Irtks基因剔除的小鼠模型及其構建方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種IRTKS基因剔除的小鼠模型的構建方法，該方法通過同源重組，用2.0-kb PGK/Neo序列取代小鼠IRTKS基因中含有ATG起始密碼子的exon1序列，得到IRTKS基因剔除的小鼠模型。本發(fā)明還公開了利用上述方法構建的IRTKS基因剔除的小鼠模型及其在糖尿病研究中的應用。通過病理分析及糖、胰島素等檢測證實IRTKS基因剔除后的小鼠會出現(xiàn)高血糖、高胰島素、糖耐量降低、胰島素敏感性降低等，與人類的發(fā)病特征相符，從而為糖尿病發(fā)病機制的研究以及治療藥物的評價和篩選提供了良好的動物模型。
【專利說明】IRTKS基因剔除的小鼠模型及其構建方法與應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】中的動物模型，更具體地說，是涉及一種IRTKS基因剔 除的小鼠模型、其構建方法，及其在糖尿病研究中的應用。

【背景技術】
[0002] 在中華醫(yī)學會糖尿病學分會組織下，2007年6月至2008年5月對全國14個省市 進行了糖尿病的流行病學調(diào)查，結果顯示我國20歲以上的成年人糖尿病患病率為9. 7%，男 性高于女性，并且隨著年齡的增長，發(fā)病率逐漸增加（20歲?39歲、40歲?59歲、大于或等 于60歲人群的發(fā)病率分別為3. 2%、11. 5%、20. 4%)，而其中城市居民的發(fā)病率要商于農(nóng)村居 民(分別為11. 4%和8. 2%)，說明伴隨城市化而來的運動減少、不健康飲食、肥胖等生活方式 的改變對糖尿病的發(fā)生發(fā)展是一個比較重要的因素。值得注意的是，流行病學研究發(fā)現(xiàn)，糖 尿病患者惡性腫瘤的發(fā)生率呈上升趨勢。來自日本和韓國的流行病學研究報道顯示，糖尿 病患者的胃癌發(fā)生率和死亡率明顯高于非糖尿病患者。
[0003] 為了深入探索糖尿病的發(fā)病機制，相關的動物模型是一個很可靠的研究工具。早 期，研究人員通過物理、生物、化學等致病因素人工誘發(fā)具有糖尿病特征的實驗動物模型； 自發(fā)性遺傳性糖尿病模型由于沒有人為干預因素，更能模擬人類糖尿病發(fā)病機制，其應用 于糖尿病發(fā)病機制及并發(fā)癥方面的科研價值較大，較常見的有Ob/ob、db/db小鼠等，分別 是由于瘦素基因或瘦素基因受體的突變導致的肥胖伴隨嚴重的胰島素抵抗，但這些動物模 型的局限在于它所基于的基因突變遺傳背景在人類患者中并不常見。近年來，隨著研究人 員對糖尿病的發(fā)病機制了解的深入，和轉基因動物模型技術的日趨成熟，基于疾病相關關 鍵信號通路的轉基因或基因剔除動物模型在糖尿病的研究中應用逐漸增多。另一方面，由 于糖尿病是一組由多種遺傳背景和環(huán)境因素相互作用而引發(fā)的臨床綜合征，目前雖然開發(fā) 的糖尿病動物模型很多，但與人類糖尿病仍有偏差，至今尚無與人類糖尿病完全吻合的動 物模型?；谔悄虿“l(fā)病機制的研究新進展，開發(fā)獲得較好模擬人類糖尿病的動物模型仍 然是我們探索糖尿病、胰島素抵抗的有效工具和研究必需。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一種IRTKS基因剔除的小鼠模型的構建方 法，它可以為糖尿病的研究及分子發(fā)病機制的探討提供研究模型。
[0005] 為解決上述技術問題，本發(fā)明的IRTKS基因剔除的小鼠模型的構建方法，通過同 源重組，用2. 0-kb PGK/Neo序列取代小鼠 IRTKS基因中含有ATG起始密碼子的exonl序列， 得到IRTKS基因剔除的小鼠模型。
[0006] 較佳的，可以按照如下具體步驟構建IRTKS基因剔除的小鼠模型：
[0007] 1)構建 IRTKS-K0 質(zhì)粒；
[0008] 2) ES細胞打靶并篩選陽性ES克??；
[0009] 3)將陽性ES克隆注射入小鼠囊胚，得到嵌合小鼠；
[0010] 4)將嵌合小鼠與雌性小鼠雜交，獲得IRTKS基因剔除的小鼠模型。
[0011] 本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供利用上述方法構建的IRTKS基因剔除的小 鼠模型。
[0012] 本發(fā)明要解決的技術問題之三是提供利用上述方法構建的IRTKS基因剔除的小 鼠模型在糖尿病發(fā)病機制的研究、診斷和治療以及糖尿病治療藥物的評價和篩選中的應 用。
[0013] 本發(fā)明通過同源重組的方法，用2. 0-kb PGK/Neo序列取代IRTKS中含有ATG起始 密碼子的exonl序列，構建了可靠的IRTKS基因剔除的小鼠模型。通過對IRTKS基因剔除 的小鼠模型的血糖、血清胰島素、葡萄糖耐糖量、胰島素耐量等的檢測分析，發(fā)現(xiàn)IRTKS基 因剔除的小鼠會出現(xiàn)高血糖、高胰島素、葡萄糖耐量降低、胰島素敏感性降低，與人類的發(fā) 病特征相符，從而為糖尿病發(fā)病機制的研究以及治療藥物的評價和篩選提供了良好的動物 模型。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明實施例1IRTKS-K0小鼠的構建與首代雜合子的基因型鑒定。其中， (A) 是IRTKS-K0小鼠打靶質(zhì)粒構建示意圖，5L&neoR，3R&neoF為用于鑒定的PCR引物設計； (B) 是首代雜合子的PCR鑒定結果。
[0015] 圖2是本發(fā)明實施例2IRTKS-K0小鼠的基因型鑒定以及IRTKS的表達鑒定。其中， (A)是純合子（IRTKS-/-)、雜合子（IRTKS+/-)和野生型小鼠（WT)的基因型鑒定，下方是設 計的引物示意圖 IRTKS-F1/IRTKS-F2、IRTKS-F3/IRTKS-ne〇-F4,簡寫為 F1/F2、F3/F4 ;(B) 和（C)分別是純合子（IRTKS-/-)、雜合子（IRTKS+/-)和野生型小鼠（WT)的多個組織器官 (心、肝、脾、肺、腎、前列腺、睪丸）中檢測IRTKS表達的RT-PCR結果（B圖）和western-blot (免疫印跡法）結果（C圖）。
[0016] 圖3是本發(fā)明實施例3三組小鼠的糖代謝檢測結果圖。（A)雄性純合（IRTKS-/-)、 雜合（IRTKS+/-)、野生（WT)小鼠空腹血糖值（n=5-8) ;(B)雄性純合（IRTKS-/-)、雜合 (IRTKS+/-)、野生（WT)小鼠血清中胰島素值（n=5-8) ; (C)雄性純合（IRTKS-/-)、雜合 (IRTKS+/-)、野生（WT)小鼠葡萄糖耐量曲線（n=5-8) ;(D)雄性純合（IRTKS-/-)、雜合 (IRTKS+/-)、野生（WT)小鼠胰島素耐量曲線（n=5-8)。
[0017] 圖4是本發(fā)明實施例4IRTKS在糖尿病人和小鼠中表達降低。（A)2型糖尿病患者 和正常人肝臟中IRTKS的表達（n=10);(B) db/db小鼠和同窩對照小鼠的肝臟、脂肪組織中 IRTKS的表達（n=5-6) ;(C)高脂飲食（HFD)誘導肥胖的小鼠與正常飲食（RD)小鼠肝臟、月旨 肪組織中IRTKS的表達（n=5)。

【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0019] 實施例1IRTKS-K0小鼠的構建
[0020] 1. IRTKS-K0 質(zhì)粒的構建
[0021] 參見圖 1(A)，將 80μ g IRTKS K0 Vector 質(zhì)粒 DNA 用 NotI(酶用量：100U)酶切，酶 切體積200yl，37°C消化過夜；走膠分離純化，膠回收試劑盒用QIA quick Gel Extraction Kit (Cat No. 28706);隨后乙醇沉淀，100 μ 1無菌的PBS (磷酸鹽緩沖溶液）重懸。
[0022] 2. ES細胞打靶及篩選
[0023] 將上述IRTKS-K0線性化質(zhì)粒用于ES細胞打靶。
[0024] ES細胞(胚胎干細胞）：SCR012
[0025] DNA 量：35 μ g
[0026] 電轉儀型號：Bio - Rad Gene Pulser (Cat. No. 165-2105)
[0027] 電穿孔條件：設定電壓240V，電容500 μ F，實際通電時間10. 5ms，實際電壓256V
[0028] 克隆篩選條件：300 μ g/ml G418、2 μ M GanC 篩選 8 天
[0029] 挑取抗性克隆共96個，提供DNA樣本96份。
[0030] 3.陽性ES克隆的鑒定
[0031] 分別設計兩對PCR鑒定引物，參見圖1 (A)。
[0032] 5' PCR鑒定：鑒定引物5L和neo-R，目的片段為5· 2K。PCR引物序列：
[0033] Neo-R ：CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA (SEQ ID No:l)
[0034] 5L ：TCGCCGGCCAGTCTAGTCAAGTCAGG (SEQ ID No:2)
[0035] PCR 反應體系（50 μ 1) :5units/μ 1 TaKaRa rTaqO. 25 μ 1，lOXTaKaRa rTaq 緩沖 液5 μ 1，dNTP混合溶液（每種濃度2. 5mM) 4 μ 1，DNA模板500ng以下，正向引物和反向引物 各0. 2-1. 0 μ M，滅菌蒸餾水補足體積至50 μ 1。
[0036] PCR 反應條件：95°C 10 分鐘；95°C 10 秒，62°C lmin，72°C 5min，共 35 個循環(huán)； 72 °C 10 分鐘。
[0037] 3' PCR鑒定：鑒定引物3R和neo-F，目的片段為3. 6K。PCR引物序列：
[0038] Ne〇-F:CCTCCCCCGTGCCTTCCTTGAC (SEQ ID No:3)
[0039] 3R:CCGAGGGCAAATTCTGGGCACACTAT (SEQ ID No:4)
[0040] PCR 反應體系（50 μ 1) :5units/ μ 1 TaKaRa rTaqO. 25 μ 1，lOXTaKaRa rTaq 緩沖 液5 μ 1，dNTP混合溶液（每種濃度2. 5mM) 4 μ 1，DNA模板500ng以下，正向引物和反向引物 各0. 2-1. 0 μ M，滅菌蒸餾水補足體積至50 μ 1。
[0041] PCR 反應條件：95°C 10 分鐘；95°C 10 秒，62°C lmin，72°C 4min，共 35 個循環(huán)； 72 °C 10 分鐘。
[0042] 4.囊胚注射
[0043] 顯微注射用囊胚來源：C57BL/6J小鼠超數(shù)排卵，自然受孕，體內(nèi)發(fā)育至囊胚階段。
[0044] 將已經(jīng)發(fā)生同源重組的胚胎干細胞陽性克隆注入C57BL/6J小鼠的囊胚，共注射 87枚胚胎，制作6只受體。共出生3只小鼠，其中，嵌合率在50%以上的雄性小鼠3只，為嵌 合小鼠。
[0045] 5.嵌合小鼠的繁育
[0046] 將嵌合率在50%以上的成熟雄性小鼠與C57BL/6J雌性小鼠進行交配，后代灰色 小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進行PCR鑒定（鑒定方法同陽性ES克隆的鑒定，鑒定結果見圖1 (B))，共獲得5只IRTKS基因剔除的首代雜合小鼠。
[0047] 實施例2IRTKS-K0小鼠的基因型鑒定以及IRTKS的表達鑒定
[0048] 1.純合、雜合和野生小鼠的基因型鑒定
[0049] 首先，設計兩對PCR鑒定引物鑒定純合、雜合和野生小鼠，參見圖2(A)。引物序列 如下：
[0050] FI：CTGCGGGCTGTTAAAGGTTA (SEQ ID No:5)
[0051] F2 ：ACTCAGCGCTTGAGACTTG (SEQ ID No:6)
[0052] F3 ：GATCTGCCAAGGAAAGACA (SEQ ID No:7)
[0053] F4 ：GGGAACTTCCTGACTAGGG (SEQ ID No:8)
[0054] PCR 反應體系（50 μ 1) :5units/μ 1 TaKaRa rTaqO. 25 μ 1，lOXTaKaRa rTaq 緩沖 液5 μ 1，dNTP混合溶液（每種濃度2. 5mM) 4 μ 1，DNA模板500ng以下，正向引物和反向引物 各0. 2-1. 0 μ M，滅菌蒸餾水補足體積至50 μ 1。
[0055] PCR 反應條件：95°C 10 分鐘；95°C 10 秒，59°C 30 秒，72°C 40 秒，共 33 個循環(huán)； 72 °C 5分鐘。
[0056] 2.小鼠組織RNA的提取、逆轉錄及半定量PCR
[0057] 將基因型鑒定好的小鼠頸椎脫臼處死，解剖，取各個組織器官（心、肝、脾、肺、腎、 前列腺、睪丸）于液氮中速凍并移至 -7〇°C冰箱保存。采用TRIzol reagent(Invitrogen) 試劑提取組織RNA，進行RT-PCR鑒定。
[0058] RT-PCR鑒定的引物為：
[0059] IRTKS-F ：TTGGCAGGCTACGTCTACCT (SEQ ID No:9)
[0060] IRTKS-R ：GCGCCTAGGACTTGAGACTG (SEQ ID No:10)
[0061] Actin-F ：AATCGTGCGTGACATTAAGGAG (SEQ ID No: 11)
[0062] Actin-R:ACTGTGTTGGCGTACAGGTCTT (SEQ ID No:12)
[0063] PCR 反應體系（50 μ 1) :5units/μ 1 TaKaRa rTaqO. 25 μ 1，lOXTaKaRa rTaq 緩沖 液5 μ 1，dNTP混合溶液（每種濃度2. 5mM) 4 μ 1，RNA模板500ng以下，正向引物和反向引物 各0. 2-1. 0 μ M，滅菌蒸餾水補足體積至50 μ 1。
[0064] PCR 反應條件：95°C 10 分鐘；95°C 10 秒，55°C 30 秒，72°C 40 秒，共 30 個循環(huán)； 72 °C 5分鐘。
[0065] RT-PCR鑒定結果見圖2 (B)。
[0066] 3.小鼠組織蛋白的提取及免疫印跡分析
[0067] 預先配制好含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液：20mM Tris pH8. 0、137mM NaCl、10% 甘油、1%NP_40(乙基苯基聚乙二醇）、2mM EDTA (含有 protease and phosphatase inhibitor cocktails, Roche)，置于冰上，將研磨好的組織放入裂解液中裂解20min，然后 4°C離心（12000rpm) 20分鐘，取上清，進行免疫印跡分析。免疫印跡分析所用Anti-IRTKS 兔多抗為我們實驗室的自制抗體，Anti-actin鼠單抗購自Santa Cruz。免疫印跡分析結果 見圖2 (C)。
[0068] 通過上述分析鑒定，驗證了實施例1構建的IRTKS基因剔除的小鼠模型的可靠性。
[0069] 實施例3三組小鼠(雄性純合、雜合、野生）的糖代謝分析
[0070] 1.用羅氏血糖儀（Roche Accu-chek)檢測IRTKS-K0(IRTKS基因敲除的純合子)、 IRTKS-WT (野生型）與IRTKS-HET (雜合子）小鼠空腹血糖值，結果見圖3 (A);
[0071] 2. 3. 5月齡的小鼠禁食6小時后，眼眶穿刺取血50yl-100yl，5000rpm離心 5分鐘，取上清，用millipore公司的小鼠胰島素 ELISA試劑盒（Cat#EZRMI-13K)檢測 IRTKS-KO、IRTKS-WT與IRTKS-HET小鼠血清胰島素值，結果見圖3 (B);
[0072] 3. 3. 5月齡的小鼠，禁食過夜，用1ml注射器腹腔注射1. 5g/kg葡萄糖，分別在注 射前（〇)以及注射后的15、30、60、90、120分鐘這6個時間點測定每只小鼠的血糖值，計算 出每個時間點每組小鼠血糖的平均值和標準誤（s. e.m.)，并進行student' s t-test統(tǒng)計 學分析，得出P值。以時間（Time)為橫坐標，血糖平均值（Blood glucose)為縱坐標，標準 誤為誤差值，繪制葡萄糖耐量曲線，結果見圖3 (C);
[0073] 4. 3. 5月齡的小鼠，用1ml注射器腹腔注射lunit/kg的胰島素，分別在注射前（0) 以及注射后的15、30、60、90、120分鐘這6個時間點測定每只小鼠的血糖值，以0點的血糖 值為基礎值（100%)，推算各個時間點血糖相對于起始點血糖的百分比，計算每組小鼠每個 時間點的血糖百分比的均值和標準誤，并用student's t-test進行統(tǒng)計學分析，得出p值。 以時間（Time)為橫坐標，血糖百分比為縱坐標，繪制胰島素耐量曲線，結果見圖3 (D)。
[0074] 由糖代謝檢測結果可見，IRTKS-K0小鼠呈現(xiàn)高血糖、高胰島素血癥，葡萄糖耐量和 胰島素耐量降低，表明IRTKS基因缺失后，小鼠可以發(fā)生胰島素抵抗，這一分析符合臨床上 2型糖尿病的發(fā)病特征。
[0075] 實施例41RTKS在糖尿病人和小鼠中表達降低
[0076] 1.從復旦大學中山醫(yī)院肝研所以及華山醫(yī)院內(nèi)分泌科共獲贈 10對2型糖尿病人 和非糖尿病人臨床肝臟手術樣本，研磨抽提RNA，進行IRTKS的定量PCR分析。
[0077] 定量 PCR 反應使用 Thermal Cycler Dice? Real Time System (TP800 實時突 光定量 PCR 儀，TaKaRa)及SYBR1? Premix Ex Taq?(Perfect Real Time)試劑盒（TaKaRa Biotechnology Inc. Dalian, China)進行。
[0078] PCR 引物：
[0079] IRTKS-F:TTGGCAGGCTACGTCTACCT (SEQ ID No:9)
[0080] IRTKS-R:GCGCCTAGGACTTGAGACTG (SEQ ID No:10)
[0081] Actin-F:AATCGTGCGTGACATTAAGGAG (SEQ ID No:11)
[0082] Actin-R:ACTGTGTTGGCGTACAGGTCTT (SEQ ID No:12)
[0083] PCR反應體系（25μ 1): 2XSYB_ Premix Ex Taq?12. 5μ l，cDNA模板 2μ 1，10μΜ 正向引物和反向引物各0.5 μ 1，ddH20補足體積至25 μ 1。
[0084] PCR反應條件(二步法擴增）:95°C變性10秒；95°C 5秒，60°C 30秒，共40個循環(huán)。
[0085] 擴增得到的PCR產(chǎn)物進行溶解曲線分析，溶解曲線生成的反應程序為：95°C 15秒， 60°C 30秒，95°C 15秒，解離時間為4秒。
[0086] 結果見圖4 (A)，糖尿病患者肝臟中IRTKS的表達水平遠低于正常人。
[0087] 2.從中國科學院上海實驗動物中心（SLAC)購得db/db小鼠與同窩的對照瘦鼠 (lean)每組5-6只，取肝臟和脂肪組織抽提RNA，對IRTKS的表達進行PCR鑒定，PCR鑒定 方法及引物、反應體系、反應條件等均與本實施例4的第1部分相同，定量PCR鑒定結果見 圖4 (B)，db/db小鼠的肝臟和脂肪組織中IRTKS的表達水平低于同窩對照瘦鼠。
[0088] 3.高脂飲食小鼠（HFD)的喂養(yǎng)
[0089] 1)從中國科學院上海實驗動物中心（SLAC)購得C57BL/6雄性6周齡小鼠共10 只，分成兩組，每組5只，剪腳趾編號；一組常規(guī)飲食（RD)，另一組高脂飲食（HFD) (55%fat calories, Harlan_Teklad93075)，喂養(yǎng)12周后，測定每只小鼠的體重和血糖值。
[0090] 2)解剖小鼠，取肝臟和脂肪組織抽提RNA，對IRTKS的表達進行定量PCR鑒定，PCR 鑒定方法及引物、反應體系、反應條件等均與本實施例4的第1部分相同，定量PCR鑒定結 果見圖4(C)，高脂飲食小鼠的肝臟和脂肪組織中IRTKS的表達水平明顯低于正常飲食的小 鼠。
[0091] 綜合圖4可見，IRTKS在糖尿病人、db/db小鼠和高脂飲食小鼠中表達降低。
【權利要求】
1.IRTKS基因剔除的小鼠模型的構建方法，其特征在于，通過同源重組的方法，用 2. O-kbPGK/Neo序列取代小鼠 IRTKS基因中含有ATG起始密碼子的exonl序列，得到IRTKS 基因剔除的小鼠模型。
2. 如權利要求1所述的小鼠模型的構建方法，其特征在于，該方法的具體步驟包括： 1) 構建IRTKS-K0質(zhì)粒； 2. ES細胞打靶并篩選陽性ES克??； 3) 將陽性ES克隆注射入小鼠囊胚，得到嵌合小鼠； 4) 將嵌合小鼠與雌性小鼠雜交，獲得IRTKS基因剔除的小鼠模型。
3. 如權利要求2所述的小鼠模型的構建方法，其特征在于，步驟1)，IRTKS KO Vector 質(zhì)粒DNA經(jīng)Notl酶切，消化，分離純化，乙醇沉淀，無菌PBS重懸，獲得IRTKS-K0質(zhì)粒。
4. 如權利要求2所述的小鼠模型的構建方法，其特征在于，步驟2)，ES細胞為SCR012， 克隆篩選條件為300 μ g/ml G418、2 μ M GanC篩選8天。
5. 如權利要求2所述的小鼠模型的構建方法，其特征在于，步驟2)還包括用PCR方法 鑒定陽性ES克隆。
6. 如權利要求5所述的小鼠模型的構建方法，其特征在于，步驟2 )，5 ' PCR鑒定的引物 對序列如SEQ ID No:l?2所示；3' PCR鑒定的引物對序列如SEQ ID No:3?4所示。
7. 如權利要求2所述的小鼠模型的構建方法，其特征在于，步驟3)，所述嵌合小鼠為嵌 合率在50%以上的雄性小鼠。
8. 如權利要求2所述的小鼠模型的構建方法，其特征在于，步驟3)提供囊胚的小鼠和 步驟4)所述的雌性小鼠為C57BL系小鼠。
9. 利用權利要求1-8中任意一項所述的方法獲得的IRTKS基因剔除的小鼠模型在糖尿 病發(fā)病機制的研究、診斷和治療以及糖尿病治療藥物的評價和篩選中的應用。
10. 利用權利要求1-8中任意一項所述方法構建的IRTKS基因剔除的小鼠模型。
【文檔編號】C12N15/873GK104250656SQ201310267704
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月28日 優(yōu)先權日:2013年6月28日
【發(fā)明者】韓澤廣, 黃麗鈺 申請人:上海人類基因組研究中心