一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)及其在異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)及其在異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)包括食品級宿主干酪乳桿菌Q-5CGMCC7936和食品級表面展示載體pQJ5；同時(shí)提供了利用上述干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其異源蛋白表達(dá)的方法，即采用融合基因取代載體上的基因，轉(zhuǎn)入宿主中并檢測其在宿主細(xì)胞表面的表達(dá)情況。本發(fā)明的食品級表面展示系統(tǒng)，同時(shí)具備食品級的宿主和食品級的載體，且宿主和載體具有可以完成互補(bǔ)篩選的食品級標(biāo)記，因其不含抗生素抗性篩選標(biāo)記，故不存在潛在的生物可轉(zhuǎn)移性危害。同時(shí)通過構(gòu)建的宿主和載體，配合融合基因，實(shí)現(xiàn)了異源蛋白的表達(dá)。
【專利說明】一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)及其在異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)及其在異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。
[0003]【背景技術(shù)】
據(jù)估算，地球上每年有大約1500萬人死于傳染性疾病，大約占到總死亡人數(shù)5700萬的25%。疫苗接種是人類對抗細(xì)菌、病毒、寄生蟲等感染性疾病的有效手段，一直是人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)之一?；蚬こ梯d體疫苗，指利用非致病微生物作為載體，將病菌的保護(hù)性抗原基因片段重組到載體微生物中，用表達(dá)保護(hù)性抗原的微生物作為疫苗。痘苗病毒、腺病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等是常用的病毒載體，沙門氏菌和卡介苗則是常用的細(xì)菌載體。這些疫苗載體的共同特點(diǎn)是，它們多為致病菌的減毒苗，可能存在潛在的危害性。如能利用非致病菌尤其是益生菌作為疫苗載體，將大大提高疫苗的安全性。
[0004]乳桿菌(Lactobacilli)是乳酸菌中最大的一個(gè)屬，長期以來一直被應(yīng)用于食品發(fā)酵和保存中(酸奶中含有多種乳桿菌)，被公認(rèn)為“安全級”(generally recognized assafe,GRAS)微生物，因此用乳桿菌作為載體傳遞抗原進(jìn)行免疫有著誘人的前景。這些菌株經(jīng)過分子遺傳修飾，帶有目的病原的抗原成分，口服或注射后，可以產(chǎn)生特異的局部或全身免疫反應(yīng)。而乳桿菌自身的一些特點(diǎn)，如:在腸道吸附定植的能力；對胃酸、膽汁的耐受性；產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的特性等，更使其成為基因工程載體疫苗的最佳選擇。
[0005]干酪乳桿菌是一種在食品和醫(yī)療領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景的食品級微生物。近年來，干酪乳桿菌的基因克隆和 表達(dá)系統(tǒng)引起了人們的廣泛關(guān)注，其中很重要的一個(gè)研究方向就是利用干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行基因工程疫苗的構(gòu)建。國內(nèi)外利用干酪乳桿菌構(gòu)建了能引起機(jī)體免疫應(yīng)答的多株基因工程疫苗，但大多利用抗生素標(biāo)記基因如氯霉素抗性基因和紅霉素抗性基因作為整個(gè)系統(tǒng)的篩選標(biāo)記，這些標(biāo)記基因的生物可轉(zhuǎn)移性可能危害人類健康，從而限制了這一類干酪乳桿菌基因工程疫苗在食品和醫(yī)藥等工業(yè)的應(yīng)用。
[0006]要想構(gòu)建完全食品級的基因工程疫苗，必需同時(shí)具備食品級的宿主和食品級的載體，而且宿主和載體必需具有可以完成互補(bǔ)篩選的食品級標(biāo)記。目前，這方面的研究主要集中在乳酸乳球菌上，對于干酪乳桿菌的研究較少。
[0007]經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利文獻(xiàn)號200910192146.X，公告日2010-02-24，公開了一種乳酸菌食品級表達(dá)載體pMG36N，該乳酸菌食品級表達(dá)載體以天然食品防腐劑乳鏈菌肽Nisin抗性基因nisi作為選擇標(biāo)記。
[0008]中國專利文獻(xiàn)號CN200410093875.7，授權(quán)公告日2007_11_21，公開了一種乳酸乳球菌的食品級載體，該載體以胸苷酸合成酶基因thyA為選擇標(biāo)記，且使用宿主為乳酸乳球菌。
[0009]中國專利文獻(xiàn)號CN200610154649.4，授權(quán)公告日2010-09-08，公開了兩種乳酸乳球菌食品級載體PNIl和pNI2，這兩個(gè)載體分別利用乳酸鏈球菌素(Nisin)免疫基因和抗性基因?yàn)檫x擇標(biāo)記，且使用宿主為乳酸乳球菌。
[0010]中國專利文獻(xiàn)號CN200710175269.3，授權(quán)公告日2010-09-08，公開了一種乳酸乳球菌食品級分泌表達(dá)載體，該載體以胸苷酸合成酶基因thyA為選擇標(biāo)記，且使用宿主為乳酸乳球菌。
[0011]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于解決上述已有技術(shù)存在的不足，提供一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)并利用該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)異源蛋白的成功表達(dá)，本系統(tǒng)中所有DNA元件來自于公認(rèn)安全的微生物，不含抗生素抗性篩選標(biāo)記。
[0013]本發(fā)明的一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)，特殊之處在于包括食品級宿主干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) Q-5和食品級表面展示載體pQJ5。
[0014]所述干酪乳桿菌Lactobacillus casei于2013年7月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所)，保藏號為CGMCC 7936。
[0015]所述食品級宿主干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936是對干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei) ATCC 334進(jìn)行質(zhì)粒消除并篩選而獲得，喪失了代謝乳糖的能力。
[0016]所述質(zhì)粒消除是包括亞致死高溫誘導(dǎo)的質(zhì)粒消除或新霉素誘導(dǎo)的質(zhì)粒消除。
[0017]所述食品級表面展示載體pQJ5，其堿基序列如序列表所示。
[0018]所述食品級表面展示載體pQJ5是通過如下方案獲得:
在乳酸菌表達(dá)載體PNZ2102的基礎(chǔ)上保留來源于乳酸鏈球菌的pSH71復(fù)制子和PlacA啟動(dòng)子，敲除編碼氯霉素抗性基因的堿基序列，插入來源于干酪乳桿菌ATCC 334的乳糖代謝基因IacEUacG和lacF，插入來自于嗜酸乳桿菌CICC 6075的S-層蛋白基因slpA及其啟動(dòng)子和信號肽。
[0019]所述干酪乳桿菌ATCC 334的乳糖代謝基因IacEUacG和IacF是食品級表面展示載體PQJ5與食品級宿主干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936完成互補(bǔ)篩選的食品級標(biāo)記。
[0020]所述嗜酸乳桿菌CICC 6075的S-層蛋白基因slpA及其啟動(dòng)子和信號肽序列是用于實(shí)現(xiàn)異源蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)的DNA兀件。
[0021]本發(fā)明同時(shí)提供了利用上述干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其異源蛋白表達(dá)的方法，通過如下方案實(shí)現(xiàn):
采用重組PCR方法構(gòu)建報(bào)告基因綠色熒光蛋白基因gfp和S-層蛋白基因slpA的融合基因slpA-gfp，并用該融合基因取代載體pQJ5上的slpA，采用電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的載體PQJ5質(zhì)粒轉(zhuǎn)入干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936中，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡法檢測綠色熒光蛋白在干酪乳桿菌細(xì)胞表面的表達(dá)。
[0022]本發(fā)明一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)，同時(shí)具備食品級的宿主和食品級的載體，且宿主和載體具有可以完成互補(bǔ)篩選的食品級標(biāo)記，因其不含抗生素抗性篩選標(biāo)記，故不存在潛在的生物可轉(zhuǎn)移性危害。同時(shí)通過構(gòu)建的宿主和載體，配合融合基因，實(shí)現(xiàn)了異源蛋白的表達(dá)。[0023]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]食品級宿主干酪乳桿菌Q-5于2013年7月17日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC 7936。
[0025]圖1:本發(fā)明的食品級宿主菌株干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936與出發(fā)菌株干酪乳桿菌ATCC 334代謝乳糖能力的比較結(jié)果；
圖2:本發(fā)明的食品級表面展示載體pQJ5的構(gòu)建流程圖；
圖3:利用本發(fā)明的食品級表面展示系統(tǒng)表達(dá)綠色熒光蛋白的效果圖4和0是攜帶重組質(zhì)粒pQJ5_gfp的干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936 ；B是攜帶攜帶pQJ5的干酪乳桿菌Q-5CGMCC7936 ；C 為干酪乳桿菌 ATCC 334。
[0026]
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下參照附圖，給出本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，用來對本發(fā)明的構(gòu)成進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0028]實(shí)施例1
1、本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用和涉及到的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒:
①干酪乳桿菌(Lactobacil`luscasei) ATCC 334 (含有一個(gè)約29 kb的內(nèi)源性質(zhì)粒，能利用乳糖且其乳糖代謝基因IacEUacG和IacF位于該內(nèi)源性質(zhì)粒上，購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心ATCC )
②干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)Q-5 CGMCC7936 (干酪乳桿菌ATCC 334的質(zhì)粒消除衍生物，喪失了乳糖利用能力，本發(fā)明的食品級宿主)
③嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)CICC 6075 (S-層蛋白基因及其啟動(dòng)子和信號肽的供體菌株，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心CICC)
④大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5 α (屬于公知技術(shù))
⑤pNZ2102(pSH71復(fù)制子和PlacA啟動(dòng)子的供體質(zhì)粒，氯霉素抗性，Platteeuw etal., 1996.Appl Environ Microbiol 62:1008 - 1013)
⑥pBAD-GFPuv(綠色突光蛋白基因的供體質(zhì)粒,氨卞抗性,Fisher and Mintz, 2000.J Ind Microbiol Biotechnol 24:323 - 326)
⑦PQJ5(食品級表面展示載體，以乳糖代謝基因?yàn)楹Y選標(biāo)記基因，利用S-層蛋白基因啟動(dòng)子和信號肽實(shí)現(xiàn)異源蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)，本發(fā)明的食品級載體，其堿基序列如序列表所示)
⑧pQJ5-gfp(pQJ5上表達(dá)綠色熒光蛋白基因，本發(fā)明的表達(dá)異源蛋白的質(zhì)粒)
2、食品級宿主干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei) Q-5的構(gòu)建 ①干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) ATCC 334的質(zhì)粒消除
采用亞致死高溫誘導(dǎo)的質(zhì)粒消除法或新霉素誘導(dǎo)的質(zhì)粒消除法完成干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) ATCC 334 的質(zhì)粒消除工作。
[0029]亞致死高溫誘導(dǎo)的質(zhì)粒消除是指:將干酪乳桿菌ATCC 334的單菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度40~45°C，培養(yǎng)時(shí)間24~72小時(shí)，然后取菌懸液按1%~10%的接種量接種到新鮮MRS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24~72小時(shí)，按此方法傳代8次后，用接種環(huán)取少量菌液在含15~20克/升瓊脂的MRS固體培養(yǎng)基上劃出單菌落，利用PCR法篩選出質(zhì)粒消除的菌株，并驗(yàn)證所得菌株代謝乳糖的能力。
[0030]新霉素誘導(dǎo)的質(zhì)粒消除是指:將干酪乳桿菌ATCC 334的單菌落接種到含新霉素10微克/毫升的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間24~72小時(shí)，然后取菌懸液按1%~10%的接種量接種到新鮮MRS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24~72小時(shí)，按此方法傳代8次后，用接種環(huán)取少量菌液在含15~20克/升瓊脂的MRS固體培養(yǎng)基上劃出單菌落，利用PCR法篩選出質(zhì)粒消除的菌株，并驗(yàn)證所得菌株代謝乳糖的能力。
[0031]②質(zhì)粒消除菌株的PCR篩選
根據(jù)NCBI上已經(jīng)公布的干酪乳桿菌ATCC 334的內(nèi)源性質(zhì)粒的DNA序列信息(http:// www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/NC_008502.1 )，設(shè)計(jì)兩對特異性引物，序列如下: yzl:5’ -TTTCCTGCGGTGTCG-3’ yz2:5’ -TTCGCCTTTGTTCTACTG-3’ yz3:5’ -TGCCATCTGGGAGTTT-3’ yz4:5’ -GGCTTATGCGAAGTTTT-3’
若質(zhì)粒未消除，以yzl和yz2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增可獲得1440bp片段。
[0032]若質(zhì)粒未消除，以yz3和yz4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增可獲得602bp片段。
[0033]若質(zhì)粒已消除，兩對引物均不能擴(kuò)增出特異性條帶。
[0034]經(jīng)PCR篩選獲得一株利用兩對引物均不能獲得特異性條帶的干酪乳桿菌Q-5CGMCC7936，其可能為質(zhì)粒消`除的菌株。
[0035]③質(zhì)粒消除菌株代謝乳糖能力的鑒定
在LMRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述獲得的可能的質(zhì)粒消除菌株Q-5 CGMCC7936和出發(fā)菌株干酪乳桿菌ATCC 334，48~72小時(shí)后檢測菌懸液的光密度、培養(yǎng)液中乳糖的消耗量以及L-乳酸的生產(chǎn)量。
[0036]LMRS培養(yǎng)基每升中含有:乳糖20克，酵母粉5克，胰蛋白胨10克，牛肉浸粉10克，檸檬酸三銨2克，乙酸鈉5克，磷酸氫二鉀2克，七水硫酸鎂0.2克，一水硫酸錳0.05克，余量為水，pH為6~7。
[0037]其中，光密度的檢測方法為:將菌懸液稀釋后利用分光光度計(jì)檢測，檢測波長為600nm。
[0038]乳糖的檢測方法為:利用愛爾蘭Megazyme公司的Sucrose/Lactose/D-GlucoseKit K-LACSU 01/12試劑盒進(jìn)行檢測。
[0039]L-乳酸的檢測方法為:利用愛爾蘭Megazyme公司的L-lactic acid Kit K-LATE07/11試劑盒進(jìn)行檢測。
[0040]兩株菌株代謝乳糖能力的具體比較結(jié)果見附圖1，菌株Q-5 CGMCC7936基本喪失了利用乳糖的能力，是干酪乳桿菌ATCC 334的質(zhì)粒消除衍生物。將該菌株實(shí)驗(yàn)室命名為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei )Q_5,并于2013年07月17日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC 7936。[0041]3、食品級表面展示載體pQJ5的構(gòu)建 ①乳糖代謝基因的克隆
根據(jù)干酪乳桿菌ATCC 334的內(nèi)源性質(zhì)粒上的乳糖代謝基因序列，設(shè)計(jì)一對引物L(fēng)9和L8，具體序列如下:
L9:5’ -GCGCTGCAGACGCTTATGCTTTGGCTTCC-3’
L8:5’ -GCGCTCGAGTTACTGCTTGTTCTCAAGTT-3>
其中L9上劃線部分為PstI酶切位點(diǎn)，L8上劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn)。
[0042]以干酪乳桿菌ATCC 334的全基因組為模板，利用引物L(fēng)9和L8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測序驗(yàn)證，獲得約3.6 kb基因片段，該基因片段包含了乳糖代謝的三個(gè)關(guān)鍵基因lacE、IacG和lacF，其序列同NCBI上公布的干酪乳桿菌ATCC 334內(nèi)源性質(zhì)粒上的乳糖代謝基因具有100%的一致性。
[0043]利用PstI和XhoI對該片段進(jìn)行雙酶切后，連接到同樣利用PstI和XhoI雙酶切的質(zhì)粒PNZ2102上，后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，再涂布到含氯霉素20微克/毫升的LB固體培養(yǎng)基上，得到單菌落后，利用引物L(fēng)9和L8進(jìn)行菌落PCR篩選，對其中的陽性轉(zhuǎn)化子在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時(shí)后，提取質(zhì)粒，并利用PstI和XhoI雙酶切驗(yàn)證，最終成功獲得重組質(zhì)粒 pNZ2102-lacEGF。
[0044]LB培養(yǎng)基每升中含有:酵母粉5克，胰蛋白胨10克，氯化鈉10克，瓊脂粉17克(只在配制固體培養(yǎng)基時(shí)添加)，余量為水，pH為6.5~7。
[0045]②S-層蛋白基因及其啟動(dòng)子和信號肽的克隆 根據(jù)已公布的嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)的S-層蛋白基因及其啟動(dòng)子和信號肽序列，設(shè)計(jì)一對引物P5和P6，具體序列如下:
P5:5， - CGCAGATCTGGGATGAAATAAAGCCAATA-3?
P6:5’ - CGCGAATTCTCTAAAGTTTGCAACCTTA-3，
其中P5上劃線部分為BglII酶切位點(diǎn)，P6上劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)。
[0046]以嗜酸乳桿菌CICC 6075的全基因組為模板，利用引物P5和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測序驗(yàn)證，獲得約1.8 kb基因片段，該基因片段包含了 S-層蛋白基因及其啟動(dòng)子和信號肽序列，其序列同已經(jīng)公布基因組的嗜酸乳桿菌NCFM的S-層蛋白基因及其啟動(dòng)子和信號肽序列具有99%的一致性。
[0047]③S-層蛋白基因及其啟動(dòng)子和信號肽取代氯霉素抗性基因
根據(jù)重組質(zhì)粒pNZ2102-lacEGF的序列，設(shè)計(jì)一對引物Cl和C2，用于擴(kuò)增該質(zhì)粒中除了氯霉素抗性基因以外的全部序列，引物具體序列如下:
Cl:5’ -gatctcagaattcgagct-3，
C2:5’ -gcgagatctCAATAATCCCTCCTCT-3，
其中Cl上劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)，C2上劃線部分為BglII酶切位點(diǎn)。
[0048]以質(zhì)粒pNZ2102_lacEGF為模板，利用引物Cl和C2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測序驗(yàn)證，獲得約5.8 kb基因片段，該基因片段包含了 pNZ2102-lacEGF上除了氯霉素抗性基因以外的全部序列。
[0049]利用EcoRI和BglII雙酶切上述獲得的5.8 kb基因片段，同樣利用EcoRI和BglII雙酶切上述獲得的1.8 kb S-層蛋白基因及其啟動(dòng)子和信號肽序列，利用T4 DNA連接酶連接兩個(gè)DNA片段，連接產(chǎn)物經(jīng)純化后電轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936感受態(tài)細(xì)胞中，電擊電壓為900伏/毫米，電擊后的菌液在含10%蔗糖的MRS培養(yǎng)基中復(fù)蘇3小時(shí)候后涂布到以乳糖為唯一碳源的LMRS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48~72小時(shí)后得到單菌落，利用引物P5和P6進(jìn)行菌落PCR篩選，對其中的陽性轉(zhuǎn)化子在LMRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36~48小時(shí)后，提取質(zhì)粒，利用EcoRI和BglII雙酶切驗(yàn)證。最終成功獲得不含任何抗生素標(biāo)記的食品級表面展示載體，實(shí)驗(yàn)室命名為PQJ-5，其序列如SEQ ID NO:1所示。[0050]MRS培養(yǎng)基每升中含有:葡萄糖20克，酵母粉5克，胰蛋白胨10克，牛肉浸粉10克，檸檬酸三銨2克，乙酸鈉5克，磷酸氫二鉀2克，七水硫酸鎂0.2克，一水硫酸錳0.05克，余量為水，pH為6~7。
[0051]LMRS培養(yǎng)基每升中含有:乳糖20克，酵母粉5克，胰蛋白胨10克，牛肉浸粉10克，檸檬酸三銨2克，乙酸鈉5克，磷酸氫二鉀2克，七水硫酸鎂0.2克，一水硫酸錳0.05克，瓊脂粉17克(只在配制固體培養(yǎng)基時(shí)添加)，余量為水，pH為6~7。
[0052]食品級表面展示載體pQJ5的具體構(gòu)建流程可參考附圖2。
[0053]4、利用本發(fā)明所構(gòu)建的食品級表面展示系統(tǒng)異源表達(dá)綠色熒光蛋白
設(shè)計(jì)兩對引物利用重組PCR方法構(gòu)建S-層蛋白基因和綠色熒光蛋白基因的融合基因，引物序列如下:
Pl:5’ -TGCAGATCTGGGATGAAATAAAGCCAATA-3>
P2:5’ -CCTTTACTCATTCTAAAGTTTGCAACCTTA-3’
P3:5， -CAAACTTTAGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTT-3，
P4:5’ -CGCGAATTCTTATTTGTATAGTTCATCCAT-3>
其中Pl上劃線部分為BglII酶切位點(diǎn)，P4上劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)，P2和P3上部分序列是互補(bǔ)序列。
[0054]以質(zhì)粒pQJ5為模板，利用引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以質(zhì)粒pBAD_GFPuv為模板，利用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將兩次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物混合后取微量作為重組PCR的模板，以引物Pl和P4進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約2.6 kb基因片段，經(jīng)測序驗(yàn)證，S-層蛋白基因和綠色熒光蛋白基因成功融合到一起，命名為slpA-gfp。
[0055]利用EcoRI和BglII雙酶切slpA-gfp,同樣利用EcoRI和BglII雙酶切載體pQJ5去除其中的slpA基因，利用T4 DNA連接酶連接兩個(gè)DNA片段，連接產(chǎn)物經(jīng)純化后電轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936感受態(tài)細(xì)胞中，電擊電壓為900伏/毫米，電擊后的菌液在含10%蔗糖的MRS培養(yǎng)基中復(fù)蘇3小時(shí)候后涂布到以乳糖為唯一碳源的LMRS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48~72小時(shí)后得到單菌落，利用引物Pl和P4進(jìn)行菌落PCR篩選，對其中的陽性轉(zhuǎn)化子在LMRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36~48小時(shí)后，提取質(zhì)粒，利用EcoRI和BglII雙酶切驗(yàn)證，最終成功構(gòu)建干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936/pQJ5-gfp。
[0056]在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936/pQJ5_gfp 24~48小時(shí)，離心收集細(xì)胞并用0.85%的生理鹽水洗滌菌體，利用激光掃描共聚焦顯微鏡(德國萊卡)檢測干酪乳桿菌細(xì)胞表面綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，具體結(jié)果可見附圖3。
[0057]序列表 〈110〉濱州醫(yī)學(xué)院
〈120〉一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)及其在異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用〈160〉 I
〈210〉 I
<211>7695
<212>DNA
〈213〉干酷乳桿菌 ILactobaciIIus casei)
〈221〉食品級表面展示載體pQJ5 <400>1
gaattcgagctcggtacccctttctttcataaagtaatttttttccaaagataattctcttttaattgtatcataaaagataatattttcaaggtaaaacaaacaatttcaaacaaaaacaaacgttagatgatgaaataagaacagaggattgacgtatattagcttaggtcagattttgtataagacgaaaataaagtaggacctcttaatcagtaagttatagaaagtaaaagacttttgtaatacctgaatagatatttcacgtccattttgtgatggattaaatgaacaaaaatgaacaataatttaacggtgttatctattttttaaaaaaacaaataaaaaaaaacaaaaaattaacaaaaatagttgcgttttgtttgaatgtttgatatcatataaacaaagaaatgatgaaaacgttatcttgaacattttgcaaaatattttctacttctacgtagcatttctttttaaaatttaggaggtagtccaaatggctattgttgttggtgcagatcctctagagtcgacctgcagacgcttatgctttggcttccaagcgctcaggaggaaaagactcatgaataaggtttttgataaattaaaaccaatttttgaagccatcgctgctaacaaatatatttccgcgattcgtgatggctttatcgcatgtatgccgatcatcatcttctcaagtatctttatgatggttgcttatgttccgaacgcttgggggttttactggccagacaacgtaacgaatacgttgatggttgcttataaatattccatgggcttgctggcactgtttgtggcgggaacgactgctaaaaacttgactgacagcaagaaccttgaattaccgaaaacaaatcaaattaatccagtggccgtcattgtggcgtctgaaatttcttttgtcattttgtcgatcttgccgcttaaaaccggtgttgacctgacttacatggggactcagggattgatctgcgcttatatcgttgggttgatcgtgccaaatatttactacgtctgtattaagaacaatgtcacgattaaattaccagcgcaggtaccaggtaatatcgcccagtcatttaaagaccttatcccgatgggcctttctgtgacagccttctggcttttcggtgttggcttcaaagcggcaacgggtactgtattgccacgctggatcattcaagtactttcgccgcttttccaagccagcgattcttatctaggcttagccctgattgctggcgcgatggctttcttctggttctgtggtgtccaaggcccatcaattgttcagccggctgt`tgtcccgattatgattgcgaatacagcagctaacttgcagcaatatcaggcagggcaacatgtctcgcacgttttggccatgaacacgatggactacgtcatgaattttggtggaaccggagcaacattggtggtacctttcatcatgctgtttgcggcccgatcagcgcaattaaaagccgttggtaaggtttcctttgtgccatgcactttcggggtcaatgaacctgttttgtttggaatgccgattatcatgaatcccattttcttcattccgttcttagcaaccccgatcgtgaacgtttgcttattcaaattctttgtgagtgtacttggcatgaacagtatgatgtacaccatgccatggacagttccgggaccgattgggattttgatttcgactgggtttgccccgttggctttcgcctttgttctactgacgttggttctggacgttgcgatatacttcccattcattcgcgtttatgacagcacactcttagctgaagaaaaagctaaggaagaggtcattgaagacgacggcatggctgttcaggcgagtgacacagtgtcaccttctatcccgactggtttgactgttgcgactgccacagacgacgatgcgacccatgtgttgcctgaaacagccccatctgcccacggcgaagcctatttcaaacaaaatgaagttaatgttttagtgttgtgtgctggtggtggaacaagcggtattcttgccaacgcgctaaacaaactgtctaaggaacgcggtttaaagctctcggccgccgcccgcgcttatggacaggatatggatttgatcaaagatatgaacatggtcatccttgcgccgcaaatggaaagcatgaaaggtaatttaaaaaagatcaccgataagtatggcgtcaagctggtcacaacaactggtcggcaatacattgaattaaccaacaatggtgacaaggcacttgattttgttgaatccaatctttgagacacttaacaggaggttattaagcaatgagtaaacagctacctcaagattttgtaatgggcggggcaaccgccgcgtatcaagtcgaaggagccaccaaggaagacggtaaaggtcgcgtgctttgggacgattttctggataaacaggggcggttcaagcccgacccggcagcggatttttatcatcgttatgatgaagatttggcattagcggaaaaatacggccatcaagtgattcgggtgtcaattgcctggtcgcgaatttttccggatggtgccggggaagttgagccacgcggggttgctttttaccacaagctcttcgcggattgtgccgcccatcatatcgaaccgtttgttacgctacatcattttgatacgcccgaacgcttgcacgaagccggtgattggttgagtcaagagatgttggacgactttgtggcttatgcgaagttttgctttgaagaattttccgaagtgaagtattggatcaccattaatgaaccgacctcaatggccgttcaacaatatacaagcgggacattcccgcctgccgagtctggacgttttgataagacgttccaagctgaacacaatcaaatggtggcgcatgcccgtatcgttaatctatataagtcaatgcaattaggtggccaaattggaattgttcatgcgttgcaaactgtttatccctacagtgatagcgctgtggatcaccatgccgccgagttgcaggacgctttggaaaatcgattgtatctggatggcacattagctggcgaatatcaccaagaaactttggcgctcgtgaaggaaattctggatgccaatcatcaaccgatgtttcaatcgacaccgcaggaaatgaaggctattgatgaagcggcccatcagttagactttgttggggtcaataattatttcagcaagtggttgcgtgcctatcatggcaaatcagagaccatteataatggcgacggcaccaaaggctcttcggtcgcgcggctgcaaggcgttggcgaggaaaaactcccagatggcattgagacgacagattgggattggtcgatttatccacgaggaatgtatgacatactgatgcggattcataatgactatccgttggtgccagtgacctacgtgacagaaaatggtattggtcttaaagaaagcttgccagaaaatgcgacccctgacaccgtgattgaagatccaaaacggattgattatgtaaagaaatatctgtccgcaatggctgatgctatccatgatggcgcaaatgtcaaaggttacttcatctggtcacttcaagatcagttttcttggacaaacggttacagtaaacgatatggtctgttcttcgttgattttccaacacaaaatcgttatatcaaacaaagtgccgagtggtttaagtctgtgagtgagacccacatcattccggattaaaaagtttttggctatttagacagcaaggattgaatcggagggaaatgatggctactaaagaagaaatttcaatggttggttttgcacttgtggcgtatgcaggcgatgctcgaacggctgctgtgcatgcacttgatgccgctgaagcaggcgatttcgataaggcaaacgaattggttgagaaggcccaacaggatatcaatgaagcccacaaccaacagacccagcttctaagtcaagaagctggcggtgctgaaatggatgtcacctttatcatggttcatggtcaagatacgttgatgacaaccatgttgctcattgatgaaacacgctacatgattcgcatgtttaagcggatcaaagaacttgagaacaagcagtaactcgagtgcatattttcggcaatcttctcaatgagatgctcttcagcatgttcaatgatgtcgattttttattaaaacgtctcaaaatcgtttctgagacgttttagcgtttatttcgtttagttatcggcataatcgttaaaacaggcgttatcgtagcgtaaaagcccttgagcgtagcgtgctttgcagcgaagatgttgtctgttagattatgaaagccgatgactgaatgaaataataagcgcagcg 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【權(quán)利要求】
1.一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)，其特征在于包括食品級宿主干酪乳桿菌Q-5CGMCC7936和食品級表面展示載體pQJ5。
2.如權(quán)利要求1所述的一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)，其特征在于所述食品級宿主干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936是對干酪乳桿菌(LactobaciIIus casei)ATCC 334進(jìn)行質(zhì)粒消除并篩選而獲得，喪失了代謝乳糖的能力。
3.如權(quán)利要求2所述的一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)，其特征在于所述質(zhì)粒消除是亞致死高溫誘導(dǎo)的質(zhì)粒消除或新霉素誘導(dǎo)的質(zhì)粒消除。
4.如權(quán)利要求1所述的一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)，其特征在于所述食品級表面展不載體PQJ5，其喊基序列如序列表所不。
5.如權(quán)利要求1所述的一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)，其特征在于所述食品級表面展示載體PQJ5是通過如下方案獲得: 在乳酸菌表達(dá)載體PNZ2102的基礎(chǔ)上保留來源于乳酸鏈球菌的pSH71復(fù)制子和PlacA啟動(dòng)子，敲除編碼氯霉素抗性基因的堿基序列，插入來源于干酪乳桿菌ATCC 334的乳糖代謝基因IacEUacG和lacF，插入來自于嗜酸乳桿菌CICC 6075的S-層蛋白基因slpA及其啟動(dòng)子和信號肽。
6.如權(quán)利要求5所述的一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)，其特征在于所述干酪乳桿菌ATCC 334的乳糖代謝基因lacE、IacG和IacF是食品級表面展示載體pQJ5與食品級宿主干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936完成互補(bǔ)篩選的食品級標(biāo)記。
7.如權(quán)利要求5所述的一套干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)，其特征在于所述嗜酸乳桿菌CICC 6075的S-層蛋白基因SlpA及其啟動(dòng)子和信號肽序列是用于實(shí)現(xiàn)異源蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)的DNA元件。
8.本發(fā)明同時(shí)提供了利用上述干酪乳桿菌食品級表面展示系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其異源蛋白表達(dá)的方法，其特征在于通過如下方案實(shí)現(xiàn): 采用重組PCR方法構(gòu)建報(bào)告基因綠色熒光蛋白基因gfp和S-層蛋白基因slpA的融合基因slpA-gfp，并用該融合基因取代載體pQJ5上的slpA，采用電轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的載體PQJ5質(zhì)粒轉(zhuǎn)入干酪乳桿菌Q-5 CGMCC7936中，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡法檢測綠色熒光蛋白在干酪乳桿菌細(xì)胞表面的表達(dá)。
【文檔編號】C12N15/62GK103484415SQ201310315901
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】秦加陽, 王秀文, 許平 申請人:濱州醫(yī)學(xué)院