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一種高效發(fā)酵綠色木霉制備纖維素酶的方法

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一種高效發(fā)酵綠色木霉制備纖維素酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高效發(fā)酵綠色木霉制備纖維素酶的方法。采用方法的要點(diǎn)是將綠色木霉接種于察氏培養(yǎng)基上活化,挑取單菌落接種于液體活化培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)得到種子液,按照體積比1:10~20的接種量接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,40至60目毛竹粉5~20g/L作為發(fā)酵底物,液體發(fā)酵72~120h制備纖維素酶。該方法穩(wěn)定、高效,特別適用于綠色木霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。本發(fā)明針對(duì)綠色木霉生理特性優(yōu)化得到一套高效液體發(fā)酵工藝,可以獲得高酶活力的纖維素酶;同時(shí)提出資源化利用毛竹原料作為纖維素酶誘導(dǎo)底物,制備高附加值生物酶制劑,是高值化利用毛竹資源的一條創(chuàng)新思路,可切實(shí)提高我國(guó)竹區(qū)農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【專利說(shuō)明】一種高效發(fā)酵綠色木霉制備纖維素酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備纖維素酶的方法,特別涉及一種高效發(fā)酵綠色木霉制備纖維素酶的方法,屬于生物化學(xué)中微生物培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶是一組能夠水解纖維素分子鏈的葡萄糖苷鍵使其轉(zhuǎn)化成葡萄糖的多組分酶的總稱,是幾種具有不同酶活力的酶復(fù)合物,主要包括外切纖維素酶、內(nèi)切纖維素酶、
葡萄糖苷酶等。纖維素需要這些酶的共同出現(xiàn)并協(xié)同作用、共同催化才能被完全降解。 利用纖維素酶將纖維素轉(zhuǎn)化為食品、能源、化工材料,對(duì)解決人類面臨的諸多資源、環(huán)境問(wèn)題具有極大的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]當(dāng)前阻礙人類廣泛高效利用纖維素酶的瓶頸,一是缺少纖維素酶高產(chǎn)菌,二是發(fā)酵產(chǎn)酶工藝仍待進(jìn)一步優(yōu)化。目前用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物菌種較多的是絲狀真菌, 其中,酶活力較強(qiáng)的菌種為木霉屬、曲霉屬和青霉屬,特別是綠色木霉及其近緣菌株較為典型,是公認(rèn)較好的纖維素酶生產(chǎn)菌。此外,反芻動(dòng)物依靠瘤胃微生物可消化纖維素,如瘤胃細(xì)菌和熱纖梭菌等,但產(chǎn)量和活性較低。國(guó)內(nèi)外纖維素酶的制備方法主要有固體發(fā)酵法和液體發(fā)酵法兩種。固體發(fā)酵設(shè)備投資少,但占地面積大、易染雜菌、生產(chǎn)穩(wěn)定性較差,而且技術(shù)不易掌握,難以進(jìn)行擴(kuò)大化生產(chǎn),目前我國(guó)多數(shù)企業(yè)仍采用固體發(fā)酵工藝制備纖維素酶;液體發(fā)酵具有生產(chǎn)穩(wěn)定性高、技術(shù)易掌握、便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì),但因纖維素酶為誘導(dǎo)酶,采用玉米秸、麥秸、稻草等作為誘導(dǎo)物,效果并不十分理想,因此企業(yè)紛紛采用價(jià)格昂貴的木材作為原料,大大增加了企業(yè)生產(chǎn)成本,制約了纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)的推廣和應(yīng)用。
[0004]在發(fā)酵微生物制備纖維素酶領(lǐng)域,中國(guó)專利(ZL200810023480.8) “一種提高纖維素酶產(chǎn)量的里氏木霉培養(yǎng)方法”在里氏木霉產(chǎn)酶過(guò)程中調(diào)節(jié)通風(fēng)量,使產(chǎn)酶主要階段溶解氧濃度在20~30%,以利于菌體生長(zhǎng),產(chǎn)出的纖維素酶較固定通風(fēng)量產(chǎn)酶的濾紙酶活提高30%,產(chǎn)酶時(shí)間縮短14% ;中國(guó)專利(ZL200510009000.9) “高活性纖維素酶及其制造方法”以擔(dān)子菌CGMCCN0.1294作為生產(chǎn)菌種,滅菌接入三角瓶液體菌種,進(jìn)行液體深層發(fā)酵, 經(jīng)過(guò)濾、濃縮和噴霧干燥制成纖維素酶粉,測(cè)定產(chǎn)酶活力為40000u/g,且過(guò)程穩(wěn)定性好、不易染菌、便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn);中國(guó)專利(ZL200610002014.2) “微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶的方法”將產(chǎn)生纖維素酶的微生物逐級(jí)低溫馴化,使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好,經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酶,根據(jù)不同需要和使用對(duì)象,將粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化,制備不同活性、純度和劑型的纖維素酶制劑;美國(guó)專利(US61110732) “Hosts an`d fermentation processes for cellulase production”將經(jīng)過(guò)基因改性的絲狀真菌作為培養(yǎng)菌種,以 25~100wt%的半纖維素來(lái)源醇糖和0~75wt%的葡萄糖、丙三醇或者二者的混合物作為碳源,發(fā)酵制備同時(shí)含有纖維素酶和半纖維素酶活力的復(fù)合酶。美國(guó)專利(US60920942) “Process for producing cellulase”將長(zhǎng)枝木霉、木素木霉、黑曲霉、木曲霉通過(guò)不同培養(yǎng)和發(fā)酵工藝,同時(shí)制備纖維素酶和槐糖脂兩種產(chǎn)品。截至目前,還未見(jiàn)到利用毛竹原料作為誘導(dǎo)底物,高效發(fā)酵綠色木霉制備纖維素酶的相關(guān)工藝技術(shù)出現(xiàn)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決目前微生物發(fā)酵制備纖維素酶工藝過(guò)程的菌種產(chǎn)酶效率低、固體發(fā)酵穩(wěn)定性差、誘導(dǎo)底物效果不理想等實(shí)際問(wèn)題,同時(shí)資源化利用我國(guó)豐富、價(jià)格低廉的毛竹資源,制備高附加值生物酶制劑,本發(fā)明目的是提供一種高效發(fā)酵綠色木霉制備纖維素酶的方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案是采用以下步驟:
[0007]I)將未經(jīng)活化的綠色木霉在無(wú)菌環(huán)境中以無(wú)菌水溶解,采用平板劃線法將菌種接種于察氏培養(yǎng)基上,在24~32°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72~168h,至生長(zhǎng)出單菌落,得到經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉;
[0008]2)將步驟I)得到的經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉在無(wú)菌環(huán)境中挑取單菌落,接種于液體活化培養(yǎng)基中,在24~32°C、180~260r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)48~72h,得到擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液;
[0009]3)將步驟2)得到的擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液按照體積比1:10~20的接種量接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,按照60%的裝入量裝入發(fā)酵罐中,產(chǎn)酶培養(yǎng)制備纖維素酶,控制發(fā)酵液pH 值3~7、發(fā)酵溫度24~32°C、通氣量1:0.4~1.2、發(fā)酵時(shí)間72~120h,得到的發(fā)酵液在 4000r/min的冷凍離心機(jī)中離心IOmin,采用截留分子量100~500k的聚醚砜膜濃縮使其濃度提升20倍,得到纖維素酶。
[0010]所述的液體活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖10~20g/L、蛋白胨I~2g/L、 Tween800.2~0.4g/L、硫酸銨I~2g/L、磷酸二氫鉀I~3g/L、硫酸鎂0.1~0.3g/L、氯化鈣0.1~0.3g/L、尿素0.4~0.8g/L、占液體活化培養(yǎng)基總體積10~20%的Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽、溶劑為PH=3~7的PBS,120°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0011]所述的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為:葡萄糖4~6g/L、40至60目毛竹粉5~20g/L、 Tween800.2~0.6g/L、硫酸銨I~3g/L、磷酸二氫鉀3~5g/L、硫酸鎂0.3~0.5g/L、氯化鈣0.3~0.5g/L、尿素0.8~1.2g/L,占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積0.1~0.3%的Mandels微量元素、溶劑為pH=3~7的PBS,120°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0012]與【背景技術(shù)】相比,本發(fā)明具有的有益效果是:
[0013]本發(fā)明在發(fā)酵制備纖維素酶的微生物菌種中引入綠色木霉,針對(duì)綠色木霉的生理特性優(yōu)化得到一套高效液體發(fā)酵工藝,在此工藝下可以獲得高酶活力的纖維素酶;`同時(shí)提出資源化利用毛竹原料作為纖維素酶的誘導(dǎo)底物,制備高附加值生物酶制劑,是高值化利用毛竹資源的一條創(chuàng)新思路,符合國(guó)家發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)政策,并可切實(shí)提高我國(guó)竹區(qū)農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是實(shí)施例3經(jīng)過(guò)察氏培養(yǎng)基活化生長(zhǎng)出單菌落的綠色木霉照片;
[0015]圖2是依據(jù)實(shí)施例3的工藝條件,在不同發(fā)酵時(shí)間段制備的纖維素酶的CMC酶活。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。[0017]實(shí)施例1:
[0018]I)將未經(jīng)活化的綠色木霉在無(wú)菌環(huán)境中以無(wú)菌水溶解,采用平板劃線法將菌種接種于察氏培養(yǎng)基上,在24°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h,至生長(zhǎng)出單菌落,得到經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉;
[0019]2)將步驟I)得到的經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉在無(wú)菌環(huán)境中挑取單菌落,接種于液體活化培養(yǎng)基中,在24°C、180r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)48h,得到擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液;(液體活化培養(yǎng)基配方:葡萄糖10g/L、蛋白胨lg/L、Tween800.2g/L、硫酸銨lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、 硫酸鎂0.lg/L、氯化鈣0.lg/L、尿素0.4g/L、占液體活化培養(yǎng)基總體積10%的Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽、溶劑為PH=3的PBS,120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0020]3)將步驟2)得到的擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液按照體積比1:10的接種量接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,按照60%的裝入量裝入發(fā)酵罐中,產(chǎn)酶培養(yǎng)制備纖維素酶,控制發(fā)酵液PH值3、發(fā)酵溫度24°C、通氣量1:0.4、發(fā)酵時(shí)間72h,得到的發(fā)酵液在4000r/min的冷凍離心機(jī)中離心 lOmin,采用截留分子量IOOk的聚醚砜膜濃縮使其濃度提升20倍,得到纖維素酶(a)。(液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方:葡萄糖4g/L、40至60目毛竹粉5g/L、Tween800.2g/L、硫酸銨lg/L、磷酸二氫鉀3g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.3g/L、尿素0.8g/L,占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積0.1% 的Mandels微量元素、溶劑為pH=3的PBS,120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0021]實(shí)施例2:
[0022]I)將未經(jīng)活化的綠色木霉在無(wú)菌環(huán)境中以無(wú)菌水溶解,采用平板劃線法將菌種接種于察氏培養(yǎng)基上,在28°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)108h,至生長(zhǎng)出單菌落,得到經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉;
[0023]2)將步驟I)得到的經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉在無(wú)菌環(huán)境中挑取單菌落,接種于液體活化培養(yǎng)基中,在28°C、220r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)60h,得到擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液;(液體活化培養(yǎng)基配方:葡萄糖15g/L、蛋白胨1.5g/L、Tween800.3g/L、硫酸銨1.5g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.2g/L、氯化鈣0.2g/L、尿素0.6g/L、占液體活化培養(yǎng)基總體積15%的 Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽、溶劑為pH=5的PBS,120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0024]3)將步驟2)得到的擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液按照體積比1:15的接種量接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,按照60%的裝入量裝入發(fā)酵罐中,產(chǎn)酶培養(yǎng)制備纖維素酶,控制發(fā)酵液pH值5、 發(fā)酵溫度28°C、通氣量1:0.8、發(fā)酵時(shí)間96h,得到的發(fā)酵液在4000r/min的冷凍離心機(jī)中離心lOmin,采用截留分子量300k的聚醚砜膜濃縮使其濃度提升20倍,得到纖維素酶(b)。 (液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方:葡萄糖5g/L、40至60目毛竹粉10g/L、Tween800.4g/L、硫酸銨2`g/ L、磷酸二氫鉀4g/L、硫酸鎂0.4g/L、氯化鈣0.4g/L、尿素1.0g/L,占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積
0.2%的Mandels微量元素、溶劑為pH=5的PBS,120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0025]實(shí)施例3:
[0026]I)將未經(jīng)活化的綠色木霉在無(wú)菌環(huán)境中以無(wú)菌水溶解,采用平板劃線法將菌種接種于察氏培養(yǎng)基上,在30°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)144h,至生長(zhǎng)出單菌落,得到經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉;
[0027]2)將步驟I)得到的經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉在無(wú)菌環(huán)境中挑取單菌落,接種于液體活化培養(yǎng)基中,在30°C、240r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)72h,得到擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液;(液體活化培養(yǎng)基配方:葡萄糖20g/L、蛋白胨2g/L、Tween800.3g/L、硫酸銨1.5g/L、磷酸二氫鉀2g/L、硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.2g/L、尿素0.8g/L、占液體活化培養(yǎng)基總體積15%的Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽、溶劑為pH=5的PBS,120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0028]3)將步驟2)得到的擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液按照體積比1:15的接種量接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,按照60%的裝入量裝入發(fā)酵罐中,產(chǎn)酶培養(yǎng)制備纖維素酶,控制發(fā)酵液PH值5、發(fā)酵溫度30°C、通氣量1: 1、發(fā)酵時(shí)間108h,得到的發(fā)酵液在4000r/min的冷凍離心機(jī)中離心 lOmin,采用截留分子量300k的聚醚砜膜濃縮使其濃度提升20倍,得到纖維素酶(C)。(液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方:葡萄糖6g/L、40至60目毛竹粉15g/L、Tween800.4g/L、硫酸銨1.5g/ L、磷酸二氫鉀4g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈣0.4g/L、尿素1.2g/L,占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積 0.15%的Mandels微量元素、溶劑為pH=5的PBS,120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0029]實(shí)施例4:
[0030]I)將未經(jīng)活化的綠色木霉在無(wú)菌環(huán)境中以無(wú)菌水溶解,采用平板劃線法將菌種接種于察氏培養(yǎng)基上,在32°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)168h,至生長(zhǎng)出單菌落,得到經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉;
[0031]2)將步驟I)得到的經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉在無(wú)菌環(huán)境中挑取單菌落,接種于液體活化培養(yǎng)基中,在32°C、260r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)72h,得到擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液;(液體活化培養(yǎng)基配方:葡萄糖20g/L、蛋白胨2g/L、Tween800.4g/L、硫酸銨2g/L、磷酸二氫鉀3g/L、 硫酸鎂0.3g/L、氯化鈣0.3g/L、尿素0.8g/L、占液體活化培養(yǎng)基總體積20%的Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽、溶劑為PH=7的PBS,120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0032]3)將步驟2)得到的擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液按照體積比1:20的接種量接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,按照60%的裝入量裝入發(fā)酵罐中,產(chǎn)酶培養(yǎng)制備纖維素酶,控制發(fā)酵液pH值7、 發(fā)酵溫度32°C、通氣量1: 1.2、發(fā)酵時(shí)間120h,得到的發(fā)酵液在4000r/min的冷凍離心機(jī)中離心lOmin,采用截留分子量500k的聚醚砜膜濃縮使其濃度提升20倍,得到纖維素酶(d)。 (液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方:葡萄糖6g/L、40至60目毛竹粉20g/L、Tween800.6g/L、硫酸銨3g/ L、磷酸二氫鉀5g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈣0.5g/L、尿素1.2g/L,占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積
0.3%的Mandels微量元素、溶劑為pH=7的PBS,120°C高壓蒸汽滅菌20min)
[0033]測(cè)定實(shí)施例1、2、3、4制備得到的四種纖維素酶的CMC酶活。表1為由實(shí)施例1、2、
3、4制備的四種纖維素酶CM`C酶活的測(cè)定結(jié)果。由表1中數(shù)據(jù)可知,采用本發(fā)明所述的制備方法獲得的纖維素酶(a)、(b)、(c)、(d)的CMC酶活分布在2110~2640IU/mL,均具有較高的纖維素酶活力,說(shuō)明本發(fā)明涉及方法符合高效發(fā)酵制備纖維素酶的技術(shù)范疇。
[0034]如圖1,從實(shí)施例3經(jīng)過(guò)察氏培養(yǎng)基活化生長(zhǎng)出單菌落的綠色木霉照片可看出,其為氣生綠色菌絲,菌絲較長(zhǎng)而直,側(cè)枝較少,在生長(zhǎng)的中后期收縮而產(chǎn)生孢子絲,孢子小,呈卵圓形。如圖2,依據(jù)實(shí)施例3的工藝條件,在72~120h的發(fā)酵過(guò)程中,得到的纖維素酶 CMC酶活先升后降,在108h達(dá)到最高酶活2640IU/mL,因此實(shí)施例3的最佳產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間定為 108h。
[0035]表1
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種高效發(fā)酵綠色木霉制備纖維素酶的方法,其特征在于,包括以下步驟:1)將未經(jīng)活化的綠色木霉(Trichodermaviviride)在無(wú)菌環(huán)境中以無(wú)菌水溶解,采用平板劃線法將菌種接種于察氏培養(yǎng)基(czapck)上,在24~32°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72~ 168h,至生長(zhǎng)出單菌落,得到經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉;2)將步驟I)得到的經(jīng)過(guò)活化的綠色木霉在無(wú)菌環(huán)境中挑取單菌落,接種于液體活化培養(yǎng)基中,在24~32°C、180~260r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)48~72h,得到擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液;3)將步驟2)得到的擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液按照體積比1:10~20的接種量接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,按照60%的裝入量裝入發(fā)酵罐中,產(chǎn)酶培養(yǎng)制備纖維素酶,控制發(fā)酵液pH值3~7、發(fā)酵溫度24~32°C、通氣量1:0.4~1.2、發(fā)酵時(shí)間72~120h,得到的發(fā)酵液在4000r/ min的冷凍離心機(jī)中離心IOmin,采用截留分子量100~500k的聚醚砜膜濃縮使其濃度提升20倍,得到纖維素酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效發(fā)酵綠色木霉制備纖維素酶的方法,其特征在于: 所述的液體活化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖10~20g/L、蛋白胨I~2g/L、Tween800.2~0.4g/ L、硫酸銨I~2g/L、磷酸二氫鉀I~3g/L、硫酸鎂0.1~0.3g/L、氯化鈣0.1~0.3g/L、尿素0.4~0.8g/L、占液體活化培養(yǎng)基總體積10~20%的Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽、溶劑為pH=3~7 的磷酸緩沖液(PBS),120°C高壓蒸汽滅菌20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效發(fā)酵綠色木霉制備纖維素酶的方法,其特征在于:所述的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為:葡萄糖4~6g/L、40至60目毛竹粉5~20g/L、 Tween800.2~0.6g/L、硫酸銨I~3g/L、磷酸二氫3~5g/L、硫酸鎂0.3~0.5g/L、氯化鈣0.3~0.5g/L、尿素0.8~1.2g/L,占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積0.1~0.3%的Mandels微量元素、溶劑為pH=3~7的PBS,120°C高壓蒸汽滅菌20min。
【文檔編號(hào)】C12R1/885GK103497941SQ201310393491
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月1日
【發(fā)明者】姚菊明, 莊源, 張勇, 崔建梅 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)
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