由干細(xì)胞分化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明在由干細(xì)胞分化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的方法中，通過(guò)特征為將干細(xì)胞在抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)的存在下進(jìn)行向心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)的該方法，提供高效而且有選擇性地對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)的方法。
【專利說(shuō)明】由干細(xì)胞分化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的方法
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2004年10月4日的申請(qǐng)?zhí)枮?00480028917.7 (PCT /JP2004 / 014598)的專利申請(qǐng)“由干細(xì)胞分化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的方法”的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及由ES細(xì)胞等多能性干細(xì)胞選擇性地且高效率地制備心肌細(xì)胞的方法，以及通過(guò)該方法得到的再生醫(yī)療用細(xì)胞。
【背景技術(shù)】 [0003]一般來(lái)說(shuō)，心肌細(xì)胞在出生前邊進(jìn)行自律搏動(dòng)，邊活躍地進(jìn)行細(xì)胞分裂，從剛出生后就喪失了其分裂能力，另外由于不具有未分化的前體細(xì)胞，所以因暴露于心肌梗塞或心肌炎等各種壓力下，一旦導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，喪失的心肌細(xì)胞不能補(bǔ)充。結(jié)果殘存心肌細(xì)胞通過(guò)代償性肥大雖然能夠維持心功能，但各種壓力仍持續(xù)存在，一旦超過(guò)其容許范圍，會(huì)進(jìn)一步誘使心肌細(xì)胞疲憊、死亡，表現(xiàn)出心肌功能低下(即，心力衰竭)的狀態(tài)。
[0004]以心力衰竭為首的心臟病已成在日本成為位居第二的死亡原因，其預(yù)后也非常差，心臟疾病患者的5年生存率為50%左右。因此，認(rèn)為治療效果好的心力衰竭治療法的開(kāi)發(fā)與醫(yī)療福利的巨大進(jìn)步以及醫(yī)療經(jīng)濟(jì)的改善緊密相關(guān)。作為心力衰竭治療藥，以往一直使用使心肌收縮力增加的洋地黃制劑或黃嘌呤制劑等強(qiáng)心劑，已知這些藥劑長(zhǎng)期服用，由于心肌能量的過(guò)度消耗，會(huì)使病情惡化。而最近，雖然使用可通過(guò)交感神經(jīng)系統(tǒng)或腎素-血管緊張素系統(tǒng)的亢進(jìn)來(lái)減輕過(guò)度的心臟負(fù)荷的β抑制劑和ACE阻礙藥進(jìn)行治療已經(jīng)成為主流，這些藥物不過(guò)是對(duì)癥的治療法，并不是可使受到傷害的心組織本身恢復(fù)的藥物。此外，心臟移植是對(duì)于重癥心力衰竭的根本治療法，但由于臟器提供者不足以及醫(yī)療倫理、患者肉體的、經(jīng)濟(jì)的負(fù)擔(dān)重等問(wèn)題，難以將本法作為一般的治療法經(jīng)常使用。
[0005]因此，認(rèn)為對(duì)衰弱的或喪失的心肌細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充性移植的方法對(duì)于心力衰竭的治療非常有用。事實(shí)上，在使用動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中，已知從胎兒取得未成熟的心肌細(xì)胞，將它移植到發(fā)育成熟心臟組織，移植細(xì)胞可作為心肌細(xì)胞起到有效作用(參照非專利文獻(xiàn)I)。然而，難以用該方法取得大量心肌細(xì)胞，從倫理觀點(diǎn)看，也難以應(yīng)用到臨床醫(yī)療。
[0006]因此，由未分化干細(xì)胞分化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，將該細(xì)胞作為移植用細(xì)胞而進(jìn)行利用的方法近年來(lái)特別引人注目。目前，由于尚未發(fā)現(xiàn)能明確鑒定為可作為在發(fā)育成熟心臟組織中能產(chǎn)生心肌細(xì)胞的前體細(xì)胞或干細(xì)胞的細(xì)胞集團(tuán)，為了實(shí)施上述方法，考慮使用更為未分化的而且具有多種細(xì)胞分化能力的多能性干細(xì)胞。
[0007]所謂多能性干細(xì)胞(pluripotent stem cells)被定義為通過(guò)體外培養(yǎng)仍保持未分化狀態(tài)，幾乎可進(jìn)行永久或長(zhǎng)期的細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)正常的核(染色體)型，在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有分化為三胚層(外胚層，中胚層和內(nèi)胚層)所有譜系細(xì)胞的能力的細(xì)胞?，F(xiàn)在，作為多能性干細(xì)胞，最熟知的有從初期胚分離的胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells:ES細(xì)胞)、從胎兒期的原始生殖細(xì)胞分離的胚胎生殖細(xì)胞(embryonic germ cells:EG細(xì)胞)以及從發(fā)育成熟骨髓分離的成人型多能性干細(xì)胞(multipotent adult progenitor cells:MAPC)3 種。
[0008] 特別是ES細(xì)胞以前就知道通過(guò)體外培養(yǎng)可以分化誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞。初期的研究幾乎都是使用來(lái)自小鼠的ES細(xì)胞進(jìn)行的。如果對(duì)ES細(xì)胞在單一細(xì)胞狀態(tài)(通過(guò)實(shí)施酶處理等，細(xì)胞之間沒(méi)有粘附的各個(gè)細(xì)胞分散的狀態(tài))下，在沒(méi)有白血病抑制因子(leukemiainhibitory factor:LIF)等分化抑制因子存在下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，ES細(xì)胞彼此粘附、凝集，形成稱為胚狀體(embryoid body:EB)的類似初期胚的結(jié)構(gòu)體。已知然后，通過(guò)以懸浮狀態(tài)或粘附狀態(tài)培養(yǎng)EB，出現(xiàn)了具有自發(fā)搏動(dòng)性的心肌細(xì)胞。
[0009]上述那樣制備的來(lái)自ES細(xì)胞的心肌細(xì)胞呈現(xiàn)出與來(lái)自胎兒心臟的未成熟心肌細(xì)胞非常類似的特性(參照非專利文獻(xiàn)2，3)。此外，實(shí)際上，有將來(lái)自ES細(xì)胞的心肌細(xì)胞移植到發(fā)育成熟心臟組織的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)例中，幾乎與移植了胎兒心肌的例子沒(méi)有變化，也確認(rèn)表現(xiàn)出極高的有效性(參照專利文獻(xiàn)1，非專利文獻(xiàn)4)。
[0010]1995年，Thomson等人首次通過(guò)由靈長(zhǎng)類建立ES細(xì)胞，使用來(lái)自多能性干細(xì)胞的心肌細(xì)胞的心肌再生治療法的實(shí)際應(yīng)用成為可能(參照專利文獻(xiàn)2，非專利文獻(xiàn)5)。接下來(lái)他們還成功地實(shí)現(xiàn)了從人初期胚分離、建立人ES細(xì)胞株(參照非專利文獻(xiàn)6)。另外，Gearhart等人也由人原始生殖細(xì)胞建立了 hEG細(xì)胞株(參照非專利文獻(xiàn)7,專利文獻(xiàn)3)。
[0011]Kehat等人(參照非專利文獻(xiàn)8)以及Chunhui等人(參照專利文獻(xiàn)4,非專利文獻(xiàn)9)報(bào)告了與小鼠ES細(xì)胞同樣，也可以由人ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞。如果根據(jù)這些報(bào)告，不用說(shuō)由人ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具有自發(fā)搏動(dòng)能力，在表達(dá)、產(chǎn)生肌球蛋白重鏈/輕鏈和α -輔肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白1、心房性利尿肽(artial natriuretic peptide ；ANP)等心肌特異性蛋白質(zhì)、GATA-4或Nkx2.5、MEF_2c等心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子的同時(shí)，微細(xì)解剖學(xué)的觀察以及電生理學(xué)的解析也表明保持著胎兒期的未成熟心肌細(xì)胞的特性，預(yù)期可用于再生醫(yī)療。
[0012]另外，作為將來(lái)自多能性干細(xì)胞的心肌細(xì)胞用于細(xì)胞移植治療或其它目的時(shí)的重要問(wèn)題，例如:使用以往方法由ES細(xì)胞或EG細(xì)胞形成的EB除了發(fā)育為心肌細(xì)胞以外，還可發(fā)育為包括血細(xì)胞、或血管細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腸細(xì)胞、骨/軟骨細(xì)胞等在內(nèi)的其它種類的細(xì)胞。另外，在這些分化的細(xì)胞中，心肌細(xì)胞所占比例不太高，只不過(guò)為整體的5~20%左右。
[0013]作為從混有其它種類細(xì)胞的細(xì)胞溶液中有選擇性地只挑選心肌細(xì)胞的方法，例如，通過(guò)對(duì)ES細(xì)胞的基因進(jìn)行人為修飾,賦予耐藥性或異地表達(dá)(ectopic expression)能力，回收心肌細(xì)胞或具有作為其前體細(xì)胞特性的細(xì)胞的方法。例如，F(xiàn)ield以及共同研究者等構(gòu)建了通過(guò)將在α型肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子調(diào)控下，可表達(dá)新霉素(G418)耐性基因的基因序列組導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞，只在該ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，并伴隨分化進(jìn)行α型肌球蛋白重鏈基因表達(dá)時(shí)，可在添加了 G418的培養(yǎng)基中存活的體系(參照專利文獻(xiàn)1，非專利文獻(xiàn)4)。通過(guò)該方法作為G418耐性細(xì)胞挑選的細(xì)胞以99%以上的概率確認(rèn)是心肌細(xì)胞。然而，使用該方法，雖然心肌細(xì)胞的純度非常高，但最終得到的心肌細(xì)胞數(shù)不過(guò)為全細(xì)胞數(shù)的百分之幾程度，不容易獲得移植治療所必需的心肌細(xì)胞。
[0014]最近，Chunhui等人報(bào)告了通過(guò)用5-氮雜胞(嘧啶核)苷對(duì)人ES細(xì)胞進(jìn)行處理，EB中的肌鈣蛋白I陽(yáng)性(心肌)細(xì)胞由15%增加到44% (參照非專利文獻(xiàn)9)，在該方法中，心肌細(xì)胞所占比例沒(méi)有超過(guò)EB中的50 %。另外，脫甲基化劑5-氮雜胞(嘧啶核)苷是通過(guò)使與DNA結(jié)合的甲基脫掉，使基因的表達(dá)狀態(tài)變化的藥劑，由于藥劑直接作用于染色體，所以不合適作為制備移植用細(xì)胞的藥劑。
[0015]另外，作為使由ES細(xì)胞更高效率地產(chǎn)生心肌細(xì)胞的方法，已知例如，在小鼠ES細(xì)胞中添加視黃酸(參照非專利文獻(xiàn)10)或抗壞血酸(參照非專利文獻(xiàn)11)、TGF0、BMP-2(參照非專利文獻(xiàn)12)，H)GF (參照非專利文獻(xiàn)13) ,Dynorphin B (參照非專利文獻(xiàn)14)、或使細(xì)胞內(nèi)的活性氧類(reactive oxigen species:R0S)(參照非專利文獻(xiàn)15)和Ca2+(參照非專利文獻(xiàn)16)增加的處理可起到促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用。然而，無(wú)論使用那一種方法，心肌細(xì)胞特異的或有選擇性的分化誘導(dǎo)都尚未成功。 [0016]分泌性蛋白質(zhì)頭蛋白(Noggin)和索蛋白(Chordin)當(dāng)初作為非洲爪蟾胚中的神經(jīng)誘導(dǎo)因子被鑒定(參照非專利文獻(xiàn)17，18，專利文獻(xiàn)5~8)。已報(bào)道通過(guò)其后的研究，頭蛋白和索蛋白通過(guò)與具有抑制神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、分化效果的BMP(Bone MorphogenicProtein ;骨形成因子)家族分子結(jié)合，阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)，表現(xiàn)出神經(jīng)誘導(dǎo)效果(參照非專利文獻(xiàn)19~21)。實(shí)際上，即使在使用小鼠ES細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，也表明通過(guò)對(duì)頭蛋白基因或索蛋白基因進(jìn)行恒定表達(dá)，可誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞的分化(參照非專利文獻(xiàn)22)。
[0017]另外，據(jù)報(bào)道如果將人ES細(xì)胞用添加頭蛋白的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)抑制ES細(xì)胞內(nèi)因性產(chǎn)生的BMP-2的作用，ES細(xì)胞向胚體外內(nèi)胚層細(xì)胞的分化被抑制，在ES細(xì)胞保持未分化狀態(tài)的同時(shí)，通過(guò)繼續(xù)在神經(jīng)分化培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，可促進(jìn)向神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)(參照專利文獻(xiàn)9)。
[0018]另外，據(jù)報(bào)道在使用雞胚(參照非專利文獻(xiàn)23)，非洲爪蟾胚(參照非專利文獻(xiàn)24)或小鼠胚胎癌細(xì)胞(參照非專利文獻(xiàn)25)的以往的解析中，對(duì)于心肌細(xì)胞的發(fā)育和/或分化，BMP家族分子起著促進(jìn)作用，如果通過(guò)頭蛋白刺激阻礙其作用，心肌細(xì)胞的發(fā)育和/或分化也就被抑制了。
[0019]因此，通過(guò)利用頭蛋白、或索蛋白或其它BMP信號(hào)抑制因子，促進(jìn)心肌細(xì)胞發(fā)育、分化的嘗試到目前為止完全沒(méi)有。
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[0021]【專利文獻(xiàn)2】美國(guó)專利第5843780號(hào)說(shuō)明書
[0022]【專利文獻(xiàn)3】美國(guó)專利第6090622號(hào)說(shuō)明書
[0023]【專利文獻(xiàn)4】國(guó)際專利公開(kāi)第03/ 06950號(hào)小冊(cè)子
[0024]【專利文獻(xiàn)5】國(guó)際專利公開(kāi)第94/ 05791號(hào)小冊(cè)子
[0025]【專利文獻(xiàn)6】美國(guó)專利第5，679，783號(hào)說(shuō)明書
[0026]【專利文獻(xiàn)7】美國(guó)專利第5，846，770號(hào)說(shuō)明書
[0027]【專利文獻(xiàn)8】美國(guó)專利第5，986，056號(hào)說(shuō)明書
[0028]【專利文獻(xiàn)9】國(guó)際專利公開(kāi)第01/ 98463號(hào)小冊(cè)子
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0054]【發(fā)明要解決的課題】
[0055]本發(fā)明以提供將未分化的干細(xì)胞高效率而且有選擇性地分化誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞的方法，通過(guò)該方法得到的心肌細(xì)胞和將該細(xì)胞進(jìn)行以心臟病為靶的細(xì)胞移植、注入以及在其它治療中使用的方法等作為課題。
[0056]【用于解決課題的手段】
[0057]本發(fā)明主要涉及到以下內(nèi)容。
[0058](I)由干細(xì)胞分化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的方法，其特征是在抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)存在下，對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)的培養(yǎng)。
[0059](2)上述⑴所述的方法，其中，用于分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞的培養(yǎng)包括進(jìn)行懸浮凝集培養(yǎng)、使胚狀體形成的工序。
[0060](3)上述⑴所述的方法，其中，包括用于分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞的培養(yǎng)與飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)的工序。
[0061](4)上述(I)所述的方法，其中，包括用于分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞的培養(yǎng)在培養(yǎng)容器上進(jìn)行平面培養(yǎng)的工序。
[0062](5)上述⑴~(4)任一項(xiàng)所述的方法，其中，只在分化誘導(dǎo)期的最初數(shù)日內(nèi)添加抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)。
[0063](6)上述(I)~(4)任一項(xiàng)所述的方法，其中，包括預(yù)先用抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)對(duì)分化誘導(dǎo)期前的干細(xì)胞進(jìn)行處理的工序。
[0064](7)上述(I)~⑷任一項(xiàng)所述的方法，其中，包括預(yù)先用抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)對(duì)分化誘導(dǎo)期前的干細(xì)胞進(jìn)行處理的工序，而且只在分化誘導(dǎo)期的最初數(shù)日內(nèi)添加抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)。
[0065](8)上述⑴~(7)任一項(xiàng)所述的方法，其中，抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)是BMP拮抗劑。
[0066](9)上述⑶所述的方法，其中，BMP拮抗劑是從頭蛋白、索蛋白、胎球蛋白、抑濾泡素、sclerostin、DAN、Cerberus、gremlin、和Dante,以及它們的相關(guān)蛋白質(zhì)中選出的I個(gè)或多個(gè)。
[0067](10)上述(1)~(9)任一項(xiàng)所述的方法，其中，干細(xì)胞是具有在試管內(nèi)培養(yǎng)下可向心肌細(xì)胞分化能力的來(lái)自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。
[0068](11)上述(10)所述的方法，其中，具有可向心肌細(xì)胞分化能力的來(lái)自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞是多能性干細(xì)胞或來(lái)自該細(xì)胞的細(xì)胞。
[0069](12)上述(11)所述的方法，其中，多能性干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞、具有類似于胚胎干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞或成人型多能性干細(xì)胞。
[0070](13)上述(12)所述的方法，其中，多能性干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
[0071](14)上述⑴~(13)所述的方法，其中，干細(xì)胞來(lái)自人。
[0072](15)包括上述(1)~(14)任一項(xiàng)所述的方法的心肌細(xì)胞制造方法。
[0073](16)通過(guò)上述(1)~(14)任一項(xiàng)所述的方法得到的心肌細(xì)胞。
[0074](17)心臟病的治療方法，是在起因于心肌細(xì)胞衰弱、功能停止或死亡的心臟病治療方法中，將上述(16)所述的心肌細(xì)胞投給(移植)到心肌細(xì)胞衰弱、功能停止或死亡的部位或其周邊。
[0075](18)篩選方法，是在起因于心肌細(xì)胞衰弱、功能停止或死亡的心臟病治療方法中，使測(cè)試物質(zhì)與上述(16)所述的心肌細(xì)胞接觸，對(duì)該細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化效率或其細(xì)胞功能的質(zhì)的或量的變化進(jìn)行測(cè)定。
[0076](19)起因于心肌細(xì)胞衰弱、功能停止或死亡的心臟病治療用的醫(yī)藥組合物或支持體，作為有效成分含有上述(16)所述的心肌細(xì)胞。
[0077]本發(fā)明人等就使用多能性干細(xì)胞，特別是最頻繁使用的ES細(xì)胞作為制備心肌細(xì)胞的干細(xì)胞源，向心肌細(xì)胞或其前體細(xì)胞的分化誘導(dǎo)條件不斷進(jìn)行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)在培養(yǎng)時(shí)的某一期間，向培養(yǎng)基中添加抑制骨形成因子(Bone Morphogenic Protein ；BMP)信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)，被證實(shí)為具有搏動(dòng)能力的心肌細(xì)胞的細(xì)胞比以往方法更有選擇性、而且更有效發(fā)育，另外還發(fā)現(xiàn)如添加過(guò)量的BMP，通過(guò)抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)處理產(chǎn)生的心肌分化誘導(dǎo)效果明顯降低，結(jié)果表明BMP信號(hào)的抑制促進(jìn)誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，直至完成本發(fā)明。
[0078]在本發(fā)明中，所謂抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)指的是具有阻礙或阻斷BMP的信號(hào)傳導(dǎo)作用的物質(zhì)，例如，BMP拮抗劑或抗BMP家族分子的特異的中和抗體、可溶化型(細(xì)胞膜非結(jié)合型)BMP受體分子等。另外的例子，如抑制或停止BMP家族分子或其受體基因的功能性基因產(chǎn)物的表達(dá)、或抑制或停止規(guī)定BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的反式激活(作用)性成分的基因表達(dá)的基因表達(dá)載體、特異的反義寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反義RNA、低分子化合物等。
[0079]通過(guò)本發(fā)明的方法由多能性干細(xì)胞制備的搏動(dòng)性細(xì)胞是具有“心肌細(xì)胞”特征的細(xì)胞，可以確認(rèn)例如GATA- 4，TEF-1，Tbx-5，MEF2和MLC_2v等心肌特異的轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)以及作為心肌特異標(biāo)志的肌節(jié)/肌球蛋白、肌鈣蛋白1、α-輔肌動(dòng)蛋白、ANP等蛋白表達(dá)。
[0080]另外，在本發(fā)明中，作為多能性干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)法，不僅一般常用的懸浮凝集培養(yǎng)法，而且懸滴(hanging drop)培養(yǎng)法以及使用飼養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)法中的任一種方法也都可得到同樣的效果。
[0081]另外，在研究抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)的添加時(shí)期和期間時(shí)，使多能性干細(xì)胞分散為由單一細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞塊，通過(guò)懸浮凝集培養(yǎng)或與飼養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)等方法誘導(dǎo)分化時(shí)，如果預(yù)先將多能性干細(xì)胞用BMP拮抗劑進(jìn)行預(yù)處理、或只是在剛開(kāi)始進(jìn)行分化誘導(dǎo)培養(yǎng)后數(shù)日間添加、或?qū)烧呓M合更有效。而當(dāng)在與懸浮細(xì)胞或飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)等實(shí)施期間使BMP拮抗劑恒定存在時(shí)，顯示由多能性干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)效率非常低下。
[0082]即，本發(fā)明涉及以在抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)的短暫刺激下進(jìn)行培養(yǎng)為特征的將多能性干細(xì)胞分化誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞的方法和制備心肌細(xì)胞的方法。
[0083]本發(fā)明中所謂具有心肌分化能力的干細(xì)胞指的是在試管內(nèi)培養(yǎng)下具有可向心肌細(xì)胞分化能力的細(xì)胞，例如，多能性干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、CMG細(xì)胞和SPoC細(xì)胞等。而所謂多能性干細(xì)胞指的是通過(guò)試管內(nèi)培養(yǎng)仍保持未分化狀態(tài)，幾乎可進(jìn)行持續(xù)不斷的或長(zhǎng)期間的細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)正常的核(染色體)型，在適當(dāng)條件下具有分化為三胚層(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)所有譜系細(xì)胞的能力的細(xì)胞，例如，ES細(xì)胞、ES類似細(xì)胞、EG細(xì)胞和MAPC等。
[0084]在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及到通過(guò)分化誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞制備的表現(xiàn)出心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和/或免疫學(xué)上特征的細(xì)胞。對(duì)生理學(xué)和/或免疫學(xué)的特征雖然沒(méi)有特別限定，但利用本發(fā)明方法制備的細(xì)胞能表達(dá)對(duì)于被識(shí)別為心肌細(xì)胞的心肌細(xì)胞特異的I個(gè)或I個(gè)以上的標(biāo)志即可。
[0085]本發(fā)明涉及到為了鑒定可促進(jìn)心肌細(xì)胞發(fā)育以及分化誘導(dǎo)、再生、存活等的新的因子或可能的化學(xué)治療劑，使用通過(guò)本發(fā)明方法制備的細(xì)胞的篩選方法。
[0086]本發(fā)明還涉及到用于將多能性干細(xì)胞分化誘導(dǎo)為具有心肌前體細(xì)胞或心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和/或免疫學(xué)特征的細(xì)胞的試劑盒。這樣的試劑盒對(duì)于實(shí)施本發(fā)明的方法有用。
[0087]在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及到以使用本發(fā)明方法制備的細(xì)胞為特征的治療處于心臟病狀態(tài)的心臟的方法以及以用本發(fā)明方法制備的細(xì)胞作為有效成分的心臟病治療藥。
[0088]本發(fā)明這些優(yōu)點(diǎn)以及其它優(yōu)點(diǎn)和特征在以下適合的實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明中進(jìn)行了充分描述。
[0089]另外，在本發(fā)明的實(shí)施中，有關(guān)使用多能性干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)育、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一般方法，實(shí)施者可參照該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考書籍。其中包括Guide to Techniquesin Mouse Development (Wasserman等人編，Academic Press, 1993) ；Embryonic Stem CellDifferent iation in vitro(Μ.V.Wiles, Meth.Enzymol.,225:900,1993) !Manipulatingthe Mouse Embryo:A laboratory manual (Hogan等人編，Cold SpringHarbor LaborayoryPress, 1994) ；Embryonic Stem Cells (Turksen 編，Humana Press, 2002)。在本說(shuō)明書中可參照的用于細(xì)胞培養(yǎng)、發(fā)育和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的試劑和試劑盒類可以從Invitrogen /GIBCO公司或Sigma公司等銷售商買到。
[0090]發(fā)明的效果
[0091]通過(guò)使用本發(fā)明方法，可以由干細(xì)胞有效且有選擇性地生產(chǎn)心肌前體細(xì)胞和心肌細(xì)胞。這樣制備的心肌(前體)細(xì)胞可在對(duì)心臟病治療有效的藥劑的探索、開(kāi)發(fā)中利用的同時(shí)，還有可能適用于對(duì)嚴(yán)重心臟病的心肌移植治療。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0092]【圖1A】在使用懸浮培養(yǎng)法的ES細(xì)胞(EB3)的心肌分化誘導(dǎo)系中，頭蛋白(500ng / mL)的添加對(duì)搏動(dòng)性EB出現(xiàn)的影響。
[0093]【圖1B】在使用懸滴培養(yǎng)法的ES細(xì)胞(EB3)的心肌分化誘導(dǎo)系中，頭蛋白(500ng / mL)的添加對(duì)搏動(dòng)性EB出現(xiàn)的影響。
[0094]【圖2】頭蛋白添加濃度不同對(duì)搏動(dòng)性EB出現(xiàn)率的影響。算出由ES細(xì)胞(EB3細(xì)胞和Rl細(xì)胞)形成EB，懸浮培養(yǎng)后第10日的搏動(dòng)性EB的出現(xiàn)率。
[0095]【圖3】頭蛋白添加對(duì)心肌特異標(biāo)志基因表達(dá)的影響。在懸浮培養(yǎng)后第0、5、10、15日后回收EB(來(lái)自EB3細(xì)胞)，研究各基因的表達(dá)。TEF-1:轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子-1 (transcri ptionenhancer factor-1), MEF_2c:肌肉增強(qiáng)因子-2c (muscle enhancement factor-2c)，a -MHC: a -肌球蛋白重鏈(a -myosin heavy chain)，MLC_2v:肌球蛋白輕鏈 ~2v (myosinlight chain-2v)，GAPDH:甘油醒-3-憐酸脫氫酶(glycera ldehyde-3-phosphatedehydrogenase)
[0096]【圖4】對(duì)從懸浮培養(yǎng) 后第10日的頭蛋白⑴組EB(來(lái)自EB3細(xì)胞)分離、回收的心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的結(jié)果。a:肌原纖維節(jié)和肌球蛋白，b:肌鈣蛋白I，c: α -輔肌動(dòng)蛋白，d =ANP
[0097]【圖5】對(duì)懸浮培養(yǎng)后第10日的頭蛋白⑴組和頭蛋白㈠組EB(來(lái)自EB3細(xì)胞)內(nèi)的心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的結(jié)果。a、b:肌原纖維節(jié)和肌球蛋白，C、d:肌鈣蛋白I，e、f:α-輔肌動(dòng)蛋白，g、h:ΑΝΡ
[0098]【圖6】ΒΜΡ對(duì)頭蛋白的心肌分化誘導(dǎo)作用的阻礙效果。
[0099]【圖7Α】頭蛋白處理在使用飼養(yǎng)細(xì)胞的心肌分化誘導(dǎo)系中的效果。將ES細(xì)胞(Rl)接種在ST2飼養(yǎng)細(xì)胞上，研究其心肌分化。在接種第8日使用抗肌原纖維節(jié)和肌球蛋白抗體(MF20)的染色照片。η>5。※:對(duì)頭蛋白(_)組ρ〈0.01
[0100]【圖7Β】頭蛋白處理在使用飼養(yǎng)細(xì)胞的心肌分化誘導(dǎo)系中的效果。將ES細(xì)胞(Rl)接種到ST2飼養(yǎng)細(xì)胞上，研究其心肌分化。在接種第8日的MF20陽(yáng)性集落的出現(xiàn)率。η>5。^:對(duì)頭蛋白(-)組p〈0.01
[0101]【圖7C】頭蛋白處理在使用飼養(yǎng)細(xì)胞的心肌分化誘導(dǎo)系中的效果。將ES細(xì)胞(Rl)接種到ST2飼養(yǎng)細(xì)胞上，研究其心肌分化。接種第12日的搏動(dòng)性集落的出現(xiàn)率。η>5。※:對(duì)頭蛋白(-)組Ρ〈0.01
[0102]【圖8】在使用懸滴培養(yǎng)法的ES細(xì)胞(Rl)的心肌分化誘導(dǎo)系中，索蛋白(500ng/mL)的添加對(duì)搏動(dòng)性EB出現(xiàn)的影響與添加頭蛋白(500ng / mL)時(shí)比較的結(jié)果。培養(yǎng)天數(shù)為開(kāi)始懸滴培養(yǎng)之后的天數(shù)。n=8?！?對(duì)未添加組(_)，p〈0.01
[0103]【圖9】在使用懸浮培養(yǎng)法的ES細(xì)胞(Rl)的心肌分化誘導(dǎo)系中，索蛋白(500ng/mL)的添加對(duì)搏動(dòng)性EB出現(xiàn)的影響。C:添加索蛋白，N:添加頭蛋白(150ng / mL)，(-):沒(méi)有添加。將EB形成前的處理與EB形成后的處理用“預(yù)處理”一“后處理”表示形式表示。
[0104]【圖10】在使用懸浮培養(yǎng)法的ES細(xì)胞(Rl)的心肌分化誘導(dǎo)系中，各種BMP拮抗蛋白質(zhì)(各150ng / mL)的添加對(duì)搏動(dòng)性EB出現(xiàn)的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0105]本內(nèi)容中，所謂“心肌細(xì)胞”包括將來(lái)具有可成為功能性心肌細(xì)胞的能力的心肌前體細(xì)胞以及胎兒型心肌細(xì)胞、發(fā)育成熟型心肌細(xì)胞的所有分化階段的細(xì)胞，定義為通過(guò)以下所述的至少I個(gè)、最好是多個(gè)方法能夠確認(rèn)至少I個(gè)、最好是多個(gè)標(biāo)志或基準(zhǔn)的細(xì)胞。 [0106]心肌細(xì)胞中特異的各種標(biāo)志的表達(dá)可通過(guò)以往的生物化學(xué)或免疫化學(xué)的手法進(jìn)行檢測(cè)。該方法雖然沒(méi)有特別限定，但最好是使用免疫組織化學(xué)的染色法或免疫電泳法那樣的免疫化學(xué)的手法。在這些方法中，可以使用與心肌前體細(xì)胞或心肌細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)志特異的多克隆抗體或單克隆抗體。以各個(gè)特異的標(biāo)志作為靶的抗體已經(jīng)有商品銷售，容易使用。心肌前體細(xì)胞或心肌細(xì)胞中特異的標(biāo)志，例如肌球蛋白重鏈/輕鏈或α-輔肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白 1、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF_2c 等。
[0107]或者，心肌前體細(xì)胞或心肌細(xì)胞特異的標(biāo)志的表達(dá)通過(guò)稱之為利用逆轉(zhuǎn)錄酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)或雜交分析的用于對(duì)編碼任意標(biāo)志蛋白質(zhì)的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)、解析的以往經(jīng)常使用的分子生物學(xué)方法可以確認(rèn)，但對(duì)其手法沒(méi)有特別限制。編碼心肌前體細(xì)胞或心肌細(xì)胞中特異的標(biāo)志(例如，肌球蛋白重鏈/輕鏈和α-輔肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白
1、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c)蛋白質(zhì)的核酸序列已知，可利用基因庫(kù)(GenBank)那樣的公共數(shù)據(jù)庫(kù)，容易決定作為引物或探針使用的必需的特異標(biāo)志的序列。
[0108]另外，為了確認(rèn)多能性細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，也可進(jìn)一步使用生理學(xué)的基準(zhǔn)。即，來(lái)自多能性細(xì)胞的細(xì)胞具有自立的搏動(dòng)性以及表達(dá)各種離子通道，能夠?qū)﹄娚泶碳し磻?yīng)等都成為其有用的指標(biāo)。
[0109]作為本發(fā)明使用的多能性干細(xì)胞，可舉出已廣泛作為培養(yǎng)細(xì)胞使用的來(lái)自小鼠、猴、人等哺乳動(dòng)物的ES細(xì)胞、EG細(xì)胞、MAPC等，但不包括從人類胚胎分離的干細(xì)胞。作為來(lái)自小鼠ES細(xì)胞的具體例子，可舉出EB3細(xì)胞、E14細(xì)胞、D3細(xì)胞、CCE細(xì)胞、Rl細(xì)胞、129SV細(xì)胞、Jl細(xì)胞等。另外有關(guān)ES細(xì)胞、EG細(xì)胞、MAPC的制備、傳代、保存法已經(jīng)確立了標(biāo)準(zhǔn)的程序，實(shí)施者通過(guò)參照前面列舉的參考書籍以及很多參考文獻(xiàn)(Masui等人，Cell, 70:841，1992 ；Shamblott 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,95:13726,1998 ;美國(guó)專利第 6090622號(hào)Jiang等人，Nature，418 =41,2002 ;國(guó)際專利公開(kāi)01 / 11011)，能夠容易使用這些多能性干細(xì)胞。不過(guò)，不包含從人胚胎分離的干細(xì)胞。
[0110]另外，本發(fā)明中可以使用的細(xì)胞不限于上述3種，包括來(lái)自哺乳動(dòng)物的胚或胎兒、臍帶血、或發(fā)育成熟臟器或骨髓等發(fā)育成熟組織、血液等的所有多能性干細(xì)胞。不過(guò)，不包含從人胚胎分離的干細(xì)胞。作為具體例子，可舉出毛根鞘細(xì)胞或表皮細(xì)胞經(jīng)5-氮雜胞(嘧唳核)苷等藥劑處理后得到的干細(xì)胞(Sharda & Zahner,國(guó)際專利公開(kāi)第02 / 051980號(hào))或單核球細(xì)胞經(jīng)CR3 / 43抗體處理后得到的干細(xì)胞(Abul jadayel, Curr.Med.Res.0pinion, 19:355, 2003),以及來(lái)自發(fā)育成熟內(nèi)耳細(xì)胞的干細(xì)胞(Li等人，Nature Med.,Advance online pubIicat ion)等具有與ES細(xì)胞類似形態(tài)的干細(xì)胞。此時(shí)所謂的與ES細(xì)胞類似的形態(tài)可以相據(jù)ES細(xì)胞中具有特異的細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)來(lái)定義，例如ES細(xì)胞中特異的表面(抗原)標(biāo)志的存在、或ES細(xì)胞特異基因的表達(dá)、或具有畸胎瘤(teratoma)形成能力或具有嵌合小鼠形成能力。
[0111]另外，即使是不具有與ES細(xì)胞類似形態(tài)的細(xì)胞或不是多能性干細(xì)胞的細(xì)胞，只要是具有至少在試管內(nèi)培養(yǎng)下可分化為具有心肌細(xì)胞那樣形態(tài)的細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞，就可以使用本發(fā)明所述的方法。作為這樣細(xì)胞的例子，如來(lái)自于骨髓細(xì)胞的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bruder 等人，美國(guó)專利第 5736396 號(hào)；Pittenger 等人，Science, 284:143，1999)和 CMG 細(xì)胞(Makino 等人，J.Clin.1nvest.，103 =697,1999 ;國(guó)際專利公開(kāi)第 01 / 048151 號(hào))，來(lái)自肌肉組織的Spoc細(xì)胞(國(guó)際專利公開(kāi)第03 / 035382號(hào))。
[0112]在本發(fā)明中，作為由多能性干細(xì)胞制備心肌細(xì)胞的培養(yǎng)法，只要是適合心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)的方法，可以使用任一種方法，例如使用ES細(xì)胞時(shí)，可舉出懸浮凝集培養(yǎng)法、懸滴(hanging drop)培養(yǎng)法、與支持細(xì)胞的共培養(yǎng)法、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法、軟瓊脂培養(yǎng)法、微載體培養(yǎng)法等。作為具體方法的例子，例如使用懸浮凝集培養(yǎng)法時(shí)，將成為單一細(xì)胞狀態(tài)(通過(guò)實(shí)施酶消化等，細(xì)胞之間沒(méi)有粘連的各個(gè)細(xì)胞在液相中分散的狀態(tài))的ES細(xì)胞優(yōu)選按照濃度為10細(xì)胞/ mL~I X IO7細(xì)胞/ mL，更優(yōu)選100細(xì)胞/ mL~I X IO6細(xì)胞/ mL細(xì)胞密度那樣懸浮于培養(yǎng)基中，接種到培養(yǎng)板后，4~30日，優(yōu)選6~15日，于37°C、通5%的二氧化碳的CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)的方法。
[0113]而作為另外的實(shí)施方式，當(dāng)使用與支持細(xì)胞的共培養(yǎng)法時(shí)，作為支持細(xì)胞雖然沒(méi)有特別限定，優(yōu)選具有間充質(zhì)細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞，更優(yōu)選ST2細(xì)胞、0P9細(xì)胞、PA6細(xì)胞等具有骨髓基質(zhì)細(xì)胞那樣形態(tài)的細(xì)胞。通過(guò)對(duì)這些支持細(xì)胞進(jìn)行高密度培養(yǎng)、絲裂霉素C處理、或放射線照射等方法做成飼養(yǎng)層，然后以懸浮的單一細(xì)胞狀態(tài)將ES細(xì)胞接種于培養(yǎng)基，使ES細(xì)胞達(dá)到I細(xì)胞/ mL~IX IO6細(xì)胞/ mL、優(yōu)選100細(xì)胞/ mL~1父105細(xì)胞/ mL、更優(yōu)選I X IO3細(xì)胞/ mL~IX IO4 細(xì)胞/ mL細(xì)胞密度后，于37°C、通5%的二氧化碳的CO2條件下培養(yǎng)4~30日、優(yōu)選6~15日。
[0114]在本發(fā)明中，所謂抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)指的是具有阻礙或阻斷BMP的信號(hào)傳導(dǎo)的作用的物質(zhì)，例如，BMP拮抗劑或抗BMP家族分子的特異的中和抗體、可溶化型(非細(xì)胞膜結(jié)合型)BMP受體分子等。作為另外的例子，如抑制或停止BMP家族分子或其受體基因的功能性基因產(chǎn)物的表達(dá)、或抑制或停止規(guī)定BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的反式激活(作用)性成分的基因表達(dá)的基因表達(dá)載體、特異的反義寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反義RNA、低分子化合物等。
[0115]而所謂BMP拮抗劑被定義為與BMP家族分子(例如BMP-2、BMP-4、BMP-7等)結(jié)合、阻礙或抑制BMP分子與細(xì)胞表面上的BMP受體結(jié)合的物質(zhì)、或通過(guò)結(jié)合BMP受體引起B(yǎng)MP信號(hào)傳導(dǎo)的抑制或阻斷的物質(zhì)。作為本發(fā)明中優(yōu)選的BMP拮抗劑，例如，可舉出頭蛋白和索蛋白等，另外，如與該蛋白質(zhì)在氨基酸序列上具有80%以上、更優(yōu)選90%以上同源性，而且具有BMP拮抗劑活性的頭蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)或索蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)，另外通過(guò)由與編碼頭蛋白或索蛋白的堿基在嚴(yán)格條件(例如，2x SSC)進(jìn)行雜交的堿基編碼的頭蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)或索蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)也同樣包括在內(nèi)。
[0116]本發(fā)明以在短暫抑制BMP信號(hào)的物質(zhì)刺激下對(duì)多能性干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)為特征，作為該刺激方法雖然沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選如在培養(yǎng)基中添加純化重組蛋白質(zhì)的方法。此外，只要是表現(xiàn)出與將抑制BMP信號(hào)的物質(zhì)作為純化重組蛋白質(zhì)添加到培養(yǎng)基中的方法同樣效果的方法，可以使用任一種方法。例如，添加從生體組織提取、純化的頭蛋白等BMP拮抗劑的方法；將頭蛋白等BMP拮抗劑的基因表達(dá)載體導(dǎo)入多能性干細(xì)胞自身的方法；將頭蛋白等BMP拮抗劑基因表達(dá)載體導(dǎo)入支持細(xì)胞，該導(dǎo)入細(xì)胞作為共培養(yǎng)細(xì)胞使用的方法；或使用該導(dǎo)入細(xì)胞的培養(yǎng)上清等細(xì)胞產(chǎn)生物的方法等，任一種在培養(yǎng)基中添加了 BMP拮抗劑的實(shí)施方式都包括本發(fā)明的方法中。
[0117]在本發(fā)明的實(shí)施中，使用的抑制BMP信號(hào)的物質(zhì)的蛋白質(zhì)和基因優(yōu)選是來(lái)自與多能性干細(xì)胞來(lái)自種類同種的動(dòng)物的蛋白質(zhì)和基因，例如，用小鼠多能性干細(xì)胞實(shí)施本發(fā)明時(shí)，將小鼠的頭蛋白cDNA與免疫球蛋白恒定(Fe)區(qū)cDNA連接的融合基因?qū)胄∈蠹?xì)胞，使其表達(dá)制備的純化重組蛋白質(zhì)(Recombinant Mouse Noggin / Fe Chimera ；R & Dsystems公司，Genzyme Technology公司)在市場(chǎng)已有銷售,可以很容易用作為來(lái)自小鼠的頭蛋白。另外，也可以使用來(lái)自異種動(dòng)物的頭蛋白，將人的頭蛋白cDNA導(dǎo)入大腸桿菌，使其表達(dá)制備的純化重組蛋白質(zhì)(P印roTech公司銷售)作為代用。另外也可以使用來(lái)自豬、羊、馬、或鳥(niǎo)類(例如，雞等)、或兩棲類(例如，非洲爪蟾等)的頭蛋白。對(duì)于索蛋白和其它的BMP拮抗劑也同樣可以使用類似的蛋白質(zhì).另外，編碼這些因子的基因的堿基序列可利用美國(guó)Nationa 1 Center for Biotechno logy (NCB I)等公共的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以獲取、使用該基因的cDNA。例如，頭蛋白和索蛋白基因已經(jīng)通過(guò)人或小鼠鑒定，人的頭蛋白、小鼠的頭蛋白、人的索蛋白、以及小鼠的索蛋白的堿基序列已經(jīng)分別以access 登記號(hào):NM#005450、NM#008711、NM#073411、NM#009893 記錄在 NCBI 的數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0118]作為本發(fā)明的BMP拮抗劑，只要是與BMP家族分子(例如BMP-2、BMP-4、BMP-7等)結(jié)合，阻礙或抑制BMP分子與細(xì)胞表面上的BMP受體結(jié)合的物質(zhì)、或通過(guò)結(jié)合BMP受體，引起B(yǎng)MP信號(hào)傳導(dǎo)的抑制或阻斷的物質(zhì)就可以，作為典型例子，如頭蛋白(Re' em-Kalma等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,92:12141,1995 ;Zimmerman 等人，Cell,86:599,1996)、以及索蛋白(Piccolo 等人，Cell，86:589，1996 ;De Robertis 等人，美國(guó)專利第 5679783號(hào)；LaVallie等人，美國(guó)專利第5846770號(hào)；Lavallie等人，美國(guó)專利第5986056號(hào))。作為其它的BMP拮抗劑的具體例子，已知有抑濾泡素(follistatin)、胎球蛋白(fetuin)、sclerostin、以及屬于DAN / Serberus家族的分子等,作為該分子已知有DAN、cerberus、gremlin、Dante 等(Balemans & Hul,Dev.Biol.，250:231, 2002)?；蛘撸烊淮嬖诘?BMP 拮抗劑的合成或重組類似物也可用在實(shí)施本方法上。
[0119]另外在發(fā)明的實(shí)施中，作為處理多能性干細(xì)胞的方法，不限于只使用頭蛋白等BMP拮抗劑的方法，只要是產(chǎn)生與BMP拮抗劑同樣的效果，即引起B(yǎng)MP信號(hào)傳導(dǎo)抑制的方法都可以使用。作為引起B(yǎng)MP信號(hào)傳導(dǎo)抑制的方法的具體例子，可舉出使用抗BMP家族分子的特異的中和抗體的方法、使用可溶化型(非細(xì)胞膜結(jié)合型)BMP受體分子的方法等。其它的例子，可舉出將抑制或停止BMP家族分子或其受體基因的功能性基因產(chǎn)物的表達(dá)、或抑制或停止規(guī)定BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的反式激活(作用)性成分的基因表達(dá)的基因表達(dá)載體、特異的反義寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反義RNA、低分子化合物等導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法。
[0120]在本發(fā)明的實(shí)施中，對(duì)多能性干細(xì)胞使用抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)(例如，頭蛋白、索蛋白等的BMP拮抗劑)時(shí)，使這些因子作用的期間可以分為2個(gè)時(shí)期。即，使多能性干細(xì)胞分散為由單一細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞塊，進(jìn)行懸浮凝集培養(yǎng)或與支持細(xì)胞共培養(yǎng)等時(shí)刻的前和后，以下，將之前的時(shí)期稱為預(yù)處理期，后面的時(shí)期稱為分化誘導(dǎo)期。
[0121]對(duì)于預(yù)處理期的多能性干細(xì)胞，使抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)作用的期間優(yōu)選是分化誘導(dǎo)期開(kāi)始的前I~2日，優(yōu)選前3日以上。
[0122]另外，在預(yù)處理期，為了將ES細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)，最好是根據(jù)該ES細(xì)胞的動(dòng)物種類，在通常使用的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。即，對(duì)于小鼠ES細(xì)胞，最好是在培養(yǎng)基中添加100 ~10000U / mL,優(yōu)選 500 ~2000U / mL濃度的白血病抑制因子(Leukemia inhibitoryfactor:LIF)。
[0123]作為使抑制BMP的信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)作用的期間，不需要整個(gè)培養(yǎng)期間都使該物質(zhì)存在，例如，作為抑制BMP的信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)使用頭蛋白或索蛋白等的BMP拮抗劑時(shí)，在BMP拮抗劑以具有活性狀態(tài)存在的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)優(yōu)選在分化誘導(dǎo)期最初的5日以內(nèi)，更優(yōu)選3日以內(nèi)。但使抑制BMP的信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)作用的期間可以根據(jù)使用的細(xì)胞來(lái)自的動(dòng)物種類、使用的細(xì)胞株、使用的分化誘導(dǎo)以及使用的抑制BMP的信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)等條件不同來(lái)改變最適合的天數(shù)。
[0124]在本發(fā)明的實(shí)施中，作為抑制BMP信號(hào)的物質(zhì)使用BMP拮抗劑(例如，頭蛋白、索蛋白等)時(shí)，在將舊的培養(yǎng)基在無(wú)菌下除去后，最好用含有Ing / mL~2yg / ml,優(yōu)選5ng / mL~1000ng / mL,更優(yōu)選IOng / mL~500ng / mL濃度的頭蛋白、或用索蛋白的培養(yǎng)基取代，再繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)日。使用其它的抑制BMP信號(hào)的物質(zhì)時(shí)，可以根據(jù)物質(zhì)種類來(lái)變更為最適合的濃度后使用。
[0125]接下來(lái)，運(yùn)用上述方法從以ES細(xì)胞為首的多能性干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞通過(guò)使用公知方法中的細(xì)胞回收、分離、純化法，可以有效、且大量獲得高純度的心肌細(xì)胞。以下將這樣得到的心肌細(xì)胞稱之為根據(jù)本發(fā)明制備的心肌細(xì)胞。
[0126]心肌細(xì)胞的純化方法可以使用任一種已公知的細(xì)胞分離純化方法，作為具體例子，可舉出流式細(xì)胞儀、磁珠、淘篩法等根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)的方法(Monoc 1nalAnti bodies !principles and practice, Third Edition(Acad.Press,1993) ；AntibodyEngineering:APract ical Approach(IRL Press at Oxford Univers i ty Press,1996)以及通過(guò)使用蔗糖、Percoll等載體的密度梯度離心的細(xì)胞分級(jí)法。而作為其它的心肌細(xì)胞篩選法，可舉出在起始的ES細(xì)胞等多能性干細(xì)胞的基因上預(yù)先加上人為的修飾，通過(guò)賦予耐藥性或異地性蛋白質(zhì)的表達(dá)能力，回收具有作為心肌細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞的方法。例如，F(xiàn)ield和共同研究者通過(guò)將在α型肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子的調(diào)控下可表達(dá)新霉素(G418)耐性基因的基因序列組導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞，構(gòu)建了該ES細(xì)胞在添加了 G418培養(yǎng)基中可存活的體系，在該體系中ES細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞、同時(shí)僅伴隨著分化表達(dá)α型肌球蛋白重鏈基因，通過(guò)該方法以99%以上概率確認(rèn)選作G418耐性細(xì)胞的細(xì)胞是心肌細(xì)胞(美國(guó)專利第6015671 號(hào) J.Clin.1nvest.,98:216，1996)。
[0127]通過(guò)本發(fā)明制備的心肌細(xì)胞可用于各種生理活性物質(zhì)(例如，藥物)和功能未知的新的基因產(chǎn)物等藥理評(píng)價(jià)和活性評(píng)價(jià)。例如，可以用于與由ES細(xì)胞等多能性干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化調(diào)控有關(guān)的物質(zhì)或藥劑的篩選、或與心肌細(xì)胞的功能調(diào)解有關(guān)的物質(zhì)或藥劑的篩選、以及對(duì)心肌細(xì)胞有毒性或傷害性的物質(zhì)或藥劑的篩選。特別是目前現(xiàn)狀幾乎不存在人心肌細(xì)胞的篩選法，根據(jù)本發(fā)明制備的心肌細(xì)胞可成為用于實(shí)施該篩選法的有用的細(xì)胞源。在另外一種方式中，含有根據(jù)本發(fā)明制備的心肌細(xì)胞的評(píng)價(jià)試劑盒也可用于上述篩選。
[0128]作為供篩選的測(cè)試物質(zhì)，只要是可添加到培養(yǎng)系的物質(zhì)無(wú)論什么種類都可以，例如，低分子化合物、高分子化合物、有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)化合物、蛋白質(zhì)、肽、基因、病毒、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)液、微生物培養(yǎng)液等。作為將基因有效地導(dǎo)入培養(yǎng)系的方法，可舉出使用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等病毒載體添加到培養(yǎng)系的方法、或封入到脂質(zhì)體等人工的構(gòu)造物后添加到培養(yǎng)系的方法等。 [0129]可以通過(guò)測(cè)定由ES細(xì)胞等多能性干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)效率以及心肌細(xì)胞功能的質(zhì)的或量的變化進(jìn)行測(cè)試物質(zhì)的評(píng)價(jià)。例如，測(cè)試物質(zhì)的心肌分化誘導(dǎo)效率通過(guò)對(duì)使用本發(fā)明所述方法培養(yǎng)的多能性干細(xì)胞，在培養(yǎng)開(kāi)始后第5~15日，優(yōu)選第7~12日時(shí)候，利用生物化學(xué)的或免疫化學(xué)的手法對(duì)在心肌細(xì)胞中特異的各種標(biāo)志的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)而測(cè)定。作為生物化學(xué)的或免疫化學(xué)的手法沒(méi)有特別限定，最好是使用象免疫組織化學(xué)的染色法或免疫電泳動(dòng)法那樣的免疫化學(xué)的手法。在這些方法中，可以使用結(jié)合心肌細(xì)胞的標(biāo)志特異的多克隆抗體或單克隆抗體。以各個(gè)特異的標(biāo)志為靶的抗體有銷售商品，容易使用。心肌細(xì)胞中特異的標(biāo)志，例如肌球蛋白重鏈/輕鏈或α -輔肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白Ι、ΑΝΡ、GATA-4、Nkx2.5、MEF_2c 等。
[0130]另外，作為評(píng)價(jià)測(cè)試物質(zhì)的指標(biāo)的心肌細(xì)胞功能，可舉出心肌細(xì)胞的存活性作為一例。具體來(lái)說(shuō)，將通過(guò)本發(fā)明所述的方法制備的心肌細(xì)胞以合適的細(xì)胞密度接種到培養(yǎng)板，用不含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(凋亡)，而此時(shí)向培養(yǎng)基中添加適當(dāng)量的測(cè)試物質(zhì)，可以測(cè)定心肌細(xì)胞的存活率或死亡率。作為心肌細(xì)胞的存活率或死亡率的測(cè)定方法，可以使用以臺(tái)盼藍(lán)等色素?fù)饺胱鳛橹笜?biāo)通過(guò)肉眼觀察的方法，也可以使用以脫氫酶的活性(還原活性)作為指標(biāo)的方法，以及以凋亡細(xì)胞特異的半胱天冬酶活性或膜聯(lián)蛋白V的表達(dá)作為指標(biāo)的方法。利用該機(jī)制的試劑盒,作為S i gma公司和Clohetech公司、Promega公司等許多丁家的利用該機(jī)制的試劑盒都有銷售，可輕易使用。
[0131]通過(guò)這樣的篩選方法得到的物質(zhì)或藥劑由于具有心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用和功能調(diào)解作用，可作為例如心肌梗塞、局部缺血心臟病、充血性心力衰竭、肥大型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等心臟病予防藥或治療藥使用。這些化合物可以是新的化合物，也可以是眾所周知的化合物。
[0132]另外通過(guò)本發(fā)明制備的心肌細(xì)胞可作為心肌再生藥或心臟疾患治療藥使用。心臟病如心肌梗塞、局部缺血心臟病、充血性心力衰竭、肥大型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等。作為心肌再生藥或心臟疾患治療藥，只要是含有根據(jù)本發(fā)明制備的高純度心肌細(xì)胞的藥，加工成使細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基等水性載體、將細(xì)胞包埋于生體分解性基質(zhì)等支持體、或單層或多層心肌細(xì)胞層(Shimizu等人，Circ.Res.,90:e40, 2002)的形態(tài)等，無(wú)論什么樣形狀的藥都可以使用。
[0133]作為將上述治療藥輸送到損傷部位的方法，可舉出開(kāi)胸，用注射器直接注入心臟的方法、通過(guò)外科手術(shù)將心臟的一部切開(kāi)之后進(jìn)行移植的方法、以及通過(guò)使用導(dǎo)管通過(guò)血管的方法進(jìn)行移植的方法等(Murry 等人，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.,67:519,
2002；Menasche, Ann.Thorac.Surg.,75:S20, 2003 ；Dowell 等人，Cardiovasc.Res.,58:336，2003)，沒(méi)有特別限定。據(jù)報(bào)道通過(guò)這樣方法，將從胎兒心臟回收的心肌細(xì)胞移植到心臟損傷動(dòng)物的心臟，表現(xiàn)出非常好的治療效果(Menasche, Ann.Thorac.Surg.,75:S20,2003；ReffeImann 等人，Heart Fail.Rev.，8:201,2003)。來(lái)自 ES 細(xì)胞的的心肌細(xì)胞呈現(xiàn)出與來(lái)自胎兒心臟的心肌細(xì)胞非常類似的形態(tài)(MaltseV等人，Mech.Dev.,44 =41,1993 ；Circ.Res.,75:233，1994)。另外，還確認(rèn)實(shí)際上在將來(lái)自ES細(xì)胞的心肌細(xì)胞移植到發(fā)育成熟心臟的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)例中，與移植胎兒心肌的例子幾乎沒(méi)有什么變化，表現(xiàn)出非常高的生長(zhǎng)率(Klug等人，J.Clin.1nvest.,98:216，1996)。因此，在起因于心肌細(xì)胞的破壞以及脫落的上述心臟病中，通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的心肌細(xì)胞補(bǔ)充性地移植到病的心臟組織，預(yù)期可以促進(jìn)心臟功能的改善。
[0134]【實(shí)施例】
[0135]以下給出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，以下的實(shí)施例只不過(guò)是給出的本發(fā)明的示例，對(duì)本發(fā)明的范圍并沒(méi)有任何限定。
[0136](實(shí)施例1:通過(guò)頭蛋白處理的來(lái)自ES細(xì)胞的心肌細(xì)胞的出現(xiàn)增強(qiáng)效果)
[0137]使ES細(xì)胞通過(guò)懸浮凝集培養(yǎng)(以下，在本申請(qǐng)實(shí)施例中簡(jiǎn)單記為懸浮培養(yǎng))形成EB，使用分化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)系，在培養(yǎng)基中添加頭蛋白對(duì)心肌細(xì)胞的出現(xiàn)率的影響進(jìn)行研究。
[0138]在以下實(shí)驗(yàn)中，作為ES細(xì)胞，使用EB3細(xì)胞(丹羽仁史博士 [理科學(xué)研究所]惠贈(zèng))、R1細(xì)胞(Andrew Nagy博士 [Mount Sinai病院；加拿大]惠贈(zèng))、和129SV細(xì)胞(從大日本制藥株式會(huì)公司購(gòu)入)，總的說(shuō)來(lái)，沒(méi)有看到由于ES細(xì)胞種類不同導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差別。這些ES細(xì)胞使用在含有10%胎牛血清、0.1mM MEM非必需氨基酸液、2mML_谷氨酰胺、和 0.lmM2_ 疏基乙醇的 Glasgow Minimum Essential Medium(GMEM ;Sigma 公司)培養(yǎng)基中添加了 2000U / mL 白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor:LIF) (ESGRO ；Chemicon公司)的培養(yǎng)基，根據(jù)Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual (Hogan等人編，Cold Spring Harbor Laborayory Press,1994) ；Embryonic Stem Cells:Methods andProtocols (Turksen編 ,Humana Press, 2002)等所述的方法，在保持未分化形態(tài)的同時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)后供實(shí)驗(yàn)用。
[0139]開(kāi)始懸浮培養(yǎng)3日前，將用上述條件培養(yǎng)形成集落的ES細(xì)胞用PBS清洗2次后，通過(guò)用含有ImM EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行處理，形成單一細(xì)胞狀態(tài)，使用在含有10%胎牛血清、0.1mM MEM非必需氨基酸液、2mM L-谷氨酰胺和0.lmM2_巰基乙醇的a -modified Minimum Essential Medium( a MEM ;Sigma 公司)培養(yǎng)基(以下，稱為“分化培養(yǎng)基”)中添加了 2000U / mL LIF的培養(yǎng)基，制備2.5X IO5細(xì)胞/ mL的細(xì)胞懸濁液。向該懸池液中添加、或不添加500ng / mL重組.頭蛋白-Fe嵌合蛋白質(zhì)(Recombinant MouseNoggin / Fe Chimera ；R & D systems公司)(以下,簡(jiǎn)單稱為“頭蛋白”)后,對(duì)于飼養(yǎng)非依賴性ES細(xì)胞株EB3細(xì)胞，接種在明膠包被的市售的細(xì)胞培養(yǎng)用板(T75f Iask5Greiner公司制)上。另一方面，對(duì)于飼養(yǎng)依賴性ES細(xì)胞株Rl細(xì)胞和129SV細(xì)胞，預(yù)先制備在明膠包被的板上接種了絲裂霉素處理過(guò)的初代小鼠胚成纖維細(xì)胞(大日本制藥公司)的板，將細(xì)胞懸濁液接種在飼養(yǎng)細(xì)胞層上。
[0140]象以下那樣進(jìn)行由ES細(xì)胞形成EB的懸浮培養(yǎng)。將在添加、或沒(méi)有添加頭蛋白的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)了 3日的ES細(xì)胞用PBS清洗2次后，通過(guò)用含有ImM EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行處理，形成單一細(xì)胞狀態(tài)，然后以I X IO2細(xì)胞/ mL、或2X105細(xì)胞/ mL濃度接種在用分化培養(yǎng)基鋪滿的市售的細(xì)胞粘附性弱的細(xì)菌用板(直徑100mm ；Valmalk公司制)上。此時(shí)，向開(kāi)始懸浮培養(yǎng)的3日前添加了頭蛋白的細(xì)胞組的培養(yǎng)基添加500ng / mL頭蛋白。然后，細(xì)胞在保持不粘附板的狀態(tài)下進(jìn)行4~14日的懸浮培養(yǎng)。在本實(shí)驗(yàn)條件下從剛懸浮培養(yǎng)后確認(rèn)ES細(xì)胞開(kāi)始凝集，并形成EB，從懸浮培養(yǎng)后第7~8日，已經(jīng)在一部分的EB中觀察到自發(fā)搏動(dòng)性。
[0141]另外，作為由ES細(xì)胞形成EB的其它的方法，懸滴培養(yǎng)如以下那樣進(jìn)行。將在添加、或沒(méi)有添加頭蛋白的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)了 3日的ES細(xì)胞用PBS清洗2次后，通過(guò)用含有ImMEDTA的0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行處理，形成單一細(xì)胞狀態(tài)。然后，制備在分化培養(yǎng)基15 μ L中含有500個(gè)細(xì)胞的液滴，將液滴滴在培養(yǎng)板的頂蓋，培養(yǎng)4日。此時(shí)，在從開(kāi)始懸滴培養(yǎng)的3日前添加了頭蛋白的細(xì)胞組的培養(yǎng)基中添加500ng / mL頭蛋白。懸滴培養(yǎng)后，將懸滴中形成的EB接種在用分化培養(yǎng)基鋪滿的市售細(xì)胞培養(yǎng)用平皿(4孔多孔平皿；Nunc公司制)上，然后進(jìn)行粘附培養(yǎng)，誘導(dǎo)向心肌細(xì)胞分化。粘附培養(yǎng)后，每隔2日，將一半培養(yǎng)基換成新鮮培養(yǎng)基。在本實(shí)驗(yàn)條件下，與懸浮培養(yǎng)法同樣，從剛懸滴培養(yǎng)后確認(rèn)ES細(xì)胞開(kāi)始凝集，并形成EB，從對(duì)回收的EB開(kāi)始粘附培養(yǎng)的第3~4日(懸滴培養(yǎng)后第7~8日)時(shí)間，已經(jīng)在來(lái)自一部分EB的集落觀察到自發(fā)搏動(dòng)性。
[0142]作為心肌細(xì)胞從ES細(xì)胞分化、發(fā)育的一個(gè)指標(biāo)，對(duì)呈現(xiàn)自發(fā)搏動(dòng)性的EB的出現(xiàn)率進(jìn)行經(jīng)時(shí)研究。作為ES細(xì)胞，使用EB3細(xì)胞，以I X IO2個(gè)/ mL的細(xì)胞濃度進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時(shí)，在來(lái)自沒(méi)有進(jìn)行頭蛋白處理的(頭蛋白(_)組)ES細(xì)胞的EB中，即使在懸浮培養(yǎng)后第14日也幾乎沒(méi)有觀察到搏動(dòng)性(圖1A)。而在來(lái)自進(jìn)行了頭蛋白處理的(頭蛋白(+)組)ES細(xì)胞的EB中，從懸浮培養(yǎng)后第7日開(kāi)始觀察到出現(xiàn)搏動(dòng)性的EB，在第14日，80%以上的EB可確認(rèn)搏動(dòng)性。在以2X105個(gè)/ mL細(xì)胞濃度進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時(shí)也看到同樣的傾向，在頭蛋白㈠組EB中，最終只有在不到10%的EB中確認(rèn)搏動(dòng)，相反在頭蛋白⑴組EB中，懸浮培養(yǎng)后第10日30%以上，第1490%以上的EB表現(xiàn)出搏動(dòng)性。另外，在頭蛋白㈠組EB中，搏動(dòng)的區(qū)域限定于EB的一部分，但在頭蛋白(+)組EB中，令人驚奇的是能夠觀察到幾乎遍布EB表層整個(gè)區(qū)域的細(xì)胞 都在搏動(dòng)。
[0143]即使在懸滴培養(yǎng)條件下，在頭蛋白(+)組ES細(xì)胞中的心肌分化能力與頭蛋白(_)組ES細(xì)胞相比也顯著高，在分化誘導(dǎo)后第7日(粘附培養(yǎng)后第3日)看到40%以上，在第10日看到80%以上，而在第14日幾乎在所有的來(lái)自EB的集落中都看到搏動(dòng)(圖1B)。另外，與在懸浮培養(yǎng)條件下觀察同樣，在頭蛋白(_)組中，只在使EB粘附在培養(yǎng)平皿形成的集落的一部分區(qū)域的細(xì)胞看到搏動(dòng)性，相反在頭蛋白(+)組中，確認(rèn)在來(lái)自EB的遍布整個(gè)集落的所有細(xì)胞都在搏動(dòng)。
[0144]另外,在兩個(gè)培養(yǎng)系中，在與頭蛋白處理同樣的條件下,將例如ICF(insulin-likegrowth factor)-1、FGF(fibroblast growth factor)-2, BMP-2 等各種增殖因子類或細(xì)胞因子類的重組蛋白質(zhì)添加到培養(yǎng)基中，不能確認(rèn)呈現(xiàn)出與頭蛋白同樣、或超過(guò)頭蛋白的心肌誘導(dǎo)活性。
[0145]接下來(lái)，進(jìn)行了關(guān)于頭蛋白的添加濃度不同對(duì)由ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的影響的研究。圖2示出了除了添加的頭蛋白的濃度為0.5~1500ng / mL以外，其它完全與圖1條件同樣進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的結(jié)果。EB3細(xì)胞和Rl細(xì)胞都表現(xiàn)出幾乎同樣的濃度依賴性，通過(guò)添加5ng / mL~1500ng / mL濃度的頭蛋白，確認(rèn)出現(xiàn)了比頭蛋白(-)組有意義高的搏動(dòng)性EB。特別是通過(guò)添加50ng / mL~150ng / mL濃度的頭蛋白看到非常好的搏動(dòng)性EB的出現(xiàn)。
[0146](實(shí)施例2:通過(guò)頭蛋白處理進(jìn)行分化誘導(dǎo)的來(lái)自ES細(xì)胞的心肌細(xì)胞的形態(tài))
[0147]就像實(shí)施例1所示那樣，通過(guò)進(jìn)行頭蛋白處理，由ES細(xì)胞制備的EB的搏動(dòng)性有意義增高，為了確認(rèn)在該搏動(dòng)性EB中，該搏動(dòng)性細(xì)胞是心肌細(xì)胞，對(duì)各種心肌特異的標(biāo)志分子的基因表達(dá)以及蛋白質(zhì)產(chǎn)生進(jìn)行了研究。
[0148]圖3表示各種心肌細(xì)胞特異的標(biāo)志基因在頭蛋白(+)組、或頭蛋白(_)組EB中的表達(dá)。對(duì)用與圖1同樣的懸浮培養(yǎng)法形成的EB進(jìn)行定期回收，使用RNeaSy(Qiagen公司制)制備總RNA。然后，根據(jù)常規(guī)方法，使用SUPERSCRIPT II (Invitrogen公司制)對(duì)cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction ；PCR)檢測(cè)特異的基因在心肌細(xì)胞的表達(dá)。在 GATA-4、TEF-l、Tbx-5、MEF-2c、aMHC、MLC_2v、a -cardiacactin,GAPDH的各轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)中使用的引物如下。
[0149]GATA-4(正向)5' -CTGTCATCTC ACTATGGGCA-3' (SEQ ID NO:1)，
[0150]GATA-4(反向)5' -CCAAGTCCGA GCAGGAATTT-3' (SEQ ID NO:2)；
[0151]TEF-1 (正向)5' -AAGACGTCAA GCCCTTTGTG-3' (SEQ ID NO:3),
[0152]TEF-1 (反向)5' -AAAGGAGCAC ACTTTGGTGG-3' (SEQ ID NO:4)；
[0153]Tbx-5(正向)5' -GGAGCCTGAT TCCAAAGACA-3' (SEQ ID NO:5),
[0154]Tbx-5(反向)5' -TTCAGCCACA GTTCACGTTC-3' (SEQ ID NO:6)；
[0155]MEF-2c (正向)5' -AGCAAGAATA CGATGCCATC-3' (SEQ ID NO:7),
[0156]MEF-2c (反向)5' -GAAGGGGTGG TGGTACGGTC-3' (SEQ ID NO:8)；
[0157]a MHC(正向)5' -GGAAGAGTGA GCGGCCATCA AGG-3' (SEQ ID NO:9),
[0158]a MHC(反向)5' -CTGCTGGAGA GGTTATTCCT CG-3' (SEQ ID NO: 10);
[0159]MLC-2v(正向)5' -GCCAAGAAGC GGATAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 11)，
[0160]MLC-2v(反向)5' -CTGTGGTTCA GGGCTCAGTC-3' (SEQ ID NO:12)；
[0161]a -cardiac act in (正向)5' -CTGAGATGTC TCTCTCTCTC TTAG-3' (SEQ ID NO:13)，
[0162]a -cardiac act in(反向)5' -ACAATGACTG ATGAGAGATG-3' (SEQ ID NO:14)；
[0163]GAPDH(正向)5' -TTCAACGGCA CAGTCAAGG-3' (SEQ ID NO:15)，
[0164]GAPDH(反向)5' -CATGGACTGT GGTCATGAG-3' (SEQ ID NO:16)。
[0165]PCR使用TaKaRa Taq (寶酒造公司制)作為耐熱性DNA聚合酶，用GeneAmp PCRSystem9600 (Perkin-Elmer公司制)進(jìn)行。首先將含有cDNA的PCR反應(yīng)液于94°C下加熱3分鐘后，反復(fù)進(jìn)行94°C:1分鐘，-55°C: I分鐘，-72°C: I分鐘的30次加熱循環(huán)，最后于72°C下加熱5分鐘后，在4°C下冷卻。將PCR產(chǎn)物用3%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用SYBR GreenI (寶酒造公司制)染色,通過(guò)Molecular Imager FX (Bio-Rad公司制)進(jìn)行檢測(cè)。
[0166]結(jié)果GATA-4、TEF_l、Tbx-5、MLC-2v等基因在頭蛋白(_)組EB中從懸浮培養(yǎng)開(kāi)始后第5至第10日開(kāi)始看到比較弱的表達(dá)，相反在頭蛋白(+)組EB，從懸浮培養(yǎng)開(kāi)始的當(dāng)日(O日)開(kāi)始看到表達(dá)，之后，在第5~第15日持續(xù)強(qiáng)的表達(dá)。MEF-2C和心肌特異的α -肌動(dòng)蛋白都是從懸浮培養(yǎng)后第5日開(kāi)始看到表達(dá)，其表達(dá)量，頭蛋白(+)組EB有意義地強(qiáng)。而，a MHC(肌球蛋白重鏈)基因，在頭蛋白(+)組ΕΒ，在第10、15日看到強(qiáng)表達(dá)，但在頭蛋白(_)組EB不能確認(rèn)表達(dá)。以上 結(jié)果表明通過(guò)頭蛋白處理，迅速、且強(qiáng)烈地促進(jìn)EB內(nèi)的心肌細(xì)胞的分化以及發(fā)育。
[0167]另外，用免疫組織化學(xué)染色法確認(rèn)在頭蛋白(+)組EB中發(fā)育的搏動(dòng)性細(xì)胞產(chǎn)生心肌細(xì)胞特異的標(biāo)志蛋白質(zhì)。將用圖1同樣的懸浮培養(yǎng)法形成的蛋白(+)組EB在懸浮培養(yǎng)后第12日回收，用含有ImM EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液處理后使細(xì)胞分散。分散的細(xì)胞以個(gè)個(gè)細(xì)胞相互不粘連程度的低密度接種在明膠包被的蓋玻片上，在鋪滿分化培養(yǎng)基的市售的細(xì)胞培養(yǎng)用板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。翌日，將蓋玻片上的細(xì)胞用4%低聚甲醛溶液固定，依次與作為I次抗體的抗肌原纖維節(jié)和肌球蛋白抗體(MF20 ； Ameri can Type Culture Collection)、抗肌鈣蛋白I抗體(#SC_8120 ；Santa Cruz Biotechnology公司)、抗α -輔肌動(dòng)蛋白抗體(#SC-15335 ；Santa Cruz 公司)、抗 ANP 抗體(#AB5490 ；Chemicon 公司)反應(yīng)，再與Alexa488標(biāo)記2次抗體(MoleCular Probes公司)依次反應(yīng)后,在突光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
[0168]結(jié)果，作為心肌細(xì)胞中特異的標(biāo)志蛋白質(zhì)的肌原纖維節(jié)和肌球蛋白或肌鈣蛋白1、α -輔肌動(dòng)蛋白、ANP陽(yáng)性細(xì)胞多數(shù)被確認(rèn)(圖4)，證實(shí)來(lái)自ES細(xì)胞的搏動(dòng)性細(xì)胞是心肌細(xì)胞。
[0169]接下來(lái)，使用與上述同樣的免疫組織化學(xué)的染色法，對(duì)EB內(nèi)的心肌細(xì)胞的分布和發(fā)生頻率進(jìn)行確認(rèn)。將懸浮培養(yǎng)后第12日回收的EB用冷凍切片制備用包埋劑(0CTCompound, Sakura Finetek USA Inc.)新鮮包埋,將于液氮下冷凍制備的冷凍標(biāo)本用恒冷切片機(jī)(LEICA CM3050-S)切成薄片(5 μ m)后，貼在載玻片上。使冷凍切片與上述抗心肌細(xì)胞特異標(biāo)志抗體反應(yīng)，用與上述同樣的方法進(jìn)行標(biāo)志蛋白質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)。
[0170]檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。在頭蛋白(_)組EB中，心肌細(xì)胞中特異的標(biāo)志蛋白質(zhì)的陽(yáng)性細(xì)胞只在EB的極有限的區(qū)域觀察到，而相反在頭蛋白(+)組EB中，在遍布幾乎整個(gè)EB表層區(qū)域都可確認(rèn)心肌標(biāo)志陽(yáng)性細(xì)胞。本見(jiàn)識(shí)與在頭蛋白(_)組EB中搏動(dòng)域被限定在EB的一部分，相反在頭蛋白(+)組EB中，搏動(dòng)遍布幾乎整個(gè)EB區(qū)域，與已證實(shí)的實(shí)施例1中的觀察結(jié)果完全一致。
[0171](實(shí)施例3:頭蛋白處理時(shí)間、期間不同對(duì)心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)效果的影響)
[0172]為了研究頭蛋白處理的最適時(shí)間和期間，改變?cè)谏鲜鰬腋∨囵B(yǎng)系中頭蛋白的添加時(shí)期，研究改變之后對(duì)心肌分化誘導(dǎo)效果的影響。
[0173]結(jié)果如表1所示。
[0174]【表1】
[0175]
【權(quán)利要求】
1.由來(lái)自哺乳動(dòng)物的多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的方法，其特征是在(a)分化誘導(dǎo)期開(kāi)始的前I~2日到分化誘導(dǎo)期，和/或 (b)分化誘導(dǎo)期的最初3日以內(nèi) 在抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)的存在下，對(duì)所述干細(xì)胞進(jìn)行用于分化誘導(dǎo)的培養(yǎng)， 其中抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)選自BMP拮抗劑、針對(duì)BMP家族分子的特異的中和抗體、非細(xì)胞膜結(jié)合型的可溶化型BMP受體分子、基因表達(dá)載體、特異的反義寡核苷酸、核酶、RNA干擾用反義RNA、低分子化合物； 其中所述干細(xì)胞排除人類胚胎分離的干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，用于分化誘導(dǎo)的干細(xì)胞的培養(yǎng)包括選自下述工序的工序:(I)進(jìn)行懸浮凝集培養(yǎng)，使胚狀體形成的工序； (2)與飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)的工序；以及 (3)在培養(yǎng)容器上進(jìn)行平面培養(yǎng)的工序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，抑制BMP信號(hào)傳導(dǎo)的物質(zhì)是BMP拮抗劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，BMP拮抗劑是從頭蛋白、索蛋白、胎球蛋白、卵泡抑素、sclerostin、DAN、Cerberus、gremlin、和 Dante 中選出的 I 個(gè)或多個(gè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，多能性干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞、具有類似于胚胎干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞、或胚胎生 殖細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，多能性干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK103602633SQ201310492188
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2004年10月4日 優(yōu)先權(quán)日:2003年10月3日
【發(fā)明者】福田惠一, 湯淺慎介, 岡野榮之, 島崎琢也, 小清水右一, 田中智文, 杉村惠二郎 申請(qǐng)人:福田惠一