枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾方法。本發(fā)明的方法利用upp正負篩選系統(tǒng)，對枯草芽孢桿菌基因組進行無痕修飾。本發(fā)明的方法利用ComK表達系統(tǒng)，使枯草芽孢桿菌具有優(yōu)異dsDNA轉(zhuǎn)化效率，可達3～5×103cfu/μg?dsDNA。同時利用了外源核酸內(nèi)切酶I-SceI表達系統(tǒng)，將雙鏈DNA斷裂引入至基因組，顯著提高了負篩選分子內(nèi)基因重組效率，最高可達8×10-4。本發(fā)明的方法可以迭代修飾枯草芽孢桿菌基因組多個目的核酸序列，包括引入基因突變至基因組，從基因組中敲除目的基因序列以及大片段基因組序列刪除等。
【專利說明】枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因組改造【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾方法。
【背景技術(shù)】
[0002]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是存在于土壤和植物微生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢微生物種，廣泛存在于自然界。無致病性，對人畜無害，不污染環(huán)境，具有較強的抗逆能力和抗菌防病作用，被廣泛用為分子生物學(xué)研究模式生物以及工業(yè)化生產(chǎn)高產(chǎn)菌株宿主。近年來，隨著第二代和第三代高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，處于功能基因組時代的比較基因組測序，逆向代謝工程，適應(yīng)性進化等方面分子生物學(xué)研究迫切需要一種快速，無痕，高效的等位基因置換和基因組修飾工具。
[0003]枯草芽孢桿菌雖然在自然條件下也可形成感受態(tài)吸收外源DNA，但是通常形成時期是處于對數(shù)生長末期開始形成，而通常形成感受態(tài)的比例不高，約占5%-15%。這直接導(dǎo)致外源DNA轉(zhuǎn)化效率較低，加大了基因操作的難度。目前，應(yīng)用于枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備的方法有多種，如Spizizen轉(zhuǎn)化、曬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo),原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)等。以傳統(tǒng)的Spizizen轉(zhuǎn)化方法為例，該方法主要原理是，使枯草芽孢桿菌生長在相對貧瘠的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)細胞形成自然感受態(tài)能力，這種技術(shù)較成熟，但是具有轉(zhuǎn)化效率低，制備過程復(fù)雜，培養(yǎng)基配制過程不易等缺點。另外幾種方法雖然具有較高的轉(zhuǎn)化效率，但是制備過程過于復(fù)雜。目前已經(jīng)有文獻表明，處于枯草芽孢桿菌感受態(tài)形成過程中ComK蛋白的強表達可以進一步激活自身的轉(zhuǎn)錄而大幅度提高其在胞內(nèi)的濃度，并且激活晚期感受態(tài)基因(包括與DNA吸附、吸收和重組的有關(guān)的基因)開始轉(zhuǎn)錄，可大幅度的提聞細胞形成感受:態(tài)的比率，對于外源DNA的轉(zhuǎn)化效率已經(jīng)可以達到IO3 cfu/ μ g dsDNA。
[0004]正負選擇系統(tǒng)是基因組修飾的常用篩選方法之一，為了更好地篩選發(fā)生同源重組的陽性轉(zhuǎn)化子，1988年Mansour等人設(shè)計了正負雙向選擇系統(tǒng)(Positive-NegativeSelection, PNS)，解決了定點整合與隨機整合的鑒別問題。常用的正選擇標記有:氯霉素(crm)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph)、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶(gpt)、次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hprt)、胸腺喃唳激酶(tk)及嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(puro)等。常用的負選擇標記基因有mazF、blal、ysbC、hwel、upp等。其中，mazF用時間長之后會積累產(chǎn)生抗mazF敏感性菌株的可能性，blal和ysbC需要宿主細胞為對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株,而hwel為來自真核細胞表達蛋白，在原核細胞內(nèi)的表達需要精心的拼接和密碼子優(yōu)化修飾，應(yīng)用上較為繁瑣。而upp為枯草芽孢桿菌內(nèi)源基因，編碼尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(UPRTase),催化尿嘧啶生成尿苷單磷酸(UMP)，從而利用胞外尿嘧啶。嘧啶類似物5_氟尿嘧啶(5FU)也能夠被UPRTase催化生成5-F_dUMP，而5-F_dUMP是枯草芽孢桿菌胸苷酸合成酶的強烈抑制劑，會導(dǎo)致細胞死亡?？莶菅挎邨U菌upp基因缺失突變株可以在低濃度(10-20 μ M)的5FU負篩選培養(yǎng)基上生長，因此可以將upp基因作為負篩選標記。
[0005]傳統(tǒng)應(yīng)用upp基因的枯草芽孢桿菌高效基因組修飾的技術(shù)方法是:首先構(gòu)建枯草芽孢桿菌UPP缺失宿主菌，其次將UPP基因和抗性基因連接在一起組成“UPP通用盒子”，然后將目標基因上下游同源臂與UPP基因通過融合PCR方法融合為dsDNA片段，進一步通過同源重組方式將dsDNA片段整合至upp缺失枯草芽孢桿菌基因組。利用抗性基因篩選陽性轉(zhuǎn)化子，最后通過細胞內(nèi)同源臂的第二次分子內(nèi)同源重組彈出upp基因，利用5FU負篩選培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化子并通過測序進行驗證。該方法存在一些缺陷:一方面，枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞對于外源DNA的吸收能力較低(如Spizizen方法)，導(dǎo)致外源DNA第一次基因重組效率較低；另一方面，整個基因組修飾過程涉及到的第二次分子內(nèi)的基因重組僅為負篩選，假陽性率較高，給菌株篩選帶來一定難度；同時第二次分子內(nèi)同源重組的效率較低，文獻報道僅為10_7-10_6數(shù)量級左右，同樣很難篩選出陽性重組菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種能顯著提高分子內(nèi)重組效率并且不留下任何篩選標記的枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾方法。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供第二種枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0009]一種枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾方法，包括如下步驟:
[0010](I)構(gòu)建含有1-SceI酶切位點的模板質(zhì)粒pSS、溫度敏感型1-SceI表達質(zhì)粒pEBS-copl和含有ComK誘導(dǎo)表達系統(tǒng)整合質(zhì)粒pST ;所述質(zhì)粒pSS含有正篩選標記基因cat，負篩選標記基因upp和1-SceI酶切識別位點；
[0011](2)將所述質(zhì)粒pST整合至菌株B.subtilisl68,獲得了 upp缺失和ComK表達系統(tǒng)整合菌株BTK ；
[0012](3)將所述質(zhì)粒pEBS-copl轉(zhuǎn)化至所述菌株BTK，獲得無痕修飾出發(fā)菌株BUK ；
[0013](4)以所述質(zhì)粒pSS為模板，通過PCR獲得正負篩選盒子；以枯草芽孢桿菌基因組為模板，通過PCR獲得目標操作基因的含有DR序列的上游同源臂F和含有DR序列的下游同源臂B ;將所述含有DR序列的上游同源臂F、正負篩選盒子和含有DR序列的下游同源臂B通過融合PCR得到目的dsDNA片段I ;[0014](5)阿拉伯糖誘導(dǎo)無痕修飾出發(fā)菌株BUK形成感受態(tài)細胞；用所述dsDNA片段I轉(zhuǎn)化至所述感受態(tài)細胞中，通過正篩選標記氯霉素抗性來篩選發(fā)生雙交換基因重組的陽性轉(zhuǎn)化子BUK-1 ；
[0015](6)將所述發(fā)生雙交換基因重組的陽性轉(zhuǎn)化子BUK-1接種于LB液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中加入木糖，通過木糖誘導(dǎo)核酸內(nèi)切酶1-SceI表達，得到基因組上DNA雙鏈斷裂，發(fā)生分子內(nèi)同源重組刪除兩DR區(qū)之間所有的篩選標記的細胞，涂布于5FU負篩選平板上篩選出基因組無痕修飾的陽性菌株BUK-1I。
[0016]另一種枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾方法，包括如下步驟:
[0017](I)構(gòu)建含有1-SceI酶切位點的模板質(zhì)粒pSS、溫度敏感型1-SceI表達質(zhì)粒pEBS-copl和含有ComK誘導(dǎo)表達系統(tǒng)整合質(zhì)粒pST ;所述質(zhì)粒pSS含有正篩選標記基因cat，負篩選標記基因upp和1-SceI酶切識別位點；
[0018](2)將所述質(zhì)粒pST整合至菌株B.subtilisl68,獲得了 upp缺失和ComK表達系統(tǒng)整合菌株BTK;[0019](3)將所述質(zhì)粒pEBS-copl轉(zhuǎn)化至所述菌株BTK，獲得無痕修飾出發(fā)菌株BUK;
[0020](4)以所述質(zhì)粒pSS為模板，通過PCR獲得正負篩選盒子；以枯草芽孢桿菌基因組為模板，通過PCR分別獲得目標刪除區(qū)域的上游同源臂A、上游同源臂C和下游同源臂Edf上游同源臂A、下游同源臂E、正負篩選盒子和上游同源臂C通過融合PCR得到融合dsDNA片段2;
[0021](5)阿拉伯糖誘導(dǎo)無痕修飾出發(fā)菌株BUK形成感受態(tài)細胞；用所述dsDNA片段2轉(zhuǎn)化至所述感受態(tài)細胞中，通過正篩選標記氯霉素抗性來篩選發(fā)生雙交換基因重組的陽性轉(zhuǎn)化子 BUK-1II ；
[0022](6)以質(zhì)粒pDK為模板，通過PCR獲得Kan基因并引入Ι-Scel酶切識別位點；以枯草芽孢桿菌基因組為模板，通過PCR分別獲得目標刪除區(qū)域的下游同源臂D和下游同源臂E ;將下游同源臂D、含有1-SceI酶切識別位點的Kan基因和下游同源臂E通過融合PCR得到融合dsDNA片段3 ;
[0023](7)阿拉伯糖誘導(dǎo)菌株BUK-1II形成感受態(tài)細胞；用所述dsDNA片段3轉(zhuǎn)化至所述感受態(tài)細胞中，通過正篩選標記卡那霉素抗性來篩選發(fā)生雙交換基因重組的陽性轉(zhuǎn)化子BUK-1V ；
[0024](8)將所述陽性轉(zhuǎn)化子BUK-1V接種于LB液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中加入木糖，通過木糖誘導(dǎo)核酸內(nèi)切酶1-SceI表達，得到基因組上DNA雙鏈斷裂，發(fā)生分子內(nèi)同源重組刪除同源臂E之間所有的篩選標記的細胞，涂布于5FU負篩選平板上篩選出基因組無痕修飾的陽性菌株BUK-V。
[0025]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0026]本發(fā)明以構(gòu)建負篩選標記upp缺失的出發(fā)菌株的同時，引入阿拉伯糖誘導(dǎo)的內(nèi)源感受態(tài)調(diào)節(jié)蛋白ComK表達系統(tǒng)，可使出發(fā)菌株在6h培養(yǎng)過程內(nèi)即可形成感受態(tài)，大大減化了常規(guī)感受態(tài)的制備流程，并且也不需要借助額外的實驗設(shè)備，同時具有優(yōu)異的轉(zhuǎn)化外源DNA能力。其中外源dsDNA片段的重組效率高達3-5X IO3Cfu/μ g dsDNA，是傳統(tǒng)Spizizen轉(zhuǎn)化效率(1-3XlO1CfVyg dsDNA)的100倍以上(見表3)。
[0027]本發(fā)明使用了外源核酸內(nèi)切酶1-Scel，通過木糖誘導(dǎo)，可以將一個或多個雙鏈DNA斷裂引入至基因組?；蚪M雙鏈斷裂誘發(fā)細胞產(chǎn)生SOS應(yīng)激響應(yīng)，并同時提高分子內(nèi)基因重組效率，可得到更多目的陽性轉(zhuǎn)化子。其中分子內(nèi)重組效率最高可達8X10—4，是未采用1-SceI誘導(dǎo)重組效率的100倍左右(見表3)。
[0028]本發(fā)明可以連續(xù)/迭代修飾枯草芽孢桿菌基因組的一個或多個目的核酸序列，包括添加一個或多個核苷酸至基因組，從基因組中敲除目的基因序列，改變基因組上一個或多個內(nèi)源基因、基因間基因序列以及大片段基因序列刪除等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為含有1-SceI酶切位點的模板質(zhì)粒pSS和溫度敏感型1-SceI表達質(zhì)粒pEBS-copl 的圖譜。
[0030]圖2為枯草芽孢桿菌無痕基因組修飾出發(fā)菌株BUK的構(gòu)建。
[0031]圖3為一種枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾流程圖(基因突變)。
[0032]圖4為一種枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾流程圖(基因敲除)。[0033]圖5為另一種枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾流程圖(大片段基因組序列刪除)。
[0034]圖6為PCR驗證無痕ccpN點突變和無痕ccpN敲除。
[0035]圖7為PCR驗證無痕基因組大片段刪除75.9kb_DEL。
【具體實施方式】
[0036]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，下述實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但對本發(fā)明不作任何限制。
[0037]本發(fā)明所用到的原始菌株B.subtilisl68 來源為 BGSC(Bacillus Genetic StockCenter, http://www.bgsc.0rg/)。
[0038]本發(fā)明所用到的原始質(zhì)粒pE194、pAXOl、pC194和pDK來源為BGSC。
[0039]pTKRED來源于參考文獻:KuhlmanTE, Cox EC: Site-specific chromosomal integrationof large synthetic constructs.Nucleic Acids Res 2010，38:e92o
[0040]本發(fā)明所用到的所用限制性內(nèi)切酶、去磷酸化酶、DNA連接酶等分子生物學(xué)試劑從Thermo 公司購買(http://www.thermoscientificbi0.com/fermentas)。其他生化試劑從生工生物工程(上海)股份有限公司購買(http://www.sangon.com/)。
[0041]實施例1
[0042]1、含有1-SceI酶切位點的模板質(zhì)粒pSS的構(gòu)建(圖譜見圖1A)
[0043]利用PCR反應(yīng)以pC194質(zhì)`粒為模版使用上下游引物pSS_Pl和pSS_P2獲得cat基因、以B.subtilisl68基因組為模版使用上下游引物PSS-P3和pSS_P4獲得upp基因，再以上面的兩個片段為模版，利用融合PCR反應(yīng)使用上下游引物pSS-Pl和pSS-P4獲得重組片段cat-upp。將該重組片段與pUC18 (通用質(zhì)粒)質(zhì)粒經(jīng)酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、驗證等操作后，得到基礎(chǔ)操作質(zhì)粒PSS (所用引物序列見表2)。
[0044]2、溫度敏感型表達質(zhì)粒pEBS-copl的構(gòu)建(圖譜見圖1B)
[0045]利用PCR反應(yīng)以pE194質(zhì)粒為模版使用上下游引物pEBS-Pl和pEBS_P2獲得erm基因，將該片段與PUC18質(zhì)粒經(jīng)酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、驗證等操作后，得到溫度敏感型質(zhì)粒pEB。以pTKRED為模版使用上下游引物PEBS-P3和pEBS_P4獲得1-SceI編碼基因，將該片段與質(zhì)粒pAXOl經(jīng)酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、驗證等操作后，得到質(zhì)粒pAXOl-Scel。以pAX01_SceI為模版使用上下游引物PEBS-P5和pEBS-P6獲得含有1-SceI編碼基因、木糖誘導(dǎo)啟動子PxylA、木糖操縱子阻遏蛋白xylR編碼基因的片段，將該片段與質(zhì)粒PEB經(jīng)酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、驗證等操作后，得到質(zhì)粒PEBS。以pEBS質(zhì)粒為模板，以pEBS-P7和pEBS_P8為引物，使用NEB公司的Phusion? Site-directed Mutagenesis kit對pEBS質(zhì)粒進行定點突變,最終獲得具有C1258G目的突變的溫度敏感型表達質(zhì)粒pEBS-copl (所用引物序列見表2)。
[0046]3、含有ComK誘導(dǎo)表達系統(tǒng)整合質(zhì)粒pST的構(gòu)建(圖譜見圖2A)
[0047]以pSS為出發(fā)質(zhì)粒，構(gòu)建包含有以下基因元件的整合型質(zhì)粒pST:comK內(nèi)源感受態(tài)調(diào)節(jié)因子編碼基因、araR阿拉伯糖啟動子阻遏蛋白，Para阿拉伯糖啟動子，以及兩個同源臂upp-F和upp-B (均約IOOObp大小)。具體構(gòu)建流程:利用PCR反應(yīng)以B.subtilis 168基因組為模版，使用上下游引物PST-Pl和pST-P2獲得同源臂upp-F，將該片段與pSS質(zhì)粒經(jīng)酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、驗證等操作后，得到質(zhì)粒PSS-F。利用PCR反應(yīng)以B.subtilisl68基因組為模版，使用上下游引物PST-P3和pST-P4獲得同源臂upp-B，將該片段與pSS_F質(zhì)粒經(jīng)酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、驗證等操作后，得到質(zhì)粒pSS-FB。利用PCR反應(yīng)以B.subtilisl68基因組為模版，使用上下游引物PST-P5和pST-P6獲得comK基因。利用PCR反應(yīng)以B.subtilisl68基因組為模版使用上下游引物PST-P7和pST-P8獲得含有Para啟動子和araR基因的片段。采用融合PCR，將上述兩個PCR片段融合獲得Para-comK-araR重組片段，與質(zhì)粒pSS_FB經(jīng)酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、驗證等操作后得到質(zhì)粒PST (所用引物序列見表2)。
[0048]4、無痕修飾出發(fā)菌株BUK的獲得(見圖2B):
[0049]通過Spizizen轉(zhuǎn)化方法，以雙交換基因重組方式，將上述質(zhì)粒pST轉(zhuǎn)化至菌株B.subtilisl68,置換基因組上upp基因編碼區(qū)域，在5FU負篩選平板上篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，將其命名為BTK。然后，將溫度敏感型表達質(zhì)粒pEBS-copl轉(zhuǎn)化至菌株BTK，在紅霉素篩選平板上篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，獲得基因組無痕修飾出發(fā)菌株BUK。
[0050]其中，抗生素篩選平板為加入抗生素的LB固體培養(yǎng)基。
[0051]紅霉素篩選平板為加入紅霉素使其終濃度是I μ g/mL。
[0052]氯霉素篩選平板為加入氯霉素使其終濃度是5 μ g/mL。
[0053]卡那霉素篩選平板為加入卡那霉素使其終濃度是5 μ g/mL。
[0054]LB液體培養(yǎng)基配方為:10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，調(diào)節(jié)pH至
7.5。0.1Mpa壓力下滅菌20min。LB固體培養(yǎng)基配方為:在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉(終濃度15g/L),0.1Mpa壓力下滅菌20min。
[0055]5FU負篩選培養(yǎng)基配方見表1:
[0056]表I 5FU負篩選培養(yǎng)基配制表
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾方法，其特征是包括如下步驟: (O構(gòu)建含有1-SceI酶切位點的模板質(zhì)粒pSS、溫度敏感型1-SceI表達質(zhì)粒pEBS-copl和含有ComK誘導(dǎo)表達系統(tǒng)整合質(zhì)粒pST ;所述質(zhì)粒pSS含有正篩選標記基因cat，負篩選標記基因upp和1-SceI酶切識別位點； (2)將所述質(zhì)粒pST整合至菌株B.subtilisl68，獲得了 upp缺失和ComK表達系統(tǒng)整合菌株BTK ； (3)將所述質(zhì)粒pEBS-copl轉(zhuǎn)化至所述菌株BTK，獲得無痕修飾出發(fā)菌株BUK； (4)以所述質(zhì)粒pSS為模板，通過PCR獲得正負篩選盒子；以枯草芽孢桿菌基因組為模板，通過PCR獲得目標操作基因的含有DR序列的上游同源臂F和含有DR序列的下游同源臂B ;將所述含有DR序列的上游同源臂F、正負篩選盒子和含有DR序列的下游同源臂B通過融合PCR得到目的dsDNA片段I ; (5)阿拉伯糖誘導(dǎo)無痕修飾出發(fā)菌株BUK形成感受態(tài)細胞；用所述dsDNA片段I轉(zhuǎn)化至所述感受態(tài)細胞中 ，通過正篩選標記氯霉素抗性來篩選發(fā)生雙交換基因重組的陽性轉(zhuǎn)化子 BUK-1 ； (6)將所述發(fā)生雙交換基因重組的陽性轉(zhuǎn)化子BUK-1接種于LB液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中加入木糖，通過木糖誘導(dǎo)核酸內(nèi)切酶1-SceI表達，得到基因組上DNA雙鏈斷裂，發(fā)生分子內(nèi)同源重組刪除兩DR區(qū)之間所有的篩選標記的細胞，涂布于5FU負篩選平板上篩選出基因組無痕修飾的陽性菌株BUK-1I。
2.一種枯草芽孢桿菌基因組無痕修飾方法，其特征是包括如下步驟: (O構(gòu)建含有1-SceI酶切位點的模板質(zhì)粒pSS、溫度敏感型1-SceI表達質(zhì)粒pEBS-copl和含有ComK誘導(dǎo)表達系統(tǒng)整合質(zhì)粒pST ;所述質(zhì)粒pSS含有正篩選標記基因cat，負篩選標記基因upp和1-SceI酶切識別位點； (2)將所述質(zhì)粒pST整合至菌株B.subtilisl68，獲得了 upp缺失和ComK表達系統(tǒng)整合菌株BTK; (3)將所述質(zhì)粒pEBS-copl轉(zhuǎn)化至所述菌株BTK，獲得無痕修飾出發(fā)菌株BUK; (4)以所述質(zhì)粒pSS為模板，通過PCR獲得正負篩選盒子；以枯草芽孢桿菌基因組為模板，通過PCR分別獲得目標刪除區(qū)域的上游同源臂A、上游同源臂C和下游同源臂E ;將上游同源臂A、下游同源臂E、正負篩選盒子和上游同源臂C通過融合PCR得到融合dsDNA片段2 ； (5)阿拉伯糖誘導(dǎo)無痕修飾出發(fā)菌株BUK形成感受態(tài)細胞；用所述dsDNA片段2轉(zhuǎn)化至所述感受態(tài)細胞中，通過正篩選標記氯霉素抗性來篩選發(fā)生雙交換基因重組的陽性轉(zhuǎn)化子 BUK-1II ； (6)以質(zhì)粒pDK為模板，通過PCR獲得Kan基因并引入1-SceI酶切識別位點；以枯草芽孢桿菌基因組為模板，通過PCR分別獲得目標刪除區(qū)域的下游同源臂D和下游同源臂E ；將下游同源臂D、含有1-SceI酶切識別位點的Kan基因和下游同源臂E通過融合PCR得到融合dsDNA片段3 ; (7)阿拉伯糖誘導(dǎo)菌株BUK-1II形成感受態(tài)細胞；用所述dsDNA片段3轉(zhuǎn)化至所述感受態(tài)細胞中，通過正篩選標記卡那霉素抗性來篩選發(fā)生雙交換基因重組的陽性轉(zhuǎn)化子BUK-1V ；(8)將所述陽性轉(zhuǎn)化子BUK-1V接種于LB液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中加入木糖，通過木糖誘導(dǎo)核酸內(nèi)切酶1-SceI表達，得到基因組上DNA雙鏈斷裂，發(fā)生分子內(nèi)同源重組刪除同源臂E之間所有的篩選標記的細胞，涂布于5FU負篩選平板上篩選出基因組無痕修飾的陽性菌株BUK-V 。
【文檔編號】C12N1/21GK103451224SQ201310375944
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月26日
【發(fā)明者】王智文, 王光路, 石婷, 陳濤, 趙學(xué)明 申請人:天津大學(xué)