抗牛支原體的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗牛支原體的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及應(yīng)用。通過本發(fā)明的單克隆抗體與不同支原體菌株菌體蛋白進(jìn)行反應(yīng)，Western?Blotting結(jié)果表明，本發(fā)明的單克隆抗體3G11只與牛支原體分離株發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，而不與絲狀支原體絲狀亞種SC型（MmmSC）、絲狀支原體絲狀亞種LC型（MmmLC）、山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp)、無乳支原體(M.agalactiae)、綿羊肺炎支原體(M.ovipneumoniase)反應(yīng)，說明本發(fā)明的抗牛支原體單克隆抗體具有良好的特異性，可用于牛支原體感染的診斷和檢測，從而也為該病的防控提供了一種有效的手段。
【專利說明】抗牛支原體的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)
胞株及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種對牛支原體有特異性的單克隆抗體，產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法和應(yīng)用。屬于疾病診斷和檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]支原體(Mycoplasma),又稱霉形體，是目前已知的能在人工培養(yǎng)基中生長的最小原核微生物。支原體無細(xì)胞壁，細(xì)胞形態(tài)多形化；能夠通過0.22 μπι的細(xì)菌濾器(Nicholas&Ayling, 2003)。其基因組小，GC含量僅為27.8mol%-32.9mol%,生物合成及代謝能力低下。對青霉素等作用于細(xì)菌胞壁的抗生素有抵抗力。支原體在自然界中廣泛存在，主要分布于污水、土壤、動(dòng)植物和人體內(nèi)。支原體最早于1700年在患有傳染性胸膜肺炎的牛中發(fā)現(xiàn)，直到1898年法國科學(xué)家RouX和Nocard用含有動(dòng)物血清的人工培養(yǎng)基首次分離成功，并將其命名為胸膜肺炎微生物(Pleuropneumonia Organism,ΡΡ0)。此后,不斷有新的類似的微生物被分離出來，統(tǒng)稱為類胸膜肺炎微生物(Pleuropneumonsa like organism,PPL0)。1967年，國際細(xì)菌命名委員會(huì)正式將這類微生物命名為支原體，并一直沿用至今。早期的支原體研究受限于培養(yǎng)條件，研究進(jìn)展一直很緩慢。直至1962年，Hayflick采用無細(xì)胞的支原體培養(yǎng)基成功分離到肺炎支原體后，支原體的研究才逐漸取得極大進(jìn)展。迄今為止，人們已經(jīng)分離到190多種支原體，許多能夠引起動(dòng)植物多種疾病。
[0003]牛支原體(Mycoplasma bovis, Μ.bovis)在分類上屬于支原體屬，同其他支原體一樣，牛支原體具有體型微小，基因組成分微量等特征(Caswell&Archambault, 2007)。普通光學(xué)顯微鏡不能觀察到牛支原體，只有在電鏡下才能觀察到其外表特征。與大部分支原體一樣，牛支原體是一種宿主特異性粘膜常在菌，在牛的呼吸道黏膜、腸道黏膜，泌尿生殖到黏膜，乳腺黏膜、眼結(jié)膜 均可存在，其主要生存方式是作為寄生或作為條件致病菌的共生關(guān)系(Gevaert, 2006;Pfutzner&Sachse, 1996)。健康牛上呼吸道黏膜的牛支原體,在應(yīng)激條件下，如長途運(yùn)輸、天機(jī)驟變，管理不良等原因，可以轉(zhuǎn)移到其他部位，引起多種疾病(MaunseIl&Donovan, 2009)。
[0004]自Nocard在1898年從患肺炎的病牛胸前積液這兩個(gè)分離到絲狀支原體絲狀亞種(MmmSC)以來，人們一直認(rèn)為MmmSC引起的牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)是危害養(yǎng)牛業(yè)最重要的傳染病。然而，1961年康奈爾大學(xué)的hela發(fā)現(xiàn)的牛支原體逐漸引起全世界的重視。
[0005]牛支原體能夠引起肺炎，中耳炎，乳房炎、角膜結(jié)膜炎等與M.bovis相關(guān)的疾病被簡稱為MbAD。MbAD在歐洲和北美廣泛流行，造成了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在英國每年超過190萬頭牛感染呼吸道疾病，約有157000頭小牛死于肺炎和相關(guān)疾病，至少有1/4-1/3是由牛支原體引起的。在美國，由于牛支原體導(dǎo)致乳房炎引起的損失比呼吸道引起的損失更加嚴(yán)重，每年約為1.08億美元。MbAD病原牛支原體于1961年首次在美國患有乳房炎的病牛中分離到，1976確認(rèn)為牛支原體感染。牛支原體在分類上地位上屬于支原體科支原體目支原體屬成員，目前由于缺乏牛支原體基因組的完整數(shù)據(jù)，所有研究工作仍然以全菌體蛋白組分與免疫血清的免疫結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)行。
[0006]2008年中國湖北省首先出現(xiàn)牛支原體的病例報(bào)告，此后，寧夏，貴州等十多個(gè)省市自治區(qū)相繼出現(xiàn)由牛支原體引起的死亡病例。據(jù)我們的統(tǒng)計(jì)，MbAD的死亡率可以達(dá)到38%，而且臨床癥狀與已經(jīng)在中國消滅的牛傳染性胸膜肺炎(0ΙΕ規(guī)定必須報(bào)告的傳染病CBPP)相似，所以最初是被當(dāng)做CBPP卷土重來而引起了獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注和焦慮。牛支原體病的快速診斷因而被提上日程。
[0007]2012年，任澤民、姜勇等以牛支原體湖北分離株HB0801作為抗原免疫8周齡BALB/C小鼠，利用雜交瘤技術(shù)篩選出了 6株能穩(wěn)定分泌抗牛支原體的單克隆抗體細(xì)胞株，分別生產(chǎn)腹水并對單抗進(jìn)行了純化和特性鑒定。但是ELISA特異性分析結(jié)果表明，這6株單抗不僅與臨床分離的牛支原體菌株以及ATCC標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45顯陽性反應(yīng)，同時(shí)所有制備的單抗都與無乳支原體PG2有交叉反應(yīng)，因此無法實(shí)現(xiàn)對牛支原體的特異性檢測(任澤民、姜勇等，牛支原體單克隆抗體的制備與鑒定，中國畜牧獸醫(yī)，2012年第39卷第7期)。
[0008]因此，建立一種快速、高通量的針對牛支原體感染的血清抗體檢測方法就顯得十分重要了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]針對目前現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)對牛支原體進(jìn)行快速且特異性檢測的單克隆抗體。
[0010]本發(fā)明的目的之二在于提供一種能夠穩(wěn)定分泌上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0011]本發(fā)明的目的之三在于提供所述的單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株在制備檢測或診斷牛支原體感染試劑中的應(yīng)用，從而為牛支原體感染所引起疾病的防控提供了一種有效的途徑。
[0012]為了達(dá)到以上所述的目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)手段為:
[0013]本發(fā)明以牛支原體湖北分離株Hube1-1株作為抗原免疫6周齡SPF級雌性BALB/C小鼠，利用雜交瘤技術(shù)篩選出了 I株能穩(wěn)定分泌抗牛支原體的單克隆抗體細(xì)胞株，分別生產(chǎn)腹水并對單抗進(jìn)行了純化和特性鑒定。ELISA特異性分析結(jié)果表明，這株單抗僅與臨床分離的牛支原體菌株顯陽性反應(yīng)，而與絲狀支原體絲狀亞種SC標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G1、絲狀支原體絲狀亞種LC型標(biāo)準(zhǔn)株Y-goat、山羊支原體山羊肺炎亞種中國分離株87001、無乳支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G2、綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y-98均不反應(yīng)，因此說明了本發(fā)明的單克隆抗體能夠?qū)崿F(xiàn)對牛支原體的特異性檢測。
[0014]本發(fā)明的一株分泌抗牛支原體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3G11，分類命名為骨髓瘤雜交瘤細(xì)胞株，其菌種保藏編號為CGMCC N0.7060，保藏時(shí)間為2013年I月16日，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所。
[0015]此外，本發(fā)明還提供了由所述的雜交瘤細(xì)胞株所分泌的抗牛支原體的單克隆抗體。及所述的雜交瘤細(xì)胞株和所述的單克隆抗體在制備診斷或檢測牛支原體感染試劑中的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】[0016]圖1為融合后的細(xì)胞形態(tài)示意圖；
[0017]左圖為融合后第3天的細(xì)胞形態(tài)；右圖為融合后第9天的細(xì)胞形態(tài)；
[0018]圖2為3G11株單克隆抗體與的牛支原體Hube1-1分離株Western Blotting分析
結(jié)果;
[0019]泳道1:牛支原體Hube1-1分離株;M為蛋白分子量Marker0671 ；
[0020]圖3為3G11株單克隆抗體的特異性分析結(jié)果；
[0021]1:牛支原體Hube1-1分離株；2:絲狀支原體絲狀亞種SC標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)Gl ；3:絲狀支原體絲狀亞種LC型標(biāo)準(zhǔn)株Y-goat ；4:山羊支原體山羊肺炎亞種分離株87001 ；5:無乳支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G2 ；6:綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y-98 ；M:蛋白分子量Marker0671 ；
[0022]圖4為3G11株單克隆抗體對牛支原體各分離株的特異性分析結(jié)果。
[0023]1:牛支原體Hube1-1分離株；2:牛支原體內(nèi)蒙分離株；3:牛支原體廣西分離株；4:牛支原體吉林分離株；5:陰性對照(牛血清白蛋白)；M:蛋白分子量Marker0671
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0025]實(shí)施例1抗牛支原體的單克隆抗體的制備及其特性檢測
[0026]I實(shí)驗(yàn)材料
[0027]1.1細(xì)胞、菌株、基因組、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0028]SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a和BL21、牛支原體Hube1-1分離株、牛支原體內(nèi)蒙分離株、牛支原體廣西分離株、牛支原體吉林分離株、絲狀支原體絲狀亞種SC標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)Gl、絲狀支原體絲狀亞種LC型標(biāo)準(zhǔn)株Y-goat、山羊支原體山羊肺炎亞種分離株87001、無乳支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G2、綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y-98由本實(shí)驗(yàn)室保存；6周齡SPF級雌性Balb/c小鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，具有合格證。
[0029]1.2工具酶及其他試劑(盒)
[0030]FBS購自GIBCO公司；卡那青霉素、購自宏博生物技術(shù)有限公司，HT、HAT (50x)培養(yǎng)基凍干粉、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、二甲基亞颯、雙抗(青霉素一鏈霉素)溶液購自Sigma公司；山羊抗鼠IgG-HRP、聚乙二醇50%(MW:1450)購自Sigma ;DMEM基本培養(yǎng)基購自哈爾濱動(dòng)物生物制品國家工程研究中心有限公司。
[0031]1.3牛支原體液體培養(yǎng)基配制
[0032]PPLO肉湯21g,滅活馬血清200mL,新鮮酵母浸出液IOOmL, 0.5g/mL的葡萄糖2mL,0.5g/mL的丙酮酸鈉8mL，0.5%酚紅3.2mL，用去離子水補(bǔ)足到IOOOmL,調(diào)節(jié)pH至7.4?7.6，經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾除菌分裝，4°C保存?zhèn)溆谩τ诔醮蛛x需加入青霉素100U/mL，醋酸鉈終濃度為0.01%。加1%的瓊脂糖制成固體培養(yǎng)基待用。
[0033]1.4血清樣品牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)陽性血清PS2、口蹄疫(FMD)陽性血清、牛結(jié)核分枝桿菌(MB)陽性血清、牛病毒性腹瀉(BVDV)陽性血清、牛傳染性鼻氣管炎(IBRV)陽性血清各I份，牛支原體臨床陽性血清20份，健康牛血清20份，以上血清均保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物細(xì)菌病研究室支原體課題組。
[0034]2 方法
[0035]2.1抗原的制備
[0036]牛支原體Hube1-1株按1%(ν/ν)比例接種于500mL牛支原體液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)36h收獲，菌數(shù)應(yīng)達(dá)到109(XU/ml以上。13000g離心30min收獲支原體菌體沉淀。將牛支原體菌體沉淀用相當(dāng)于原體積1/10的PBS重懸后，再13000g離心30min收獲支原體菌體沉淀，即洗滌，洗滌3次后，冰浴超聲破碎，功率為150w，有效時(shí)間為5min。再12000g離心20min收獲支原體菌體破碎裂解物，用BCA蛋白定量試劑盒測總蛋白濃度。定量分裝后保存于_70°C。
[0037]2.2單抗的制備
[0038]2.2.1動(dòng)物的免疫
[0039]6周齡的SPF級雌性BALB/C小鼠，首免，背部皮下注射弗氏完全佐劑乳化的抗原100 μ g/只；2周后,用不完全弗氏佐劑乳化的抗原,背部皮下注射100 μ g/只，二免后14d再用不完全弗氏佐劑乳化的抗原同樣計(jì)量加強(qiáng)免疫一次，三免14天后，通過斷尾采取免疫鼠血液，分離血清，通過間接ELISA的方法測定小鼠血清抗體效價(jià)。在融合前三天通過腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
[0040]2.2.2骨髓瘤細(xì)胞的復(fù)蘇
[0041]從液氮罐中取出凍存的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，迅速放入37°C水浴鍋中快速晃動(dòng)至完全融化；在1000r/min離心3min ;吸棄上清，用完全DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(含20%FBS)將細(xì)胞沉淀吹散懸浮后加入有適量生長液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置5%C023 7°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)3-5d后進(jìn)行細(xì)胞傳代，擴(kuò)大培養(yǎng)。融合前一夜，更換培養(yǎng)液。
[0042]2.2.3細(xì)胞融合
[0043](I)制備飼養(yǎng)細(xì)胞
[0044]取一只未免疫的BALB/C小鼠，眼眶放血，收集血清，即為陰性血清。腹部向上，固定四肢后，先撕開皮膚，露出腹膜，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后用吸管2-3mL(視老鼠大小而定)DMEM基礎(chǔ)液注入小鼠腹腔，吹吸幾次后將液體吸出放于50mL離心管中，再重復(fù)一次，此為腹腔巨噬細(xì)胞。用DMEM基礎(chǔ)液清洗腹腔巨噬細(xì)胞2次，用含F(xiàn)BS10%的完全培養(yǎng)基重新懸起，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為IO5個(gè)/mL，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ I。
[0045](2)制備免疫脾細(xì)胞
[0046]取已加強(qiáng)免疫的BALB/C小鼠一只，眼眶放血處死(收集血清，即為陽性血清)，在75%酒精中浸泡5min消毒。腹部向下，固定四肢后，用鑷子夾住下腹部皮膚，剪一小口，撕開皮膚露出腹膜，換一套鑷子和剪刀，剪開腹膜，暴露出脾臟，再換一套器械，用鑷子夾住脾臟，用剪刀去掉粘連細(xì)胞的脂肪組織，剪破脾臟外膜，放入滅菌的勻漿器中。加5mL DMEM基礎(chǔ)液于勻漿器中，輕輕研磨，擠壓出脾細(xì)胞，補(bǔ)加IOmL DMEM基礎(chǔ)液，靜置2min，吸取上層細(xì)胞懸液于一無菌的50mL離心管，再補(bǔ)加IOmL DMEM基礎(chǔ)液于勻漿器中，同上重復(fù)2次。1000r/min離心IOmin,棄 去上清,細(xì)胞重懸后計(jì)數(shù)。
[0047](3) SP2/0細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備
[0048]棄掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用DMEM基礎(chǔ)液將骨髓瘤細(xì)胞吹打下來。用DMEM基礎(chǔ)液洗滌2次后，重懸計(jì)數(shù)。
[0049](4)細(xì)胞融合
[0050]將SP2/0細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按照1:5?1:10比例加入到50mL離心管中，混合均勻后lOOOr/min，離心8min。棄凈上清，輕輕敲擊管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)，便于PEG充分的作用細(xì)胞。將裝有細(xì)胞混合物的離心管放于37°C水浴中。然后在Imin內(nèi)慢慢滴入預(yù)溫至370C的50%PEG ImL,邊加邊輕輕用吸管尖攪拌。繼續(xù)攪拌30s，靜置30s。然后慢慢加入37°C預(yù)溫的DMEM基礎(chǔ)液10mL。具體方法為:第一分鐘逐滴滴入lmL，第二分鐘加2mL，第三至第四分鐘加3mL，第5分鐘加其余的6mL，每次加時(shí)需緩慢加入，并不斷輕輕地?cái)嚢?。最后緩慢加?0mLDMEM基礎(chǔ)液。1000r/min離心7min，棄取上清，于37°C放置5_8min。用含20%FBS的HAT完全培養(yǎng)基輕柔重懸融合后的混合細(xì)胞，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，約100 μ L/孔。于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在融合后第3、6天吸去100 μ L/孔培養(yǎng)基，加入100 μ L/孔，即半換液。培養(yǎng)至第9、12天用含20%FBS的HT完全培養(yǎng)基半換液培養(yǎng)。
[0051]2.2.4間接ELISA方法篩選陽性克隆
[0052]2.2.4.1篩選方法的建立
[0053]米用方陣滴定法確定抗原的最佳包被濃度。用樣品包被液(0.5M碳酸鹽包被液)將純化的抗原按照0.25 μ g/mL、0.5 μ g/mL、0.75 μ g/mL、l.0 μ g/mL進(jìn)行稀釋,將稀釋好的不同濃度的抗原縱向加入到96孔酶標(biāo)板中，100 μ L/孔，370C 2h。用PBST洗板3次，每次將孔內(nèi)液體棄凈。用含5%(sigma)魚明膠的PBST封閉，37°C 2h。以免疫鼠血清作為陽性對照血清，空白鼠血清作為陰性對照血清，將血清按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000進(jìn)行稀釋，100 μ L/孔，橫向加入酶標(biāo)板中，37°C lh。洗滌后，加入1:5000稀釋的羊抗鼠IgG一 HRP (sigma)，100 μ L/孔，37°C lh。然后 100 μ L/孔，加入 TMB 底物顯色液，顯色 lOmin，以終止液終止反應(yīng)。在450nm波長下，用酶標(biāo)儀讀取其吸光值(OD值450)。選擇OD值接近于1.0，P/N值接近最大的孔所對應(yīng)的抗原稀釋濃度作為抗原的最佳包被濃度。
[0054]2.2.4.2陽性克隆的篩選
[0055](I)以確定好的抗原的最佳包被濃度用包被液稀釋抗原，100 μ L/孔，加入酶標(biāo)板中，37°C孵育2h ；
[0056](2)用PBST洗滌3次，室溫靜置3min/次，每次棄凈空中液體；用含5%魚明膠的pBST 封閉，100 μ L/ 孔，37°C孵育 2h ；
[0057](3)用PBST洗滌3次，室溫靜置3min/次，每次棄凈空中液體；加入按比例稀釋好的待檢樣品，100 μ L/孔，37°C孵育Ih ；
[0058](4)用PBST洗滌3次，室溫靜置3min/次，每次棄凈空中液體；加入1:5000稀釋的羊抗鼠 IgG — HRP (Sigma) 100 μ L/ 孔，37°C孵育 Ih ；
[0059](5)用PBST洗滌3次，室溫靜置3min/次，每次棄凈空中液體；加入TMB底物液，100 μ L/孔,避光顯色I(xiàn)Omin0
[0060](6)加入終止液50 μ L/孔。
[0061](7)在450nm波長下，用酶標(biāo)儀讀取其吸光值。
[0062]2.2.5陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆
[0063]采用有限稀釋法克隆陽性雜交瘤細(xì)胞。克隆前按照飼養(yǎng)細(xì)胞的制備方法制備小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞層，飼養(yǎng)細(xì)胞用含20%FBS的完全培養(yǎng)基懸浮后平鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞濃度為IO5個(gè)/mL，100 μ L/孔。將細(xì)胞用培養(yǎng)基稀釋到3個(gè)細(xì)胞/mL、5個(gè)細(xì)胞/mL、10個(gè)細(xì)胞/mL。將這三個(gè)濃度的細(xì)胞懸液分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μ L/孔，使相應(yīng)的每孔分別含0.3,0.5和I個(gè)細(xì)胞。放置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)至第3、6、9天，半換液更新孔內(nèi)培養(yǎng)基。在克隆后第7?9天，細(xì)胞克隆長滿1/3?1/2個(gè)視野時(shí)，即可檢測。如檢出的雜交瘤細(xì)胞生長孔有特異性抗體，可選擇抗體效價(jià)高，呈單個(gè)克隆生長，形態(tài)良好的細(xì)胞孔，繼續(xù)同法再克隆或擴(kuò)大培養(yǎng)，一般克隆3?4輪，直到該雜交瘤細(xì)胞株完全穩(wěn)定后，擴(kuò)大培養(yǎng)到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞生長良好時(shí)，可通過腹腔注射接種小鼠的方法制備腹水，并做好標(biāo)記，凍存4支以上的細(xì)胞。
[0064]2.2.6單克隆抗體的大量制備
[0065]采用體內(nèi)制備方案，即:預(yù)刺激BALB/C小鼠和雜交瘤細(xì)胞的腹腔注射的方法。操作過程如下:取8?10周齡的雌性BALB/C小鼠，腹腔注射滅菌的液體石蠟0.5mL/只，7?10天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5xl05?IO6/只(或者一個(gè)24孔細(xì)胞板的細(xì)胞一長滿后，收集細(xì)胞注射即可)。一般在9?15天后即可產(chǎn)生大量的腹水。抽取腹水后，離心取中間層，測定效價(jià)，并凍存細(xì)胞。
[0066]2.3單抗的鑒定
[0067]2.3.1單抗亞類鑒定
[0068]采用抗體類型及亞類鑒定試劑盒SBA Clonotyping System/AP(SouthernBiotechnology Associates, USA),檢測單抗類型。
[0069](IWflABTS底物貯存液:lmL去離子水溶解15mgABTS，避光儲(chǔ)存于2_8°C (4周)
[0070](2)用ρΗ7.4的PBS稀釋捕獲抗體濃縮物至5-lOug/mL，每孔IOOul加入ELISA板(也可用免疫用的抗原包被)
[0071](3)把板子放入濕盒孵化，2_8°C至少包被12小時(shí)
[0072](4)用PBST洗板3次，每孔加滿封閉液(含1%牛血清白蛋白的PBS)
[0073](5)將板子放入室溫至少封閉I小時(shí)
[0074](6) PBST 洗板 3 次
[0075](7)每孔加入IOOul雜交瘤上清，蓋好，室溫緩慢震蕩Ih或在2-8°C孵育過夜
[0076](8) PBST 洗板 3 次
[0077](9)用封閉液1:250-1:500稀釋HRP標(biāo)記的抗體，每孔IOOul，蓋好，室溫緩慢震蕩I小時(shí)
[0078](10) PBST 洗板 5 次
[0079](ll)55mM檸檬酸鹽:將525mg檸檬酸或804mg檸檬酸鈉.2Η20溶于50mL雙蒸水，用3M NaOH調(diào)節(jié)pH為4.0。IOmL 55mM檸檬酸鹽加入200ul ABTS貯存液和IOul 30%的雙氧水。
[0080](12)每孔加IOOul上述底物溶液
[0081](13)分別在顯色I(xiàn)Omin和20min 405nm讀OD并記錄數(shù)據(jù)。
[0082]2.3.2單克隆抗體(腹水)效價(jià)的測定
[0083]按照建立的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法測定單克隆抗體(腹水)的效價(jià)。首先，按照最佳包被濃度包被蛋白，封閉洗滌后，將收集的腹水按照ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'10_4、10_5及10_6做連續(xù)稀釋，一般做6個(gè)稀釋度。并以骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的培養(yǎng)上清按照同樣稀釋辦法稀釋作為陰性對照，按照2.2.4.1確定的ELISA方法進(jìn)行檢測。
[0084]2.3.3 單抗 Western Blotting 驗(yàn)證
[0085]取2.1制備的牛支原體沉淀的超聲裂解物40 μ I與2X SDS凝膠電泳上樣緩沖液和10μ1 lmol/L DTT混勻，置于沸水浴中加熱lOmin。離心10000r/min, lmin。取5ul處理后的樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳。電泳結(jié)束后，采用半干法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。用I3BST洗三遍，每次lOmin。用5%魚明膠封閉2h。用PBS將小鼠腹水做1:500倍稀釋，將封閉后的硝酸纖維素膜侵入到稀釋后的小鼠腹水中，孵育lh。PBST洗三遍同上。用PBS將羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)按1:5000進(jìn)行稀釋，用該液體在37°C孵育硝酸纖維素膜lh。PBST洗三遍同上。用DAB顯色液顯色后觀察。
[0086]2.3.4單抗的特異性檢驗(yàn)
[0087]應(yīng)用Western Blotting檢測所制備的單克隆抗體針對不同支原體菌株的特異性。選取的測試菌株有:牛支原體Hube1-1分離株、牛支原體內(nèi)蒙分離株、牛支原體廣西分離株、牛支原體吉林分離株、絲狀支原體絲狀亞種SC標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)Gl、絲狀支原體絲狀亞種LC型標(biāo)準(zhǔn)株Y-goat、山羊支原體山羊肺炎亞種分離株87001、無乳支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G2、綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y-98。用1.5mL離心管稱取0.03?0.04g各株支原體培養(yǎng)物沉淀，按照2.3.3方法進(jìn)行檢測。
[0088]2.4間接阻斷ELISA方法的建立
[0089]2.4.1間接阻斷ELISA方法的程序
[0090]用60mmol/L CBS將ELISA抗原稀釋成0.2 μ g/孔，以每孔100 μ L的量加入酶標(biāo)板中，4°C靜置過夜；甩去板中的液體，用含0.05%Tween-20的PBS(PBST，pH7.2)洗板3次，力口入封閉液(含2.5%脫脂奶粉的PBST)，每孔200μ L，37°C作用Ih ;甩去液體、洗板，加入被檢的牛血清，每孔100 μ L， 37°C作用45min ;甩去液體、洗板，加入單抗Η)10，每孔100 μ L，37°C作用45min ;甩去液體、洗板，加入HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗，每孔100μ L，37°C作用45min ;甩去液體、洗板，加入TMB，每孔IOOyL,室溫作用15min ;加入lmol/L H2SO4 50 yL終止反應(yīng)，測定0D450nm值。
[0091]2.4.2條件優(yōu)化
[0092]將牛支原體牛陽性血清從10倍開始倍比稀釋加入到包被好抗原的酶標(biāo)板中，100 μ L/孔，370C，Ih ;將單抗從500倍稀釋，100 μ L/孔，37°C，Ih ;加入40000倍稀釋羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)，100 μ L/孔，37°C，Ih ;終止并顯色；讀取0D450值；計(jì)算待檢血清對單抗的阻斷率(％阻斷率=IOO-1OOX被檢血清OD值/陰性對照平均OD值)。取陰性對照值接近1.0，且阻斷率最大的反應(yīng)條件為最佳反應(yīng)條件。
[0093]2.4.3特異性檢測用建立好的間接阻斷ELISA方法檢測一下血清樣品:牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)陽性血清PS2、口蹄疫(FMD)陽性血清、牛結(jié)核分枝桿菌(MB)陽性血清、牛病毒性腹瀉(BVDV)陽性血清、牛傳染性鼻氣管炎(IBRV)陽性血清各I份。阻斷率> 50%的臨床樣品判定為陽性，阻斷率< 50%的臨床樣品判定為陰性。
[0094]2.4.4臨床樣品檢測用建立好的間接阻斷ELISA方法檢測一下血清樣品:牛支原體臨床陽性血清20份，健康牛血清20份。阻斷率> 50%的臨床樣品判定為陽性，阻斷率< 50%的臨床樣品判定為陰性。
[0095]3 結(jié)果[0096]3.1雜交瘤細(xì)胞株的篩選
[0097]3.1.1細(xì)胞融合
[0098]細(xì)胞融合后第3-6天，部分孔出現(xiàn)明顯細(xì)胞群落，第9天細(xì)胞在培養(yǎng)板孔底覆蓋到1/10?1/3的面積。融合后的細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。
[0099]3.1.2陽性克隆的篩選
[0100]用間接ELISA方法對各孔培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選。經(jīng)篩選并克隆后得到I株能夠穩(wěn)定分泌抗牛支原體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3G11，分類命名為骨髓瘤雜交瘤細(xì)胞株，其菌種保藏編號為CGMCC N0.7060，保藏時(shí)間為2013年I月16日，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所。
[0101]3.2單抗的制備
[0102]3.2.1間接ELISA方法的建立
[0103]采用方陣滴定法確定抗原的最佳包被濃度。ELISA方法的最佳反應(yīng)條件為:抗原包被濃度為0.5 μ g/mL，37°C，孵育2h ;用PBST洗板3遍；用含5%(sigma)魚明膠的PBST封閉，37°C 2h ;陽性對照血清稀釋倍數(shù)為1:1000,37°C Ih ;用PBST洗板3遍，加入1:5000稀釋的羊抗鼠IgG — HRP (sigma)，100 μ L/孔，37°C孵育lh。然后100 μ L/孔，加入TMB底物顯色液，顯色lOmin，以終止液終止反應(yīng)。在450nm波長下，用酶標(biāo)儀讀取其吸光值(OD45tl值)，ELISA檢測結(jié)果如表I所示。
[0104]表I間接ELISA方法建立結(jié)果
[0105]
【權(quán)利要求】
1.一株分泌抗牛支原體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3G11，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC N0.7060。
2.由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株所分泌的抗牛支原體的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株在制備診斷或檢測牛支原體感染試劑中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所 述的單克隆抗體在制備診斷或檢測牛支原體感染試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/91GK103436496SQ201310336959
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月5日
【發(fā)明者】辛九慶, 劉洋, 李媛, 汪洋 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所, 哈爾濱動(dòng)物生物制品國家工程研究中心有限公司