一種具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽（41肽）及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述的腫瘤抑素融合肽的氨基酸序列為SEQ?No.1，編碼所述腫瘤抑素融合肽的核苷酸序列為SEQ?No.2。本發(fā)明在腫瘤抑素42肽的基礎(chǔ)上，使得21肽和19肽的連接不再依賴柔性連接片段，改由RGD序列承擔(dān)，本發(fā)明抗腫瘤活性比腫瘤抑素42肽更強(qiáng)。
【專利說(shuō)明】ー種具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽及其制備方法和應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及ー種具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人腫瘤抑素(tumstatin)來(lái)源于人膠原IV a 3鏈，由244個(gè)氨基酸殘基組成。腫瘤抑素第75至95位氨基酸殘基組成的21肽具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞増殖，阻止腫瘤組織新生血管生成的活性。第185至203位氨基酸殘基組成的19肽能直接抑制腫瘤細(xì)胞的増殖與遷移。本課題組用小鼠H22肝癌細(xì)胞腹水制作小鼠肝癌動(dòng)物模型，檢測(cè)21肽和19肽的抗腫瘤活性，結(jié)果21肽的抑瘤率為40.08%, 19肽的抑瘤率為42.41%，21肽和19肽半量聯(lián)合用藥的抑瘤率為57.55%。將21肽中第18位的N改為G，與其前面的R和后面的D組成ー個(gè)RGD序列。在21肽的羧基端添加兩個(gè)甘氨酸，使與前后的小分子氨基酸一起組成柔性連接片段，再與19肽組合成42個(gè)氨基酸的融合肽。42肽的抑瘤率為50.52%，好于21肽和19肽單獨(dú)用藥，不如21肽、19肽聯(lián)合用藥。
[0003]RGD序列廣泛分布在細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白通過(guò)RGD序列與細(xì)胞膜上的整合素受體識(shí)別、結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間，細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，參與血管新生，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程。在可溶性多肽或蛋白中引入RGD序列，可使可溶性多肽或蛋白與整合素結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性阻止細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與整合素的結(jié)合，抑制或逆轉(zhuǎn)上述病理過(guò)程，產(chǎn)生所謂的“去整合素效應(yīng)”。不管RGD序列插在蛋白質(zhì)的什么位置，在形成立體結(jié)構(gòu)時(shí)RGD序列都會(huì)以(6-轉(zhuǎn)角的二級(jí)結(jié)構(gòu)形式位于蛋白質(zhì)的表面。為了不讓引入的RGD序列影響蛋白質(zhì)原來(lái)的立體結(jié)構(gòu)，一般都將RGD序列加在蛋白質(zhì)或多肽的兩端。本課題組在內(nèi)皮抑素的內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了與串聯(lián)的RGD序列相似的RGIRGAD序列。經(jīng)軟件預(yù)測(cè)，將RGIRGAD改為RGDRGD序列不影響內(nèi)皮抑素的立體結(jié)構(gòu)，開創(chuàng)了在蛋白質(zhì)的內(nèi)部引入RGD序列的先例并獲得發(fā)明專利(專利號(hào):ZL2004.10013621.X)。
[0004]將兩種蛋白或多肽融合在一起并保持兩種蛋白或多肽各自的活性，必須保證在融合蛋白中兩種蛋白或多肽各自的立體結(jié)構(gòu)不變。為此需在兩種蛋白或多肽之間引入柔性連接片段。所謂柔性連接片段是指連續(xù)的小分子氨基酸序列，如甘氨酸、丙氨酸等。在融合蛋白中柔性連接片段自身易于形成(6-轉(zhuǎn)角二級(jí)結(jié)構(gòu)，因而不參與兩邊蛋白或多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，使兩邊的多肽或蛋白能保持原來(lái)的立體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。
[0005]腫瘤抑素42肽引入的RGD序列位于21肽的羧基端，目的是通過(guò)“去整合素效應(yīng)”增強(qiáng)21肽的生物學(xué)活性。21肽和19肽的連接需要依賴于額外添加的兩個(gè)甘氨酸及與其前后小分子氨基酸間形成的柔性連接片段。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是在腫瘤抑素42肽的基礎(chǔ)上，提供具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽(41肽)，其中21肽和19肽的連接不再依賴柔性連接片段，改由RGD序列承擔(dān)；其抗腫瘤活性比腫瘤抑素42肽更強(qiáng)。
[0007]本發(fā)明具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽的氨基酸序列見(jiàn)SEQ N0.1，編碼所述融合肽的優(yōu)選核苷酸序列見(jiàn)SEQ N0.2。
[0008]制備上述具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽的方法，包括以下步驟:
[0009]1、用DNA合成儀合成本發(fā)明的DNA序列，SEQ N0.2 ；
[0010]2、在編碼鏈的5'端增加I個(gè)T堿基，模板鏈5'端增加ACG3個(gè)堿基，且退火成雙鏈后使5'端憐酸化；
[0011]3、用Ndel和Sapl雙酶切pTYBl質(zhì)粒，酶切后與步驟2獲得的DNA片段連接重組；
[0012]4、將步驟3獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21或其他含有DE3基因的受體菌；
[0013]5、培養(yǎng)、收集步驟4中獲得的基因工程菌，并用超聲波破菌制備裂解液；
[0014]6、離心收集裂解液上清，經(jīng)幾丁質(zhì)親和層析純化，即得具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽。
[0015]相應(yīng)的，含有本發(fā)明核苷酸序列的載體，以及含有該載體的宿主細(xì)胞都在本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。
[0016]本發(fā)明的抗腫瘤融合肽全長(zhǎng)41個(gè)氨基酸(41肽)，由腫瘤抑素的21肽和19肽融合而成。21肽的第18位天冬酰胺(N)改為甘氨酸(G)，與其前面的R和后面的D形成ー個(gè)RGD序列。用另ー個(gè)RGD序列取代第20、21位的Y和S。21肽經(jīng)過(guò)上述改造成為羧基端有串聯(lián)RGD序列的22肽。改造后的22肽羧基端直接與19肽的氨基端融合，去除了原42肽中添加的2個(gè)甘氨酸而成為41肽。
[0017]本發(fā)明的腫瘤抑素融合肽(41肽)在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上的最顯著創(chuàng)新性體現(xiàn)在利用RGD序列作連接片段，直接連接21肽和19肽，去除了原42肽中的柔性連接片段。柔性連接片段因其本身易于形成(6-轉(zhuǎn)角二級(jí)結(jié)構(gòu)而不參與其兩側(cè)多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。RGD序列總是以3 -轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)突出在蛋白質(zhì)的表面，推測(cè)RGD序列也不會(huì)參與其兩側(cè)多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。41肽在結(jié)構(gòu)上設(shè)計(jì)的成功賦予RGD序列新的功能，除了發(fā)揮“去整合素效應(yīng)”外，RGD序列還可作為連接片段連結(jié)兩個(gè)多肽或蛋白。本發(fā)明將42肽中單個(gè)的RGD序列改為RGDRGD串聯(lián)序列，增強(qiáng)了其“去整合素效應(yīng)”，41肽的抑瘤率從42肽的50.54%提高到69.14%。
[0018]本發(fā)明進(jìn)ー步將21肽中第14位的F改為W，以方便在生產(chǎn)過(guò)程中用紫外檢查、監(jiān)測(cè)融合肽的濃度和產(chǎn)量。F和W都是芳香族氨基酸，芳香環(huán)外都沒(méi)有羥基。它們的PaPePt分別為113、138、60和108、137、96，形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向相同，能力相似。用W取代F不影響蛋白質(zhì)或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能。
[0019]本發(fā)明的腫瘤抑素融合肽(41肽)具有抑制腫瘤組織新生血管生成，限制腫瘤的血液供應(yīng)和直接抑制 腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的雙重抗腫瘤活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)抑瘤率不僅高于單獨(dú)應(yīng)用21肽和19肽試驗(yàn)組，也高于42肽試驗(yàn)組。因此本發(fā)明還進(jìn)一歩提出了所述融合肽及其編碼的核苷酸序列在制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為本發(fā)明腫瘤抑素融合肽(41肽)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的抗腫瘤作用，其中，上一行為PBS緩沖液(PBS緩沖液:0.1-0.2mol/L磷酸鈉緩沖液，pH為7.4)對(duì)照組，下一行為本發(fā)明腫瘤抑素41肽試驗(yàn)組；
[0021]圖2為本發(fā)明腫瘤抑素融合肽(41肽)抑制人SGC-7901胃癌遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，A為劃線后，B為PBS緩沖液(PBS緩沖液:0.1-0.2mol/L磷酸鈉緩沖液，pH為7.4)對(duì)照組，C為腫瘤抑素21肽對(duì)照組，D為本發(fā)明腫瘤抑素41肽試驗(yàn)組；
[0022]圖3為本發(fā)明腫瘤抑素融合肽(41肽)抑制HUVEC臍血管內(nèi)皮細(xì)胞和SGC-7901胃癌細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)ー步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0024]實(shí)施例1制備本發(fā)明具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽(41肽)
[0025]1、用DNA合成儀合成本發(fā)明的DNA序列，SEQ N0.2 ；
[0026]2、在編碼鏈的5'端增加I個(gè)T堿基，模板鏈5'端增加ACG3個(gè)堿基，且退火成雙鏈后使5'端憐酸化；
[0027]3、用Ndel和Sapl雙酶切pTYBl質(zhì)粒，酶切后與步驟2獲得的DNA片段連接重組；
[0028]4、將步驟3獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21或其他含有DE3基因的受體菌；
[0029]5、培養(yǎng)、收集步驟4中獲得的基因工程菌，并用超聲波破菌制備裂解液；
[0030]6、離心收集裂解液上清，`經(jīng)幾丁質(zhì)親和層析純化，即得具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽。
[0031]本基因重組方法將41肽基因置于內(nèi)含肽的氨基端，41肽的蛋氨酸密碼作為翻譯的起始密碼，內(nèi)含肽的自動(dòng)斷裂點(diǎn)正好位于41肽最后一個(gè)氨基酸絲氨酸羧基形成的肽鍵上。這樣用基因工程方法得到的41肽與化學(xué)合成的41肽序列完全相同，通過(guò)化學(xué)合成和基因工程兩種方法都能生產(chǎn)41肽。
[0032]試驗(yàn)例I檢測(cè)本發(fā)明腫瘤抑素融合肽(41肽)的抗腫瘤活性
[0033]將凍存的H22小鼠肝癌細(xì)胞(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，黑龍江省腫瘤研究所保存)置于37°C水浴l_2min，待細(xì)胞融化后，給每只昆明種小鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物室提供)腹腔注射0.2mL, 10天左右接種小鼠的腹腔長(zhǎng)滿腹水。無(wú)菌條件下抽取腹水作為瘤源，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為3X IO7個(gè)/mL。取體重為18-22g的雄性昆明種小鼠，每只于肩胛腋窩處皮下接種腫瘤細(xì)胞0.2mL。待能觸及接種部位的腫瘤結(jié)節(jié)后，試驗(yàn)組腫瘤組織內(nèi)注射本發(fā)明腫瘤抑素融合肽(41肽)5mg/kg/d (用PBS緩沖液(PBS緩沖液:
0.1-0.2mol/L磷酸鈉緩沖液，pH為7.4)溶解)，連續(xù)用藥10天，處死小鼠，剝離腫瘤結(jié)節(jié)，稱重，計(jì)算抑瘤率。對(duì)照組注射等體積的PBS緩沖液(PBS緩沖液:0.1-0.2mol/L磷酸鈉緩沖液，pH為7.4)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、圖1,本發(fā)明腫瘤抑素融合肽(41肽)的抑瘤率為69.14%。
[0034]表1腫瘤抑素融合肽(41肽)抑瘤率
[0035]
【權(quán)利要求】
1.ー種具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽，其特征在于，所述的腫瘤抑素融合肽的氨基酸序列為SEQ N0.1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽，其特征在于，編碼所述腫瘤抑素融合肽的核苷酸序列為SEQ N0.2。
3.制備權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽的方法，包括以下步驟: (1)用DNA合成儀合成本發(fā)明的DNA序列，即SEQN0.2 ； (2)在編碼鏈的5/端増加I個(gè)T堿基，模板鏈5/端増加ACG3個(gè)堿基，且退火成雙鏈后使5'端憐酸化； (3)用Ndel和Sapl雙酶切TYBl質(zhì)粒，酶切后與步驟(2)獲得的DNA片段連接重組； (4)將步驟(3)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21或其他含有DE3基因的受體菌； (5)培養(yǎng)、收集步驟(4)中獲得的基因工程菌，并用超聲波破菌制備裂解液； (6)離心收集裂解液上清，經(jīng)幾丁質(zhì)親和層析純化，即得具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽。
4.ー種載體，其特征在于，所述載體包括權(quán)利要求2所述的核苷酸序列。
5.ー種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞包括權(quán)利要求4所述的載體。
6.權(quán)利要求1或2所述的具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素融合肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK103554266SQ201310472765
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】楊寶峰, 劉興漢, 初文峰, 鄭天虎, 袁麗杰 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)