一種獲得調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的新方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種體外獲得調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的方法。涉及使用脾臟內(nèi)皮基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)一種新的調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的方法。具體而言，本發(fā)明所述的方法材料包括小鼠脾臟基質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞。將兩者共培養(yǎng)可以使骨髓單個(gè)核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，表達(dá)巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)志，以高表達(dá)CD45RB，中等表達(dá)CD11c為特征，并且該細(xì)胞具有類似于M2b性巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)譜。依賴于與ESSC接觸培養(yǎng)，該巨噬細(xì)胞能夠分泌高水平IL-10，并且在體外抑制T細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，說(shuō)明該方法所分選的巨噬細(xì)胞經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)呈現(xiàn)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的特點(diǎn)。該方法為體外大量誘導(dǎo)獲得高分泌IL-10的巨噬細(xì)胞提供了新的方法，可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)和臨床。
【專利說(shuō)明】一種獲得調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的新方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及使用脾臟內(nèi)皮基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)一種調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的方法。具體而言，本發(fā)明所述的方法材料包括小鼠脾臟基質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞。將兩者共培養(yǎng)可以使骨髓單個(gè)核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，表達(dá)巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)志，以高表達(dá)⑶45RB，中等表達(dá)⑶Ilc為特征。該巨噬細(xì)胞能夠分泌高水平IL-10，并且在體外抑制T細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，說(shuō)明該方法所分選的巨噬細(xì)胞經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)呈現(xiàn)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的特點(diǎn)。

【背景技術(shù)】
[0002]巨噬細(xì)胞是一類多功能的固有免疫細(xì)胞，分布于體內(nèi)的各個(gè)器官、結(jié)締組織、漿膜腔等[van Furth R, Cohn ZA, Hirsch JG, et al.Bull word health organ, 1972,46:845-852.]。根據(jù)巨噬細(xì)胞的功能，可將其分為Ml型巨噬細(xì)胞(或稱為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞)和M2型巨卩遼細(xì)胞(或旁路活化巨卩遼細(xì)胞)[Mantovani A, Sica A, Locati M, Immunity,2005,23:344-346.Martinez F0，Sica A, Mantovani A，et al.Front B1sc1.2008，13:453-461.]。Ml型巨噬細(xì)胞易受促炎信號(hào)刺激，比如Toll樣受體配體和Thl細(xì)胞因子；M2型巨噬細(xì)胞主要由抗炎介質(zhì)誘導(dǎo)，包括IL-10，TGF-β，糖皮質(zhì)激素，免疫復(fù)合物，凋亡細(xì)胞等。Ml型巨噬細(xì)胞主要在清除微生物、介導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答反應(yīng)上發(fā)揮重要作用，M2型巨曬細(xì)胞主要參與Th2相關(guān)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[Martinez F0, Helming L, Gordon S.Annu.Rev.Tmmunol.2009,27:45 1-483.Mantovani A, Sica A, Sozzani S, et al.Trendsimmunol.2004,25:677-686.]，并且發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。近些年，根據(jù)M2型巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)和趨化因子進(jìn)一步將其分為M2a，M2b，和M2c巨噬細(xì)胞。Th2型細(xì)胞因子IL-4和(或)IL-1 3可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2a巨噬細(xì)胞分化，M2a巨噬細(xì)胞上調(diào)甘露醇受體的表達(dá)，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，也與某些寄生蟲病相關(guān)；糖皮質(zhì)激素、IL-1 O, TGF-β等抗炎刺激可刺激巨噬細(xì)胞分化為 M2c 巨曬細(xì)胞[Luca Cassetta,Edana Cassol,Guido Pol1.Scientific WorldJournal.2011,11:2391-2402.Edwards JP, Zhang X, Frauwirth KA, et al.J.Leukoc.B1l.2006,80:1298-1307.]。
[0003]巨噬細(xì)胞在Toll樣受體的配體或IL-1R激動(dòng)劑存在的情況下受到免疫復(fù)合物的刺激會(huì)形成M2b巨噬細(xì)胞，也有研究表明清除凋亡的中性粒細(xì)胞過程也會(huì)形成M2b巨噬細(xì)胞。這類巨噬細(xì)胞主要特征是分泌大量的IL-10，IL-6和TNF-α，幾乎不分泌IL-12，一般把分泌IL-1O與IL-12的差距作為鑒定M2b巨噬細(xì)胞的一個(gè)指標(biāo)[Zhang W，Xu W,X1ng S.J Immunol,2010,184:6465-6478.Kobayashi M, Jeschke MG, Shigematsu K,et al.J Tmmunol, 2010,185:7174-7179.Schiffer L, Bethunaickan R, Ramanujam M, etal.J Immunol，2008，180:1938-1947.]。越來(lái)越多的研究表明M2b巨噬細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)和Th2細(xì)胞分化方面發(fā)揮作用，所以也被稱為“調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞” [Mosser DM.Journal ofleukocyte b1logy,2003, 73:209-212.Stout RD, Suttles J.J.Leukoc.B1l,2004, 76:509-513.]。但是這些不同亞型的巨噬細(xì)胞所表達(dá)的特異性表面標(biāo)志還沒有一個(gè)確切的定論，因?yàn)榫奘杉?xì)胞的生物特征具有很大可塑性，不同微環(huán)境可明顯改變其生物學(xué)功能，并分化為不同功能亞群[Svensson M, Kaye PM.Trends Immunol, 2006, 27:580-587.Stout RD,Jiang C，Matta B，et al.J Immunol，2005，175:342-349.]。目前基質(zhì)細(xì)胞常被作模擬體內(nèi)微環(huán)境，大部分基質(zhì)細(xì)胞由間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞組成，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等等，可以誘導(dǎo)定向造血干細(xì)胞的分化[Wolber FM, Leonard E, Michael S, et al.Exp Hematol,2002,30:1010-1019.]。脾臟是一個(gè)重要的二級(jí)淋巴器官[Ni K,O' Neill H.BrJ Haematol,1999，105:58-67.]，研究已經(jīng)證明脾基質(zhì)細(xì)胞可以誘導(dǎo)骨髓中的DC或DC前體的增殖和分化，也可誘導(dǎo)造血干細(xì)胞和成熟DC分化為調(diào)節(jié)性DC[Zhang M, Tang H, Guo Z, et al.NatImmunol,2004, 5:1124-1133.Lacey DC, Achuthan A, Fleetwood AJ, et al.J Tmmunol ,2012，188:5752-5765.]。然而脾臟基質(zhì)細(xì)胞是否能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生還不清
λ.Μ
/E.ο


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明公開了一種新的調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)方法。該方法使用脾臟基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓單個(gè)核細(xì)胞分化成為調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞。該細(xì)胞具有高水平IL-1O分泌和T細(xì)胞增殖抑制等特性。并且，該細(xì)胞有自己獨(dú)特的細(xì)胞因子表達(dá)譜。
[0005]本發(fā)明通過上述的脾臟基質(zhì)細(xì)胞與骨髓單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得新型的調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞，并對(duì)其表型進(jìn)行鑒定。具體包括以下步驟:
[0006]I)內(nèi)皮樣脾基質(zhì)細(xì)胞(ESSC)的獲得和鑒定。
[0007]無(wú)菌分離I周齡C57BL/6J小鼠脾臟，用無(wú)菌剪刀剪至l_2mm大小的組織快，將其均勻地、牢固地貼于6孔板底部，隨后加入20% RPM1-1640，所加入的液體量應(yīng)少許，這樣可使組織塊不易脫落，次日再補(bǔ)20% RPM1-1640 Iml/孔，放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，待孔底細(xì)胞飽和度達(dá)到80% -90%時(shí)，開始傳代。剛開始仍用20% RPM1-1640傳代，待傳代4或5次后可更換成 10% RPM1-1640。
[0008]ESSC通過形態(tài)學(xué)鑒定和表面Marker進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)觀察主要在光學(xué)倒置顯微鏡下進(jìn)行。通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的特異性分子CD106來(lái)確定我們所分離出的ESSC是否為內(nèi)皮型。細(xì)胞消化下來(lái)后用FACS洗液洗滌一遍，用100 μ I FACS洗液重懸，然后根據(jù)抗體說(shuō)明書加Ant1-PE⑶106，而后用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0009]2)獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞與ESSC共培養(yǎng)。
[0010]無(wú)菌分離4_6w的C57BL/6J小鼠的腿骨，用注射器沖洗并分離骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞，沖洗完畢后經(jīng)過棉芯過濾，離心；而后，用含10%血清的1640培養(yǎng)基重懸待用。
[0011]之前將ESSC種六孔板。待ESSC飽和度達(dá)到50%時(shí)，將獲取的骨髓單個(gè)核細(xì)胞以5X106/10% RPM1-1640 4ml/孔種于ESSC上培養(yǎng)14天，培養(yǎng)期間每3_4天半定量換液，棄去一半舊培養(yǎng)液換成等量新培養(yǎng)液。培養(yǎng)14天后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
[0012]3)共培養(yǎng)細(xì)胞的特征鑒定
[0013]于ESSC共培養(yǎng)14天后，將細(xì)胞輕輕從ESSC上吹下，部分細(xì)胞甩片后進(jìn)行吉姆薩染色確定形態(tài)；其余細(xì)胞分別進(jìn)行表面標(biāo)志分子染色和細(xì)胞因子表達(dá)譜測(cè)定。對(duì)于表面標(biāo)志分子檢測(cè)，將吹下的細(xì)胞用FACS洗液重懸，重懸后的細(xì)胞分別染F4/80、⑶14、⑶40、⑶80、⑶86、la、CDllb, CDllc, CD45RB、CD4、CD8和⑶19，并進(jìn)行流式檢測(cè)。對(duì)于細(xì)胞因子表達(dá)譜使用ELISA的方法，吹下來(lái)的分化細(xì)胞收取后種于96孔板，I X 105/200 μ I 10%RPM1-1640/孔，用LPS I μ g/ml刺激24h收培養(yǎng)上清，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6、TNF- a、ILl-β和IL-10的分泌。
[0014]4)分化的調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞分泌高水平IL-10需要與ESSC直接接觸。
[0015]ESSC傳代到24孔板中，到50%飽和度時(shí)，分將骨髓單個(gè)核細(xì)胞于ESSC混合培養(yǎng)和分離培養(yǎng)?；旌吓囵B(yǎng)的情況下，可直接種骨髓單個(gè)核細(xì)胞到ESSC細(xì)胞上；分隔培養(yǎng)使用Transwell板，將骨髓單個(gè)核細(xì)胞種于Tanswell孔上，孔下為ESSC。培養(yǎng)14天后，分別取出分化的細(xì)胞，并且對(duì)每孔取出的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后分別種于96孔板，一部分孔用LPS I μ g/ml刺激24h收培養(yǎng)上清，檢測(cè)IL-10分泌。
[0016]5)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
[0017]無(wú)菌獲取6-8周齡C57BL/6J小鼠的脾臟，用免疫磁珠的方法純化⑶4+⑶25_T細(xì)胞。將這群細(xì)胞標(biāo)記CFSE后與分化的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，5天后收取培養(yǎng)上清用于檢測(cè)細(xì)胞因子，收取細(xì)胞用于檢測(cè)分化細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1脾臟基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)與表面分子鑒定；
[0019]圖2分化的調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞形態(tài)和表面分子鑒定；
[0020]圖3分化的調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)。
[0021]圖4與ESSC直接接觸培養(yǎng)的分化調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞數(shù)量更多，分泌IL-10能力更強(qiáng)。
[0022]圖5調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞在體外能夠抑制⑶4+Τ細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)⑶4+Τ的凋亡。
[0023]實(shí)施例一內(nèi)皮樣脾基質(zhì)細(xì)胞(ESSC)的培養(yǎng)傳代和鑒定
[0024]一、材料和方法
[0025]1.材料
[0026]C57BL/6J小鼠，I周，雌性，購(gòu)自并飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)飼養(yǎng)。75%乙醇，生理鹽水，RPM1-1640 (購(gòu)自Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，0.25%胰酶，F(xiàn)ACS洗液，mAnt1-PE CD106 (購(gòu)自eB1science)。小青瓶，試管，剪刀，鑷子，滴管，移液器，離心機(jī)，流式細(xì)胞儀FACS Calibur (BD，美國(guó))，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma3111型，Thermo,美國(guó))，光學(xué)倒置顯微鏡。
[0027]2.實(shí)驗(yàn)方法:
[0028](I)ESSC的培養(yǎng)和傳代:
[0029]無(wú)菌分離I周齡C57BL/6J小鼠脾臟，用無(wú)菌剪刀剪至l_2mm大小的組織快，將其均勻地、牢固地貼于6孔板底部，隨后加入20% RPM1-1640，所加入的液體量應(yīng)少許，這樣可使組織塊不易脫落，次日再補(bǔ)20% RPM1-1640 lml/孔，放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，待孔底細(xì)胞飽和度達(dá)到80% -90%時(shí)，開始傳代。剛開始仍用20% RPM1-1640傳代，待傳代4或5次后可更換成 10% RPM1-1640。
[0030]傳代時(shí)，吸出舊培養(yǎng)液入小青瓶后，每孔加入2ml生理鹽水洗滌，吸出生理鹽水棄去,加入200 μ 10.25%胰酶消化，輕敲六孔板使細(xì)胞脫落，然后用舊培養(yǎng)液終止胰酶消化，吹下細(xì)胞，吸入試管，1200rpm離心4min，去上清，彈勻，向試管中加入新培養(yǎng)液9ml，混勻，取新六孔板，每孔1.5ml，放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，待細(xì)胞飽和度達(dá)到80% -90%時(shí)，再進(jìn)行傳代。
[0031](2) ESSC 的鑒定
[0032]通過形態(tài)學(xué)鑒定和表面Marker鑒定兩個(gè)方面。形態(tài)學(xué)觀察主要在光學(xué)倒置顯微鏡下進(jìn)行，并照相。另外通過鑒定內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的特異性分子⑶106來(lái)鑒定所分離出的ESSC是否為內(nèi)皮型。細(xì)胞消化下來(lái)后用FACS洗液洗滌一遍，用100 μ I FACS洗液重懸，然后根據(jù)抗體說(shuō)明書加Ant1-PE⑶106，4°C避光孵育30min，期間每1min輕彈樣品，使細(xì)胞與抗體充分混合，然后用FACS洗液洗滌，6000rpm離心30s，去上清，彈勻，加入I %多聚甲醛200 μ I固定，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0033]二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0034]ESSC最初生長(zhǎng)緩慢，但是傳代3到4次后生長(zhǎng)速度會(huì)加快，且經(jīng)過長(zhǎng)期培養(yǎng)已形成可穩(wěn)定、長(zhǎng)期傳代的細(xì)胞。圖1顯示，在顯微鏡下，原代培養(yǎng)的脾臟基質(zhì)細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)梭型，形態(tài)單一，貼壁生長(zhǎng)。經(jīng)過表面Marker的鑒定，圖1顯示，與陰性對(duì)照相比，ESSC可表達(dá)CD106，這說(shuō)明我們所分離培養(yǎng)的ESSC是內(nèi)皮型脾基質(zhì)細(xì)胞。
[0035]實(shí)施例二 ESSC與骨髓單個(gè)核細(xì)胞的共培養(yǎng)
[0036]—、材料和方法
[0037]1、材料
[0038]C57BL/6J小鼠，6-8周，雌性，購(gòu)自并飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)飼養(yǎng)。75%乙醇，生理鹽水，RPM1-1640(購(gòu)自Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，0.25%胰酶，F(xiàn)ACS洗液，mAnt1-PE CD106 (購(gòu)自eB1science)。小青瓶，試管，剪刀，鑷子，滴管，移液器，離心機(jī)，2ml無(wú)菌注射器，流式細(xì)胞儀FACSCalibur (BD，美國(guó))，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma3111型，Thermo，美國(guó))，光學(xué)倒置顯微鏡。
[0039]2、實(shí)驗(yàn)方法:
[0040](I)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的獲取
[0041]取C57BL/6J小鼠頸椎脫臼處死，浸泡于75%乙醇中2_3分鐘，取出后用紙擦去酒精，分離股骨，用剪刀將股骨兩段剪去，使關(guān)節(jié)腔打通，用2ml無(wú)菌注射器吸取Iml生理鹽水將關(guān)節(jié)腔的細(xì)胞沖入試管中，再吸取生理鹽水重復(fù)沖洗幾次。然后取兩只小滴管進(jìn)行過濾，一只滴管的棉花頭推至中央，另一只滴管吸取試管中的骨髓細(xì)胞滴入第一只滴管，經(jīng)過棉花處可起到過濾作用，濾進(jìn)小青瓶中，用生理鹽水20倍稀釋計(jì)數(shù)。取5X 16細(xì)胞/EP管，6000rpm，30s離心，彈勻，去上清，用Iml 10% RPM1-1640重懸。
[0042](2)骨髓單個(gè)核細(xì)胞和ESSC的混合培養(yǎng)及獲取
[0043]待ESSC飽和度達(dá)到50%時(shí)，將獲取的骨髓單個(gè)核細(xì)胞以5X 1074ml 10%RPM1-1640/孔種于ESSC上培養(yǎng)14天，培養(yǎng)期間每3_4天半定量換液，棄去一半舊培養(yǎng)液換成等量新培養(yǎng)液。培養(yǎng)14天后收集細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液剩余少量，敲打使細(xì)胞脫落，將剩余的培養(yǎng)液及細(xì)胞吸入試管，同時(shí)用顯微鏡觀察細(xì)胞的分離情況，加少量生理鹽水，繼續(xù)敲打并吸出至試管，直至大部分細(xì)胞被收集后，2000rpm離心4min，去上清，彈勻，計(jì)數(shù)。
[0044]實(shí)施例三共培養(yǎng)后分化細(xì)胞的特征鑒定
[0045]一、材料和方法
[0046]1、材料
[0047]抗小鼠F4/80、CD 14、CD40、CD80、CD86、I a、CD I Ib、CD 11 c、CD45RB、CD4、CD8、CD 19 和同型對(duì)照抗體購(gòu)自 eB1science。IL-6、IL_12、TNF_ a ELISA 試劑盒(購(gòu)自 eB1science),IL-10 ELISA試劑盒(購(gòu)自達(dá)科為公司)，LPS(購(gòu)自Sigma)。吉姆薩試劑。
[0048]2、實(shí)驗(yàn)方法:
[0049](I)吉姆薩染色
[0050]取分化細(xì)胞2Χ 105/50 μ I 10% RPM1-1640用甩片機(jī)將細(xì)胞甩到載玻片上；待快晾干時(shí)，用甲醇固定1min;期間用PBS I: 10稀釋吉姆薩染液；從甲醇中取出后，待快晾干時(shí)，用100 μ I吉姆薩染色滴加到細(xì)胞上并覆蓋，室溫染30min ;半小時(shí)后，倒去吉姆薩染液，待快晾干用清水輕輕沖洗，期間可用顯微鏡觀察染色情況。
[0051](2) ELISA
[0052]分化細(xì)胞收取后種于96孔板，1Χ 105/200 μ I 10 % RPM1-1640/孔；一部分孔用LPS I μ g/ml刺激24h收培養(yǎng)上清，凍存與_20°C，檢測(cè)細(xì)胞因子分泌。
[0053]I: 250 用 ELISA 包被液稀釋小鼠 IL_6capture antibody, 50 μ I/孔，放入濕盒中4°C包被過夜；取出濕盒至室溫，1: 5用雙蒸水稀釋5XAssay diluent,棄去包被液，PBST洗板條2次，每次靜置I?2分鐘棄去，加IXAssay diluent 100 μ I/孔，室溫封閉Ih ;棄去封閉液，PBST洗板條I次，方法同前，加樣和標(biāo)準(zhǔn)品50 μ I/孔，室溫孵育2h ;棄去樣品及標(biāo)準(zhǔn)品，PBST洗板條5次，方法同前，I: 250用IXAssay diluent稀釋小鼠IL-6detect1n antibody 50μ1/孔,室溫孵育Ih ;棄去孔中液體,PBST洗板條5次,方法同前，I: 250 用 IXAssay diluent 稀釋小鼠 IL-6Anti_HRP 50 μ I/孔，室溫孵育 30min ;棄去棄去孔中液體，PBST洗板條7次，方法同前，加TMB 50 μ I/孔，5?15min，室溫避光，待顏色變化恰當(dāng)時(shí)加StopSolut1n 50 μ I/孔，上機(jī)檢測(cè)0D450。IL-12、IL-1 β、TNF-α的檢測(cè)同IL-6, IL-10的檢測(cè)參照IL-10ELISA試劑盒說(shuō)明書。
[0054](3)表面 Marker 鑒定
[0055]同CD106 鑒定。
[0056]二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0057]圖2顯示:吉姆薩染色看出，腎形胞核位于細(xì)胞邊緣，胞質(zhì)豐富，是典型的巨噬細(xì)胞形態(tài)。流式檢測(cè)表明，分化巨噬細(xì)胞低表達(dá)Ia和⑶Ilc ;高表達(dá)^451?和^116 ;幾乎不表達(dá)共刺激分子⑶40、⑶86，⑶80中等程度表達(dá)；不表達(dá)T、B細(xì)胞的表面標(biāo)志⑶4、⑶8、⑶19，表達(dá)巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志F4/80、⑶14。圖3顯示，ELISA實(shí)驗(yàn)表明，分化巨噬細(xì)胞在LPS刺激后，分泌大量的抑炎因子IL-10及炎性因子IL-6、TNF-α，幾乎不表達(dá)IL-12。因此，脾臟ESSC可誘導(dǎo)骨髓單個(gè)核細(xì)胞分化出一群新的巨噬細(xì)胞，這群細(xì)胞呈現(xiàn)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的特征。
[0058]實(shí)施例四分化細(xì)胞分泌IL-10需要與ESSC直接接觸
[0059]一、材料和方法
[0060]1、材料:
[0061]Transwell培養(yǎng)板(購(gòu)自康寧公司)。其余同實(shí)施例2.
[0062]2、方法:
[0063]ESSC傳代到24孔板中，到50%飽和度時(shí)，分別種骨髓單個(gè)核細(xì)胞?；旌吓囵B(yǎng)的情況下，可直接種骨髓單個(gè)核細(xì)胞2Χ 105/700 μ I 10% RPM1-1640/孔，這樣ESSC和骨髓單個(gè)核細(xì)胞可直接接觸；用Tanswell分隔培養(yǎng)的細(xì)胞，將骨髓單個(gè)核細(xì)胞種于Tanswell孔上，2Χ 105/200 μ I 10% RPM1-1640/孔，孔下 ESSC 加 500 μ I 10% RPM1-1640，其孔徑不允許骨髓單個(gè)核細(xì)胞通過，起到分隔的作用，骨髓單個(gè)核細(xì)胞不能與ESSC直接接觸。
[0064]培養(yǎng)14天后，分別取出分化的細(xì)胞，并且對(duì)每孔取出的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后分別種于 96 孔板，I X 105/200 μ I 10% RPM1-1640/ 孔；一部分孔用 LPS I μ g/ml 刺激 24h收培養(yǎng)上清，凍存與_20°C，檢測(cè)IL-10分泌。
[0065]二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0066]圖4顯示，用Transwell將ESSC與骨髓單個(gè)核細(xì)胞分開培養(yǎng)后所分化出的細(xì)胞數(shù)目會(huì)明顯減少，并且在LPS刺激下，所分泌的IL-10也顯著下降。這說(shuō)明這群調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的分化以及高水平分泌IL-10依賴于與ESSC的直接接觸。
[0067]實(shí)施例五分化細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的影響
[0068]一、材料和方法
[0069]1、材料:
[0070]C57BL/6J小鼠，6-8周，雌性，購(gòu)自并飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)飼養(yǎng)。CD4陰選試劑盒及CD25陽(yáng)選試劑盒、分選柱(購(gòu)自美天旎公司)，純化buffer，BSA (購(gòu)自Sigma)，紅細(xì)胞裂解液，凋亡試劑盒(寶賽公司)，IL_4、IFN-y ELISA試劑盒(購(gòu)自 BD), IL-17 ELISA 試劑盒(購(gòu)自 eB1science).Dynabeads mouse CD3/CD28 T cellexpander (購(gòu)自 Invitrogen),小鼠 CD4_PE_Cy5 抗體(購(gòu)自 eB1science)。
[0071]2、方法:
[0072](1)CD4+CD25-T 細(xì)胞的純化
[0073]無(wú)菌分離6-8周齡C57BL/6J小鼠脾臟，制成脾臟單細(xì)胞懸液，加紅細(xì)胞裂解液6000rpm、30s離心去上清，用生理鹽水洗滌3遍，計(jì)數(shù)后取1/107細(xì)胞于EP管，用100 μ I純化buffer重懸,轉(zhuǎn)移至試管中，加10 μ I CD4 B1tin-Antibody 1cktail混勻，4°C避光20min,每 2min 搖一次，然后加 30 μ I 純化 buffer 和 Ant1-B1tin Beads 20 μ 1,4°C避光20min,每 3min 搖一次。加 8_9ml 純化buffer 洗漆 2000rpm>4min 離心后 500 μ I 純化buffer重懸，分選柱用預(yù)冷500 μ I純化buffer洗漆一遍,然后上樣并用500 μ I純化buffer洗滌3次，收集未結(jié)合細(xì)胞，即為CD4+T細(xì)胞。然后用8-9ml純化buffer 2000rpm、4min洗滌一遍后100 μ I純化buffe重懸，加10 μ I CD25-PE混勻，4°C避光20min，每2min搖一次，然后用2ml純化buffe 2000rpm、4min洗漆一遍,用90 μ I純化buffe重懸,加Ant1-PEBeadslO μ 1,4°C避光 20min,每 3min 搖一次。加 8_9ml 純化 buffer 洗漆 2000rpm、4min 離心后500 μ I重懸，分選柱用預(yù)冷500 μ I純化buffer洗滌一遍，然后上樣并用500 μ I純化buffer洗滌3次，收集未結(jié)合細(xì)胞即為⑶4+⑶25—T細(xì)胞。
[0074](2) CD4+T 細(xì)胞標(biāo)記 CFSE
[0075]按照上述方法純化出⑶4+⑶25_T細(xì)胞后，取一部分導(dǎo)入EP管中，用生理鹽水6000rpm、30s洗滌3遍；用500 μ I生理鹽水重懸，加CFSE至終濃度為0.2 μ Μ，37 °C孵育8min ;然后加500 μ I血清37°C孵育1min ；生理鹽水6000rpm、30s洗漆3遍,用10 %RPM1-1640重懸，以1Χ 105/100 μ I 10% RPM1-1640/孔種入96孔板，一部分與分化巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，5天后檢測(cè)CFSE。
[0076](3)⑶4+CD25_T細(xì)胞與分化細(xì)胞共培養(yǎng)
[0077]二者以1:1的比例種入96孔板，即二者均種I X 15的細(xì)胞，用200 μ I 10%RPM1-1640進(jìn)行培養(yǎng)5天，收取培養(yǎng)上清凍存于_20°C，用于檢測(cè)細(xì)胞因子(方法詳見例三)，收取細(xì)胞用于檢測(cè)分化巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
[0078](4)凋亡的檢測(cè)
[0079]共培養(yǎng)5天后，收取細(xì)胞，先標(biāo)記小鼠⑶4 (此方法詳見例一)，然后用PBS洗滌一遍，6000rpm離心30s,用200 μ I Binding buffer重懸,根據(jù)說(shuō)明書，加小鼠PI及AnnexinV-FITC抗體，室溫染色15min，上機(jī)檢測(cè)。
[0080]二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0081]圖5顯示，根據(jù)CFSE跟蹤標(biāo)記⑶4+⑶25_T細(xì)胞可以看出，與分化巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，CFSE明顯向左移動(dòng)，說(shuō)明分化巨噬細(xì)胞可以抑制T細(xì)胞的增殖；凋亡實(shí)驗(yàn)中，在分化巨噬細(xì)胞存在時(shí)，T細(xì)胞的早起凋亡比例幾乎沒有差異，但是晚凋比例要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于沒有分化巨噬細(xì)胞存在時(shí)，說(shuō)明分化的調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的晚期凋亡。
【權(quán)利要求】
1.一種新的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的方法，其特征在于，所述分選材料包括脾臟基質(zhì)細(xì)胞。
2.一種新的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的方法，其特征在于，所誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞高表達(dá) 11-10。
3.權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的脾臟基質(zhì)細(xì)胞是可以傳代培養(yǎng)的。
4.權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的方法，其特征在于，所誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的獲得需要與脾臟基質(zhì)細(xì)胞直接接觸。
5.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的體外調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)方法用于自身免疫病細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/0786GK104342404SQ201310345011
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】王慶陽(yáng), 張紀(jì)巖, 王小茜, 肖鶴, 張雪瑩, 黎燕, 沈倍奮 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所