xiàn)人禽流感病例。截至2008年4月30日，由世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道的全球確診病例共378例，其中238例患者死亡，病死率高達(dá)63%。我國(guó)大陸H5N1型人禽流感病毒感染呈高度散發(fā)，從2005年4月底確診第I例人禽流感病例以來(lái)，現(xiàn)已確診30例，其中17例患者死亡，病死率為56.7%。到目前為止，禽流感已造成全球超過(guò)1.5億只禽類被撲殺，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)100億美元。H5N1型禽流感已經(jīng)在15個(gè)亞洲和歐洲國(guó)家與地區(qū)傳播，雖然目前未出現(xiàn)禽流感病毒在人群中流行的現(xiàn)象，但根據(jù)WHO的估計(jì)，目前H5N1禽流感仍在一些國(guó)家的禽類中流行，且流行區(qū)在不斷擴(kuò)大。因此，有跡象表明，H5N1型禽流感在人群中流行只是時(shí)間問(wèn)題。
[0003]H5N1病毒的基因組由8個(gè)分節(jié)段的負(fù)鏈RNA組成，編碼9種結(jié)構(gòu)蛋白和2種非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structoral protein I, NSl ;non_structoral protein 2, NS2)。一直以來(lái)，科學(xué)家們認(rèn)為劃分病毒類型的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)這兩種結(jié)構(gòu)蛋白在禽流感病毒感染人類細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮主要作用，然而來(lái)自圣猶大兒童醫(yī)院的研究人員在分析比對(duì)了2196個(gè)包括流感基因和169個(gè)全基因組序列(包括了人類和豬流感病毒，這是迄今包括病毒種類最多、最廣泛的流感全基因組對(duì)照分析)之后，發(fā)現(xiàn)除了編碼血凝素和神經(jīng)氨酸酶的基因發(fā)生變異外，編碼NSl蛋白質(zhì)的基因也頻繁變異。在不同亞型的流感病毒中，編碼這三種蛋白質(zhì)的基因序列變異最大，這表明它們決定了病毒的致病性。
[0004]NS基因是H5N1基因組中最小的基因節(jié)段，全序列為890個(gè)核苷酸，有兩個(gè)編碼區(qū)，分別編碼NSl和NS2兩種蛋白質(zhì)。第I個(gè)編碼區(qū)編碼含202~237個(gè)氨基酸殘基的NSl蛋白，在不同病毒株系間有差異；第2個(gè)編碼區(qū)編碼含121個(gè)氨基酸殘基的NS2蛋白，其5'端有56個(gè)核苷酸與NSl相同，整個(gè)mRNA包含一個(gè)中斷的含473個(gè)核苷酸的區(qū)域。NSl蛋白含有2個(gè)核定位區(qū)，其中34位~38位氨基酸殘基處的信號(hào)區(qū)非常保守，在所有A型和B型流感病毒中都相同，其氨基酸排列順序?yàn)?Asp-Arg-Leu-Arg-Arg-。第2個(gè)信號(hào)區(qū)在203位~230位氨基酸殘基處，在大多數(shù)A型流感病毒中都有這一序列。有研究表明，NSl基因核苷酸替代大致是保守的，即 使突變也是不連續(xù)的。早期研究表明，這兩種蛋白質(zhì)僅存在于被流感病毒感染的細(xì)胞中，而不出現(xiàn)在流感病毒粒子內(nèi)，所以稱為非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)。NSl在感染的早期就被大量合成并很快轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，調(diào)節(jié)病毒RNA的合成、Pre mRNA的剪切、運(yùn)輸及mRNA的翻譯過(guò)程；NS2主要在胞漿內(nèi)，在感染的后期才會(huì)合成，與Ml蛋白密切作用，將RNP由細(xì)胞核輸送到細(xì)胞漿，在病毒的復(fù)制周期中起重要作用。隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)NS2蛋白在成熟的病毒粒子中少量存在，所以NSl蛋白是流感病毒唯一的非結(jié)構(gòu)蛋白。因此，研究人員認(rèn)為血凝素和神經(jīng)氨酸酶是流感病毒感染宿主細(xì)胞、破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵，而NSl蛋白只在病毒侵入機(jī)體細(xì)胞后才生成，表明其可能在破壞被感染細(xì)胞的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，可能與多個(gè)細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合，破壞細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)通道，致使宿主細(xì)胞死亡。
[0005]雖然對(duì)于流感病毒的研究已經(jīng)持續(xù)了很多年，然而到目前為止人們對(duì)于流感病毒的致病致死機(jī)理還不很清楚。比較贊同的觀點(diǎn)是:流感病毒通過(guò)其表面的HA蛋白與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部快速?gòu)?fù)制，從而導(dǎo)致了宿主細(xì)胞凋亡，進(jìn)而器官衰竭，最后導(dǎo)致宿主死亡。不過(guò)近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，即使使用抗流感病毒藥物有效抑制了流感病毒的復(fù)制后，宿主的死亡率并沒(méi)有明顯下降。這就提示流感病毒的致病致死機(jī)理可能還有其他尚未發(fā)現(xiàn)的途徑。目前，NSl被證實(shí)能夠協(xié)助H5N1逃避人體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用，NSl作為干擾素和腫瘤壞死因子的拮抗物，可以調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫，并在病毒復(fù)制、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是流感病毒一個(gè)主要的毒力因子。
[0006]本發(fā)明以NSl作為研究靶點(diǎn)，通過(guò)對(duì)NSl基因的克隆、原核和真核載體的構(gòu)建，重組蛋白的表達(dá)、純化和鑒定，制備NSl抗體，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)診斷NSl的ELISA檢測(cè)試劑盒做準(zhǔn)備，為進(jìn)一步深入研究流感病毒致病的分子機(jī)制以及研發(fā)治療H5N1感染的NSl功能抑制劑奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體，本多克隆抗體效價(jià)高，能特異性的檢測(cè)人血清及其他體液中的NSl蛋白。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:` 一種基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體，所述H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.2所示，其對(duì)應(yīng)的DNA序列如序列表中SEQ IDN0.1所示。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供所述多克隆抗體的制備方法，本方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0010]為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
一種基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟: (OH5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的制備
以H5N1亞型禽流感病毒核酸鏈為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得含有完整H5N1亞型禽流感病毒NSl基因開(kāi)放閱讀框的目的片段，并克隆于表達(dá)載體中得重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后誘導(dǎo)表達(dá)并純化，獲得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白；
(2)動(dòng)物免疫
用步驟I所得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白免疫新西蘭大白兔，取血，得抗血清；
(3)多克隆抗體的獲得
分離并提純步驟2所得抗血清IgG，得多克隆抗體。
[0011 ] 進(jìn)一步地，在步驟(1)中，提取H5N1亞型禽流感病毒核酸基因組，以H5N1亞型禽流感病毒核酸鏈為模板，以如序列表中SEQ ID N0.3所示的上游引物和序列表中SEQ ID N0.4所示的下游引物通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增獲得含有完整H5N1亞型禽流感病毒NSl基因ORF的目的片段，并克隆于大腸桿菌原核表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主細(xì)胞后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)蛋白柱純化，獲得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白。
[0012]進(jìn)一步地，在步驟(2)中，用所得的H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔,測(cè)血清效價(jià)并取血,得抗血清。
[0013]進(jìn)一步地，在步驟(3)中，通過(guò)蛋白純化柱對(duì)步驟(1)所得抗血清IgG進(jìn)行提取和純化，得多克隆抗體。
[0014]本發(fā)明的目的之三是提供一種基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體的應(yīng)用，該多克隆抗體能應(yīng)用于檢測(cè)H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白，且特異性高。 [0015]為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
上述基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體在制備禽流感病毒檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0016]進(jìn)一步，基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體在制備禽流感H5N1病毒間接免疫熒光檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:本多克隆抗體效價(jià)高、特異性好，可以滿足H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的相關(guān)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)；其應(yīng)用包括免疫印跡(Western-blotting)、免疫熒光及ELISA試驗(yàn)等。本制備方法以原核表達(dá)載體pET-28a(+)為基礎(chǔ)所構(gòu)建的體外H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白表達(dá)系統(tǒng)能在大腸桿菌BL21 (DE3)中能高效地表達(dá)目的蛋白，進(jìn)一步純化用于免疫動(dòng)物，制得效價(jià)高特異性好的多克隆抗體，本方法操作簡(jiǎn)單，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為PCR獲得H5N1亞型禽流感病毒NSl基因的片斷。
[0019]圖2為重組質(zhì)粒pET-28a(+)_NSl的雙酶切鑒定結(jié)果。
[0020]圖3為重組蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0021]圖4為重組蛋白的western-blotting分析結(jié)果。
[0022]圖5為兔抗H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白純化結(jié)果。其中，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；Lanel:總菌體裂解液(OmM IPTG，3小時(shí)后，37°C ) ;Lane2:總菌體裂解液(ImM IPTG，3小時(shí)后，37°C) ;Lane3:誘導(dǎo)菌體超聲破碎上清液；Lane4:誘導(dǎo)菌體超聲沉淀8M Urea溶解上清(純化前樣品)；Lane5:NTA純化柱流穿；Lane6 =IOmM咪唑濃度洗脫液；Lane7:40mM咪唑濃度洗脫液；Lane8:80mM咪唑濃度洗脫液；Lane9 =IOOmM咪唑濃度洗脫液；LanelO:200mM咪唑濃度洗脫液；Lanell:300mM咪唑濃度洗脫液；Lanel2:400mM咪唑濃度洗脫液；Lanel3:500mM咪唑濃度洗脫液。
[0023]圖6為本發(fā)明的兔抗H5N1亞型禽流感病毒NSl抗體的效價(jià)分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。[0025]實(shí)施例1:禽流感H5N1基因的PCR擴(kuò)增
應(yīng)用Oiig0軟件設(shè)計(jì)引物，為了便于基因的克隆及構(gòu)建表達(dá)載體，同時(shí)參照原核表達(dá)載體pET-28a (+)的多克隆位點(diǎn)序列，分析NSl基因序列內(nèi)的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物(下劃線標(biāo)注為酶切位點(diǎn)):
Primer-Forward: 5’ -ccatggatggattccaacactgtgtc-3，
Primer-Reverse: 5’ -ctcgaggttaactcggtcttcaaaact-3，
Primer-Forward和Primer-Reverse分別為上游引物和下游引物，其5’端分別引入與質(zhì)粒載體相同的NcoI (ccatgg)和XhoI (ctcgag)酶切位點(diǎn)，經(jīng)Primer5.0軟件檢測(cè)，所設(shè)計(jì)的引物不含有自身互補(bǔ)序列，不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，兩引物間不形成引物二聚體。Primer-Forward和Primer-Reverse引物的跨幅為902bp,包含了完整的NSl基因片段(693bp);引物由寶生生物技術(shù)有限公司合成。合成后，以適量滅菌去離子水溶解，使其終濃度為 10mmol/L,-20 度保存。PCR 反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性 5min，95°C 30s, 58°C 30s, 72°C 60s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘結(jié)束。(圖1)
實(shí)施例2:原核表達(dá)載體pET-28a(+)-NSl表達(dá)載體的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)及重組鑒定
PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段，酶切，將酶切片段直接連接于pET-28a(+)載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌BL21 (DE3)，在Amp平板上挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行LB液體擴(kuò)大培養(yǎng)，抽取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定(圖2)。
[0026]將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)宿主菌，挑取單克隆接種到含有50ug/mlAmp的LB培養(yǎng)基中，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)2小時(shí)左右，當(dāng)0D600在0.4-0.6之間時(shí)，按終濃度ImM (mmol/L)加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)，離心收集菌體。沉淀中加入80ul超純水和20ul 5xSDS上樣緩沖液，100°C水浴加熱變性10分鐘，進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，觀察表達(dá)結(jié)果。重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)了約61kDa的融合蛋白。對(duì)照組沒(méi)有相應(yīng)條帶。(圖3)
Western-blotting分析:表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜(PVDF)上，用含有5% (w/v)脫脂奶粉的TBST 37°C緩慢搖動(dòng)溫育1.5小時(shí)封閉NC膜；然后加入含5% (w/v)脫脂奶粉的TBST 稀釋的兔抗NSl血清，同時(shí)設(shè)兔陰性血清對(duì)照組，370C緩慢搖動(dòng)溫育I小時(shí)；TBST洗滌膜3次，每次10分鐘；再加入含5%脫脂奶粉的TBST稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，37°C緩慢搖動(dòng)溫育I小時(shí)；TBST洗滌膜3次，每次10分鐘后，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行反應(yīng)，最后壓片，曝光，顯色，結(jié)果能觀察到特異性地反應(yīng)條帶。(圖4)
實(shí)施例3:重組蛋白的純化
挑取單菌落于IOmlLB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜后，轉(zhuǎn)接1%過(guò)夜菌于500mlLB培養(yǎng)基，37°C，250rpm培養(yǎng)3小時(shí)，然后加入ImM IPTG誘導(dǎo)5小時(shí)。離心收集500ml表達(dá)目標(biāo)蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)物，超聲破菌于20ml破菌緩沖液中，離心后分別收集沉淀和上清。將沉淀重懸于5mlNTA-0緩沖液中，離心取上清。將上清上樣于預(yù)先平衡好的NTA純化柱(10倍柱體積NTAU-O緩沖液平衡);樣品上樣完成以后，使用NATU-O緩沖液洗柱10個(gè)柱體積；順序使用 NATU-10, NATU-40, NATU-80, NATU-100, NATU-200, NATU-300, NATU-400 和 NATU-500緩沖液各洗柱I個(gè)柱體積。分步收集不同組分并電泳檢測(cè)，最終將含目的蛋白的組分混合在一起。(圖5)
實(shí)施例4:制備基于禽流感病毒H5N1抗原的多克隆抗體
(I)多克隆抗體制備
用PBS將蛋白稀釋為0.5mg/ml，每管1ml，分裝凍存于_20°C冰箱。第一天取Iml抗原加入Iml弗氏完全佐劑，乳化(檢驗(yàn)乳化程度:將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開(kāi)，表明已達(dá)到要求)，頸背部皮下多點(diǎn)(至少8點(diǎn))注射，免疫2只新西蘭大白兔。第15天，取Iml抗原加入Iml弗氏不完全佐劑，乳化(檢驗(yàn)乳化程度:將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開(kāi)，表明已達(dá)到要求)，頸背部皮下多點(diǎn)(至少8點(diǎn))注射，免疫2只新西蘭大白兔。第29天，取Iml抗原加入Iml弗氏不完全佐劑，乳化(檢驗(yàn)乳化程度:將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開(kāi)，表明已達(dá)到要求)，頸背部皮下多點(diǎn)(至少8點(diǎn))注射，免疫2只新西蘭白兔。第43天，取Iml抗原加入Iml弗氏不完全佐劑，乳化(檢驗(yàn)乳化程度:將一滴乳化抗原液滴入生理鹽水中，若不散開(kāi)，表明已達(dá)到要求)，頸背部皮下多點(diǎn)(至少8點(diǎn))注射，免疫2只新西蘭大白兔。第53天，頸動(dòng)脈取血，將兔子處死，兔血在4°C放置過(guò)夜，離心(4°C, 1000Orpm) 30分鐘，收集上清。
[0027]取出ProgeinA柱(柱體積5ml)，用25mlPBS平衡，待pbs流干后，血清上樣過(guò)柱，收集流穿；用25mlPBS平衡，流干后，加入25ml洗脫液，分管收集洗脫峰，每管Iml樣品，每管加入90ul IM Tris溶液(pH8.8)中和；加入25mlPBS平衡，流感后加入2ml的20%乙醇，4度保存柱子；將抗體洗脫液用PBS透析過(guò)夜，Elisa檢測(cè)效價(jià)，將含有航提的組分合并；合并后的抗體檢測(cè)蛋白濃度(紫外吸收法)及Elisa效價(jià)。
[0028](2)多克隆抗體效價(jià)、靈敏度及特異性檢測(cè) 包被:把蛋白用包被液稀釋成lug/ml, IOOul/孔加至酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；封閉，棄去包被液，自來(lái)水沖洗I遍，用封閉液封閉，每孔200ul，37°C放置1.5小時(shí)；加樣品，棄去封閉液，自來(lái)水沖洗I遍，將梯度稀釋的抗體加入酶標(biāo)板，lOOOul、孔，37°C放置I小時(shí)(空白兔抗體作為陰性對(duì)照);自來(lái)水沖洗10遍，拍干；加酶標(biāo)二抗，為酶標(biāo)羊抗兔IgG，用封閉液稀釋，IOOul/孔，37°C放置30分鐘；自來(lái)水沖洗10遍，拍干；加顯色液TMB,即用即配，IOOul/孔，37°C放置15分鐘；終止反應(yīng)，于各反應(yīng)孔中加入2M的硫酸，50ul/孔；酶標(biāo)儀讀數(shù)，450nm波長(zhǎng)測(cè)定。(圖6)
制得的基于H5N1亞型禽流感病毒的NSl蛋白多克隆抗體具有效價(jià)高、特異性好的特點(diǎn)，可以滿足H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的相關(guān)檢測(cè)試驗(yàn)，并能在試驗(yàn)中檢測(cè)出H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白，相關(guān)檢測(cè)試驗(yàn)包括免疫印跡(Western-blotting)、免疫熒光及ELISA試驗(yàn)等。
[0029]最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體，其特征在于:所述H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白具有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，其對(duì)應(yīng)的DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
2.基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于:所述制備方法包括以下步驟: (OH5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白制備 以H5N1亞型禽流感病毒核酸鏈為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得含有完整NSl基因開(kāi)放閱讀框的目的片段，并克隆于表達(dá)載體中，得重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后誘導(dǎo)表達(dá)并純化，獲得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白； (2)動(dòng)物免疫 用步驟(1)所得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白免疫動(dòng)物，取血，得抗血清； (3)多克隆抗體的獲得 分離并提純步驟(2)所得抗血清NS1，得多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，提取H5N1亞型禽流感病毒核酸鏈為模板，以如SEQ ID N0.3所示的上游引物和SEQ ID N0.4所示的下游引物通過(guò)PCR方法擴(kuò)增獲得含有完整NSl基因ORF的目的片段，并克隆于大腸桿菌原核表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主細(xì)胞后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)蛋白柱純化，獲得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，用所得H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔，測(cè)血清效價(jià)并取血，得抗血`清。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，通過(guò)蛋白純化柱對(duì)步驟(1)所得抗血清IgG進(jìn)行提取和純化，得多克隆抗體。
6.如權(quán)利要求1所述的基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體在制備禽流感病毒檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的基于H5N1亞型禽流感病毒NSl蛋白多克隆抗體在制備禽流感病毒檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述多克隆抗體在制備禽流感H5N1病毒間接免疫熒光檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103755803SQ201310514317
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】蔣培余, 戴利成, 黃惠蓮 申請(qǐng)人:湖州師范學(xué)院