一種高溫重組木聚糖酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組高溫木聚糖酶及其編碼基因和應(yīng)用。該高溫木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明的木聚糖酶，在90℃、pH為6.5的條件下酶活性最高，比酶活達到109U/mg；該蛋白酶在溫度為75℃-100℃、pH為6.0-7.0的范圍內(nèi)，均具有較高的酶活。該木聚糖酶在65℃、pH6.5下，保溫2h酶活性基本保持不變。上述特性使得本發(fā)明得到的木聚糖酶比現(xiàn)有木聚糖酶具有更大的優(yōu)越性，適用于80℃以上高溫、弱酸性pH條件下木聚糖的降解，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。
【專利說明】一種高溫重組木聚糖酶及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及對一種高溫重組木聚糖酶基因克隆和表達、耐熱及熱穩(wěn)定性好的高溫重組木聚糖酶的制備及其在半纖維素降解中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]木聚糖廣泛存在于自然界，是植物細(xì)胞壁的主要組成成分之一，其含量僅次于纖維素，通常占高等植物細(xì)胞干重的7%-30%，在被子植物中甚至高30%-35%。目前，對于半纖維素酶的生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究主要集中在木聚糖降解酶。木聚糖酶作用于木聚糖主鏈內(nèi)的β -1, 4糖苷鍵產(chǎn)生不同長度的木寡糖短鏈，能將木聚糖降解為低聚木糖和少量木糖。木聚糖酶在飼料、食品、造紙和醫(yī)藥行業(yè)等都有極大地應(yīng)用價值及應(yīng)用前景。已報道的能產(chǎn)木聚糖酶的微生物有細(xì)菌、鏈霉菌、曲霉、青霉和木霉等，人們研究和應(yīng)用最多的是細(xì)菌、曲霉和木霉產(chǎn)木聚糖酶。而我國當(dāng)前的研究工作起步相對較晚，成熟的木聚糖酶產(chǎn)品較少，尤其缺乏能夠與規(guī)?；a(chǎn)相適應(yīng)的高產(chǎn)菌株，因此有必要進一步開展木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建及其分子改造工作。了解酶的理化性質(zhì)將有助于未來更好的利用這生物催化酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高溫木聚糖酶，以使其滿足使用要求。本發(fā)明的另一目的是提供一種編碼上述高溫木聚糖酶的基因。本發(fā)明還有一目的是提供上述一種高溫木聚糖酶的應(yīng)用。
[0004]技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:` 一種高溫木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0005]一種編碼高溫木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.2所示。
[0006]一種表達高溫木聚糖酶的重組體系，在所述的重組體系上克隆有SEQ ID N0.2所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質(zhì)粒和重組菌。
[0007]—種擴增編碼高溫木聚糖酶的基因的方法，所使用的引物對為:
引物 1:5，- GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGA-3’ ；
引物 2:5，- CCGCTCGAGCTCCGGCTTAACCAGAGCCCAATATGCCA-3。
[0008]所述的高溫木聚糖酶在酶解木聚糖中的應(yīng)用。酶解反應(yīng)溫度為75-100°C，pH
6.0-7.0。所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。
[0009]所述的重組體系在酶解木聚糖中的應(yīng)用。
[0010]一種高溫木聚糖酶，氨基酸序列為SEQ ID N0.1序列中的氨基酸經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質(zhì)。
[0011]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的木聚糖酶具有極強的耐熱性能和弱酸性pH條件下高活性的特性，在90°C、pH 6.5的條件下酶活性最高，比酶活達到109 U/mg ；該蛋白酶在溫度為75°C -100°C、pH為6.0-7.0的范圍內(nèi)，均具有較高的酶活。該木聚糖酶的耐熱性能極高，在65°C、pH 6.5的反應(yīng)體系中，保溫2 h酶活穩(wěn)定。上述特性使得本發(fā)明得到的木聚糖酶比現(xiàn)有木聚糖酶具有更大的優(yōu)越性，適用于65°C以上高溫、弱酸性pH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是木聚糖酶XynlOA-Ol的SDS-PAGE蛋白電泳圖；
圖2是XynlOA-Ol活性隨溫度的變化結(jié)果圖；
圖3是XynlOA-Ol活性隨pH的變化結(jié)果圖；
圖4是XynlOA-Ol熱穩(wěn)定變化結(jié)果圖；
圖5是XynlOA-Ol降解櫸木木聚糖TLC圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0014]以下實施例中所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0015]實施例1木聚糖酶基因Xjwi似-似的制備
可采用如下人工合成的方式制備似-似基因，也可以以Thermotoga thermarum的總DNA為模版通過PCR的方式得到。本研究的木聚糖酶基因xynlOA-Ol通過上海捷瑞生物工程有限公司合成，基因序列如SE Q ID N0.2所示實施例2木聚糖酶基因似-似的亞克隆用下述引物對PCR擴增實施例1中的木聚糖酶基因:
引物 1:5，- GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGA-3’ ；
引物 2:5，- CCGCTCGAGCTCCGGCTTAACCAGAGCCCAATATGCCA-3。
[0016]上述引物合成時，引物I引入#而I酶切位點，引物2引入通ο I酶切位點。
[0017]PCR反應(yīng)體系:IyL 模版 DNA，lyL 引物 l，lyL 引物 2，25 μ L Premix ExTaq,22 μ L超純水。
[0018]PCR 反應(yīng)條件:94°C變性 5 min ;94°C 變性 30sec，52°C 退火 30 sec，72°C 延伸 3min, 30 Cycles ;72°C延伸 10 min ;4°C保溫。
[0019]PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)量和特異性，并用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進行純化(B10MIGA，上海)。
[0020]實施例3重組克隆、表達載體pET-20b- F/?7似-似的構(gòu)建與驗證
將純化過的PCR產(chǎn)物、pET-20b用分別Ndel和ZAo I雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切酶切PCR及載體大片段。割膠回收 后的目的片段與載體，經(jīng)濃縮加入8 μ L無菌水重懸，加入IuL IOXLigase Buffei PlyL Ligase，于16°C連接過夜。用連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌pET-20b，然后涂于含100μ g/mL Amp (氨芐青霉素)的培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)10_12h。
[0021]從轉(zhuǎn)化平板上挑取多個單菌落，采用B10MIGA的質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒。對獲得的質(zhì)粒雙酶切驗證并對獲得的重組質(zhì)粒進行測序。測序結(jié)果顯示，pET-20b載體中插入所克隆的目的片段(2385bp)，進而得到重組克隆、表達載體pET-20b- F/ 似-似。目的片段即為編碼木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.2所示，其表達的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，將該蛋白命名為XynlOA-Ol。
[0022]實施例4重組木聚糖酶XynlOA-Ol的表達與純化
將重組克隆、表達載體pET-20b- 似-似電轉(zhuǎn)至宿主菌疋coli BL21(DE3)，獲得含有重組質(zhì)粒的重組菌。將單菌落的重組菌接種于5mL含有100 μ g/mL氨芐青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培養(yǎng)基，在 37°C溫度下，200rpm 震蕩培養(yǎng) 8_12h。將上述 4mL菌液接種于含400mL培養(yǎng)基的IOOOmL搖瓶中，37°C溫度下，200 rpm震蕩培養(yǎng)，當(dāng)吸光度達到0.6-0.8時，加人200μ L的IM IPTG，并在30°C溫度下，120rpm誘導(dǎo)表達10_12h。用高速冷凍離心機將培養(yǎng)液在4°C下以13000 rpm離心15min，收集菌體。用40mL超純水洗滌并在4°C下以13000rpm離心15min,回收菌體,接著用20mL I XBinding Buffer重懸(0.5MNaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole, pH7.9)，在冰水浴中，用超聲波破碎機破碎細(xì)菌細(xì)胞，并在4°C下13000rpm離心15min，得到含木聚糖酶XynlOA-Ol的粗提液。
[0023]粗提液先經(jīng)60°C加熱處理30min的熱處理，除去不耐熱的雜蛋白，再用N1-NTA親和層析柱進行純化(方法見His-Bind Kits, Novagen)。純化酶純度的鑒定和分子量的測定采用SDS-PAGE方法進行，結(jié)果見圖1，M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；S1表示IOOmM咪唑洗脫后的蛋白；S2、S3表示200mM咪唑依次洗脫后的蛋白；S4、S5、S6表示400mM咪唑依次洗脫后的蛋白，S7表示400mM咪唑純化過后的XynlOA-Ol蛋白，分子量約為95kDa。
[0024]實施例5重組木聚糖酶XynlOA-Ol的酶學(xué)性質(zhì)分析
酶活定義為:lmin內(nèi)催化櫸木木聚糖(sigma)產(chǎn)生Iymol木糖所需的酶量。
[0025]( I)最適溫度
用PH值為7.0的0.1M咪唑-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實施4中的純酶液，用稀釋后的酶液進行酶活測定。酶活測.定反應(yīng)體系為200 μ L，由1%櫸木木聚糖100 μ L，90 μ L 0.1M咪唑-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液組成；反應(yīng)體系的pH為7.0。將反應(yīng)體系在60-100°C溫育IOmin后，加入300 μ L DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5min后測定540nm的吸光值。實驗設(shè)3次重復(fù)，取平均值作圖。結(jié)果如圖2所示，研究結(jié)果表明在90°C時，木聚糖具有最高的酶活性；將此溫度下的酶活反應(yīng)體系的吸光值最為相對活性100%，其它溫度下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值作為相對活性。其中，在溫度75-100°C的反應(yīng)體系中酶活性較高。
[0026](2)最適 pH
酶活性測定體系為200 μ L，由1%櫸木木聚糖100 μ L，ρΗ5.0-8.5的90 μ L 0.1M咪唑-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液和IOyL稀釋酶液組成。將反應(yīng)體系在90°C溫育IOmin后，力口Λ 300 μ L DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5min后測定540nm的吸光值，實驗設(shè)3次重復(fù)實驗，取平均值。結(jié)果如圖3所示，研究結(jié)果表明，在pH為6.5時，木聚糖酶具有最高的酶活性；將此pH值下的酶活反應(yīng)體系的作為相對活性100%，其它pH值下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為相對活性。在PH6.0-7.0的條件下，酶活較高。
[0027](3)重組酶熱穩(wěn)定性
用PH值為6.5的0.1M咪唑-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實施例4中的純酶液，用稀釋后的酶液進行酶活測定。酶熱穩(wěn)定的反應(yīng)體系為200 μ L，由1%櫸木木聚糖100 μ L，90 μ L
0.1M咪唑-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液和10 μ L稀釋酶液組成。將稀釋酶液在65°C、75°C、85°C和90°C水浴30、60、90和120min，測定酶的殘存酶活。酶活測定反應(yīng)體系中pH為6.5，測定溫度為90°C。實驗設(shè)3次重復(fù)，取平均值。結(jié)果如圖4所示，90°C下水浴120min后無酶活，因此圖中未標(biāo)示。研究結(jié)果顯示，65°C處理2h酶活下降較少，可見該木聚糖酶在65°C條件下熱穩(wěn)定性能優(yōu)越。
[0028]實施例6重組木聚糖酶XynlOA-Ol的應(yīng)用研究
重組木聚糖酶XynlOA-Ol對櫸木木聚糖的降解研究,具體步驟如下所述:
(I)稱取0.05g櫸木木聚糖，加入5mL ddH20，配制成1%濃度的櫸木木聚糖溶液。
[0029](2)反應(yīng)體系為200 μ L，由1%櫸木木聚糖100 μ L，90 μ L 0.1M咪唑-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液和?ο μ L稀釋酶液組成，pH6.5，65°C水浴震蕩0.5h、lh、2h和3h。
[0030](3)分別收集上述0.5h、lh、2h和3h水解液100 μ L, 13000rpm，20°C條件下離心IOmin,收集上清并于_20°C的冰箱中保存。
[0031](4)配置上述水解液適宜的TLC的展層劑和顯色劑，展層劑中正丁醇:乙酸:水=2:1:1，顯色劑為將0.5g的苔黑酚加入到IOOmL的硫酸/甲醇溶液(2:8)中配制而成。
[0032](5)用毛細(xì)吸管蘸取少量的1%的木1-木4糖的混合液及上述樣品，分別點至寬度為10cm、長度為20cm的玻璃娃膠板上，點完樣后用吹分機吹干并將娃膠板放置于上述展層劑的層析缸中。
[0033](6) 3h后取出玻璃板先風(fēng)干，再放置于100°C的干燥箱中烘干，在通風(fēng)櫥中用噴壺將硅膠板均勻噴灑，接著在再放置于100 °c的干燥箱中烘干。
[0034]結(jié)果如圖5所示，M為木1-木4的標(biāo)準(zhǔn)樣品，1、2、3和4分別為0.5h、lh、2h和3h
的水解液。研究結(jié)果表明， 重組木聚糖酶XynlOA-Ol可以快速有效地將櫸木木聚糖降解為低聚木糖。
【權(quán)利要求】
1.一種高溫木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—種編碼權(quán)利要求1所述的高溫木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.2所示。
3.—種表達權(quán)利要求1所述的高溫木聚糖酶的重組體系，其特征在于:在所述的重組體系上克隆有SEQ ID N0.2所示的DNA序列；所述的重組體系包括重組質(zhì)粒和重組菌。
4.一種擴增權(quán)利要求2所述的編碼高溫木聚糖酶的基因的方法，其特征在于:所使用的引物對為: 引物 1:5，- GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGA-3’ ； 引物 2:5，- CCGCTCGAGCTCCGGCTTAACCAGAGCCCAATATGCCA-3。
5.權(quán)利要求1所述的高溫木聚糖酶在酶解木聚糖中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:酶解反應(yīng)溫度為75-100°C，pH6.0-7.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。
8.權(quán)利要求3所 述的重組體系在酶解木聚糖中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/10GK103436510SQ201310391421
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】王飛, 黃穎娟, 時號 申請人:南京林業(yè)大學(xué)