提高多肽的纖維素分解增強(qiáng)活性的方法【專利摘要】本發(fā)明涉及提高多肽的纖維素分解增強(qiáng)活性的方法，具體的涉及提高具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的活性的方法，包括：向含有具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的組合物加入可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子，其中與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高。本發(fā)明還涉及組合物、降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的方法，以及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法?！緦＠f(shuō)明】提高多肽的纖維素分解增強(qiáng)活性的方法[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年05月30日，申請(qǐng)?zhí)枮椤?00880101442.8”(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮椤癙CT/US2008/065360”)，名稱為“提高多肽的纖維素分解增強(qiáng)活性的方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。[0002]對(duì)序列表的援引[0003]本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。本申請(qǐng)通過(guò)援引并入該序列表。[0004]對(duì)生物材料保藏物的援弓I[0005]本申請(qǐng)包含對(duì)生物材料保藏物的援引，并通過(guò)援引并入該生物材料保藏物。[0006]發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域[0007]本發(fā)明涉及用于提高具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的活性的方法和組合物。[0008]相關(guān)技術(shù)的說(shuō)明[0009]纖維素是一種由簡(jiǎn)單糖類葡萄糖通過(guò)β_1，4-聯(lián)結(jié)共價(jià)鍵合而成的聚合物。許多微生物可產(chǎn)生水解β_聯(lián)結(jié)的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanases)、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolases)和β_葡糖苷酶(β-glucosidases)。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機(jī)的部位消化纖維素聚合物，使其暴露于纖維二糖水解酶的攻擊之下。纖維二糖水解酶從該纖維素聚合物的末端順序地釋放纖維二糖分子。纖維二糖是一種水溶性的葡萄糖β-1,4-聯(lián)結(jié)二聚物。β-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。[0010]將含纖維素原料轉(zhuǎn)化為乙醇具有大量原料易得、可理想地避免材料的焚燒和填埋，以及乙醇燃料的清潔性等優(yōu)勢(shì)。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物，以及城市固體廢物已被考慮用來(lái)作為生產(chǎn)乙醇的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成。一旦纖維素被轉(zhuǎn)化為葡萄糖，葡萄糖即被酵母容易地轉(zhuǎn)化為乙醇。[0011]WO2005/074647公開了來(lái)自土生梭抱殼(Thielaviaterrestris)的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離多肽及其多核苷酸。WO2005/074656公開了來(lái)自橙色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽及其多核苷酸。公布的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)2007/0077630公開了來(lái)自里氏木霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽及其多核苷酸。[0012]提高具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的活性在本領(lǐng)域中將會(huì)是有利的。[0013]本發(fā)明涉及用于提高具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的活性的方法和組合物?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0014]本發(fā)明涉及提高具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的活性的方法，其包括:向包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的組合物添加可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子，其中可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的過(guò)程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在，且與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高。[0015]本發(fā)明還涉及降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的方法，其包括:用有效量的纖維素分解酶組合物處理含纖維素材料，所述組合物包含有效量的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在。[0016]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:(a)用有效量的纖維素分解酶組合物糖化含纖維素材料，所述組合物包含有效量的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟(a)中經(jīng)糖化的含纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵中回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0017]本發(fā)明還涉及包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的組合物，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的過(guò)程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在，且與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高。[0018]本發(fā)明還涉及包含有效量的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的過(guò)程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在，且與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提聞。[0019]具體地，本發(fā)明還涉及如下各項(xiàng):[0020]1.提高具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的活性的方法，包括:向含有具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的組合物中加入可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的過(guò)程中以優(yōu)選約0.0OlmM-約50mM、更優(yōu)選約0.0lmM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約10mM、進(jìn)一步更優(yōu)選約0.3mM-約5mM、最優(yōu)選約0.3mM-約2.5mM、進(jìn)一步最優(yōu)選約0.3mM-約ImM的有效濃度存在，與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高。[0021]2.項(xiàng)I的方法，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。[0022]3.項(xiàng)I的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組:[0023](a)含有[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，而X(4)是在4個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸；和[0024](b)含有[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，而X(3)是在3個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸；[0025]其中含有[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽還任選包含:[0026]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]、[0027][EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或[0028]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]—X—Y—X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],[0029]其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在I個(gè)位置或2個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，而X(2)是在2個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸。[0030]4.項(xiàng)I的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組:[0031](a)含有與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、進(jìn)一步更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列的多肽；[0032](b)由在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊度條件、更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊度條件、最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊度條件下與(i)SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:USEQIDNO:3,SEQIDNO:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列中含有的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7、SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸編碼的多肽；[0033](c)由如下多核苷酸編碼的多肽:該多核苷酸包含與SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、進(jìn)一步更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%同一'丨生的核苷酸序列；[0034](d)SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和[0035](e)含有SEQIDN0:2、SEQIDNO:4,SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽或由SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽組成的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽；或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。[0036]5.項(xiàng)4的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是由大腸桿菌NRRLB-30699中所含的質(zhì)粒PEJG120、大腸桿菌NRRLB-30813中所含的質(zhì)粒pTter61C、大腸桿菌NRRLB-30812中所含的質(zhì)粒pTter61D、大腸桿菌NRRLB-30814中所含的質(zhì)粒pTter61E、大腸桿菌NRRLB-30811中所含的質(zhì)粒pTter61G、大`腸桿菌NRRLB-30704中所含的質(zhì)粒PDZA2-7或大腸桿菌NRRLB-30878中所含的質(zhì)粒pTr3337中包含的多核苷酸編碼的。[0037]6.降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的方法，包括:用有效量的纖維素分解酶組合物處理含纖維素材料，所述纖維素分解酶組合物包含有效量的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以優(yōu)選約0.00ImM-約50mM、更優(yōu)選約0.0lmM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約10mM、進(jìn)一步更優(yōu)選約0.3mM-約5mM、最優(yōu)選約0.3mM_約2.5mM、進(jìn)一步最優(yōu)選約0.3mM_約ImM的有效濃度存在。[0038]7.項(xiàng)6的方法，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。[0039]8.項(xiàng)6的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組:[0040](a)包含[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，而X(4)是在4個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸；和[0041](b)含有[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，而X(3)是在3個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸；[0042]其中含有[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽還任選包含:[0043]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]、[0044][EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或[0045]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],[0046]其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在I個(gè)位置或2個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，而X(2)是在2個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸。[0047]9.項(xiàng)6的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組:[0048](a)含有與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、進(jìn)一步更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列的多肽；[0049](b)由在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊度條件、更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊度條件、最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊度條件下與(i)SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:USEQIDNO:3,SEQIDN0:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列中含有的cDNA序列，或者包含SEQIDN0:7、SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸編碼的多肽；[0050](c)由如下多核苷酸編碼的多肽:該多核苷酸包含與SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、進(jìn)一步更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%同一'丨生的核苷酸序列；[0051](d)SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDN0:8或SEQI`DNO:10,SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和[0052](e)含有SEQIDN0:2、SEQIDNO:4,SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽或由SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽組成的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽；或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。[0053]10.項(xiàng)9的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是由大腸桿菌NRRLB-30699中所含的質(zhì)粒PEJG120、大腸桿菌NRRLB-30813中所含的質(zhì)粒pTter61C、大腸桿菌NRRLB-30812中所含的質(zhì)粒pTter61D、大腸桿菌NRRLB-30814中所含的質(zhì)粒pTter61E、大腸桿菌NRRLB-30811中所含的質(zhì)粒pTter61G、大腸桿菌NRRLB-30704中所含的質(zhì)粒PDZA2-7或大腸桿菌NRRLB-30878中所含的質(zhì)粒pTr3337中包含的多核苷酸編碼的。[0054]11.項(xiàng)6-10中任一項(xiàng)的方法，其還包括用有效量的β-葡糖苷酶處理含纖維素材料。[0055]12.項(xiàng)6-11中任一項(xiàng)的方法,其還包括用有效量的一種或多種選自下組的酶處理含纖維素材料:半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過(guò)氧化物酶或其混合物。[0056]13.項(xiàng)6-12中任一項(xiàng)的方法，其還包括補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的濃度以維持可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的有效濃度為優(yōu)選約0.0OlmM-約50mM、更優(yōu)選約0.0lmM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約10mM、進(jìn)一步更優(yōu)選約0.3mM-約5mM、最優(yōu)選約0.3mM-約2.5mM、進(jìn)一步最優(yōu)選約0.3mM-約ImM。[0057]14.項(xiàng)6-13中任一項(xiàng)的方法，其還包括回收經(jīng)降解的含纖維素材料。[0058]15.產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括:(a)用有效量的包含有效量的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的纖維素分解酶組合物糖化含纖維素材料，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以優(yōu)選約0.0OlmM-約50mM、更優(yōu)選約0.0lmM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約10mM、進(jìn)一步更優(yōu)選約0.3mM-約5mM、最優(yōu)選約0.3mM-約2.5mM、進(jìn)一步最優(yōu)選約0.3mM-約ImM的有效濃度存在；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟(a)中經(jīng)糖化的含纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0059]16.項(xiàng)15的方法，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。[0060]17.項(xiàng)15的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組:[0061](a)包含[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，而X(4)是在4個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸；和[0062](b)含有[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，其中X是任何氨基酸，X(4,5)是在4或5個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，而X(3)是在3個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸；[0063]其中含有[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽還任選包含:[0064]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]、[0065][EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]或[0066]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]—X—Y—X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV],[0067]其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在I個(gè)位置或2個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，而X(2)是在2個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸。[0068]18.項(xiàng)15的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組:[0069](a)含有與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、進(jìn)一步更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%同一性的氨基酸序列的多肽；[0070](b)由在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊度條件、更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊度條件、最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊度條件下與(i)SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:USEQIDNO:3,SEQIDNO:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列中含有的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7、SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或者(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸編碼的多肽；[0071](c)由如下多核苷酸編碼的多肽:該多核苷酸包含與SEQIDNOiUSEQIDN0:3、SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、進(jìn)一步更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%同一'丨生的核苷酸序列；[0072](d)SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體；和[0073](e)含有SEQIDN0:2、SEQIDNO:4,SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽或由SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽組成的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽；或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。[0074]19.項(xiàng)18的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是由大腸桿菌NRRLB-30699中所含的質(zhì)粒PEJG120、大腸桿菌NRRLB-30813中所含的質(zhì)粒pTter61C、大腸桿菌NRRLB-30812中所含的質(zhì)粒pTter61D、大腸桿菌NRRLB-30814中所含的質(zhì)粒pTter61E、大腸桿菌NRRLB-30811中所含的質(zhì)粒pTter61G、大腸桿菌NRRLB-30704中所含的質(zhì)粒PDZA2-7或大腸桿菌NRRLB-30878中所含的質(zhì)粒pTr3337中包含的多核苷酸編碼的。[0075]20.項(xiàng)15-19中任一項(xiàng)的方法,其還包括用有效量的β-葡糖苷酶處理含纖維素材料。[0076]21.項(xiàng)15-20中任一項(xiàng)的方法，其還包括用有效量的一種或多種選自下組的酶處理含纖維素材料:半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過(guò)氧化物酶或其混合物。[0077]22.項(xiàng)15的方法，其還包括補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的濃度以維持可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的有效濃度為優(yōu)選約0.0OlmM-約50mM、更優(yōu)選約0.0lmM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約10mM、進(jìn)一步更優(yōu)選約0.3mM-約5mM、最優(yōu)選約0.3mM-約2.5mM、進(jìn)一步最優(yōu)選約0.3mM-約ImM。[0078]23.項(xiàng)15-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物為醇、有機(jī)酸、酮、醛、氨基酸或氣體。[0079]24.包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的過(guò)程中以優(yōu)選約0.0OlmM-約50mM、更優(yōu)選約0.0lmM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約10mM、進(jìn)一步更優(yōu)選約0.3mM-約5mM、最優(yōu)選約0.3mM-約2.5mM、進(jìn)一步最優(yōu)選約0.3mM-約ImM的有效濃度存在,與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高。[0080]25.項(xiàng)24的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。[0081]26.包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的組合物，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的過(guò)程中以優(yōu)選約0.0OlmM-約50mM、更優(yōu)選約0.0ImM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約25mM、更優(yōu)選約0.1mM-約10mM、進(jìn)一步更優(yōu)選約0.3mM-約5mM、最優(yōu)選約0.3mM_約2.5mM、進(jìn)一步最優(yōu)選約0.3mM_約ImM的有效濃度存在，與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高。[0082]27.項(xiàng)26的組合物，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。[0083]附圖簡(jiǎn)述[0084]圖1顯示pMJ04的限制性酶切圖。[0085]圖2顯示pCaHj527的限制性酶切圖。[0086]圖3顯示pMT2188的限制性酶切圖。[0087]圖4顯示pCaHj568的限制性酶切圖。[0088]圖5顯示pMJ05的限制性酶切圖。[0089]圖6顯示pSMail30的限制性酶切圖。[0090]圖7顯示米曲霉β-葡糖苷酶天然信號(hào)序列的DNA序列和氨基酸序列(SEQIDNO:57和58)。[0091]圖8顯示特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)內(nèi)切葡聚糖酶V信號(hào)序列的DNA序列及氨基酸序列(SEQIDNO:61和62)。[0092]圖9顯示pSMail35的限制性酶切圖。[0093]圖10顯示pSMail40的限制性酶切圖。[0094]圖11顯示pSaMe-Fl的限制性酶切圖。[0095]圖12A、12B、12C和12D顯示米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:25和26)。[0096]圖13顯示pSaMe-FX的限制性酶切圖。[0097]圖14A、14B、14C和14D顯示米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白的DNA序列和推定的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:27和28)。[0098]圖15顯示pAlLo47的限制性酶切圖。[0099]圖16顯示向包括含有里氏木霉纖維素分解酶、米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙色嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)GH61A多肽的發(fā)酵液的混合物中加入不同的可溶性二價(jià)金屬陽(yáng)離子至終濃度為IOmM時(shí)，經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿中的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖和纖維二糖的情況。[0100]圖17顯示向包括含有里氏木霉纖維素分解酶和米曲霉葡糖苷酶(加入或不加入具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽)的發(fā)酵液的混合物中加入不同的二價(jià)金屬陽(yáng)離子至終濃度為ImM時(shí)，經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿中的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖和纖維二糖的情況。[0101]圖18顯示向包括含有里氏木霉纖維素分解酶、米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的橙色嗜熱子囊菌GH61A多肽的脫鹽或未脫鹽發(fā)酵液的混合物中加入MgCl2和MnSO4至終濃度為0.0OOl-1OmM時(shí)，經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿中的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖和纖維二糖的情況。[0102]定義[0103]纖維素分解增強(qiáng)活性(cellulolyticenhancingactivity):術(shù)語(yǔ)“纖維素分解增強(qiáng)活性”在此定義為增強(qiáng)具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)對(duì)含纖維素材料的水解的生物學(xué)活性。為本發(fā)明的目的，纖維素分解增強(qiáng)活性是通過(guò)測(cè)量纖維素分解性蛋白質(zhì)在下述條件下水解含纖維素材料所致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來(lái)加以確定的:l-50mg總蛋白，其包含80-99.5%w/w的纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素，及0.5-20%w/w的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的蛋白質(zhì)，50°C歷時(shí)1-7天，與用相等的無(wú)纖維素分解增強(qiáng)活性總蛋白加載量(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素)所進(jìn)行的對(duì)照水解反應(yīng)作比較。在一個(gè)優(yōu)選的方面，將存在占纖維素酶蛋白加載3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)WO02/095014在米曲霉中重組表達(dá)的)或3%的煙曲霉(Aspergillusfumigatus)β-葡糖苷酶(根據(jù)WO02/095014的實(shí)施例22在米曲霉中重組表達(dá)的)的CELLUCLAST?1.5L(NovozymesA/S,Bagsvserd,Denmark)混合物用作纖維素分解活性的標(biāo)準(zhǔn)。[0104]所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽具有SEQIDN0:2、4、6、8、10、12或14的成熟多肽的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，進(jìn)一步最優(yōu)選至少100%的纖維素分解增強(qiáng)活性。[0105]所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽以下述方式增強(qiáng)由具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)所催化的含纖維素材料的水解:將為達(dá)到同樣水解程度所需的纖維素分解酶的量減少優(yōu)選至少0.1倍，更優(yōu)選至少0.2倍、更優(yōu)選至少0.3倍、更優(yōu)選至少0.4倍、更優(yōu)選至少0.5倍、更優(yōu)選至少I倍、更優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少4倍、更優(yōu)選至少5倍、更優(yōu)選至少10倍、更優(yōu)選至少20倍、進(jìn)一步更優(yōu)選至少30倍、最優(yōu)選至少50倍、進(jìn)一步最優(yōu)選至少100倍。[0106]纖維素分解活性(cellulolyticactivity):術(shù)語(yǔ)“纖維素分解活性”在本文中定義為水解含纖維素材料的纖維素酶活性(如內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶或其組合)。纖維素分解蛋白可水解或水解羧甲基纖維素(CMC)，從而降低溫育混合物的粘度。由此造成的粘度下降可以用振動(dòng)粘度計(jì)(例如Sofraser,France產(chǎn)的MIVI3000)來(lái)測(cè)定。纖維素酶活性(以纖維素粘度單位(CellulaseViscosityUnit，CEVU)作為量度)測(cè)定是通過(guò)測(cè)量樣品降低羧甲基纖維素(CMC)溶液粘度的能力來(lái)確定樣品中催化活性的量。測(cè)定在適合纖維素分解蛋白和底物的溫度和PH進(jìn)行。[0107]為本發(fā)明的目的，纖維素分解活性是通過(guò)測(cè)量在下述條件下纖維素分解組合物對(duì)含纖維素材料的水解的增加來(lái)確定的:l_50mg纖維素分解蛋白質(zhì)/gPCS中的纖維素，歷時(shí)1-7天，50°C，與不加纖維素分解蛋白的對(duì)照水解相比較。[0108]內(nèi)切葡聚糖酶:術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切葡聚糖酶”在本文中定義為一種內(nèi)切-1，4-(1，3;1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.N0.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(諸如羧甲基纖維素和羥甲基纖維素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷聯(lián)結(jié)；混合型β_1，3葡聚糖如谷物(cereal)β-D-葡聚糖或木葡聚糖，和其他含纖維素性組分的植物材料中的β-1,4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。為本發(fā)明的目的，內(nèi)切葡聚糖酶活性是根據(jù)Ghose,1987，PureandAppl.Chem.59:257-268所述的程序利用竣甲基纖維素(CMC)水解來(lái)確定的。[0109]纖維二糖水解酶:術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶”在本文中定義為一種1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化水解纖維素、纖維寡糖、或任何含β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-葡糖苷聯(lián)結(jié)，從鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖。為本發(fā)明的目的，纖維二糖水解酶活性是依照Lever等，1972,Anal.Biochem.47:273-279和vanTilbeurgh等，1982,FEBSLettersl49:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters187:283-288中記載的程序加以測(cè)定的。在本發(fā)明中，Lever等人的方法被用來(lái)評(píng)估玉米秸桿中纖維素的水解，而vanTilbeurgh等人的方法被用于測(cè)定對(duì)一種熒光性二糖衍生物的纖維二糖水解酶活性。[0110]β-葡糖苷酶:術(shù)語(yǔ)“β-葡糖苷酶”在本文中定義為一種β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化水解末端非還原性β-D-葡萄糖殘基，釋放β-D-葡萄糖。為本發(fā)明的目的，β-葡糖苷酶活性是根據(jù)Venturi等，2002,J.BasicMicrobiol.42:55-66記載的基本程序來(lái)測(cè)定的，只是使用了如本文所述的不同條件。一個(gè)單位的葡糖苷酶活性定義為:在IOOmM檸檬酸鈉、0.01%TWEEN?20中，50°C、pH5條件下每分鐘從作為底物的4mM對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷產(chǎn)生1.0微摩爾對(duì)硝基苯酚。[0111]家族7、12、45或61葡糖苷水解酶:術(shù)語(yǔ)“家族7糖苷水解酶”或“家族GH7”、“家族12糖苷水解酶”或“家族GH12”、“家族45糖苷水解酶”或“家族GH45”，以及“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”在本文中定義為根據(jù)Henrissat,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316以及HenrissatB.,andBairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696分別落入糖苷水解酶家族7、家族12、家族45和家族61的多肽。目前，Henrissat將GH61家族歸于未分類之列，表明該家族所屬的多肽的機(jī)制、催化性親核體/堿、催化性質(zhì)子供體以及3D結(jié)構(gòu)等性質(zhì)均系未知。GH7、GH12或GH45蛋白分別又被稱為CEL7、CEL12或CEL45蛋白。[0112]含纖維素材料:生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁中主要的多糖是纖維素，豐度第二高的是半纖維素，第三是果膠。在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后產(chǎn)生的次生細(xì)胞璧也含有多糖，并且被與半纖維素共價(jià)交聯(lián)的多聚體木質(zhì)素所增強(qiáng)。纖維素是脫水纖維二糖的同聚物，因此是一種直鏈β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有復(fù)雜的分枝結(jié)構(gòu)和一系列取代基。雖然纖維素一般是無(wú)定形的，但植物組織中發(fā)現(xiàn)的纖維素主要呈現(xiàn)為由平行葡聚糖鏈構(gòu)成的不溶性晶體基質(zhì)。半纖維素通常通過(guò)氫鍵連接于纖維素以及其他半纖維素上，這有助于細(xì)胞壁基質(zhì)的穩(wěn)定化。[0113]含纖維素材料可以是任何含有纖維素的材料。纖維素通常存在于例如植株的莖、葉、果/種殼(hulls)、果/種皮(husks)和穗軸(cobs),或者樹的葉、枝、和木材等之中。含纖維素材料可以是，但不限于，草質(zhì)材料(herbaceousmaterial)、農(nóng)業(yè)殘余物(agriculturalresidues)、林業(yè)殘余物(forestryresidues)、城市固體廢物(municipalsolidwastes)、廢紙(wastepaper),以及紙衆(zhòng)和造紙廠殘余物(pulpandpapermillresidues)。含纖維素材料可以是任何類型的生物質(zhì),包括但不限于木材資源、城市固體廢物、廢紙、作物和作物殘余物(見例如Wiselogel等，1995，《HandbookonBioethanol〉〉(CharlesE.Wyman編)，第105-118頁(yè)，Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719；Mosier等，1999，RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,((AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology)),T.Scheper總編，第65卷,第23-40頁(yè)，Springer-Verlag,NewYork)。在本文中應(yīng)當(dāng)理解,含纖維素材料優(yōu)選地為木素纖維素的形式，例如在混合的基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料。[0114]在一個(gè)優(yōu)選的方面,含纖維素材料是玉米稻桿(cornstover)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，含纖維素材料是玉米纖維。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，含纖維素材料是玉米穗軸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，含纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，含纖維素材料是稻草(ricestraw)0在另一個(gè)優(yōu)選的方面，含纖維素材料是紙和紙漿加工廢物。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，含纖維素材料是木本或草本植物。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，含纖維素材料是甘蔗渣。[0115]含纖維素材料可以直接使用，或者可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。例如，物理預(yù)處理技術(shù)可包括各種類型的粉碎(milling)、福射(irradiation)、汽蒸/蒸汽爆破(steaming/steamexplosion)、和濕熱分解作用(hydrothermolysis)；化學(xué)預(yù)處理技術(shù)可包括稀酸、堿、有機(jī)溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳、和PH受控的濕熱分解作用；而生物預(yù)處理技術(shù)可涉及施加溶木質(zhì)素性微生物(參見，例如HsujT.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,《HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization》，Wyman，C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.，1994，Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,《EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction》，Himmel，M.E.，Baker，J.0.和Overend，R.P.編，ACSSymposiumSeries566，AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong，C.S.，CaojN.J.，DujJ.和Tsao，G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,((AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology))，ScheperjT.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；01sson,L.和Hahn-HagerdaljB.,1996，F(xiàn)ermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；以及VallanderjL.和Eriksson，Κ.-Ε.L，1990，Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。[0116]預(yù)處理玉米秸桿:術(shù)語(yǔ)“PCS”或“預(yù)處理的玉米秸桿”在本文中定義為通過(guò)熱和稀酸處理從玉米秸桿獲得的含纖維素材料。為本發(fā)明的目的，PCS是通過(guò)本文中說(shuō)明的方法制備的。為本發(fā)明的目的，PCS是由實(shí)施例20所述方法或改變其時(shí)間、溫度和酸量的變化形式來(lái)制備的。[0117]分離的多肽:本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”是指從一個(gè)來(lái)源分離的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定為至少1%純、優(yōu)選至少5%純、更優(yōu)選至少10%純、更優(yōu)選至少20%純、更優(yōu)選至少40%純、更優(yōu)選至少60%純、進(jìn)一步更優(yōu)選至少80%純、最優(yōu)選至少90%純的。[0118]基本上純的多肽:術(shù)語(yǔ)“基本上純的多肽”在本文是指這樣的多肽制備物，其含有以重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，進(jìn)一步更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，進(jìn)一步最優(yōu)選至多0.5%的與其天然地或重組地相伴隨的其他多肽物質(zhì)。因此，優(yōu)選的是，基本上純的多肽以制備物中存在的總多肽物質(zhì)的重量計(jì)是至少92%純、優(yōu)選至少94%純、更優(yōu)選至少95%純、更優(yōu)選至少96%純、更優(yōu)選至少96%純、更優(yōu)選至少97%純、更優(yōu)選至少98%純、進(jìn)一步更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選至少99.5%純、進(jìn)一步最優(yōu)選100%純的。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，多肽制備物實(shí)質(zhì)上不含與其天然地或重組地相伴隨的其他多肽物質(zhì)。這可以通過(guò)例如用公知的重組技術(shù)或通過(guò)經(jīng)典的純化方法制備所述多肽來(lái)實(shí)現(xiàn)。[0119]成熟多肽:術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”在本文中定義為經(jīng)過(guò)翻譯和任何翻譯后修飾(如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等)之后，處于其最終形式的具有生物學(xué)活性(例如酶活性)的多肽。[0120]成熟多肽編碼序列:術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼成熟的具有生物學(xué)活性的多肽的核苷酸序列。[0121]同一性:兩個(gè)氨基酸序列之間或者兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性用參數(shù)“同一性”來(lái)描述。[0122]為本發(fā)明的目的，兩個(gè)氨基酸序列之間同一性程度的確定使用如EMBOSS軟件包(EMB0SS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsinGenetics16:276-277),優(yōu)選3.0.0或更新的版本中的Needle程序所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)。所用的可選參數(shù)為缺口形成罰分(gapopenpenalty)10、缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5、和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。將Needle的標(biāo)記為“l(fā)ongestidentity”(“最長(zhǎng)同一'丨生”)(使用-nobrief(無(wú)簡(jiǎn)述)選項(xiàng)獲得)的輸出結(jié)果作為百分比同一性使用，它是這樣計(jì)算出來(lái)的:[0123](相同的殘基數(shù)XlOO)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口總數(shù))[0124]為本發(fā)明的目的，兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度的確定使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,同上),優(yōu)選3.0.0或更新的版本中的Needle程序所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)。所用的可選參數(shù)為缺口形成罰分10、缺口延伸罰分0.5、和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。將Needle的標(biāo)記為“l(fā)ongestidentity”(“最長(zhǎng)同一性”)(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)的輸出結(jié)果作為百分比同一性使用，它是這樣計(jì)算出來(lái)的:[0125](相同的脫氧核糖核苷酸數(shù)χ100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口總數(shù))[0126]同源序列:術(shù)語(yǔ)“同源序列”在本文中定義為:用blastp(對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)而言)或tblastn(對(duì)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)而言)算法得出的E值(或稱期望值)小于0.001的序列，該算法用BL0SUM62矩陣，字長(zhǎng)(wordsize)3、缺口出現(xiàn)罰分(gapexistencecost)ll、缺口延伸罰分(gapextensioncost)I,無(wú)低復(fù)雜度過(guò)濾,并用成熟蛋白序列查詢。參見Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.25:3389-3402。[0127]多肽片段:術(shù)語(yǔ)“多肽片段”在本文中定義為從成熟多肽的氨基端和/或羧基端缺失一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))氨基酸而得到的多肽；或其同源序列；其中所述片段具有其成熟多肽的活性。[0128]子序列:術(shù)語(yǔ)“子序列”在本文中定義為從成熟多肽編碼序列的5’端和/或3’端缺失了一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))核苷酸的核苷酸序列；或者其同源序列；其中所述子序列編碼具有其成熟多肽活性的多肽片段。[0129]等位變體(allelicvariant):術(shù)語(yǔ)“等位變體”是指基因的占據(jù)同一染色體座位的兩種或更多種可選形式中的任一種。等位變異在天然情況下通過(guò)突變產(chǎn)生，并可導(dǎo)致群體中的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?被編碼的多肽中沒(méi)有變化)，或者可以編碼氨基酸序列被改變的多肽。多肽的等位變體是基因的等位變體所編碼的多肽。[0130]分離的多核苷酸:本文中所用的術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”是指從一個(gè)來(lái)源分離而來(lái)的多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多核苷酸通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定為至少1%純、優(yōu)選至少5%純、更優(yōu)選至少10%純、更優(yōu)選至少20%純、更優(yōu)選至少40%純、更優(yōu)選至少60%純、進(jìn)一步更優(yōu)選至少80%純、最優(yōu)選至少90%純。[0131]基本上純的多核苷酸:本文中所用的術(shù)語(yǔ)“基本上純的多核苷酸”是指這樣的多核苷酸制備物，其不含有其他無(wú)關(guān)或不需要的核苷酸，并且處于適合在經(jīng)基因工程改造的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有以重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%,更優(yōu)選至多6%,更優(yōu)選至多5%,更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%,進(jìn)一步更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，進(jìn)一步最優(yōu)選至多0.5%的與其天然地或重組地相伴隨的其他多核苷酸物質(zhì)。但是，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選的是，基本上純的多核苷酸以重量計(jì)為至少90%純、優(yōu)選至少92%純、更優(yōu)選至少94%純、更優(yōu)選至少95%純、更優(yōu)選至少96%純、更優(yōu)選至少97%純、進(jìn)一步更優(yōu)選至少98%純、最優(yōu)選至少99%純、進(jìn)一步最優(yōu)選至少99.5%純。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選是處于基本上純的形式，即多核苷酸制備物基本上不含與其天然地或重組地相伴隨的其他多核苷酸物質(zhì)。多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來(lái)源的，或者上述來(lái)源的任意組合。[0132]cDNA:術(shù)語(yǔ)“cDNA”在本文中定義為這樣的DNA分子，它能夠從獲自真核細(xì)胞的成熟的、經(jīng)剪接的mRNA分子通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄制備得到。cDNA缺少在對(duì)應(yīng)的基因組DNA中通常存在的內(nèi)含子序列。最初的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，它經(jīng)歷一系列步驟被加工之后作為成熟的、經(jīng)剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過(guò)一個(gè)稱為剪接的過(guò)程去除內(nèi)含子序列。因此，從mRNA衍生而來(lái)的cDNA缺少任何內(nèi)含子序列。[0133]核酸構(gòu)建體:術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”在用于本文時(shí)是指這樣的單鏈或雙鏈核酸分子:其是從天然存在的基因分離的，或者經(jīng)過(guò)修飾而以原本不會(huì)存在于自然界中的方式包含核酸的片段，或者是合成的。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明的編碼序列的表達(dá)所需的控制序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”與術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”是同義的。[0134]控制序列:術(shù)語(yǔ)“控制序列”在本文中定義為包括編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的表達(dá)所必需的所有組件。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼多肽的核苷酸序列而言，或者對(duì)于其它控制序列而言，可以是天然的或者外來(lái)的。這樣的控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽(prop印tide)序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。在最低程度上，控制序列包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。控制序列可以具有接頭，用來(lái)引入特異性限制性位點(diǎn)以幫助將控制序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區(qū)連接。[0135]可操作地連接:術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”在本文中是指這樣一種構(gòu)型，其中控制序列相對(duì)于多核苷酸序列的編碼序列被置于合適的位置上，使得該控制序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。[0136]編碼序列:當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“編碼序列”是指這樣的核苷酸序列，它直接規(guī)定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般是由可讀框決定的，后者通常以ATG起始密碼子或其他可選的起始密碼子如GTG及TTG開始，而以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的、或重組的核苷酸序列。[0137]表達(dá):術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包含多肽產(chǎn)生過(guò)程中涉及的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。[0138]表達(dá)載體:術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”在本文中定義為一種線性或環(huán)狀DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，且可操作地連接于為其表達(dá)提供條件的其他核苷酸。[0139]宿主細(xì)胞:術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”在用于本文時(shí)包括任何易于被包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞類型。`[0140]修飾:術(shù)語(yǔ)“修飾”在本文中意指對(duì)成熟多肽或其同源序列進(jìn)行的任何化學(xué)修飾；以及對(duì)編碼此類多肽的DNA進(jìn)行的遺傳操作。修飾可以是一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))氨基酸側(cè)鏈的替換。[0141]人工變體:當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“人工變體”是指由這樣的生物體所產(chǎn)生的多肽:所述生物體表達(dá)成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾型核苷酸序列。所述修飾型多核苷酸序列是對(duì)所述多核苷酸序列或其同源序列通過(guò)修飾加以人工干預(yù)而獲得的。[0142]發(fā)明詳述[0143]本發(fā)明涉及提高具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的活性的方法，其包括:向含有具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的組合物加入可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的過(guò)程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在，且與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高。[0144]本發(fā)明還涉及降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的方法，其包括:用有效量的含有有效量的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的纖維素分解酶組合物處理含纖維素材料，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在。[0145]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:(a)將含纖維素材料用有效量的含有有效量具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的纖維素分解酶組合物糖化，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物將步驟(a)中經(jīng)糖化的含纖維素材料發(fā)酵；和(c)從發(fā)酵中回收發(fā)酵產(chǎn)物。[0146]本發(fā)明還涉及含有具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的組合物，其中所述可溶性活化性二價(jià)陽(yáng)離子在含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化過(guò)程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存，且與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高。[0147]本發(fā)明還涉及包含有效量的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的過(guò)程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度存在，且與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提聞。[0148]二價(jià)金屬陽(yáng)離子[0149]本發(fā)明可以使用任何可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自由Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合組成的組。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子是Mn++。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子是Co++。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子是Mg++。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子是Ca++。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子是兩種或更多種(數(shù)種)選自由Mn++、Co++、Mg++和Ca++組成的組中的陽(yáng)離子。在最優(yōu)選的方面，所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子是Mn++。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子是Mg++。[0150]可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中以優(yōu)選約0.0OlmM-約50mM，更優(yōu)選約0.0lmM-約25mM，更優(yōu)選約0.1mM-約25mM，更優(yōu)選約0.1mM-約IOmM,進(jìn)一步更優(yōu)選約0.3mM-約5mM，最優(yōu)選約0.3mM-約2.5mM,進(jìn)一步最優(yōu)選約0.3mM-約ImM的有效濃度加入。[0151]在一個(gè)優(yōu)選的方面，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中以約0.0OlmM-約50mM的有效濃度加入。在一個(gè)更優(yōu)選的方面,可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中以約0.0lmM-約25mM的有效濃度加入。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中以約0.1mM-約25mM的有效濃度加入。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中以約0.1mM-約IOmM的有效濃度加入。在一個(gè)進(jìn)一步更優(yōu)選的方面，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中以約0.3mM-約5mM的有效濃度加入。在一個(gè)最優(yōu)選的方面,可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中以約0.3mM-約2.5mM的有效濃度加入。在一個(gè)進(jìn)一步最優(yōu)選的方面，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中以約0.3mM-約ImM的有效濃度加入。[0152]可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子優(yōu)選作為可溶性鹽加入，諸如，例如硫酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氟化物或碘化物。不過(guò)，本領(lǐng)域公知纖維素類生物質(zhì)(cellulosicbiomass)可以含有多種二價(jià)金屬陽(yáng)離子。參見,例如F.B.Salisbury和C.ff.Ross:PlantPhysiology,WadsworthsPublishingCompany,Belmont,California(1992)。因此纖維素類生物質(zhì)可以部分地或全部地作為金屬陽(yáng)離子的來(lái)源使用?；罨远r(jià)金屬陽(yáng)離子可以是可溶的或不溶的。術(shù)語(yǔ)“可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子”在本文定義為在溶液中可得的提高具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的活性的二價(jià)金屬陽(yáng)離子。術(shù)語(yǔ)“不溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子”在本文定義為在溶液中不可獲得的提高具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的活性的二價(jià)金屬陽(yáng)離子。二價(jià)金屬陽(yáng)離子不可獲得可以是由于，例如其被螯合(例如被EDTA或EGTA螯合)，或其與纖維素類生物質(zhì)的組分(例如焦磷酸鹽)絡(luò)合。[0153]纖維素類生物質(zhì)也可提供抑制纖維素分解的可溶性二價(jià)金屬陽(yáng)離子(下稱“可溶性抑制性二價(jià)金屬陽(yáng)離子”)。例如，抑制性二價(jià)金屬陽(yáng)離子是Zn++或Fe++。因此，在存在可溶性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的混合物的條件下，一些活化而另一些抑制纖維素分解，加入過(guò)量的可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以勝過(guò)抑制性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的抑制性效果。在這種情況下，為了防止抑制性二價(jià)金屬陽(yáng)離子反向地影響具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，本發(fā)明的方法還包括補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的濃度以將可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的有效濃度在優(yōu)選約0.0OlmM-約50mM，更優(yōu)選約0.0lmM-約25mM，更優(yōu)選約0.1mM-約25mM,更優(yōu)選約0.1mM-約10mM，進(jìn)一步更優(yōu)選約0.3mM-約5mM，最優(yōu)選約0.3mM-約2.5mM,而進(jìn)一步最優(yōu)選約0.3mM-約ImM的范圍保持一段足以降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的時(shí)間。[0154]在一個(gè)優(yōu)選的方面，在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以維持其有效濃度為約0.0OlmM-約50mM。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以維持其有效濃度為約0.0lmM-約25mM。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以維持其有效濃度為約0.1mM-約25mM。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以維持其有效濃度為約0.1mM-約10mM。在一個(gè)進(jìn)一`步更優(yōu)選的方面，在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以維持其有效濃度為約0.3mM-約5mM。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以維持其有效濃度為約0.3mM-約2.5mM。在一個(gè)進(jìn)一步最優(yōu)選的方面，在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素底物的過(guò)程中補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以維持其有效濃度為約0.3mM-約ImM。[0155]纖維素類生物質(zhì)中二價(jià)金屬陽(yáng)離子的濃度可使用本領(lǐng)域公知的任何方法測(cè)定，例如原子吸收、電化學(xué)電極、金屬離子生物傳感器或光傳感器，或螯合滴定(參見，例如MethodsinEnzymology,v.158(!?),Haugland,R.P.HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals,6thed.;MolecularProbes,Inc.:Eugene,OR,1996.，Thompson等Anal.Chem.，70(22)，4717-4723，1998，InductivelyCoupledPlasmaMassSpectrometry,AkbarMontaser(Editor)May1998)。[0156]在本發(fā)明的方法中，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子提高具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的活性優(yōu)選至少0.1倍，更優(yōu)選至少0.2倍，更優(yōu)選至少0.3倍，更優(yōu)選至少0.4倍，更優(yōu)選至少0.5倍，更優(yōu)選至少I倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，更優(yōu)選至少10倍，更優(yōu)選至少20倍，進(jìn)一步更優(yōu)選至少30倍，最優(yōu)選至少50倍，進(jìn)一步最優(yōu)選至少100倍。[0157]纖維素分解酶組合物[0158]本發(fā)明還涉及包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的組合物，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料過(guò)程中以優(yōu)選約0.0OlmM-約50mM，更優(yōu)選約0.0lmM-約25mM，更優(yōu)選約0.1mM-約25mM，更優(yōu)選約0.1mM-約10mM，進(jìn)一步更優(yōu)選約0.3mM-約5mM，最優(yōu)選約0.3mM-約2.5mM,而進(jìn)一步最優(yōu)選約0.3mM-約ImM的有效濃度存在，且與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高。[0159]本發(fā)明還涉及包含有效量的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料過(guò)程中以優(yōu)選約0.0OlmM-約50mM，更優(yōu)選約0.0lmM-約25mM，更優(yōu)選約0.1mM-約25mM,更優(yōu)選約0.1mM-約IOmM,進(jìn)一步更優(yōu)選約0.3mM-約5mM,最優(yōu)選約0.3mM-約2.5mM,而進(jìn)一步最優(yōu)選約0.3mM-約ImM的有效濃度存在，且與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高。[0160]在本發(fā)明的方法中，纖維素分解酶組合物可以包含在將含纖維素材料加工成葡萄糖，或?qū)肜w維素加工成木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖、它們的聚合物，或如下所述的它們的衍生產(chǎn)物的加工中涉及的任何蛋白質(zhì)。在一個(gè)方面，所述纖維素分解酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β_葡糖苷酶，或它們的組合。在另一個(gè)方面，所述纖維素分解酶組合物還包含一種或多種附加的用于改善含纖維素材料降解的酶活性。優(yōu)選的附加酶有半纖維素酶、酯酶(例如脂肪酶、磷脂酶、和/或角質(zhì)酶)、蛋白酶、漆酶、過(guò)氧化物酶、或它們的混合物。[0161]纖維素分解酶組合物可以是單組分制備物，例如一種內(nèi)切葡聚糖酶，多組分制備物，例如一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶，一種或多種纖維二糖水解酶；和一種或多種葡糖苷酶，或者多組分蛋白制備物與單組分蛋白制備物的組合。纖維素分解蛋白可在酸性、中性或堿性PH范圍內(nèi)具有活性，即，水解含纖維素材料。[0162]如上文所述，本發(fā)明中使用的纖維素分解蛋白可以是單組分制備物，即基本上不含其它纖維素分解性組分的組分。單個(gè)組分可以是重組組分，即通過(guò)克隆編碼該單個(gè)組分的DNA序列，然后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并在宿主中表達(dá)而產(chǎn)生的(參見例如WO91/17243和WO91/17244)。宿主細(xì)胞可以是異源宿主(酶對(duì)宿主而言是外來(lái)的)或者宿主也可以是野生型宿主(酶對(duì)宿主而言是天然的)。單組分纖維素分解蛋白還可以通過(guò)從發(fā)酵液中純化此類蛋白來(lái)加以制備。[0163]本發(fā)明使用的酶可以是任何適合在本文所述的方法中使用的形式，例如含或不含細(xì)胞的粗發(fā)酵液、干粉或顆粒劑、非粉化性顆粒劑(non-dustinggranulate)、液體、穩(wěn)定化液體、或經(jīng)保護(hù)的酶。顆粒劑例如可如在美國(guó)專利4，106，991和4，661，452中所公開的方法制備，并可任選使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包衣。例如，液體酶制備物可根據(jù)既定的方法通過(guò)加入穩(wěn)定劑諸如糖、糖醇或其它多元醇、和/或乳酸或其它有機(jī)酸來(lái)穩(wěn)定化。經(jīng)保護(hù)的酶可根據(jù)EP238，216中所公開的方法制備。[0164]具有纖維素分解酶活性的多肽可以從任何屬的微生物獲得。術(shù)語(yǔ)“從...獲得”(或“獲自...在此處意思是指所述酶可以是從天然產(chǎn)生所述酶作為天然酶的生物體分離而來(lái)的?！皬?..獲得”(或“獲自...在此處還意指所述酶可以是在宿主生物體中重組產(chǎn)生的，其中重組產(chǎn)生的酶對(duì)于宿主生物體而言為天然的或外來(lái)的，或者具有經(jīng)修飾的氨基酸序列，例如缺失、插入和/或取代了一個(gè)或多個(gè)氨基酸，即作為天然氨基酸序列的突變體和/或片段的重組產(chǎn)生的酶或通過(guò)本領(lǐng)域已知的核酸改組方法產(chǎn)生的酶。天然酶的意義中涵蓋天然變體，外來(lái)酶的意義中涵蓋通過(guò)化學(xué)或重組誘變，如通過(guò)定點(diǎn)誘變或改組獲得的變體。因此，纖維素分解性蛋白的經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體也可以用于本發(fā)明。在一個(gè)優(yōu)選的方面，獲自給定來(lái)源的多肽是胞外分泌的。[0165]具有纖維素分解酶活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，該多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽，諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)的具有纖維素分解酶活性的多肽，或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)或尿枝原體屬(Ureaplasma)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0166]在一個(gè)優(yōu)選的方面,所述多肽是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacilluslautus)、緩慢芽抱桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0167]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀胺鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0168]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)、或淺青紫鏈霉菌(StreptomycesIividans)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0169]具有纖維素分解酶活性的多肽還可以是真菌多肽，更優(yōu)選酵母多肽，如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉屬(Yarrowia)的具有纖維素分解酶活性的多肽；或者更優(yōu)選絲狀真菌多肽，如枝頂孢霉屬(Acremonium)、蘑菇屬(Agaricus)、鏈格抱屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、葡萄座腔菌屬(Botryospaeria)、擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)、毛殼菌屬(Chaetomidium)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、麥角屬(Claviceps)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、Coprinopsis、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、栗疫病菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二抱屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、網(wǎng)抱菌屬(Filibasidium)、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、把菌屬(Irpex)、香燕屬(Lentinula)、小球腔菌屬(Leptospaeria)、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、Trichophaea、輪枝抱屬(Verticillium)、小包腳菇屬(Volvariella)、或炭角菌屬(Xylaria)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0170]在一個(gè)優(yōu)選的方面所述多肽是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0171]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫(kù)威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(Fusariumreticulatum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰色腐質(zhì)酶(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、乳白奉巴菌(IrpexIacteus)、米赫毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無(wú)色梭抱殼(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimet1、小抱子梭抱殼(Thielaviamicrospora)、Thielaviaovispora、Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱殼、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉、綠色木霉(Trichodermaviride)或Trichophaeasaccata的具有纖維素分解酶活性的多肽。[0172]在本發(fā)明的方法中，任何內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和/或β_葡糖苷酶，以及任何其它纖維素分解酶都可以使用。[0173]可以用于本發(fā)明的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的例子包括但不限于解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(WO91/05039；W093/15186;美國(guó)專利5，275，944；W096/02551;美國(guó)專利5，536，655，WO00/70031,WO05/093050);褐色喜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)內(nèi)切葡聚糖酶III(W005/093050);和褐色喜熱裂孢菌內(nèi)切葡聚糖酶V(W005/093050)。[0174]可以用于本發(fā)明的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的例子包括但不限于里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253-263;GenBank?登錄號(hào)M15665);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene63:11-22;GenBank?登錄號(hào)M19373);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GenBank?登錄號(hào)AB003694);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249:584-591；GenBank?登錄號(hào)Yllll3);和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiology13:219-228;GenBank?登錄號(hào)Z33381);棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearch18:5884)；川地曲霉(Aspergilliskawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435-439);金抱子菌屬菌種(Chrysosporiumsp.)C1(美國(guó)專利6，573，086；GenPept登錄號(hào)AAQ38150)；Corynascusheterothallicus(美國(guó)專利6，855，531;GenPept登錄號(hào)AAY00844)；Erwiniacarotovara內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9-14);尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(GenBank?登錄號(hào)L29381);灰腐質(zhì)霉thermoidea變體菌株內(nèi)切葡聚糖酶(GenBank?登錄號(hào)AB003107)；Melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(GenBank?登錄號(hào)MAL515703);粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GenBank?登錄號(hào)XM—324477);馬瘤胃弧菌(Piromycesequi)(Eberhardt等，2000，Microbiology146:1999-2008；GenPept登錄號(hào)CAB92325);米根霉(Rhizopusoryzae)(Moriya等，2003，J.Bacteriology185:1749-1756；GenBank?登錄號(hào)AB047927，AB056667、AB056668);和土生梭孢殼(W02004/053039;EMBL登錄號(hào)CQ827970)。[0175]公開了使用依照HenrissatB.，1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities，Biochem.J.280:309-316;以及HenrissatB.和BairochA.，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolasess，Biochem.J.316:695-696的分類法分類的超過(guò)13個(gè)糖基水解酶家族中的其它內(nèi)切葡聚糖酶。[0176]在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述內(nèi)切葡聚糖酶是里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述內(nèi)切葡聚糖酶是里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述內(nèi)切葡聚糖酶是里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述內(nèi)切葡聚糖酶是里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述內(nèi)切葡聚糖酶是嗜熱毀絲霉CEL7內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述內(nèi)切葡聚糖酶是ChrysosporiumlucknowenseCEL12內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面,所述內(nèi)切葡聚糖酶是ChrysosporiumlucknowenseCEL45內(nèi)切葡聚糖酶。[0177]在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)是SEQIDNO:74的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IKCEL5A)是SEQIDNO:76的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)是SEQIDNO:78的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)是SEQIDNO:80的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述嗜熱毀絲霉CEL7內(nèi)切葡聚糖酶是SEQIDN0:82的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述MyceliophthorathermophilaCEL12內(nèi)切葡聚糖酶是SEQIDN0:84的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述MyceliophthorathermophilaCEL45內(nèi)切葡聚糖酶是SEQIDN0:86的成熟多肽或其直向同源物或變體。[0178]在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)由SEQIDNO:73的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)由SEQIDNO:75的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)由SEQIDNO:77的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)由SEQIDNO:79的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述嗜熱毀絲霉CEL7內(nèi)切葡聚糖酶由SEQIDN0:81的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述金孢子菌CEL12內(nèi)切葡聚糖酶由SEQIDNO:83的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述金孢子菌CEL45內(nèi)切葡聚糖酶由SEQIDN0:85的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。[0179]所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)可根據(jù)Penttila等，1986，Gene45:253-263獲得。所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)可根據(jù)Saloheimo等，1988，Gene63:11-22獲得。所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)可根據(jù)Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563獲得。所述里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)可根據(jù)Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiologyl3:219-228獲得。所述嗜熱毀絲霉CEL7內(nèi)切葡聚糖酶可根據(jù)WO95/024471獲得。所述ChrysosporiumlucknowenseCEL12內(nèi)切葡聚糖酶可根據(jù)WO2001/25468獲得。所述ChrysosporiumlucknowenseCEL45內(nèi)切葡聚糖酶可根據(jù)WO2000/20555獲得。[0180]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述纖維二糖水解酶是里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述纖維二糖水解酶是里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述纖維二糖水解酶是具有纖維素結(jié)合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述纖維二糖水解酶是不具有纖維素結(jié)合域的嗜熱毀絲霉CEL7纖維二糖水解酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述纖維二糖水解酶是土生梭孢殼纖維二糖水解酶。[0181]在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)是SEQIDNO:88的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)是SEQIDNO:90的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述具有纖維素結(jié)合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶是SEQIDNO:92的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述不具有纖維素結(jié)合域的嗜熱毀絲霉CEL7纖維二糖水解酶是SEQIDNO:94的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述土生梭孢殼纖維二糖水解酶是SEQIDN0:96的成熟多肽或其直向同源物或變體。[0182]在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)纖維二糖水解酶由SEQIDNO:87的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)纖維二糖水解酶由SEQIDN0:89的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述具有纖維素結(jié)合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶由SEQIDN0:91的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述不具有纖維素結(jié)合域的嗜熱毀絲霉CEL7纖維二糖水解酶由SEQIDNO:93的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述土生梭孢殼纖維二糖水解酶由SEQIDNO:95的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。[0183]所述里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)可以依照Shoemaker等，1983，Biotechnology(N.Y.)1:691-696獲得。所`述里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)可以依照Terri等，1987，Gene51:43-52獲得。所述具有纖維素結(jié)合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7纖維二糖水解酶可以依照WO2001/79507獲得。所述不具有纖維素結(jié)合域的嗜熱毀絲霉CEL7纖維二糖水解酶可以依照WO2003/000941獲得。所述土生梭孢殼纖維二糖水解酶可以依照WO2006/074435獲得。[0184]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述葡糖苷酶獲自米曲霉。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述葡糖苷酶獲自煙曲霉。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述葡糖苷酶獲自巴西青霉(Penicilliumbrasilianum),例如巴西青霉IBT20888株。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述β_葡糖苷酶獲自黑曲霉。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述β_葡糖苷酶獲自棘孢曲霉。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述米曲霉β-葡糖苷酶是SEQIDNO:16的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述煙曲霉葡糖苷酶是SEQIDΝ0:18的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述巴西青霉葡糖苷酶是SEQIDNO:20的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述黑曲霉β_葡糖苷酶是SEQIDNO:22的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述棘孢曲霉β-葡糖苷酶是SEQIDNO:24的成熟多肽或其直向同源物或變體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述米曲霉β-葡糖苷酶由SEQIDNO:15的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述煙曲霉葡糖苷酶由SEQIDΝ0:17的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述巴西青霉葡糖苷酶由SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述黑曲霉β-葡糖苷酶由SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述棘孢曲霉葡糖苷酶由SEQIDΝ0:23的成熟多肽編碼序列或其直向同源物或變體所編碼。[0185]所述具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可以根據(jù)WO2002/095014獲得。所述具有β-葡糖苷酶活性的煙曲霉多肽可以根據(jù)WO2005/047499獲得。所述具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可以根據(jù)WO2007/019442獲得。所述具有β_葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可以根據(jù)Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980獲得。所述具有β_葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可以根據(jù)Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288獲得。[0186]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，SEQIDNO:16的成熟多肽是由大腸桿菌DSM14240中所含質(zhì)粒中含有的多核苷酸編碼的。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，SEQIDNO:18的成熟多肽是由大腸桿菌NRRLB-30695中所含質(zhì)粒pEJG113中含有的多核苷酸編碼的。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，SEQIDNO:20的成熟多肽是由大腸桿菌NRRLB-30860中所含質(zhì)粒pKKAB中含有的多核苷酸編碼的。[0187]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述葡糖苷酶是SEQIDNO:26的米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述米曲霉葡糖苷酶變體BG融合蛋白由SEQIDNO:25的多核苷酸編碼。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述β-葡糖苷酶是SEQIDΝ0:28的米曲霉β_葡糖苷酶融合蛋白。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述米曲霉β_葡糖苷酶融合蛋白由SEQIDNO:27的多核苷酸編碼。[0188]本發(fā)明可用的其它β_葡糖苷酶實(shí)例包括但不限于米曲霉β_葡糖苷酶(W002/095014;WO04/099228);棘孢曲霉β-葡糖苷酶(Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288)；Aspergillusavenaceusβ-葡糖苷酶(GenBank?登錄號(hào)ΑΥ943971);煙曲霉葡糖苷酶(GenBank?登錄號(hào)ΧΜ745234);川地曲霉β-葡糖苷酶(GenBank?登錄號(hào)AB003470);黑曲霉β-葡糖苷酶(GenBank?AJl32386);灰色梨抱菌(Magnaporthegrisea)β-葡糖苷酶(GenBank?登錄號(hào)ΑΥ849670);黃孢平革菌β-葡糖苷酶(GenBank?登錄號(hào)AB253327)；Talaromycesemersoniiβ-葡糖苷酶(GenBank?登錄號(hào)ΑΥ072918)和里氏木霉β-葡糖苷酶(GenBank?登錄號(hào)U09580,AB003110,AY281374,AY281375,AY281377,AY281378和AY281379)。β-葡糖苷酶的變體也可使用，如WO04/099228中記載的那些。[0189]其它葡糖苷酶在根據(jù)以下文獻(xiàn)分類得到的13個(gè)以上的糖基水解酶家族中公開:HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316和HenrissatB.,andBairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696。[0190]應(yīng)當(dāng)理解的是，就前文所述的物種而言，本發(fā)明涵蓋了它們的完全和不完全狀態(tài)，以及其它分類學(xué)上的等同物，例如無(wú)性型，不管它們已知的種名是什么。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地識(shí)別出合適的等同物的身份。[0191]公眾可以在若干保藏機(jī)構(gòu)容易地獲取這些物種的菌株，這樣的機(jī)構(gòu)諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)和北方區(qū)域研究中心農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)。[0192]此外，還可以使用上文所述的探針，從包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等等)分離的微生物在內(nèi)的來(lái)源鑒定和獲取這樣的多肽。用于從天然生境分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的。然后可以通過(guò)類似地篩選此類微生物的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)來(lái)獲得所述多核苷酸。一旦用探針檢測(cè)到了編碼多肽的多核苷酸序列，就可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)(參見例如Sambrook等，1989同上)分離或者克隆該多核苷酸。[0193]具有纖維素分解酶活性的多肽還包括融合的多肽或者可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在所述多肽或其具有纖維素分解酶活性的片段的N-末端或C-末端。融合的多肽是通過(guò)將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到編碼具有纖維素分解酶活性的多肽的核苷酸序列(或其部分)而產(chǎn)生的。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括將編碼各多肽的編碼序列連接起來(lái)使它們符合閱讀框，并使得被融合的多肽的表達(dá)處于相同的啟動(dòng)子和終止子的控制之下。[0194]融合多肽還可以包含切割位點(diǎn)。融合蛋白一旦被分泌，該位點(diǎn)就被切割，從融合蛋白中釋放出具有纖維素分解酶活性的多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于:Kex2位點(diǎn)，其編碼二肽Lys-Arg(Martin等,2003,J.1nd.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-ffiIson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；ffard等，1995，Biotechnology13:498-503；和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位點(diǎn)，其被因子Xa蛋白酶在精氛酸殘基之后切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點(diǎn)，其被腸激酶在賴氨酸之后切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點(diǎn)或His-Tyr-Asp位點(diǎn)，其被GenenaseI切割(Carter等，1989，Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點(diǎn)，其被凝血酶在Arg之后切割(Stevens,2003,DrugDiscoveryWorld4:35-48);Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點(diǎn)，其被TEV蛋白酶在Gln之后切割(Stevens,2003,同上)；以及Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點(diǎn)，其被一種基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶在Gln之后切割(Stevens，2003，同上)。[0195]在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素分解酶組合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。[0196]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素分解酶組合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，其還包含一種或多種選自下組的酶:里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶11(CEL5A)、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)。[0197]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素分解酶組合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，其還包含土生梭孢殼纖維二糖水解酶。[0198]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素分解酶組合物包含葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)、里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)，其還包含(I)一種或多種選自下組的酶:里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)，和/或還包含(2)土生梭孢殼纖維二糖水解酶。[0199]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含選自下組的一種或多種(數(shù)種)組分:有內(nèi)切葡聚糖酶活性的嗜熱毀絲霉CEL7多肽，有內(nèi)切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL12多妝，有內(nèi)切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL45多肽,有纖維二糖水解酶活性并具有纖維素結(jié)合域的ChrysosporiumlucknowenseCEL7多肽，和有纖維二糖水解酶活性而沒(méi)有纖維素結(jié)合域的嗜熱毀絲霉CEL7多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述纖維素分解酶組合物包含有內(nèi)切葡聚糖酶活性的嗜熱毀絲霉CEL7多肽,有內(nèi)切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL12多肽,有內(nèi)切葡聚糖酶活性的ChrysosporiumlucknowenseCEL45多肽，有纖維二糖水解酶活性并具有纖維素結(jié)合域的CEL7多肽，和有纖維二糖水解酶活性而沒(méi)有纖維素結(jié)合域的嗜熱毀絲霉CEL7多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，上述組合物還包含一種或多種(數(shù)種)具有β_葡糖苷酶的多肽。[0200]所述纖維素分解酶組合物還可以是商業(yè)制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)纖維素分解酶制備物的實(shí)例包括，例如，CELLUCLAST?(可獲自NovozymesA/S)和N0V0ZYM?188(可獲自NovozymesA/S)。其它可用的商品化制備物包括CELLUZYME?、CEREFL0?和ULTRAFL0?(NovozymesA/S)，LAMINEX?和SPEZYME?CP(GenencorInt.),R0HAMENT?7069ff(RohmGmbH)，和FIBREZYME?LDI，F(xiàn)IBREZYME?LBR,或VISCOSTAR?150L(DyadicInternational,Inc.,Jupiter,FL,USA)。[0201]可用于本發(fā)明的其它纖維素分解蛋白在下列文獻(xiàn)中有記載:EP495，257、EP531，315、EP531，372、WO89/09259、WO94/07998、WO95/24471、WO96/11262、WO96/29397、WO96/034108、WO97/14804、WO98/08940、WO98/012307、WO98/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO98/028411、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025846、WO99/025847、WO99/031255、WO2000/009707,WO2002/050245、WO2002/0076792、WO2002/101078、WO2003/027306,WO2003/052054,WO2003/052055,WO2003/052056,WO2003/052057、WO2003/052118,WO2004/016760,WO2004/043980,WO2004/048592,WO2005/001065、WO2005/028636、WO2005/093050,WO2005/093073,WO2006/074005,WO2006/117432、WO2007/071818、W`O2007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美國(guó)專利4，435，307、美國(guó)專利5，457，046、美國(guó)專利5，648，263、美國(guó)專利5，686，593、美國(guó)專利5，691，178、美國(guó)專利5，763，254、和美國(guó)專利5，776，757。[0202]本發(fā)明的方法中使用的纖維素分解蛋白可以通過(guò)利用本領(lǐng)域已知的程序，用含有合適的碳源及氮源和無(wú)機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵上文提到的微生物菌株來(lái)加以生產(chǎn)(參見例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(編輯)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress，CA，1991)。合適的培養(yǎng)基可以從供應(yīng)商獲得，或者可以依照公開的組成(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)來(lái)制備。適于生長(zhǎng)和纖維素分解蛋白產(chǎn)生的溫度范圍及其它條件是本領(lǐng)域已知的(參見例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。[0203]發(fā)酵可以是任何培養(yǎng)細(xì)胞而導(dǎo)致纖維素分解蛋白的表達(dá)或分離的方法。因此，發(fā)酵可以理解為包括在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中實(shí)施的搖瓶培養(yǎng)、或小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)，其在合適的培養(yǎng)基中，在容許纖維素分解蛋白表達(dá)或分離的條件下進(jìn)行。依照上述方法所得的纖維素分解蛋白可以從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并通過(guò)如本文描述的常規(guī)程序加以純化。[0204]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽[0205]在第一方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽包含以下基序:[0206][ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV],[0207]其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸并且X(4)是在4個(gè)連鄰接位置上的任何氨基酸。[0208]包含上述基序的分離的多肽可進(jìn)一步包含:[0209]H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]，[0210][EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或[0211]H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[0212][EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，[0213]其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在I個(gè)位置或2個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸，X(3)是在3個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸并且X(2)是在2個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸。在以上基序中，采用公認(rèn)的IUPAC單字母氨基酸縮寫。[0214]在優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽進(jìn)一步包含H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]0在另一優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽還包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽還包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]_X_Y_X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。[0215]在第二方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽包含以下基序:[0216][ILMV]-P-X(4，5)—G—x—Y—[ILMV]—x—R—x—[EQ]-χ(3)-Α-[HNQ]，[0217]其中χ是任何氨基酸，χ(4，5)是在4或5個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸以及χ(3)是在3個(gè)鄰接位置上的任何氨基酸。在以上基序中，采用公認(rèn)的IUPAC單字母氨基酸縮寫。[0218]在第三個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，所述多肽具有纖維素分解增強(qiáng)活性(下文中的“同源多肽”)。在優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽有十個(gè)氨基酸，優(yōu)選五個(gè)氨基酸，更優(yōu)選四個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選三個(gè)氨基酸，最優(yōu)選兩個(gè)氨基酸以及甚至最優(yōu)選一個(gè)氨基酸的不同。[0219]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:2的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸20至326，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸20至326。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位變體組成；或者由它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:2的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:2的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸20至326或其等位變體組成；或者由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸20至326組成。[0220]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDN0:4的氨基酸序列或其等位變體；或者它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:4的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDN0:4的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸18至240，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:4的氨基酸18至240。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:4的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:4的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:4的氨基酸18至240或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:4的氨基酸18至240組成。[0221]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:6的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:6的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸20至258，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸20至258。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:6的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:6的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:6的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:6的氨基酸20至258或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:6的氨基酸20至258組成。`[0222]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:8的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:8的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:8的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:8的氨基酸19至226，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDN0:8的氨基酸19至226。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:8的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:8的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:8的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:8的氨基酸19至226或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDN0:8的氨基酸19至226組成。[0223]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:10的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸20至304，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:10的氨基酸20至304。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸20至304或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:10的氨基酸20至304組成。[0224]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:12的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸23至250，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:12的氨基酸23至250。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸23至250或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:12的氨基酸23至250組成。[0225]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:14的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的氨基酸20至249，或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽包含SEQIDNO:14的氨基酸20至249。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸序列或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸20至249或其等位變體組成；或由它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽由SEQIDNO:14的氨基酸20至249組成。[0226]SEQIDNO:2的成熟多肽的片段優(yōu)選包含至少277個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選至少287個(gè)氨基酸殘基、最優(yōu)選至少297個(gè)氨基酸殘基。SEQIDNO:4的成熟多肽的片段優(yōu)選包含至少185個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選至少195個(gè)氨基酸殘基、最優(yōu)選至少205個(gè)氨基酸殘基。SEQIDN0:6的成熟多肽的片段優(yōu)選包含至少200個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選至少212個(gè)氨基酸殘基、最優(yōu)選至少224個(gè)氨基酸殘基。SEQIDNO:8的成熟多肽的片段優(yōu)選包含至少175個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選至少185個(gè)氨基酸殘基、最優(yōu)選至少195個(gè)氨基酸殘基。SEQIDNO:10的成熟多肽的片段優(yōu)選包含至少240個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選至少255個(gè)氨基酸殘基、最優(yōu)選至少270個(gè)氨基酸殘基。SEQIDNO:12的成熟多肽的片段優(yōu)選包含至少175個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選至少190個(gè)氨基酸殘基、最優(yōu)選至少205個(gè)氨基酸殘基。SEQIDNO:14的成熟多肽的片段優(yōu)選包含至少200個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選至少210個(gè)氨基酸殘基、最優(yōu)選至少220個(gè)氣基酸殘基。[0227]SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的子序列優(yōu)選包含至少831個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少861個(gè)核苷酸、最優(yōu)選至少891個(gè)核苷酸。SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列的子序列優(yōu)選包含至少555個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少585個(gè)核苷酸、最優(yōu)選至少615個(gè)核苷酸。SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列的子序列優(yōu)選包含至少600個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少636個(gè)核苷酸、最優(yōu)選至少672個(gè)核苷酸。SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列的子序列優(yōu)選包含至少525個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少555個(gè)核苷酸、最優(yōu)選至少585個(gè)核苷酸。SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列的子序列優(yōu)選包含至少720個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少765個(gè)核苷酸、最優(yōu)選至少810個(gè)核苷酸。SEQIDNO:11核苷酸67-796的成熟多肽編碼序列的子序列優(yōu)選包含至少525個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少570個(gè)核苷酸、最優(yōu)選至少615個(gè)核苷酸。SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的子序列優(yōu)選包含至少600個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少630個(gè)核苷酸、最優(yōu)選至少660個(gè)核苷酸。[0228]在第四個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽是由在至少非常低嚴(yán)緊度條件、優(yōu)選至少低嚴(yán)緊度條件、更優(yōu)選至少中嚴(yán)緊度條件、更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊度條件、進(jìn)一步更優(yōu)選至少高嚴(yán)緊度條件、最優(yōu)選至少非常高嚴(yán)緊度條件下與以下序列雜交的多核苷酸編碼的:(i)SEQIDN0:USEQIDNO:3,SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDNO:9,SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:KSEQIDN0:3、SEQIDN0:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列含有的cDNA序列，或者包含SEQIDNO:7,SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)⑴或(ii)的子序列，或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,同上)。SEQIDNO:USEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:`13的成熟多肽編碼序列的子序列包含至少100個(gè)鄰接核苷酸或優(yōu)選至少200個(gè)鄰接核苷酸。而且，所述子序列可編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸388-1332、SEQIDNO:3的核苷酸98-821、SEQIDNO:5的核苷酸126-978、SEQIDN0:7的核苷酸55-678、SEQIDNO:9的核苷酸58-912、SEQIDNO:11的核苷酸67-796或SEQIDNO:13的核苷酸77-766。[0229]同上所述，SEQIDNO:USEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的核苷酸序列，或其子序列；以及SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDN0:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10,SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的氨基酸序列，或其片段可用于設(shè)計(jì)核酸探針以從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的DNA。[0230]就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)緊條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9,SEQIDN0:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列、包含在SEQIDNO:KSEQIDNO:3,SEQIDN0:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列、或包含SEQIDNO:7,SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列、它的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈或其亞序列，如上文所述。[0231]在優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一優(yōu)選的方面,核酸探針是包含在質(zhì)粒pEJG120中的多核苷酸序列,所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30699中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒PEJG120中的成熟多肽編碼序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30699中。[0232]在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDN0:3的核苷酸98至821。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:4的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3。在另一優(yōu)選的方面,核酸探針是包含在質(zhì)粒pTter61C中的多核苷酸序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30813中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒pTter61C中的成熟多肽編碼序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30813中。[0233]在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:5的核苷酸126至978。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:6的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDN0:5。在另一優(yōu)選的方面,核酸探針是包含在質(zhì)粒pTter61D中的多核苷酸序列,所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30812中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒pTter61D中的成熟多肽編碼序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30812中。[0234]在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7的核苷酸55至678。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDN0:8的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:7。在另一優(yōu)選的方面,核酸探針是包含在質(zhì)粒pTter6IE中的多核苷酸序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30814中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒PTter61E中的成熟多肽編碼序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30814中。[0235]在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDN0:9的核苷酸58至912。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:10的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDN0:9。在另一優(yōu)選的方面,核酸探針是包含在質(zhì)粒pTter61G中的多核苷酸序列,所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30811中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒pTter61G中的成熟多肽編碼序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30811中。[0236]在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:11的核苷酸67至796。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:12的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNOill0在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒PDZA2-7中的多核苷酸序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒PDZA2-7中的成熟多肽編碼序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。[0237]在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:13的核苷酸77至766。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:14的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:13ο在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒pTr333中的多核苷酸序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中，其中它的多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在質(zhì)粒PTr333中的成熟多肽編碼序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中。[0238]對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，非常低至非常高的嚴(yán)緊條件如在本文中所定義。[0239]對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，載體材料的最終洗滌如在本文中定義。[0240]對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)緊條件如本文所定義。[0241]對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，載體材料的最終洗滌如在本文中定義。[0242]在第五方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由包含如下核苷酸序列或由如下核苷酸序列組成的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，`更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，甚至更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，其編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。[0243]在一個(gè)優(yōu)選的方面，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332、SEQIDNO:3的核苷酸98至821、SEQIDNO:5的核苷酸126至978、SEQIDNO:7的核苷酸55至678、SEQIDNO:9的核苷酸58至912、SEQIDNO:11的核苷酸67至796、SEQIDNO:13的核苷酸77至766。參見本文中的多核苷酸部分。[0244]在第六個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是人工變體，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的SEQIDNO:2,SEQIDNO:4、SEQIDN0:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10,SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽或其同源序列。制備這樣的人工變體的方法如上所述。[0245]SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選I。[0246]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的來(lái)源[0247]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽可從任何屬的微生物獲得。在一個(gè)優(yōu)選的方面，從給定來(lái)源獲得的多肽分泌至胞外。[0248]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬或海洋芽孢桿菌屬多肽；或者可以是革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬或脲原體屬多肽。[0249]在優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌多肽。[0250]在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種多肽。[0251]在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌或淺青紫鏈霉菌多肽。[0252]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽還可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選是酵母多肽例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬多肽；或更優(yōu)選是絲狀真菌多肽例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的枝頂孢霉屬、蘑菇屬、鏈格孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、葡萄座腔菌屬、擬蠟菌屬、毛殼菌屬、金孢子菌屬、麥角屬、旋孢腔菌屬、Coprinopsis、Coptotermes、棒囊殼屬、栗疫病菌屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、網(wǎng)孢菌屬、鐮孢屬、赤霉屬、全鞭毛蟲屬、腐質(zhì)霉屬、IE菌屬、香燕屬、小球腔菌屬、梨孢菌屬、Melanocarpus、多孔菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、Poitrasia、假黑盤菌屬、Pseudotrichonympha、根毛霉屬、裂褶菌屬、柱頂孢屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬或木霉屬、Trichophaea、輪枝孢屬、小包腳燕屬、或炭角菌屬(Xylaria)多肽。[0253]在優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。[0254]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉黑曲霉、米曲霉、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、乳白耙菌、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉、產(chǎn)紫青霉、黃抱平革菌、無(wú)色梭抱殼、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼、Thielaviafimet1、小抱子梭抱殼、Thielaviaovispora>Thielaviaperuviana、Thielaviaspededonium、毛梭孢殼、Thielaviasubthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、綠色木霉或Trichophaeasaccata多肽。[0255]在更優(yōu)選的方面，多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢霉多肽。在最優(yōu)選的方面。多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢霉NRRL8126多肽，例如，SEQIDNO:2、4、6、8或10的成熟多肽或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。[0256]在另一更優(yōu)選的方面，多肽是橙色嗜熱子囊菌多肽，例如，SEQIDN0:12的成熟多肽。[0257]在另一更優(yōu)選的方面，多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的里氏木酶多肽。在另一最優(yōu)選的方面，多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的里氏木酶RutC30(ATCC56765)多肽，例如，SEQIDNO:14的成熟多肽或其具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。[0258]可理解的是對(duì)于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段兩種，和其它分類學(xué)的等同物，例如無(wú)性型，無(wú)論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將輕易地識(shí)別適合的等同物的身份。[0259]公眾可以在若干保藏機(jī)構(gòu)容易地獲取這些物種的菌株，這樣的機(jī)構(gòu)諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM)，真菌菌種保藏中心(CBS)和北方區(qū)域研究中心農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)。[0260]此外，還可以使用本文描述的上述探針，從包括從自然界(例如土壤、堆肥、水等等)分離的微生物在內(nèi)的其它來(lái)源鑒定和獲取這樣的多肽。[0261]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽還包括融合多肽或者可切割的融合多肽，其中另一多肽融合于具有纖維素分解增強(qiáng)活性的所述多肽或其片段的N-末端或C-末端，并如本文所述，還可以包含切割位點(diǎn)。[0262]具有纖維素分解活性的多肽及其多核苷酸的更多細(xì)節(jié)，請(qǐng)參見以參考方式并入本文的WO2005/074647、WO2005/074656和公布的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)2007/0077630。[0263]編碼具有纖維素分解增強(qiáng)`活性的多肽的多核苷酸[0264]包含編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸可以被分離并用于實(shí)踐本文所述的本發(fā)明的方法。[0265]多肽包含如下多核苷酸序列，所述多核苷酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDN0:11*4SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，甚至更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，以及甚至最優(yōu)選至少96%、97%、98%或99%的同一性程度，其編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。[0266]在優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1或由SEQIDNO:1組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含質(zhì)粒PEJG120中包含的序列或由該序列組成，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30699中。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質(zhì)粒PEJG120中包含的成熟多肽編碼序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30699中。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDN0:1。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的SEQIDNO:2的片段。[0267]在另一優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:3或由SEQIDNO:3組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質(zhì)粒pTter61C中包含的序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30813中。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含質(zhì)粒pTter61C中包含的成熟多肽編碼序列或由質(zhì)粒pTter61C中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30813中。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:4的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:3。本發(fā)明還涉及SEQIDN0:3的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的SEQIDN0:4的片段。[0268]在另一優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:5或由SEQIDNO:5組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質(zhì)粒pTter61D中包含的序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30812中。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含質(zhì)粒pTter61D中包含的成熟多肽編碼序列或由質(zhì)粒pTter61D中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30812中。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:6的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:5。本發(fā)明還涉及SEQIDN0:5的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的SEQIDN0:6的片段。[0269]在另一優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:7或由SEQIDNO:7組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質(zhì)粒pTter61E中包含的序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30814中。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含質(zhì)粒pTter61E中包含的成熟多肽編碼序列或由質(zhì)粒pTter61E中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30814中。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:8的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDN0:7。本發(fā)明還涉及SEQIDN0:7的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的SEQIDN0:8的片段。[0270]在另一優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:9或由SEQIDNO:9組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質(zhì)粒pTter61G中包含的序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30811中。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:9的成熟多肽編碼序列組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含質(zhì)粒pTter61G中包含的成熟多肽編碼序列或由質(zhì)粒pTter61G中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30811中。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:10的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDN0:9。本發(fā)明還涉及SEQIDN0:9的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的SEQIDNO:10的片段。[0271]在另一優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDN0:11或由SEQIDN0:11組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質(zhì)粒PDZA2-7中包含的序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含質(zhì)粒PDZA2-7中包含的成熟多肽編碼序列或由質(zhì)粒PDZA2-7中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30704中。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:22的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNOill0本發(fā)明還涉及SEQIDNO:11的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的SEQIDNO:12的片段。[0272]在另一優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDN0:13或由SEQIDN0:13組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含或其組成為質(zhì)粒pTr3337中包含的序列，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含質(zhì)粒pTr3337中包含的成熟多肽編碼序列或由質(zhì)粒pTr3337中包含的成熟多肽編碼序列組成，所述質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRLB-30878中。本發(fā)明還包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼具有SEQIDNO:14的氨基酸序列或其成熟多肽的多肽，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:13或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:13的亞序列，所述亞序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的SEQIDNO:14的片段。[0273]本發(fā)明還涉及在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9,SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)突變的突變多核苷酸，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDN0:2、SEQIDNO:4,SEQIDN0:6、SEQIDN0:8或SEQIDNO:10,SEQIDN0:12或SEQIDNO:14的成熟多肽。在優(yōu)選的方面，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20至326，SEQIDNO:4的氨基酸18至240，SEQIDNO:6的氨基酸20至258，SEQIDNO:8的氨基酸19至226或SEQIDNO:10的氨基酸20至304，SEQIDNO:12的氨基酸23至250或SEQIDNO:14的氨基酸20至249。在另一優(yōu)選的方面，所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332，SEQIDN0:3的核苷酸98至821，SEQIDNO:5的核苷酸126至978，SEQIDNO:7的核苷酸55至678，SEQIDNO:9的核苷酸58至912，SEQIDNO:11的核苷酸67至796，SEQIDNO:13的核苷酸77至766。[0274]如早前所述，用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。[0275]所述多核苷酸也可以是編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸在至少極低嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選至少低嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選至少中嚴(yán)緊條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴(yán)緊條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴(yán)緊條件下，與以下雜交:(i)SEQIDN0:USEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，(ii)包含在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3,SEQIDN0:5或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列或包含SEQIDN0:7、SEQIDN0:9或SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或其等位變體和亞序列(Sambrook等，1989,同上)，如本文所定義。在優(yōu)選的方面，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸388至1332，SEQIDN0:3的核苷酸98至821，SEQIDNO:5的核苷酸126至978，SEQIDNO:7的核苷酸55至678，SEQIDN0:9的核苷酸58至912，SEQIDNO:11的核苷酸67至796，或SEQIDNO:13的核苷酸77至766。[0276]核酸構(gòu)建體[0277]可以將編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽或具有纖維素分解酶活性的多肽的分離的多核苷酸用多種方法進(jìn)行操作，以通過(guò)構(gòu)建核酸構(gòu)建體提供多肽的表達(dá)，所述核酸構(gòu)建體含有與一種或多種控制序列可操作連接的編碼所述多肽的分離的多核苷酸，所述控制序列指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中在與這些控制序列相容的條件下表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在插入載體之前對(duì)多核苷酸的序列進(jìn)行操作可能是理想的或者必要的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。[0278]控制序列可以是合適的啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子序列是被宿主細(xì)胞所識(shí)別來(lái)表達(dá)編碼這樣的多肽的多核苷酸的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子序列可以是任何在所選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，而且可以從對(duì)宿主細(xì)胞而言為同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽獲得。[0279]適于指導(dǎo)核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的例子是獲自大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、以及原核β-內(nèi)酰胺酶基因的啟動(dòng)子(Villa-KamarofT等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),和tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。ScientificAmerican,1980,242:74-94中"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"和Sambrook等，1989(同上)中描述了其它啟動(dòng)子。[0280]適于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子:米曲霉TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉喊性蛋白酶、米曲霉憐酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)桌曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W0`00/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉β-木糖苷酶；以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)；以及它們的突變、截短和雜合的啟動(dòng)子。[0281]在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子是從釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因獲得的。對(duì)酵母宿主細(xì)胞有用的其他啟動(dòng)子在Romanos等，1992，Yeast8:423-488中有記載。[0282]控制序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列。終止子序列是被宿主細(xì)胞識(shí)別來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的3’末端。任何可在所選的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的終止子都可以用于本發(fā)明。[0283]優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的終止子是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因獲得的。[0284]優(yōu)選的用于酵母宿主細(xì)胞的終止子是從釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得的。對(duì)酵母宿主細(xì)胞有用的其他終止子在Romanos等,1992(同上)中有記載。[0285]控制序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，前導(dǎo)序列是mRNA中的一種不被翻譯的區(qū)域，它對(duì)于宿主細(xì)胞進(jìn)行的翻譯而言是重要的。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’末端。任何可在所選擇的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的前導(dǎo)序列都可以用于本發(fā)明。[0286]優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因獲得的。[0287]用于酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列是從釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因獲得的。[0288]控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，聚腺苷酸化序列是一段與核苷酸序列的3’末端可操作連接的序列，轉(zhuǎn)錄后被宿主細(xì)胞所識(shí)別，作為向被轉(zhuǎn)錄的mRNA添加聚腺苷酸殘基的信號(hào)。任何可在所選擇的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的聚腺苷酸化序列都可以用于本發(fā)明。[0289]優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的聚腺苷酸化序列是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖昔酶的基因獲得的。[0290]Guo和Sherman,1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990記載了在酵母宿主細(xì)胞中有用的聚腺苷酸化序列。[0291]控制序列還可以是信號(hào)肽編碼序列，其編碼的氨基酸序列連接于多肽的氨基末端，并引導(dǎo)被編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列的5’端可以固有地包含信號(hào)肽編碼序列，該序列天然地以符合翻譯閱讀框的方式連接于編碼區(qū)中編碼分泌型多肽的區(qū)段。或者，編碼序列的5’端可以包含對(duì)該編碼序列而言為外源的信號(hào)肽編碼序列。在編碼序列天然地不包含信號(hào)肽編碼序列的場(chǎng)合，可能需要外源信號(hào)肽編碼序列?；蛘撸梢院?jiǎn)單地用外源信號(hào)肽編碼序列取代天然信號(hào)肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，引導(dǎo)被表達(dá)的多肽進(jìn)入所選的宿主細(xì)胞的分泌途徑，即分泌到培養(yǎng)基中的任何信號(hào)肽編碼序列都可以用于本發(fā)明。[0292]對(duì)細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從芽孢桿菌NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢桿菌prsA的基因獲得的信號(hào)妝編碼序列。Simonen和Palva,1993，MicrobiologicalReviews57:109-137記載了其它信號(hào)肽。[0293]對(duì)絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列。[0294]在一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1_19或者由SEQIDNO:2的氨基酸1-19組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽編碼區(qū)包含SEQIDNO:1的核苷酸330-387或者由SEQIDNO:1的核苷酸330-387組成。[0295]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽包含SEQIDNO:4的氨基酸1_17或者由SEQIDN0:4的氨基酸1-17組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽編碼區(qū)包含SEQIDN0:3的核苷酸47-97或者由SEQIDNO:3的核苷酸47-97組成。[0296]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽包含SEQIDNO:6的氨基酸1_19或者由SEQIDN0:6的氨基酸1-19組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽編碼區(qū)包含SEQIDN0:5的核苷酸69-125或者由SEQIDNO:5的核苷酸69-125組成。[0297]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽包含SEQIDN0:8的氨基酸1_18或者由SEQIDNO:8的氨基酸1-18組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽編碼區(qū)包含SEQIDNO:7的核苷酸1-54或者由SEQIDNO:7的核苷酸1-54組成。[0298]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽包含SEQIDNO:10的氨基酸1_19或者由SEQIDNO:10的氨基酸1-19組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽編碼區(qū)包含SEQIDNO:9的核苷酸1-57或者由SEQIDNO:9的核苷酸1-57組成。[0299]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽包含SEQIDNO:12的氨基酸1_22或者由SEQIDNO:12的氨基酸1-22組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽編碼區(qū)包含SEQIDNO:11的核苷酸1-66或者由SEQIDNO:11的核苷酸1_66組成。[0300]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽包含SEQIDNO:14的氨基酸1_19或者由SEQIDNO:14的氨基酸1-19組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽編碼區(qū)包含SEQIDNO:13的核苷酸20-76或者由SEQIDNO:13的核苷酸20-76組成。[0301]對(duì)酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽是從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶獲得的。其它有用的信號(hào)肽編碼序列在Romanos等，1992，同上文中有記載。`[0302]控制序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽的氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽被稱為酶原(proenzyme)或原多肽(propolypeptide)(或者在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是沒(méi)有活性的，并且通過(guò)將前肽從原多肽中催化或自催化切割出來(lái)可以轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。前肽編碼序列可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶的基因獲得(W095/33836)。[0303]在信號(hào)肽和前肽序列都存在于多肽氨基末端的場(chǎng)合，前肽序列位于多肽氨基末端的相鄰位置，而信號(hào)肽序列位于前肽序列的氨基末端的相鄰位置。[0304]添加這樣的調(diào)控序列可能也是理想的:該序列容許相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)控系統(tǒng)的例子有導(dǎo)致基因的表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)控性化合物的存在)而開啟或關(guān)閉的那些調(diào)控系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子作為調(diào)控序列。其他調(diào)控序列的例子有使基因能夠擴(kuò)增的調(diào)控序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控序列包括在甲氨蝶呤存在下被擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和在重金屬存在下被擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些場(chǎng)合，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)控序列可操作地連接。[0305]表達(dá)載體[0306]可以將本文中描述的各種核酸和控制序列連接起來(lái)產(chǎn)生重組表達(dá)載體，其包含編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽或具有纖維素分解酶活性的多肽、啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。所述表達(dá)載體可包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制性位點(diǎn)以便于在這些位點(diǎn)上插入或替換編碼多肽的多核苷酸序列?；蛘?，可以將多核苷酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入合適的表達(dá)用載體來(lái)表達(dá)編碼這樣的多肽的多核苷酸序列。在生成表達(dá)載體的過(guò)程中，將編碼序列置于載體中使得該編碼序列與合適的表達(dá)用控制序列可操作地連接。[0307]重組表達(dá)載體可以是任何可便利地進(jìn)行重組DNA程序并且能夠帶來(lái)多核苷酸序列的表達(dá)的載體(例如質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇通常將取決于載體與該載體要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性的或者閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。[0308]所述載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可含有任何用于保證自我復(fù)制的工具?；蛘撸d體可以是這樣的載體，當(dāng)它被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，整合到基因組中并隨同它整合到其中的染色體一起復(fù)制。另外，可以使用單一的載體或質(zhì)粒，或兩個(gè)或更多個(gè)共同包含要導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的總DNA的載體或質(zhì)粒，或者轉(zhuǎn)座子。[0309]載體優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記,這些標(biāo)記容許容易地選擇經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇標(biāo)記是這樣的基因，其產(chǎn)物可提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性，對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性，等等。[0310]細(xì)菌選擇標(biāo)記的例子有來(lái)自枯草芽孢桿菌或者地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。用于酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脫羧酶)、SC(硫酸腺苷轉(zhuǎn)移酶)，和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，以及它們的等同物。優(yōu)選用于曲霉細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，以及吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。[0311]載體優(yōu)選包含容許載體整合到宿主細(xì)胞的基因組或者容許載體在細(xì)胞中不依賴基因組自主復(fù)制的元件。[0312]為了整合到宿主細(xì)胞基因組中，載體可能依賴多核苷酸的編碼多肽的序列或者載體的任何其它元件來(lái)通過(guò)同源或異源重組整合到基因組中。或者，載體可含有附加的核苷酸序列，用來(lái)指導(dǎo)通過(guò)同源重組在染色體上的精確位置整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了增加在精確位置上整合的機(jī)率，整合元件優(yōu)選應(yīng)含有足夠數(shù)目的與相應(yīng)靶序列具有高度同一性的核酸，諸如100-10，000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400-10，000個(gè)堿基對(duì)，最優(yōu)選800-10，000個(gè)堿基對(duì)，以提高同源重組的概率。整合元件可以是任何與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非編碼的或者編碼的核苷酸序列。此外，載體可以通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組中。[0313]為了自主復(fù)制,載體可進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，該起點(diǎn)使得載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何介導(dǎo)自主復(fù)制的質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文中定義為使質(zhì)粒或載體能夠在體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。[0314]細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例有容許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，以及容許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060和ρΑΜβI的復(fù)制起點(diǎn)。[0315]用于在酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的例子有2微米復(fù)制起點(diǎn)、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合，以及ARS4和CEN6的組合。[0316]在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的例子有AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175；W000/24883)。AMAl基因的分離，以及包含該基因的質(zhì)粒或載體的構(gòu)建，可以根據(jù)WO00/24883中公開的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。[0317]可以向宿主細(xì)胞中插入編碼這樣的多肽的多核苷酸的多于一個(gè)拷貝以增加所述多肽的生產(chǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)下述方法獲得多核苷酸的拷貝數(shù)的增加:向宿主細(xì)胞基因組中插入至少一個(gè)額外拷貝的序列；或者納入伴隨該多核苷酸的可擴(kuò)增選擇標(biāo)記基因，由此通過(guò)在合適的選擇劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，可以選擇出含有擴(kuò)增拷貝數(shù)的選擇標(biāo)記基因，從而也就含有更多拷貝的所述多核苷酸的細(xì)胞。[0318]用于連接上述元件來(lái)構(gòu)建重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見例如Sambrook等,1989,同上文)。[0319]宿主細(xì)胞[0320]包含編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽或具有纖維素分解酶活性的多肽的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞可以有利地用于多肽的重組生產(chǎn)。將包含這樣的多核苷酸的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞使得載體作為染色體整合子或者如前文所述的自復(fù)制的染色體外載體被保持。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋親本細(xì)胞的任何因復(fù)制過(guò)程中的突變而與親本細(xì)胞不同的后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上將取決于編碼多肽的基因及其來(lái)源。[0321]宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或者非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。[0322]細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏球菌屬或尿枝原體屬。[0323]細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)踐中可以使用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。[0324]在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。[0325]細(xì)菌宿主細(xì)胞也可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)踐中可以使用的鏈球菌屬細(xì)胞包括但不限于似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌、和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。[0326]在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是似馬鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是釀膿鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是乳房鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。[0327]細(xì)菌宿主細(xì)胞也可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)踐中可以使用的鏈霉菌屬細(xì)胞包括但不限于不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。[0328]在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是除蟲鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是天藍(lán)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是灰色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。[0329]向芽孢桿菌屬細(xì)胞中導(dǎo)入DNA可以通過(guò)例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如Chang和Cohen,1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)、使用感受態(tài)細(xì)胞(參見例如Young和Spizizen,1961,JournalofBacteriology81:823-829,或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209-221)、通過(guò)電穿孔(參見例如Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)，或通過(guò)接合(參見例如Koehler和Thorne,1987，JournalofBacteriology169:5271-5278)來(lái)實(shí)現(xiàn)。向大腸桿菌細(xì)胞中導(dǎo)入DNA可以通過(guò)例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見例如Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127-6145)來(lái)實(shí)現(xiàn)。向鏈霉菌屬細(xì)胞中導(dǎo)入DNA可以通過(guò)例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔來(lái)實(shí)現(xiàn)(參見例如Gong等，2004，F(xiàn)oliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)、接合(參見例如Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)、或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見例如Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:6289-6294)來(lái)實(shí)現(xiàn)。向假單胞菌屬細(xì)胞中導(dǎo)入DNA可以通過(guò)例如電穿孔(參見例如Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)、或接合(參見例如Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)來(lái)實(shí)現(xiàn)。向鏈球菌屬細(xì)胞中導(dǎo)入DNA可以通過(guò)例如天然感受態(tài)(參見例如Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Tm`mun.32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-2070)>電穿孔(參見例如Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)>或接合(參見例如Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)來(lái)實(shí)現(xiàn)。盡管如此，本領(lǐng)域已知的任何用于將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法都可以使用。[0330]宿主細(xì)胞也可以是真核生物，諸如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物、或真菌細(xì)胞。[0331]在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等在AinsworthandBisbyjsDictionaryofTheFungi,第八版,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中定義的)，和卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，同上文，第171頁(yè)引用的)等門，以及全部有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995,同上文)。[0332]在一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。本文所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子抱子囊酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在將來(lái)可能有所改變，為了本發(fā)明的目的，酵母將如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.和Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesN0.9,1980)中所述加以定義。[0333]在一個(gè)進(jìn)一步更優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞。[0334]在一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳克魯維酵母(KluyveromycesIactis)細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)細(xì)胞。[0335]在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等，1995，同上文定義)。絲狀真菌的一般特征在于由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲壁。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲延伸，且碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)單細(xì)胞菌體的芽殖，且碳分解代謝可以是發(fā)酵的。[0336]在一個(gè)進(jìn)一步更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、網(wǎng)孢菌屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)、或木霉屬細(xì)胞。[0337]在一個(gè)更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬臘菌(Ceriporiopsisaneirina)、干擬臘菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、剌序側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢殼、長(zhǎng)域毛栓菌(Trametesvillosa)、雜色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。[0338]真菌細(xì)胞可以用包括方式本身已知的原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法來(lái)加以轉(zhuǎn)化。用于曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的合適方法描述于EP238023和Yelton等，1984,ProceedingsoftheNational.AcademyofSciencesUSA81:1470-1474。Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述了轉(zhuǎn)化鐮孢屬的種的合適方法。酵母可用Becker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon,M.1.編的GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,第194卷，第182-187頁(yè)，AcademicPress,NewYork;Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；和Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920中所述的方法轉(zhuǎn)化。[0339]生產(chǎn)方法[0340]生產(chǎn)具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽或具有纖維素分解酶活性的多肽的方法包括:(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收多肽。[0341]或者，生產(chǎn)具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽或具有纖維素分解酶活性的多肽的方法包括:(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞；和(b)回收多肽。[0342]在產(chǎn)生方法中，用本領(lǐng)域中公知的方法在適于多肽產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、和小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細(xì)胞，這在合適的培養(yǎng)基中和使多肽能被表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行。用本領(lǐng)域中已知的程序，在含有碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商得到或根據(jù)公開的組成(例如，于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可直接從培養(yǎng)基中回收該多肽。如果該多肽不被分泌，則可從細(xì)胞裂解產(chǎn)物中回收它。[0343]具有纖維素分解增強(qiáng)活性或纖維素酶活性的多肽用本文記載的方法檢測(cè)。[0344]得到的發(fā)酵液可以直接`使用，或者可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收所述多肽。例如，可以通過(guò)常規(guī)方法，包括，但不限于，離心、過(guò)濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀將多肽從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收出來(lái)。[0345]多肽可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的多種方法進(jìn)行純化，所述方法包括，但不限于，層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(見,例如，ProteinPurificationJ.-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989),來(lái)獲得基本上純的多妝。[0346]含纖維素材料的加工方法[0347]本發(fā)明的組合物和方法可以用來(lái)將含纖維素材料例如木素纖維素水解(糖化)成可發(fā)酵糖，并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為許多有用的物質(zhì)，例如化學(xué)品和燃料。從含纖維素材料生產(chǎn)期望的發(fā)酵產(chǎn)品通常涉及預(yù)處理、酶促水解(糖化)和發(fā)酵。[0348]本發(fā)明的含纖維素材料的加工可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)完成。此外，本發(fā)明的方法可以使用任何為了依照本發(fā)明運(yùn)行而配置的生物質(zhì)加工裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)。[0349]單獨(dú)或同時(shí)進(jìn)行的水解(糖化)和發(fā)酵包括，但不限于:單獨(dú)水解和發(fā)酵(SHF)、同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)、同時(shí)糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合水解和發(fā)酵(hybridhydrolysisandfermentation,HHF)、SHCF(單獨(dú)水解和共發(fā)酵)、HHCF(混合水解和發(fā)酵)、及直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。本文中應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域中任何包括預(yù)處理、酶促水解(糖化)、發(fā)酵或它們的組合的方法都可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。[0350]常規(guī)裝置可以包括補(bǔ)料分批攪拌反應(yīng)器、分批攪拌反應(yīng)器、帶超濾的連續(xù)流動(dòng)攪拌反應(yīng)器、和/或連續(xù)活塞流動(dòng)柱反應(yīng)器(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin和IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33—38;Gusakov,A.V.和Sinitsyn,A.P.，1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、碾磨反應(yīng)器(Ryu,S.K.和Lee,J.M.,1983,Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)>或具有電磁場(chǎng)誘發(fā)的強(qiáng)烈攪拌的反應(yīng)器(Gusakov,A.V.，Sinitsyn,A.P.，Davydkin,1.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反應(yīng)器類型包括，例如，用于水解和/或發(fā)酵的流化床型、厭氧污泥床(upflowblanket)型、固定化型、以及擠出機(jī)型反應(yīng)器。[0351]預(yù)處理.在本發(fā)明的方法的實(shí)施中，本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理方法都可以用來(lái)破壞含纖維素材料的植物細(xì)胞壁組分。在預(yù)處理之前還可以使用本領(lǐng)域已知的方法對(duì)含纖維素材料進(jìn)行預(yù)浸泡、潤(rùn)濕、或調(diào)制(conditioning)。常規(guī)的預(yù)處理包括但不限于蒸汽預(yù)處理(有或沒(méi)有爆破)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆破、氨纖維爆破(ammoniafiberexplosion)、有機(jī)溶劑預(yù)處理(organosolvpretreatment)、和生物預(yù)處理。其它預(yù)處理包括超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界H20、和氨滲濾(ammoniapercolation)。[0352]可以在水解和/或發(fā)酵之前預(yù)處理含纖維素材料。預(yù)處理優(yōu)選在水解之前進(jìn)行?；蛘?，預(yù)處理可以和水解同時(shí)進(jìn)行，諸如在用一種或多種纖維素分解酶或其它酶活性處理含纖維素材料以釋放可發(fā)酵糖如葡萄糖和/或麥芽糖的同時(shí)進(jìn)行預(yù)處理。在大多數(shù)情況下預(yù)處理步驟本身會(huì)導(dǎo)致一些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(即使沒(méi)有酶存在)。[0353]蒸汽預(yù)處理.在蒸汽預(yù)處理中，將含纖維素材料加熱以破壞植物細(xì)胞壁組分，包括木質(zhì)素、半纖維素、和纖維素，以使得纖維素和其它部分如半纖維素(hemicellulase)暴露于酶。使纖維素材料通至或通過(guò)反應(yīng)容器，在那里噴射蒸汽以升溫到需要的溫度和壓力，并在其中保持需要的反應(yīng)時(shí)間。蒸汽預(yù)處理優(yōu)選在140-230°C、更優(yōu)選160-200°C、最優(yōu)選170-190°C進(jìn)行，其中最優(yōu)的溫度范圍取決于化學(xué)催化劑的添加。蒸汽預(yù)處理的停留時(shí)間優(yōu)選1-15分鐘、更優(yōu)選3-12分鐘、最優(yōu)選4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時(shí)間取決于溫度范圍和化學(xué)催化劑的添加。蒸汽預(yù)處理容許相對(duì)較高的固形物載量，使得含纖維素材料在預(yù)處理過(guò)程中一般僅是輕微潮濕的。蒸汽預(yù)處理通常與預(yù)處理后對(duì)材料的爆破性出料(explosivedischarge)相結(jié)合,后者被稱為蒸汽爆破(steamexplosion),即將材料急速瞬時(shí)置于大氣壓和湍流下，以通過(guò)碎裂作用增加暴露的表面積(Duff和Murray,1996，BioresourceTechnology855:1-33;Galbe和Zacchi,2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美國(guó)專利申請(qǐng)20020164730)。[0354]在蒸汽預(yù)處理之前往往添加催化劑如H2SO4或SO2(典型地為0.3_3%w/w)，催化劑可減少時(shí)間和溫度，增加收率，以及改善酶促水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.BiotechnoI.I29-132:496-508;Varga等，2004，AppI.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523；Sassner等，2006,EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)。[0355]化學(xué)預(yù)處理:術(shù)語(yǔ)“化學(xué)預(yù)處理”是指任何可促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放的化學(xué)預(yù)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理過(guò)程的例子包括稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆破(AFEX)、氨滲濾(APR)、和有機(jī)溶劑預(yù)處理。[0356]在稀酸預(yù)處理中，將含纖維素材料與稀酸，通常是H2SO4,以及水混合形成漿液，蒸汽加熱到希望的溫度，然后經(jīng)過(guò)一段停留時(shí)間瞬時(shí)變化到大氣壓。稀酸預(yù)處理可以用多種反應(yīng)器設(shè)計(jì)來(lái)實(shí)施，例如活塞流動(dòng)反應(yīng)器、逆流反應(yīng)器、或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器(Duff和Murray,1996,同上文；Schell等,2004,BioresourceTechnol.91:179-188;Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。[0357]還可以采用數(shù)種堿性條件下的預(yù)處理方法。這些堿性預(yù)處理包括，但不限于石灰預(yù)處理、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆破(AFEX)。[0358]石灰預(yù)處理用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨在85_150°C的低溫下進(jìn)行，停留時(shí)間為I小時(shí)至數(shù)日(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.96:1959-1966；Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673-686)。WO2006/110891、TO2006/11899、WO2006/11900和WO2006/110901公開了使用氨的預(yù)處理方法。[0359]濕氧化是一種熱預(yù)處理，典型地在180_200°C進(jìn)行5_15分鐘，同時(shí)添加氧化劑如過(guò)氧化氫或氧過(guò)壓(Schmidt和Thomsen,1998,BioresourceTechnol.64:139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預(yù)處理優(yōu)選在1-40%干物質(zhì)、更優(yōu)選2-30%干物質(zhì)、最優(yōu)選5-20%干物質(zhì)的條件下進(jìn)行，并且經(jīng)常通過(guò)添加堿，如碳酸鈉來(lái)提高初始pH。`[0360]濕氧化預(yù)處理方法的一種變化形式，稱為濕爆破(濕氧化和蒸汽爆破的結(jié)合)，可以處理高達(dá)30%的干物質(zhì)。在濕爆破中，在預(yù)處理過(guò)程中經(jīng)過(guò)一定的停留時(shí)間后引入氧化齊U。然后瞬間變化到大氣壓而終止預(yù)處理(W02006/032282)。[0361]氨纖維爆破(AFEX)涉及用液態(tài)或氣態(tài)的氨在中等溫度如90_100°C和高壓如17-20巴的條件下處理含纖維素材料5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可高達(dá)60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等，2005,BioresourceTechnol.96:2014-2018)。[0362]有機(jī)溶劑預(yù)處理通過(guò)使用乙醇水溶液(40-60%乙醇)在160-200°C萃取30_60分鐘來(lái)使含纖維素材料脫木質(zhì)素(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851-861;Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。通常添加硫酸作為催化劑。在有機(jī)溶劑預(yù)處理中，大部分的半纖維素被去除。[0363]Schell等，2003，Appl.Biochem.andBiotechnol.第105-108卷，第69-85頁(yè)和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686以及美國(guó)專利申請(qǐng)公布2002/0164730描述了其他合適的預(yù)處理方法的例子。[0364]在一個(gè)方面，化學(xué)預(yù)處理作為酸處理，更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸和/或弱酸(mildacid)處理來(lái)實(shí)施。所述酸通常是硫酸，但也可以用其它的酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或它們的混合物。弱酸處理在優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4，最優(yōu)選1-3的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)方面，酸濃度在優(yōu)選0.01-20wt%酸，更優(yōu)選0.05-10wt%酸，進(jìn)一步更優(yōu)選0.l-5wt%酸，最優(yōu)選0.2-2.0wt%酸的范圍。將所述酸與含纖維素材料接觸，并在一定溫度如160-200°C，優(yōu)選165-195°C的范圍內(nèi)保持自若干秒到若干分鐘不等的時(shí)間，例如I秒至60分鐘。[0365]在另一個(gè)方面，預(yù)處理作為氨纖維爆破步驟(AFEX預(yù)處理步驟)來(lái)實(shí)施。[0366]在另一個(gè)方面，預(yù)處理在水漿液中進(jìn)行。在優(yōu)選的方面，含纖維素材料在預(yù)處理過(guò)程中以優(yōu)選10-80wt%之間，更優(yōu)選20-70wt%之間，最優(yōu)選30-60wt%之間，諸如50wt%左右的量存在。經(jīng)過(guò)預(yù)處理的含纖維素材料可以不予洗滌，或者可以用任何本領(lǐng)域已知的方法洗滌，例如用水洗滌。[0367]機(jī)械預(yù)處理:術(shù)語(yǔ)“機(jī)械預(yù)處理”是指各類研磨(grinding)或粉碎(milling)(例如干粉碎，濕粉碎或振動(dòng)球粉碎(vibratoryballmilling))。[0368]物理預(yù)處理:術(shù)語(yǔ)“物理預(yù)處理”是指任何可促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從含纖維素材料分離和/或釋放的預(yù)處理。例如，物理預(yù)處理可涉及輻射(例如微波輻射)、蒸汽處理/蒸汽爆破、濕熱分解作用，和它們的組合。[0369]物理預(yù)處理可涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆破)。在一個(gè)方面，高壓是指在優(yōu)選約300-約600psi，更優(yōu)選約350-約550psi，最優(yōu)選約400-約500psi的范圍，如450psi左右。在另一個(gè)方面，高溫意指約100-約300°C，優(yōu)選約140-約235°C范圍的溫度。在一個(gè)優(yōu)選的方面，機(jī)械預(yù)處理在使用如上定義的高壓及高溫的分批過(guò)程式蒸汽噴射水解裝置系統(tǒng)(batch-process,steamgunhydrolyzersystem)中，如可獲自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中進(jìn)行。[0370]物理和化學(xué)聯(lián)合預(yù)處理:可以既以物理方式又以化學(xué)方式處理含纖維素材料。例如，預(yù)處理步驟可涉及稀酸或弱酸處理以及高溫和/或高壓處理。根據(jù)需要，物理預(yù)處理和化學(xué)預(yù)處理可以順序地或同時(shí)地進(jìn)行。還可以包含機(jī)械預(yù)處理。[0371]于是，在一個(gè)優(yōu)選的方面，對(duì)含纖維素材料進(jìn)行機(jī)械、化學(xué)、或物理預(yù)處理，或它們的任何組合，來(lái)促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。[0372]生物預(yù)處理:術(shù)語(yǔ)“生物預(yù)處理”是指任何可促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從含纖維素材料分離和/或釋放的生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可涉及施用溶木質(zhì)素微生物(參見例如Hsu,T.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,《HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization》，Wyman,C.E.編,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMiIlan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,《EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction》，Himmel,M.E.，Baker,J.0.和Overend,R.P.編,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,((AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology)),Scheper,T.編,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；01sson和Hahn-HagerdaI,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331,及Vallander和Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。[0373]糖化.在水解步驟，又稱糖化中，經(jīng)過(guò)預(yù)處理的含纖維素材料被水解以將纖維素或者半纖維素降解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解以酶促方式進(jìn)行，使用本發(fā)明的包含有效量的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和水溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的纖維素分解酶組合物。該組合物的酶組分也可以順序地添加。[0374]酶促水解優(yōu)選在合適的含水環(huán)境中于本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易確定的條件下進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的方面，水解在適合于一種或多種酶的活性的條件，即對(duì)一種或多種酶而言最適的條件下進(jìn)行。水解可以作為補(bǔ)料分批或者連續(xù)過(guò)程進(jìn)行，例如經(jīng)預(yù)處理的含纖維素材料(底物)被逐漸添加到例如含酶的水解溶液中。[0375]糖化通常在攪拌槽式反應(yīng)器或發(fā)酵罐中在受控的pH、溫度和混合條件下進(jìn)行。合適的過(guò)程時(shí)間、溫度和pH條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如,糖化可持續(xù)最多達(dá)200個(gè)小時(shí)，但通常進(jìn)行優(yōu)選約12個(gè)到約96個(gè)小時(shí)，更優(yōu)選約16個(gè)到約72個(gè)小時(shí)，最優(yōu)選約24個(gè)到約48個(gè)小時(shí)。溫度范圍為優(yōu)選約25°C-約70°C，更優(yōu)選約30°C-約65°C，更優(yōu)選約40°C-60°C，尤其是約50°GpH范圍為優(yōu)選約3-約8，更優(yōu)選約3.5-約7，最優(yōu)選約4-約6，尤其是大約pH5。干固形物含量范圍為優(yōu)選約5-約50wt%，更優(yōu)選約10-約40wt%，最優(yōu)選約20-約30wt%。[0376]具有纖維素分解增強(qiáng)活性的酶和多肽的最適量取決于數(shù)種因素，包括但不限于作為成分的纖維素分解蛋白的混合物，含纖維素底物，含纖維素底物的濃度，含纖維素底物的一種或多種預(yù)處理，溫度，時(shí)間，pH,以及發(fā)酵生物的選用(例如用于同時(shí)糖化和發(fā)酵的酵母)。[0377]在一個(gè)優(yōu)選的方面，一種或多種纖維素分解蛋白對(duì)含纖維素材料的有效量為大約0.5-約50mg,優(yōu)選約0.5-約40mg,更優(yōu)選約0.5-約25mg,更優(yōu)選約0.75-約20mg,更優(yōu)選約0.75-約15mg,進(jìn)一步更優(yōu)選約0.5-約IOmg,最優(yōu)選約2.5-約IOmg每克含纖維素材料。[0378]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽對(duì)含纖維素材料的有效量為約0.5-約50mg,優(yōu)選約0.5-約40mg,更優(yōu)選約0.5-約25mg,更優(yōu)選約0.75-約20mg,更優(yōu)選約0.75-約15mg,進(jìn)一步更優(yōu)選約0.5-約IOmg,最優(yōu)選約2.5-約IOmg每克含纖維素材料。[0379]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的一種或多種多肽對(duì)含纖維素材料的有效量為約0.01-約50.0mg,優(yōu)選約0.01-約40mg，更優(yōu)選約0.01-約30mg，更優(yōu)選約0.01-約20mg,更優(yōu)選約0.01-約IOmg,更優(yōu)選約0.01-約5mg,更優(yōu)選約0.025-約1.5mg,更優(yōu)選約0.05-約1.25mg,更優(yōu)選約0.075-約1.25mg,更優(yōu)選約0.1-約1.25mg,進(jìn)一步更優(yōu)選約0.15-約1.25mg,最優(yōu)選約0.25-約1.0mg每克含纖維素材料。[0380]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，一種或多種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽對(duì)纖維素分解蛋白的有效量為約0.005-約1.0g,優(yōu)選約0.01-約1.0g,更優(yōu)選約0.15-約0.75g，更優(yōu)選約0.15-約0.5g，更優(yōu)選約0.1-約0.5g，進(jìn)一步更優(yōu)選約0.1-約0.5g，最優(yōu)選約0.05-約0.2g每克一種或多種纖維素分解蛋白。[0381]對(duì)于從經(jīng)過(guò)預(yù)處理和水解的含纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖，可以用一種或多種能夠直接或間接將糖發(fā)酵為期望的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物來(lái)加以發(fā)酵?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵過(guò)程”是指任何發(fā)酵過(guò)程或任何包含發(fā)酵步驟的過(guò)程。發(fā)酵過(guò)程還包括生物燃料工業(yè)、食用酒精工業(yè)(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工業(yè)(例如發(fā)酵乳產(chǎn)品)、皮革工業(yè)及煙草工業(yè)上使用的發(fā)酵過(guò)程。發(fā)酵條件取決于期望的發(fā)酵產(chǎn)物及發(fā)酵生物，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地予以確定。[0382]在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和酶促水解步驟的結(jié)果從含纖維素材料釋放的糖被發(fā)酵生物如酵母發(fā)酵成產(chǎn)物，例如乙醇。水解(糖化)和發(fā)酵可以分別或同時(shí)進(jìn)行。這樣的方法包括，但不限于，分別水解和發(fā)酵(SHF)、同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)、同時(shí)糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合水解和發(fā)酵(HHF)、SHCF(分別水解和共發(fā)酵)、HHCF(混合水解和發(fā)酵)、以及直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。[0383]任何合適的經(jīng)水解的含纖維素材料都可以用于本發(fā)明實(shí)施中的發(fā)酵步驟。如本領(lǐng)域中公知的，所述材料的選擇通?；谄谕陌l(fā)酵產(chǎn)物，即要通過(guò)發(fā)酵獲得的物質(zhì)，以及所采用的過(guò)程。[0384]術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中理解為指添加一種或多種發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，例如由糖化過(guò)程得到的培養(yǎng)基，以及例如在同時(shí)糖化和發(fā)酵過(guò)程(SSF)中使用的培養(yǎng)基。[0385]“發(fā)酵微生物”是指適合在期望的發(fā)酵過(guò)程中使用來(lái)產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細(xì)菌和真菌生物。發(fā)酵微生物可以是(:6和/或C5發(fā)酵生物，或它們的組合。(:6和(:5發(fā)酵生物都是本領(lǐng)域中公知的。合適`的發(fā)酵微生物能夠?qū)⑻穷?，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖，直接或間接發(fā)酵，即轉(zhuǎn)化成期望的發(fā)酵產(chǎn)物。[0386]Lin等,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642記載了產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌及真菌發(fā)酵微生物的例子。[0387]能夠發(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的例子包括細(xì)菌和真菌生物，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬一些種，優(yōu)選釀酒酵母的菌株。[0388]能夠發(fā)酵C5糖的發(fā)酵微生物的例子包括細(xì)菌和真菌生物，如酵母。優(yōu)選的發(fā)酵C5的酵母包括:畢赤酵母屬的菌株，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis),如樹干畢赤酵母CBS5773;假絲酵母屬的菌株,優(yōu)選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、蕓苔假絲酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產(chǎn)I元假絲酵母(Candidautilis)。[0389]其它發(fā)酵生物包括發(fā)酵單孢菌屬(Zymomonas)如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株；漢遜酵母屬(Hansenula)如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克魯維酵母屬如脆壁克魯維酵母(K.fragilis)的菌株；裂殖酵母屬如粟酒裂殖酵母的菌株；以及大腸桿菌，尤其是已經(jīng)過(guò)遺傳修飾而改善了乙醇產(chǎn)率的大腸桿菌菌株。[0390]在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述酵母是酵母屬的一些種(Saccharomycesspp)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是釀酒酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是糖化酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述酵母是克魯維酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,所述酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述酵母是假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是蕓苔假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述酵母是棍孢屬(Clavispora)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是葡萄牙棍孢(ClavisporaIusitaniae)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,所述酵母是仙人掌棍孢(Clavisporaopuntiae)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是嗜鞋管囊酵母(Pachysolentannophilus)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述酵母是畢赤酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酵母是樹干畢赤酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面,所述酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,在Wyman,C.Ε.編的〈〈HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization))中,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。[0391]能夠高效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細(xì)菌包括，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis,1996,同上文)。[0392]在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌是發(fā)酵單胞菌。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌是梭菌。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述細(xì)菌是熱纖維梭菌。[0393]適用于乙醇生產(chǎn)的商品化酵母包括，例如，ETHANOLRED酵母(可獲自Fermentis/Lesaffre,USA)、FALI?(可獲自Fleischmann，sYeast,USA)，SUPERSTART?和THERMOSACC?鮮酵母(可獲自EthanolTechnology,WI,USA)、BIOFERMtmAFT和XR(可獲自NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA)>GERTSTRAND?(可獲自GertStrandAB,Sweden)，以及FERM10L?(可獲自DSMSpecialties)。[0394]在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵微生物經(jīng)過(guò)了遺傳修飾來(lái)提供發(fā)酵戊糖的能力，例如利用木糖的、利用阿拉伯糖的、以及共利用木糖和阿拉伯糖的微生物。[0395]通過(guò)克隆異源基因到各種發(fā)酵微生物中，已經(jīng)構(gòu)建出了能夠?qū)⒓禾呛臀焯寝D(zhuǎn)化為乙醇(共發(fā)酵)的生物(Chen和Ho,1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等,1998,GeneticalIyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingSaccharomycescerevisiaeandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；KotterandCiriacy,1993,XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；ffalfridsson等,1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALIgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等,2004,MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4:655-664;Beall等,1991,ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等,1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204-214；Zhang等,1995,MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267:240-243;Deanda等，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470)。[0396]在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述經(jīng)過(guò)了遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述經(jīng)過(guò)了遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述經(jīng)過(guò)了遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述經(jīng)過(guò)了遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。[0397]通常將一種或多種發(fā)酵微生物添加到經(jīng)降解的纖維素或水解產(chǎn)物中，進(jìn)行約8小時(shí)至約96小時(shí)，例如約24-約60小時(shí)的發(fā)酵。溫度通常為約26°C-約60°C，尤其是約32°C或50°C,pH為約3-8，如大約pH4-5，6，或7左右。[0398]在一個(gè)優(yōu)選的方面，將一種或多種發(fā)酵微生物施加到經(jīng)降解的纖維素或水解產(chǎn)物，并進(jìn)行大約12小時(shí)至大約96小時(shí)，如通常24-60小時(shí)的發(fā)酵。在一個(gè)優(yōu)選的方面，溫度優(yōu)選為大約20°C至大約60°C，更優(yōu)選大約25°C至大約50°C，最優(yōu)選大約32°C至大約50°C，特別是大約32°C或50°C，pH—般為大約pH3至大約pH7，優(yōu)選pH4_7左右。然而，某些發(fā)酵微生物如細(xì)菌發(fā)酵生物，具有更高的最適發(fā)酵溫度。一種或多種發(fā)酵微生物施加的量?jī)?yōu)選為每ml發(fā)酵液大約IO5至1012，優(yōu)選大約IO7至101(1，特別是大約2xl08個(gè)活細(xì)胞計(jì)數(shù)。關(guān)于使用酵母進(jìn)行發(fā)酵的更多指導(dǎo)可見例如“TheAlcoholTextbook”(K.Jacques,Τ.P.Lyons和D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999),本文援引并入該文獻(xiàn)。``[0399]為了生產(chǎn)乙醇，在發(fā)酵之后將經(jīng)發(fā)酵的漿液蒸餾以提取乙醇。依照本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇即可飲用酒精(potableneutralspirits);或工業(yè)乙醇。[0400]發(fā)酵刺激物(fermentationstimulator)可與本文描述的任何酶促過(guò)程組合使用以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵方法，特別是發(fā)酵微生物的性能，諸如速率提高和乙醇產(chǎn)量?！鞍l(fā)酵刺激物”指用于發(fā)酵微生物特別是酵母的生長(zhǎng)的刺激物。優(yōu)選的用于生長(zhǎng)的發(fā)酵刺激物包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素(multivitamins)、生物素、泛酸、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-1nositol)、硫胺素、吡哆醇、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、核黃素、及維生素A、B、C、DPE。參見例如Alfenore等,ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag,2002,本文援引并入該文獻(xiàn)。礦物質(zhì)的實(shí)例包括能夠提供營(yíng)養(yǎng)的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。[0401]發(fā)酵產(chǎn)物:發(fā)酵產(chǎn)物可以是任何來(lái)源于發(fā)酵的物質(zhì)。所述發(fā)酵產(chǎn)物包括，但不限于，醇類(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有機(jī)酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富馬酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮類(例如丙酮)；醛類(例如甲醛)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如甲烷、氫(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價(jià)值產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。[0402]在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇。應(yīng)理解的是術(shù)語(yǔ)“醇”涵蓋含有一個(gè)或多個(gè)羥基部分的物質(zhì)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨糖醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見例如Gong,C.S.、CaojN.J.、DujJ.和TsaojG.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，在《AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology》中，Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany，65:207-241；SilveirajM.M.,和Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam,P.，和Singh,D.，1995，Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute，ProcessBiochemistry30(2):117-124;Ezeji，T.C.、Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping，WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595-603o[0403]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是有機(jī)酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是醋酮酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是己二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是檸檬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是甲酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是富馬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖醛酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是戊二酸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是3-羥基丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是衣康酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乳酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是蘋果酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是草酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是木糖酸。參見例如Chen,R.,和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63—65:435_4480[0404]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是酮?？梢岳斫獾氖切g(shù)語(yǔ)“酮”涵蓋含有一個(gè)或多個(gè)酮部分的物質(zhì)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見例如Qureshi和Blaschek,2003,同上文。[0405]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是醛。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醛是甲醛。[0406]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是氨基酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是天冬氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見例如Richard,A.，和Margaritis,A.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o[0407]在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是氣體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見例如Kataoka,N.、A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41-47;及GunaseelanV.N.,BiomassandBioenergyVol.13(1-2),第83-114頁(yè)，1997，Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。[0408]任選地可以使用任何本領(lǐng)域已知的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基回收一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物，這些方法包括但不限于:層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦、和大小排阻)、電泳程序(例如制備性等電聚焦)、差異溶解度(例如硫酸銨沉淀)、蒸餾、或萃取。例如，從經(jīng)過(guò)發(fā)酵的含纖維素材料通過(guò)常規(guī)蒸餾方法分離乙醇并純化。可以獲得純度最高達(dá)約96vol%的乙醇，它可以用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇即可飲用酒精(Po)，或工業(yè)乙醇。[0409]下面用實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例[0410]材料[0411]用作緩沖劑和底物的化學(xué)品是至少試劑級(jí)的商品。[0412]DNA測(cè)序[0413]DNA測(cè)序使用染料終止物化學(xué)(dyeterminatorchemistry)(Giesecke等，1992，JournalofVirol.Methods38:47-60)用AppliedBiosystemsModel3130XGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)進(jìn)行。序列使用phred/phrap/consed(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)用序列特異性引物進(jìn)行裝配。[0414]培養(yǎng)基[0415]NNCYP培養(yǎng)基的組成為每升5.0gNH4N03>0.5gMgSO4.7Η20、0.3gCaCl2、2.5g檸檬酸、1.0g細(xì)菌用蛋白胨(BactoP印tone)、5.0g酵母提取物、COVE痕量金屬溶液以及足量的K2HPO4使最終pH達(dá)到約5.4。[0416]COVE痕量金屬溶液的組成為每升0.04gNa2B4O7.10H20、0.4gCuS04.5Η20、1.2gFeSO4.7Η20、0.7gMnSO4.H2O,0.8gNa2MoO2.2H20和IOgZnSO4.7H20。[0417]YP培養(yǎng)基的組成為每升IOg酵母提取物和20g細(xì)菌用胰蛋白胨。[0418]纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為每升20g纖維素、IOg玉米浸漿固形物、1.45g(NH4)2SO4'2.08gΚΗ2Ρ04、0.28gCaCl2,0.42gMgSO4.7H20和0.42ml痕量金屬溶液。[0419]痕量金屬溶液的組成為每升216gFeCl3.6H20、58gZnSO4.7H20、27gMnS04.H2O,IOgCuSO4.5Η20、2.4gH3BO3和336g檸檬酸。[0420]STC的組成為IM山梨醇、IOmMCaCl2和IOmMTris-HCl,pH7.5。[0421]COVE平板的組成為每升342g蔗糖、IOmlCOVE鹽溶液、IOmlIM乙酰胺、IOml1.5MCsCl和25g諾布爾瓊脂(Nobleagar)。[0422]COVE鹽溶液的組成為每升26gKCl、26gMgS04、76gKH2PO4和50mlC0VE痕量金屬溶液。[0423]C0VE2平板的組成為每升30g蔗糖、20mlCOVE鹽溶液、25g諾布爾瓊脂和IOmlIM乙酰胺。[0424]PDA平板的組成為每升39克馬鈴薯葡萄糖瓊脂。[0425]LB培養(yǎng)基的組成為每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉。[0426]2XYT-Amp平板的組成為每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉和15g細(xì)菌用瓊脂，然后在高壓滅菌后加入2ml50mg/ml的氨芐青霉素的過(guò)濾除菌溶液。[0427]MDU2BP培養(yǎng)基的組成為每升45g麥芽糖、IgMgSO4.7H20、IgNaCl、2gK2HS04、12gKH2PO4,2g尿素和500μIAMG痕量金屬溶液，將pH調(diào)至5.0并隨后用0.22μm過(guò)濾元件進(jìn)行過(guò)濾除菌。[0428]AMG痕量金屬溶液的組成為每升14.3gZnSO4.7Η20、2.5gCuS04.5Η20、0.5gNiCl2.6Η20、13.8gFeSO4.H20,8.5gMnSO4.7H20和3g檸檬酸。[0429]基本培養(yǎng)基(minimalmedium)平板的組成為每升6gNaN03、0.52KC1、1.52gKH2PO4UmlCOVE痕量金屬溶液、20g諾布爾瓊脂、20ml50%葡萄糖、2.5ml20%MgS04.7H20和20ml生物素貯存溶液。[0430]生物素貯存溶液的組成為每升0.2g生物素。[0431]SOC培養(yǎng)基的組成為2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmMNaCl,2.5mMKClUOmMMgClj-PIOmMMgSO4,高壓滅菌后加入過(guò)濾除菌的葡萄糖至20mM。[0432]實(shí)施例1:pMJ04表達(dá)載體的構(gòu)建[0433]使用如下所示的引物993429(反義)和993428(有義)從里氏木霉RutC30基因組DNAPCR擴(kuò)增了里氏木霉外切纖維二糖水解酶I基因(cbhl，CEL7A)終止子，構(gòu)建了表達(dá)載體PMJ04。經(jīng)過(guò)工程改造，所述反義引物在5’末端具有一個(gè)PacI位點(diǎn)，有義引物在3’末端具有一個(gè)SpeI位點(diǎn)。[0434]引物993429(反義):[0435]5，-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3，(SEQIDNO:29)[0436]引物993428(有義):[0437]5’-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3’(SEQIDNO:30)[0438]用DNEASYΦPlantMaxiKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)分離里氏木霉RutC30基因組DNA。[0439]擴(kuò)增反應(yīng)物(50μI)組成為IXThermoPolReactionBuffer(ThermoPol反映緩沖液)(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)>0.3mMdNTP、IOOng里氏木霉RutC30基因組DNA、0.3μM弓丨物993429,0.3μM弓丨物993428和2單位的VentDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA)。將所述反應(yīng)物在如下編程的EPPEND0RF⑩MASTERCYCLER?5333(EppendorfScientific,Inc.,ffestbury,NY,USA)中溫育:進(jìn)行94°C30秒、50°C30秒、72°C60秒的循環(huán)5次，然后進(jìn)行94°C30秒、65°C30秒、72°C120秒的循環(huán)25次(最終延伸5分鐘)。反應(yīng)產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上用40mMTris堿_20mM乙酸鈉-1mMEDTA二鈉(TAE)緩沖液分離，從凝膠上切下229bp的產(chǎn)物條帶，使用QIAQUICK?GelExtractionKit(QIAQUICK⑩凝膠提取試劑盒)(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)依照制造商的說(shuō)明進(jìn)行純化。[0440]所得的PCR片段用PacI和SpeI消化后,用RapidLigationKit(快速連接試劑盒)(Roche,Indianapolis,IN,USA)連接到經(jīng)相同的限制酶消化的pAlLol(W005/067531)中產(chǎn)生pMJ04(圖1)。[0441]實(shí)施例2:pCaHj568的構(gòu)建[0442]從pCaHjl70(美國(guó)專利5，763，254)和pMT2188出發(fā)構(gòu)建質(zhì)粒pCaHj568。質(zhì)粒pCaHjl70包含特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)全長(zhǎng)編碼區(qū)(SEQIDN0:31，編碼SEQIDNO:32的氨基酸序列)。pMT2188的構(gòu)建最先是用如下所示的引物142779和142780從pCaHj483(W098/00529)PCR擴(kuò)增出pUC19復(fù)制起點(diǎn)。引物142780在PCR片段中引入BbuI位點(diǎn)。[0443]引物142779:[0444]5，-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3，(SEQIDNO:33)[0445]引物142780:[0446]5，-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3，(SEQIDNO:34)[0447]該擴(kuò)增使用EXPANDφPCRSystem(RocheMolecularBiochemicals,Basel,Switzerland)依照制造商的說(shuō)明進(jìn)行。在瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，使用JetquickGelExtractionSpinKit(離心式快速凝膠提取試劑盒)(Genomed,ffielandstr,Germany)分離并純化出一個(gè)1160bp的片段。[0448]使用如下所示的引物140288和142778，利用EXPAND?PCRSystem從通用釀酒酵母克隆載體pYES2(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中擴(kuò)增出URA3基因。引物140288在PCR片段中引入一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。[0449]引物140288:[0450]5’-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3’(SEQIDNO:35)[0451]引物142778:[0452]5’-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3’(SEQIDNO:36)[0453]在瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物,使用JetquickGelExtractionSpinKit(離心式快速凝膠提取試劑盒)分離并純化出一個(gè)U26bp的片段。[0454]通過(guò)混合所述兩個(gè)PCR片段并用如上所示的引物142780和140288依照重疊剪接(overlapsplicing)法(Horton等，1989,Gene77:61-68)進(jìn)行擴(kuò)增,將這兩個(gè)片段融合起來(lái)。在瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物,使用JetquickGelExtractionSpinKit(離心式快速凝膠提取試劑盒)分離并純化出一個(gè)2263bp的片段。[0455]所得的片段用EcoRI和BbuI消化，并使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程連接到用相同的限制酶消化過(guò)的pCaHj483的最大片段中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到依照Mandel和Higa,1970，J.Mol.Biol.45:154的方法制成感受態(tài)的pyrF陰性大腸桿菌菌株DB6507(ATCC35673)中。在每升添加了Ig酪蛋白氨基酸、500μg硫胺素和IOmg卡那霉素的M9培養(yǎng)基(Sambrook等，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress)上選擇轉(zhuǎn)化子。分離了來(lái)自于一個(gè)轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒,命名為pCaHj527(圖2)。[0456]使用EXPAND?PCRSystem并依照制造商的說(shuō)明，通過(guò)PCR對(duì)pCaHj527上存在的NA2-tpi啟動(dòng)子進(jìn)行定點(diǎn)誘變。利用如下所示的誘變引物141223，將核苷酸134-144從GTACTAAAACC(SEQIDNO:37)轉(zhuǎn)變?yōu)镃CGTTAAATTT(SEQIDNO:38)。[0457]引物141223:[0458]5’-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3’(SEQIDNO:39)[0459]利用如下所示的誘變引物141222，將核苷酸423-436從ATGCAATTTAAACT(SEQIDNO:40)轉(zhuǎn)變?yōu)镃GGCAAITTAACGG(SEQIDNO:41)。[0460]引物141222:[0461]5’-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3’(SEQIDNO:42)[0462]所得的質(zhì)粒命名為pMT2188(圖3)。[0463]將特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V編碼區(qū)從pCaHjl70作為BamH1-SalI片段轉(zhuǎn)移到用BamHI和XhoI消化過(guò)的pMT2188中，生成pCaHj568(圖7)。質(zhì)粒pCaHj568包含與特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V全長(zhǎng)編碼序列可操作地連接的突變的NA2-tpi啟動(dòng)子。[0464]實(shí)施例3:pMJ05的構(gòu)建[0465]質(zhì)粒pMJ05的構(gòu)建是通過(guò)使用如下所示的引物HiEGV-F和HiEGV-R從pCaHj568PCR擴(kuò)增出915bp的特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V全長(zhǎng)編碼區(qū)。[0466]引物HiEGV-F(有義):[0467]5，-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3’(SEQIDNO:43)[0468]引物HiEGV-R(反義):【權(quán)利要求】1.提高具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的活性的方法，包括:向含有具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的纖維素分解酶組合物中加入可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的過(guò)程中以0.3mM-5mM的有效濃度存在，與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高；且其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。2.降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的方法，包括:用有效量的纖維素分解酶組合物處理含纖維素材料，所述纖維素分解酶組合物包含有效量的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以0.3mM-5mM的有效濃度存在；且其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。3.權(quán)利要求2的方法，其還包括用有效量的β_葡糖苷酶處理含纖維素材料。4.權(quán)利要求2的方法，其還包括用有效量的一種或多種選自下組的酶處理含纖維素材料:半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、過(guò)氧化物酶或其混合物。5.權(quán)利要求2的方法，其還包括補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的濃度以維持可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的有效濃度為0.3mM-5mM。6.權(quán)利要求2的方法，其還包括回收經(jīng)降解的含纖維素材料。7.產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括:(a)用有效量的包含有效量的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的纖維素分解酶組合物糖化含纖維素材料，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子以0.3mM-5mM的有效濃度存在；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵步驟(a)中經(jīng)糖化的含纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物；且其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。8.權(quán)利要求7的方法，其還包括用有效量的β_葡糖苷酶處理含纖維素材料。9.權(quán)利要求7的方法，其還包括用有效量的一種或多種選自下組的酶處理含纖維素材料:半纖維素酶、酯·酶、蛋白酶、漆酶、過(guò)氧化物酶或其混合物。10.權(quán)利要求7的方法，其還包括補(bǔ)充可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的濃度以維持可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的有效濃度為0.3mM-5mM。11.包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽和可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的纖維素分解酶組合物，其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子在降解或轉(zhuǎn)化含纖維素材料的過(guò)程中以0.3mM-5mM的有效濃度存在,與沒(méi)有可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽相比，可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的存在使纖維素分解酶組合物對(duì)含纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化提高；且其中所述可溶性活化性二價(jià)金屬陽(yáng)離子選自下組:Mn++、Co++、Mg++、Ca++及其組合。【文檔編號(hào)】C12P7/08GK103436509SQ201310336645【公開日】2013年12月11日申請(qǐng)日期:2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日:2007年5月31日【發(fā)明者】基思.麥克法蘭,保羅.哈里斯申請(qǐng)人:諾維信股份有限公司