一種dc疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及胃癌或乳腺癌的DC疫苗及其制備方法和應(yīng)用，根據(jù)腫瘤抗原的氨基酸順序構(gòu)建一個(gè)重組重疊肽融合蛋白，重疊肽融合蛋白由一系列15個(gè)氨基酸組成的多肽組成，相鄰二個(gè)多肽有11個(gè)氨基酸是完全重疊相同，重疊肽之間由相同的酶切位點(diǎn)li-key連接，所述的重組重疊肽融合蛋白的基因通過NdeI和BamH酶切位點(diǎn)亞克隆到pET28載體，重組重疊肽融合蛋白經(jīng)大腸桿菌表達(dá)后分離純化，從人血體外分離的PBMC與GM-CSF和重組重疊肽融合蛋白共培養(yǎng)，重組重疊肽融合蛋白再經(jīng)DC內(nèi)吞，細(xì)胞內(nèi)酶切后產(chǎn)生一系列不確定的重疊肽，其中含有CTL表型和/或Th表型，結(jié)合到DC的MHC?I和MHC?II分子使DC成熟，得到所述的DC疫苗，本發(fā)明與體外用合成的每一個(gè)肽刺激DC的方法相比，刺激DC效益快且費(fèi)用低。
【專利說明】一種DC疫苗及其制備方法和應(yīng)用
[【技術(shù)領(lǐng)域】]
[0001]本發(fā)明涉及DC疫苗及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及胃癌或乳腺癌的DC疫苗及其制備方法和應(yīng)用。
[【背景技術(shù)】]
[0002]以DC為基礎(chǔ)的免疫療法在當(dāng)今腫瘤治療中是最有價(jià)值也是最有前途的方法之一。腫瘤細(xì)胞與DC融合、腫瘤抗原致敏、基因轉(zhuǎn)染等成為以DC為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療有效途徑。修飾后DC體內(nèi)回輸后可誘導(dǎo)出特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和早期臨床實(shí)驗(yàn)中取得了極具價(jià)值的結(jié)果。
[0003]I)乙肝病毒的治療可能因?yàn)镈C功能和作用的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)而得到快速發(fā)展，目前雖然已經(jīng)有學(xué)者應(yīng)用特異性DC治療CHB患者，但是其安全性和可靠性還需要進(jìn)一步的評(píng)價(jià)，而對(duì)DC的基礎(chǔ)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還應(yīng)該進(jìn)一步開展，總之，對(duì)乙型肝炎的免疫治療將會(huì)成為重要的臨床治療方法，DC在這個(gè)治療策略中將起到至關(guān)重要的作用。
[0004]2)自從1996年美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Hsu等在Nature Medicine上報(bào)道了全球首項(xiàng)DC腫瘤疫苗臨床研究以來，基于DC的腫瘤免疫治療方法一直處于研究中，一系列臨床研究正在進(jìn)行中或已經(jīng)完成。目前全球范圍內(nèi)已經(jīng)有3支DC腫瘤疫苗獲得了上市批準(zhǔn):sipuleucel-T (Dendreon,美國)、CreaVaxRCC (CreaGene,韓國)和 Hybricell (GenoaBiotechnologia,巴西)，DC腫瘤疫苗已經(jīng)由實(shí)驗(yàn)室走上臨床，其可行性和安全性以及對(duì)部分患者的有效性已經(jīng)得以證實(shí) 。但從總體上來看，DC腫瘤疫苗誘導(dǎo)的臨床反應(yīng)仍有限，受制于DC的成熟度、與臨床反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)、外源性負(fù)載的表位數(shù)量較少等因素，這表明傳統(tǒng)DC腫瘤疫苗功能可能需要進(jìn)一步改進(jìn)，而基因修飾的表達(dá)腫瘤抗原和增強(qiáng)免疫反應(yīng)的免疫刺激分子、細(xì)胞因子或趨化因子以及下調(diào)免疫負(fù)調(diào)控分子(如SOCSl等)的DC將有助于這些問題的解決。
[0005]3) 2010年Dendreon公司樹突狀細(xì)胞疫苗Provenge獲美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市、2011年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)花落DC之父斯坦曼教授都是非常具有劃時(shí)代意義的事件。在Dendron，DC在體外負(fù)載GM-CSF和PAP融合蛋白后回輸病人，啟動(dòng)體內(nèi)免疫機(jī)制。DC與腫瘤表位肽結(jié)合之后，可誘導(dǎo)⑶8+CTL及⑶4+T輔助細(xì)胞的應(yīng)答及Thl和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)。Dendron的Provenge是第一個(gè)在市場上的細(xì)胞治療產(chǎn)物(DC疫苗)，為細(xì)胞治療腫瘤和腫瘤疫苗提供了廣闊的新藥市場。
[0006]4) 10多年的臨床前研究和臨床研究已經(jīng)證實(shí)單純基因修飾DC治療或它與其他治療手段聯(lián)合治療的安全性和有效性，它將是未來DC腫瘤疫苗發(fā)展的一個(gè)重要方向，尤其是應(yīng)用于常規(guī)治療手段后的微小殘留病灶的輔助治療或與其他抗腫瘤或免疫增強(qiáng)治療手段的聯(lián)合治療。
[0007]5)近期，也有多項(xiàng)應(yīng)用DC疫苗治療膠質(zhì)瘤的研究結(jié)果發(fā)表、公布。2011年3月《Clinical Cancer Research》雜志刊登了一項(xiàng)應(yīng)用樹突狀細(xì)胞疫苗治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究結(jié)果。研究表明，接受免疫治療后的效果十分理想，患者的總生存期31.4月明顯高于常規(guī)放化療患者的18.6月，并且有3例初發(fā)GBM患者隨訪時(shí)間大于6年。較之于上述研究只是單純負(fù)載膠質(zhì)瘤細(xì)胞，中心的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞DC疫苗同時(shí)負(fù)載了膠質(zhì)瘤細(xì)胞、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，從治療原理上講，其從源頭上阻止膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)這一膠質(zhì)瘤治療的瓶頸，提高膠質(zhì)瘤治療的總體療效的作用更值得期待。
[0008]腫瘤疫苗是近年研究的熱點(diǎn)之一，其原理是通過激活患者自身免疫系統(tǒng)，利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，以達(dá)到清除或控制腫瘤的目的。以樹突狀細(xì)胞(DC)為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗是新的一類腫瘤疫苗，已成為腫瘤生物治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。有證據(jù)表明，很多腫瘤細(xì)胞不能引起機(jī)體抗腫瘤免疫作用的機(jī)制，并不是由于缺乏腫瘤抗原，而是機(jī)體的抗原提呈細(xì)胞(APC)不能將腫瘤抗原呈遞給免疫系統(tǒng)。DC是APC的一種，其數(shù)量的不足和缺乏抗原提呈能力與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。樹突狀細(xì)胞是已知機(jī)體內(nèi)抗原呈遞能力最強(qiáng)的細(xì)胞，它能捕獲抗原，并將信息傳遞給T、B淋巴細(xì)胞，從而引發(fā)一系列的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，如果將腫瘤抗原注入樹突狀細(xì)胞，將可引起機(jī)體特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。這種DC的疫苗就是應(yīng)用足夠量和功能正常的DC細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫療法，此方法已經(jīng)在動(dòng)物模型中獲得成功，使動(dòng)物產(chǎn)生了抗腫瘤的特異性免疫反應(yīng)，并且可抑制鼠腫瘤的生長。目前在國外前列腺癌、黑色素瘤、腎癌、惡性淋巴瘤等腫瘤的治療中進(jìn)入臨床研究階段，尤其是Dendron的前列腺癌樹突狀細(xì)胞瘤苗Provenge,已被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場,用于治療前列腺癌。但是，對(duì)大多數(shù)治療腫瘤的DC疫苗，理論上在抗原的選用上還存在一些問題:I)作為抗原的腫瘤裂解物，通常不易得到足夠數(shù)量的碎片，并可能引起對(duì)自身抗原的免疫應(yīng)答，不適應(yīng)于臨床應(yīng)用。2)合成抗原肽段，由于免疫應(yīng)答的嚴(yán)格MHC限制性，使其臨床應(yīng)用受到限制。3)每個(gè)病人的腫瘤抗原并不完全相同，且抗原經(jīng)DC加工所攜帶的多肽與腫瘤組織上的抗原肽也有可能不盡相同。
[
【發(fā)明內(nèi)容】
]
[0009]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足和缺陷，本發(fā)明提供一種根據(jù)腫瘤抗原的氨基酸順序構(gòu)建一個(gè)重組的重疊肽(recombinant overlapping peptide, R0P)的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。`
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的設(shè)計(jì)一種DC疫苗的制備方法，由以下步驟組成:
[0011]根據(jù)腫瘤抗原的氨基酸順序構(gòu)建一個(gè)重組重疊肽融合蛋白，重疊肽融合蛋白由一系列15個(gè)氨基酸組成的多肽組成，相鄰二個(gè)多肽有11個(gè)氨基酸是完全重疊相同，重疊肽之間由相同的酶切位點(diǎn)l1-key連接，(比如一個(gè)長度為30個(gè)氨基酸的抗原，設(shè)計(jì)的第一個(gè)肽為從N端的第I個(gè)氨基酸至第15個(gè)氨基酸，第二個(gè)肽為從N端的第4個(gè)氨基酸至第19個(gè)氨基酸，其中兩肽間有11個(gè)氨基酸重疊；第三個(gè)肽為從N端的第7個(gè)氨基酸至第22個(gè)氨基酸，其中第二肽和第三肽間有11個(gè)氨基酸重疊；依次類推設(shè)計(jì)重疊肽至抗原順序C端。)
[0012]所述的重組重疊肽融合蛋白的基因通過NdeI和BamH酶切位點(diǎn)亞克隆到pET28載體，
[0013]重組重疊肽融合蛋白經(jīng)大腸桿菌表達(dá)后分離純化，
[0014]從人血體外分離的PBMC與GM-CSF和重組重疊肽融合蛋白共培養(yǎng)，重組重疊肽融合蛋白再經(jīng)DC內(nèi)吞,酶切后產(chǎn)生一系列不確定的重疊肽，其中含有CTL表型和/或Th表型，[0015]結(jié)合到DC的MHC I和MHC II分子使DC成熟，得到所述的DC疫苗。
[0016]本發(fā)明還包括一種鑒定DC成熟的方法，由以下步驟組成:
[0017]根據(jù)腫瘤抗原的氨基酸順序構(gòu)建一個(gè)重組重疊肽融合蛋白，重疊肽融合蛋白由一系列15個(gè)氨基酸組成的多肽組成，相鄰二個(gè)多肽有11個(gè)氨基酸是完全重疊相同，重疊肽之間由相同的酶切位點(diǎn)l1-key連接，(比如一個(gè)長度為30個(gè)氨基酸的抗原，設(shè)計(jì)的第一個(gè)肽為從N段端的第I個(gè)氨基酸至第15個(gè)氨基酸，第二個(gè)肽為從N段端的第4個(gè)氨基酸至第19個(gè)氨基酸，其中兩肽間有11個(gè)氨基酸重疊；第三個(gè)肽為從N段端的第7個(gè)氨基酸至第22個(gè)氨基酸，其中第二肽和第三肽間有11個(gè)氨基酸重疊；依次類推設(shè)計(jì)重疊肽至抗原順序C端。)
[0018]所述的重組重疊肽融合蛋白的基因通過NdeI和BamH酶切位點(diǎn)亞克隆到pET28載體，
[0019]重組重疊肽融合蛋白經(jīng)大腸桿菌表達(dá)后分離純化，
[0020]從人血體外分離的PBMC與GM-CSF和重組重疊肽融合蛋白共培養(yǎng)，再加GM-CSF和IL-4，36小時(shí)共培養(yǎng)使之成熟，收集細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀測定DC的CD54表達(dá)和T細(xì)胞的⑶69表達(dá)。
[0021]所述的測定DC的⑶54表達(dá)的方法由以下步驟組成:PBMC和重組重疊肽融合蛋白共培養(yǎng)36小時(shí)后，取IO6細(xì)胞，用緩沖液洗兩次后懸浮在100 μ I的緩沖液中，加抗人⑶54-FITC抗體在4C染色30分鐘，緩沖液洗一次后懸浮在500 μ I的緩沖液中，然后通過流式細(xì)胞儀分析。
[0022]所述的測定T細(xì)胞的⑶ 69表達(dá)的方法由以下步驟組成:PBMC和重組重疊肽融合蛋白共培養(yǎng)36小時(shí)后，取IX IO6細(xì)胞，用緩沖液洗兩次后懸浮在100μ I的緩沖液中，加抗人CD69-FITC抗體和抗人CD4-PE抗體或抗人CD69-FITC抗體和抗人CD8-PE抗體在4°C雙色染色30分鐘，緩沖液洗一次后懸浮在500 μ I的緩沖液中，最后通過流式細(xì)胞儀分析。
[0023]所述DC疫苗可以用于制造胃癌或乳腺癌治療藥物。
[0024]本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，基因表達(dá)重組重疊肽，與合成每一個(gè)肽相比，刺激DC效益快且費(fèi)用低。理論上，根據(jù)腫瘤特異性表達(dá)的基因可設(shè)計(jì)任何腫瘤抗原相關(guān)的重疊肽。用重組的重疊肽(R0P)，能滿足所有抗原肽。鑒定DC成熟的方法是獨(dú)創(chuàng)的。
[【專利附圖】

【附圖說明】]
[0025]圖1為DC激活的示意圖；
[0026]圖2為第一天和第三天PBMC上⑶54的表達(dá)示意圖；
[0027]圖3為第一天和第三天PBMC中的⑶4和⑶8Τ細(xì)胞上⑶69的表達(dá)示意圖
[【具體實(shí)施方式】]
[0028]為了使本發(fā)明更加清楚，結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)當(dāng)理解，本實(shí)施例并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029]采用了一個(gè)新的DC疫苗戰(zhàn)略，根據(jù)腫瘤抗原的氨基酸順序構(gòu)建一個(gè)重組的重疊妝(recombinant overlapping peptide, R0P)的融合蛋白。ROP融合蛋白由一系列15個(gè)氨基酸組成的多肽組成，相鄰二個(gè)多肽有11個(gè)氨基酸是完全重疊相同，重疊肽之間由相同的酶切位點(diǎn)l1-key (LRMK)連接，構(gòu)建的編碼TEV的基因通過NdeI和BamH酶切位點(diǎn)亞克隆到PET28載體。重疊肽融合蛋白經(jīng)大腸桿菌表達(dá)后分離純化。從人血體外分離的PBMC與GM-CSF和ROP融合蛋白共培養(yǎng)，ROP融合蛋白再經(jīng)DC內(nèi)吞，細(xì)胞內(nèi)酶切后產(chǎn)生一系列不確定的R0P，其中含有CTL表型和Th表型，經(jīng)加工可結(jié)合到DC的MHC I和MHC II分子使DC成熟?；剌敵墒斓腄C能在體內(nèi)刺激CD8和CD4細(xì)胞而啟動(dòng)免疫應(yīng)答，殺死腫瘤細(xì)胞。這個(gè)方法是用不確定的腫瘤抗原肽致敏DC誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，無需確證個(gè)別的抗原肽，只需知道腫瘤抗原(或病毒)的氨基酸順序。用重組的重疊肽(R0P)，能滿足所有抗原肽。
[0030]DC進(jìn)行腫瘤免疫治療的主要機(jī)制有:①DC攝取腫瘤抗原，經(jīng)加工處理后，提呈給CD4+T細(xì)胞，使之活化并發(fā)揮抗瘤效應(yīng)；或提呈給CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)DC通過表達(dá)細(xì)胞表面高水平的MHC-1和II類分子提呈了腫瘤抗原肽，使相應(yīng)的T細(xì)胞受體(T lymphocyte receptor,TCR)被充分占據(jù)；同時(shí),DC提供高水平的協(xié)同刺激分子B7-1 (⑶80) B7-2 (⑶86)⑶40分子等，使T細(xì)胞被充分激活DC可通過合成和分泌一些細(xì)胞因子，發(fā)揮抗腫瘤作用，如IL-12。IL-12誘導(dǎo)T細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生大量的TNF、穿孔素和顆粒酶，從而使腫瘤細(xì)胞溶解。我們將根據(jù)腫瘤抗原Survivin和Her-2基因順序設(shè)計(jì)重疊肽。
[0031]構(gòu)建的質(zhì)粒所編碼重疊肽經(jīng)表達(dá)后得到分離純化。
[0032]體外實(shí)驗(yàn)證明純化后的重疊肽能負(fù)載到從病人血分離的PBMC，經(jīng)GM-CSF處理后的DC在三天后被激活；
[0033]激活的DC表達(dá)⑶54，且能刺激⑶4和⑶8表達(dá)⑶69。
[0034]DC激活的⑶8T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用。
[0035]動(dòng)物模型顯示DC疫苗能對(duì)產(chǎn)生胃癌或乳腺癌的裸鼠有治療作用。
`[0036]經(jīng)檢測后的DC細(xì)胞回輸給病人，胃癌和乳腺癌的DC疫苗臨床試驗(yàn)。
[0037]其具體步驟如下:
[0038]重組重疊肽(ROP)的質(zhì)粒構(gòu)建例子:
[0039]蛋白質(zhì)抗原TEV從N端起被設(shè)計(jì)成一些列15個(gè)氨基酸的多肽，相鄰兩者間有大約11個(gè)氨基酸是完全重疊的。多肽間的連接位點(diǎn)是l1-key (LRMK)。在TEV專一識(shí)別位點(diǎn)ENLYQS有六個(gè)寡聚的His。編碼ROP融合蛋白的基因通過NdeI和BamHI酶切位點(diǎn)連到PET28載體上。帶有ROP的載體可以在E.coli中表達(dá)。
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種DC疫苗的制備方法，其特征在于由以下步驟組成: 根據(jù)腫瘤抗原的氨基酸順序構(gòu)建一個(gè)重組重疊肽融合蛋白，重疊肽融合蛋白由一系列15個(gè)氨基酸組成的多肽組成，相鄰二個(gè)多肽有11個(gè)氨基酸是完全重疊相同重疊肽之間由相同的酶切位點(diǎn)l1-key連接，所述的重組重疊肽融合蛋白的基因通過NdeI和BamH酶切位點(diǎn)亞克隆到PET28載體，重組重疊肽融合蛋白經(jīng)大腸桿菌表達(dá)后分離純化，從人血體外分離的PBMC與GM-CSF和重組重疊肽融合蛋白共培養(yǎng)，重組重疊肽融合蛋白再經(jīng)DC內(nèi)吞，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)酶切后產(chǎn)生一系列不確定的重疊肽，其中含有CTL表型和/或Th表型，結(jié)合到DC的MHC I和MHC II分子使DC成熟，得到所述的DC疫苗。
2.一種鑒定DC成熟的方法，其特征在于由以下步驟組成: 根據(jù)腫瘤抗原的氨基酸順序構(gòu)建一個(gè)重組重疊肽融合蛋白，重疊肽融合蛋白由一系列15個(gè)氨基酸組成的多肽組成，相鄰二個(gè)多肽有11個(gè)氨基酸是完全重疊相同，重疊肽之間由相同的酶切位點(diǎn)l1-key連接， 所述的重組重疊肽融合蛋白的基因通過NdeI和BamH酶切位點(diǎn)亞克隆到pET28載體， 重組重疊肽融合蛋白經(jīng)大腸桿菌表達(dá)后分離純化， 從人血體外分離的PBMC與GM-CSF和重組重疊肽融合蛋白共培養(yǎng)，再加GM-CSF和IL-4，36小時(shí)共培養(yǎng)使之成熟，收集細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀測定DC的CD54表達(dá)和T細(xì)胞的⑶69表達(dá)。
3.如權(quán)利要求2所述的鑒定DC成熟的方法，其特征在于所述的測定DC的CD54表達(dá)的方法由以下步驟組成=PBMC和重組重疊肽融合蛋白共培養(yǎng)36小時(shí)后，取IO6細(xì)胞，用緩沖液洗兩次后懸浮在100 μ I的緩沖液中，加抗人⑶54-FITC抗體在4°C染色30分鐘，緩沖液洗一次后懸浮在500μ I的緩沖液中，然后通過流式細(xì)胞儀分析。
4.如權(quán)利要求2所述的鑒定DC成熟的方法，其特征在于所述的測定T細(xì)胞的CD69表達(dá)的方法由以下步驟組成=PBMC和重組重疊肽融合蛋白共培養(yǎng)36小時(shí)后，取IXlO6細(xì)胞，用緩沖液洗兩次后懸浮在100 μ I的緩沖液中，加抗人⑶69-FITC抗體和抗人⑶4-ΡΕ抗體或抗人⑶69-FITC抗體和抗人⑶8-ΡΕ抗體在4°C雙色染色30分鐘，緩沖液洗一次后懸浮在500 μ I的緩沖液中，最后通過流式細(xì)胞儀分析。
5.一種用權(quán)利要求1制備方法得到的DC疫苗。
6.一種權(quán)利要求2所述DC疫苗用于制造胃癌或乳腺癌治療藥物的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/0784GK103495157SQ201310444612
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】施煒星, 丁航海, 姜石松, 夏小兵, 陳瑛, 楊春霞 申請(qǐng)人:常州牛津石松生物科技有限公司