利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法，包括以下步驟：步驟A、米黑毛霉菌種活化：米黑毛霉（Mucormiehei）菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCCNo.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL；步驟B、配制發(fā)酵營養(yǎng)基、滅菌，接入步驟A中的菌懸液，并在38~42℃下培養(yǎng)；步驟C、從培養(yǎng)72h起、流加可溶性硫酸鹽和還原糖的混合液，再繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中100mL培養(yǎng)基含有2g還原糖，發(fā)酵得含有凝乳酶的粗樣品。本發(fā)明降低了微生物發(fā)酵生產過程中染菌的幾率，減少了因種子培養(yǎng)基滅菌造成的能源消耗，而且發(fā)酵的時間縮短，提高了發(fā)酵的效率；且發(fā)酵液凝乳酶活力由原有工藝的210IMCU/mL可提高到410IMCU/mL，提高了將近95%。
【專利說明】利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術領域】，具體涉及一種利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法?！颈尘凹夹g】
[0002]凝乳酶屬于酸性蛋白酶，又稱天冬氨酸蛋白酶，是生產奶酪不可缺少的制劑，其產值占整個酶制劑總產值的15.5%。目前該酶主要有三種來源，分別為動物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。
[0003]動物凝乳酶以其凝乳活力與蛋白水解能力的高比值而成為制作奶酪的首選酶，其傳統(tǒng)來源是哺乳期小牛的皺胃；但是動物生長緩慢且價格昂貴，容易增加企業(yè)生產成本，并且從動物中提取酶液的程序和工藝較復雜。木瓜、無花果、菠蘿、南瓜、合歡樹、銀杏樹等植物都含有能使牛奶凝固的蛋白酶。植物來源的凝乳酶因有太高的蛋白水解活力或本身有毒，因此很多植物性凝乳酶沒有得到大規(guī)模商業(yè)化應用。微生物凝乳酶來源廣泛，目前發(fā)現有40余種微生物可生產一定 量的凝乳酶。例如,米黑毛霉(Mucor miehei)、總狀毛霉(Mucoracelnosus)、乳白祀霉(Irpex Iacteus)、易脆毛霉(Mucor fragilis)芽抱桿菌(Bacillussubtilis)、寄生內座殼菌(Endothia parasitisa)等。由于微生物生長快,繁殖周期短,生長和產酶過程容易控制，且微生物所產的凝乳酶是一種包外酶，提取方便，成本低，且安全無毒，而被廣泛使用。
[0004]傳統(tǒng)的利用微生物發(fā)酵的模式為:種子擴大培養(yǎng)一發(fā)酵培養(yǎng)。該模式的發(fā)酵中，需要在種子罐中將菌種逐級擴大培養(yǎng)，其中，種子培養(yǎng)基滅菌、培養(yǎng)以及轉種過程中會增加染菌幾率以及菌種變異、退化的幾率，從而降低了凝乳酶的產量和活力，且因種子培養(yǎng)基滅菌造成了大量的能源消耗。
[0005]基于世界市場對于凝乳酶的需求量很大，進一步開展發(fā)酵法生產凝乳酶的研究，提高凝乳酶的發(fā)酵水平仍有很高的經濟價值。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法，該方法將種子擴大培養(yǎng)一發(fā)酵培養(yǎng)的傳統(tǒng)發(fā)酵模式改為菌種活化后直接發(fā)酵培養(yǎng)，減少了種子逐級擴大培養(yǎng)的過程，從而降低了培養(yǎng)基滅菌、培養(yǎng)及轉種過程中菌種染雜菌、變異和退化的可能性，也降低了整個發(fā)酵過程中的染菌幾率，且所得的發(fā)酵液凝乳酶活力較高；該生產工藝簡單、適于大規(guī)模的工業(yè)化生產。
[0007]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是:
一種利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法，包括以下步驟:
步驟A、米黑毛霉菌種活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCC N0.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL ；
步驟B、配制發(fā)酵營養(yǎng)基、滅菌，接入步驟A中的菌懸液，并在38~42°C下培養(yǎng)；
步驟C、從培養(yǎng)72h起、流加可溶性硫酸鹽和還原糖的混合液，再繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中IOOmL培養(yǎng)基含有2g還原糖，發(fā)酵得含有凝乳酶的粗樣品。
[0008]優(yōu)選的，所述菌懸液的接種量為發(fā)酵營養(yǎng)基體積的萬分之一。
[0009]步驟B中所述發(fā)酵營養(yǎng)基的配制方法為:稱取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g,葡萄糖183g,用水定容至30升。
[0010]步驟C中IOOmL混合液溶有可溶性硫酸鹽與還原糖60g，其中可溶性硫酸鹽與還原糖的重量份數比為:20-200:1200o
[0011]所述可溶性硫酸鹽為硫酸鈉、硫酸鉀或硫酸銨，還原糖為葡萄糖。硫酸銨和葡萄糖參與了凝乳酶的代謝過程，從而提高了凝乳酶的活力。
上述技術方案中，采用編號為ATCC N0.16457的米黑毛霉菌株經活化后直接用于發(fā)酵培養(yǎng)、生成凝乳酶粗品。該過程省略了種子罐的逐級擴大培養(yǎng)，降低了雜菌污染的幾率和菌種變異、退化的幾率。而且在發(fā)酵過程中流加的硫酸鹽和還原糖參與了凝乳酶的代謝過程，提高了凝乳酶的活力。
[0012]采用上述技術方案產生的有益效果在于:(1)本發(fā)明以活化后的菌種直接用于發(fā)酵培養(yǎng)，省去種子的逐級擴大培養(yǎng)，降低了微生物發(fā)酵生產過程中染菌的幾率，減少了因種子培養(yǎng)基滅菌造成的能源消耗，而且發(fā)酵的時間縮短，提高了發(fā)酵的效率；(2)發(fā)酵液凝乳酶活力由原有工藝的21(HMCU/mL可提高到41(HMCU/mL，提高了將近95%，在后提取過程收率和原有工藝一致的情況下，最終產品的產量得到大幅度提高，經濟效益明顯。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
本發(fā)明凝乳酶的發(fā)酵過程為:
步驟A、米黑毛霉菌種活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCC N0.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL ;本發(fā)明中菌種活化采用常規(guī)的方法和試劑；
步驟B、按照下述配方配制發(fā)酵營養(yǎng)基:
稱取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升。將發(fā)酵營養(yǎng)基滅菌后，接入步驟A中的菌懸液，接種量為發(fā)酵營養(yǎng)基體積的萬分之一，在38°C下培養(yǎng);
步驟C、從培養(yǎng)72h起、流加硫酸鈉和葡萄糖的混合液，并繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中維持葡萄糖的濃度為2% (即IOOmL發(fā)酵營養(yǎng)基中含有2g作為還原糖的葡萄糖)，發(fā)酵結束后得凝乳酶的粗樣品，測試該發(fā)酵液中凝乳酶的活力。
[0014]其中，硫酸鈉與葡萄糖的比例為20g: 1200g,混合液的總濃度為60%( IOOmL混合液中含有硫酸鈉和葡萄糖共60g)。
[0015]凝乳酶活力的測試方法為:
一、試劑準備 1、lmol/L醋酸溶液:吸取5.9mL的醋酸于IOOmL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。
[0016]2、pH5.5緩沖溶液:量取IOmL lmol/L的醋酸溶液，稱取IOg三水合乙酸鈉，將兩者放入一燒杯中，溶解后轉入1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。若其pH在5.5，不用調節(jié)。
[0017]3、50g/L氯化鈣溶液:稱取5g氯化鈣于燒杯中，用適量蒸餾水溶解后轉入IOOmL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。
[0018]4,0.5g/L氯化鈣溶液:吸取50g/L的氯化鈣溶液5mL于500mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。
[0019]5、底物溶液:稱取22±0.1g的脫脂奶粉，量取200mL 0.5g/L氯化鈣溶液，將兩者放入一燒杯中，緩慢攪拌均勻，用磁力攪拌器攪拌30分鐘，攪拌過程中避免產生泡沫。將該底物溶液在黑暗處室溫放置30分鐘，若其pH在6.5左右，不用調節(jié)。(該制備好的底物溶液在黑暗處室溫放置不要超過4小時)。
[0020]6、凝乳酶標準品溶液制備:稱取凝乳酶標準品2500±lmg于燒杯中，用適量pH5.5緩沖溶液溶解后轉入50mL容量瓶中，用該緩沖溶液定容至刻度(第一次稀釋)，搖勻。將該凝乳酶標準品溶液做適當稀釋(第二次稀釋)，使其凝結時間控制在350-550S范圍。
[0021]二、測試步驟
1、樣品處理:稱取步驟C中一定量凝乳酶的粗樣品，用緩沖溶液稀釋成一定濃度，使其凝結時間控制在標準品溶液的凝結時間±40s的范圍內，記錄凝乳酶粗樣品的稀釋倍數(D)。
[0022]2、量取25±0.1mL的所述底物溶液放入干燥的IOOmL三角瓶中，將三角瓶置于32±0.2°C的水浴槽中水 浴至少12分鐘(不要超過20分鐘)，吸取0.5mL的凝乳酶標準品溶液加入上述三角瓶中，并開始計時。邊振蕩邊觀察凝結情況(動作要輕，避免泡沫產生)，記錄瓶壁開始出現凝結物的時間，即凝乳酶標準品溶液所用的凝結時間tMf，單位S。
[0023]樣品(凝乳酶的粗樣品)經步驟I處理后，進行上述相同的操作，記錄凝乳酶的粗樣品所用的凝結時間。
[0024]凝乳酶標準品溶液和凝乳酶的粗樣品要使用同一批次底物溶液。凝乳酶標準品溶液和樣品溶液各做2個平行，凝結時間取各自平行的平均值。
[0025]3.計算
International Milk-clotting Units/mL= (trefXmrefXV1XDXS) / (tXVdlXVd2)
式中tMf ---凝乳酶標準品溶液所用的凝結時間，s
mref----稱取的凝乳酶標準品的質量，g
V1制備凝乳酶標準品溶液時，從第一次稀釋液中所取的體積，mL
D一一樣品的稀釋倍數
t一一凝乳酶的粗樣品所用的凝結時間，s
Vdl制備凝乳酶標準品溶液時，第一次稀釋所定容的體積，mL
Vd2制備凝乳酶標準品溶液時，第二次稀釋所定容的體積，mL
S----凝乳酶標準品的凝乳活力，IMCU/mL
按照上述公式計算發(fā)酵液樣品的活力為298MCU/mL。
[0026]實施例2
步驟A、米黑毛霉菌種活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCC N0.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL ；
步驟B、按照下述配方配制發(fā)酵營養(yǎng)基:稱取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升。將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，接入步驟A中的菌懸液，接種量為發(fā)酵營養(yǎng)基體積的萬分之一，在38°C下培養(yǎng);
步驟C、從培養(yǎng)72h起、流加硫酸鉀和葡萄糖的混合液，并繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中維持葡萄糖的濃度為2% (同上)，發(fā)酵結束后按照實施例1中的方法測試發(fā)酵液中凝乳酶的活力為302MCU/mL。其中，硫酸鉀和葡萄糖的比例為20g: 1200g，混合液總濃度為60%(同上)。
[0027]實施例3
步驟A、米黑毛霉菌種活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCC N0.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL ；
步驟B、按照下述配方配制發(fā)酵營養(yǎng)基:
稱取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，接入步驟A中的菌懸液，接種量為發(fā)酵營養(yǎng)基體積的萬分之一，在38°C下培養(yǎng) 72h ；
步驟C、培養(yǎng)72h起流加硫酸銨和葡萄糖的混合液，并繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中維持葡萄糖的濃度為2% (同上)，發(fā)酵結束后按照實施例1中的方法測試發(fā)酵液中凝乳酶的活力為286MCU/mL。其中硫酸銨與葡萄糖的比例為20g: 1200g，混合液總濃度為60% (同上)。
[0028]實施例4 步驟A、米黑毛霉菌種活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCC N0.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL ；
步驟B、按照下述配方配制發(fā)酵營養(yǎng)基:
稱取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，接入步驟A中的菌懸液，接種量為發(fā)酵營養(yǎng)基體積的萬分之一，在42°C下培養(yǎng) 72h ；
步驟C、培養(yǎng)72h后起流加硫酸鈉和葡萄糖的混合液，并繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中維持葡萄糖的濃度為2%，發(fā)酵結束后按照實施例1中的方法測試發(fā)酵液中凝乳酶的活力為286MCU/mL。其中硫酸鈉與葡萄糖的比例為150g: 1200g，混合液總濃度為60% (同上)。
[0029]實施例5
步驟A、米黑毛霉菌種活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCC N0.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL ；
步驟B、按照下述配方配制發(fā)酵營養(yǎng)基:
稱取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，接入步驟A中的菌懸液，接種量為發(fā)酵營養(yǎng)基體積的萬分之一，在38°C下培養(yǎng) 72h ；
步驟C、培養(yǎng)72h起流加硫酸鉀和葡萄糖的混合液，并繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中維持葡萄糖的濃度為2% (同上)，發(fā)酵結束后按照實施例1中的方法測試發(fā)酵液中凝乳酶的活力為295MCU/mL。其中，硫酸鉀和葡萄糖的比例為150g: 1200g，混合液總濃度為60% (同上)。
[0030]實施例6步驟A、米黑毛霉菌種活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCC N0.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL ；
步驟B、按照下述配方配制發(fā)酵營養(yǎng)基:
稱取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；將發(fā)酵營養(yǎng)基滅菌后，接入步驟A中的菌懸液，接種量為發(fā)酵營養(yǎng)基體積的萬分之一，在38°C下培養(yǎng) 72h ；
步驟C、培養(yǎng)72h后起流加硫酸銨和葡萄糖的混合液，并繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中維持葡萄糖的濃度為2% (同上)，發(fā)酵結束后按照實施例1中的方法測試發(fā)酵液中凝乳酶的活力為41(HMCU/mL。其中硫酸銨與葡萄糖的比例為150g: 1200g，混合液總濃度為60% (同上)。
[0031]若采用Arima方法測定發(fā)酵液樣品中凝乳酶的活力，具體方法如下:用0.01mol/L CaCl2溶液配制10%的脫脂奶粉溶液，取5mL 10%的脫脂奶粉液于35°C保溫10分鐘，加Λ 0.5mL適當稀釋的酶液，立即搖勻，開始計時，并把試管傾斜45度以上，沿試管軸方向旋轉，觀察試管壁上開始出現凝結小顆粒為終點，記錄凝乳時間。在上述條件下，40min凝乳ImL 10%脫脂奶粉的酶量定義為一個Soxhlet單位(SU)
酶活力(SU)=(供試乳體積/凝乳酶體積)XDX2400/t 式中，D為酶液稀釋倍數；t為反應時間。
[0032]按照上述方法測得的凝乳酶活力為:82000U/mL。
[0033]實施例7
步驟A、米黑毛霉菌種活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCC N0.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL ；
步驟B、按照下述配方配制發(fā)酵營養(yǎng)基:
稱取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；將發(fā)酵營養(yǎng)基滅菌后，接入步驟A中的菌懸液，接種量為發(fā)酵營養(yǎng)基體積的萬分之一，在42°C下培養(yǎng) 72h ；
步驟C、培養(yǎng)72h后起流加硫酸鈉和葡萄糖的混合液，并繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中維持葡萄糖的濃度為2% (同上)，發(fā)酵結束后按照實施例1中的方法測試發(fā)酵液中凝乳酶的活力為286MCU/mL。其中硫酸鈉與葡萄糖的比例為200g: 1200g，混合液總濃度為60% (同上)。
[0034]實施例8
步驟A、米黑毛霉菌種活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCC N0.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL ；
步驟B、按照下述配方配制發(fā)酵營養(yǎng)基:
稱取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；將發(fā)酵營養(yǎng)基滅菌后，接入步驟A中的菌懸液，接種量為發(fā)酵營養(yǎng)基體積的萬分之一，在38°C下培養(yǎng) 72h ；
步驟C、培養(yǎng)72h后起流加硫酸鉀和葡萄糖的混合液，并繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中維持葡萄糖的濃度為2% (同上)，發(fā)酵結束后按照實施例1中的方法測試發(fā)酵液中凝乳酶的活力為289MCU/mL。其中，硫酸鉀和葡萄糖的比例為200g: 1200g，混合液總濃度為60%(同上)。
[0035]實施例9
步驟A、米黑毛霉菌種活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCC N0.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL ；
步驟B、按照下述配方配制發(fā)酵營養(yǎng)基:
稱取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，接入步驟A中的菌懸液，接種量為發(fā)酵營養(yǎng)基體積的萬分之一，在38°C下培養(yǎng) 72h ； 步驟C、培養(yǎng)72h后起流加硫酸銨和葡萄糖的混合液，并繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中維持葡萄糖的濃度為2% (同上)，發(fā)酵結束后按照實施例1中的方法測試發(fā)酵液中凝乳酶的活力為285MCU/mL。其中硫酸銨與葡萄糖的比例為200g: 1200g，混合液總濃度為60% (同上)。
[0036]對比例I
按照以下配方配制營養(yǎng)基，大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升，滅菌后接入提前在種子罐中培養(yǎng)好的米黑毛霉(Mucor miehei ATCC16457)種子培養(yǎng)物(按相同比例配制的種子培養(yǎng)基)，接種量為萬分之一(V/V，菌懸液中孢子濃度為1012CFU/mL)，培養(yǎng)溫度38°C，培養(yǎng)96小時后結束培養(yǎng)，測得的發(fā)酵樣品中凝乳酶的活力為 21(HMCU/mL。
[0037]對比例2
按照以下配方配制營養(yǎng)基，大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升；滅菌后接入提前在種子罐中培養(yǎng)好的米黑毛霉(Mucor miehei ATCC16457)種子培養(yǎng)物(按相同比例配制的種子培養(yǎng)基)，接種量為萬分之一(V/V，菌懸液中孢子濃度為1012CFU/mL)，培養(yǎng)溫度38°C，72小時起流加葡萄糖溶液，濃度為60% (同上)，發(fā)酵過程維持葡萄糖濃度為2%(同上)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后結束培養(yǎng)，測得的發(fā)酵樣品中凝乳酶活力為236IMCU/mL0
[0038]將對比例和實施例1、進行比較，結果顯示:菌種活化與菌種擴大培養(yǎng)相比，經活化后直接發(fā)酵所得的凝乳酶的粗產品活力明顯提高，流加的葡萄糖和硫酸鹽參與了凝乳酶的代謝過程，從而進一步提高了凝乳酶的活力。
綜上所述，本發(fā)明去掉了菌種在種子罐中擴大培養(yǎng)的步驟，降低了微生物發(fā)酵生產過程中染菌的幾率，減少了能量消耗；且發(fā)酵活力與原有工藝的21(HMCU/mL相比，有了顯著的提聞，最聞可提聞95%。
【權利要求】
1.一種利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法，其特征在于包括以下步驟: 步驟A、米黑毛霉菌種活化:米黑毛霉(Mucor miehei)菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，編號為ATCC N0.16457，活化后菌懸液中孢子濃度不小于1012CFU/mL ； 步驟B、配制發(fā)酵營養(yǎng)基、滅菌，接入步驟A中的菌懸液，并在38~42°C下培養(yǎng)； 步驟C、從培養(yǎng)72h起、流加可溶性硫酸鹽和還原糖的混合液，再繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)24h，發(fā)酵過程中IOOmL培養(yǎng)基含有2g還原糖，發(fā)酵得含有凝乳酶的粗樣品。
2.根據權利要求1所述的利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法，其特征在于步驟B中所述菌懸液的接種量為發(fā)酵營養(yǎng)基體積的萬分之一。
3.根據權利要求1所述的利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法，其特征在于步驟B中所述發(fā)酵營養(yǎng)基的配制方法為:稱取大豆粉630g，玉米粉2400g，硫酸鈉105g，葡萄糖183g，用水定容至30升。
4.根據權利要求1所述的利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法，其特征在于步驟B和步驟C中培養(yǎng)溫度為38 °C。
5.根據權利要求1所述的利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法，其特征在于步驟C中IOOmL混合液溶有可溶性硫酸鹽與還原糖60g，其中可溶性硫酸鹽與還原糖的重量份數比為:20-200:1200o
6.根據權利要求5所述的利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法，其特征在于可溶性硫酸鹽與還原糖的重量份數比為150:1200。
7.根據權利要求1或5所述的利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法，其特征在于所述可溶性硫酸鹽為硫酸鈉、硫酸鉀或硫酸銨，還原糖為葡萄糖。
8.根據權利要求7所述的利用米黑毛霉生產凝乳酶的方法，其特征在于所述可溶性硫酸鹽為硫酸銨。
【文檔編號】C12N9/64GK103740685SQ201310472404
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年10月11日 優(yōu)先權日:2013年10月11日
【發(fā)明者】孟乙 申請人:孟乙