一種培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。它包括如下步驟：取新鮮采集的人臍帶，清洗，放入臍帶保護(hù)液中2-8℃保存?zhèn)溆茫蝗〗菰谀殠ПＷo(hù)液中不超過48小時的人臍帶，清洗，再依次置臨用新配的青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500U/mL和3500-4500U/mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50U注射用兩性霉素B的甲硝唑注射液中進(jìn)行浸洗，最后再清洗后置于一次性無菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行備用，然后分離，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80-90%即得。本發(fā)明能避免動物血清及動物來源的試劑帶來的潛在的危險(xiǎn)性；48小時內(nèi)均可用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，可操作性強(qiáng)；可大大減少因霉菌、厭氧菌污染造成的間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)不合格的幾率。
【專利說明】一種培養(yǎng)人胳帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞是一種未分化的細(xì)胞，有兩個基本特性，一是具有自我復(fù)制能力，二是能分化成一種以上的功能細(xì)胞，根據(jù)分化潛能的大小，干細(xì)胞一般分成三類，第一類是全能干細(xì)胞(totipotent stem cell)，其可以分化為功能一致的全能細(xì)胞，可以發(fā)育為胎兒；第二類是多潛能干細(xì)胞(pturipotent stem cel),它能夠分化為身體中的每種細(xì)胞類型,但是不能形成胎盤或胎兒發(fā)育所必需的支持組織。由于多潛能干細(xì)胞的分化潛能不是“全體”的，因此不將這種細(xì)胞稱為“全能”，而且它們不是胚胎。多潛能干細(xì)胞進(jìn)一步特化為多能(multiPotent)干細(xì)胞,其專用于分化為特定功能特化的特定種系的細(xì)胞。多能干細(xì)胞能夠分化為它們所源自的組織中含有的細(xì)胞類型；例如血液干細(xì)胞只能夠分化為紅血細(xì)胞、白血細(xì)胞和血小板。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell)具有廣泛的潛能,能生成除胎盤外的機(jī)體所有的組織細(xì)胞；第三類是成體干細(xì)胞(aduit stem cell)是一種將擁有終生自我復(fù)制(identical copies)和自我更新(self-renewal)能力的未分化細(xì)胞，它分布于不同的組織，并可演變成為各種類型的資質(zhì)細(xì)胞。干細(xì)胞的分類，主要分為造血干細(xì)胞及非造血干細(xì)胞。造血干細(xì)胞主導(dǎo)血液、免疫方面的疾病，來源例如臍帶血；非造血干細(xì)胞則以細(xì)胞分化與修復(fù)為主，可應(yīng)用于中風(fēng)、糖尿病、老年癡呆等再生醫(yī)學(xué)，來源有臍帶、胎盤、乳牙等。
[0003]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell MSC)是可形成多種細(xì)胞類型的多能干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，隨后還發(fā)現(xiàn)存在于人體發(fā)生、發(fā)育過程的許多種組織中。鑒于間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能、能支持造血和促進(jìn)造血干細(xì)胞植入、調(diào)節(jié)免疫以及分離培養(yǎng)操作簡便等特點(diǎn)，正日益受到人們的關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用范圍也越來越廣泛。目前國內(nèi)外已開展了`多項(xiàng)臨床應(yīng)用研究，主要疾病類型包括骨關(guān)節(jié)炎疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反應(yīng)(GVHD)，脊髓損傷及退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病和糖尿病等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
[0005]為解決本發(fā)明的技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于:它包括如下步驟:
(1)取新鮮采集的人臍帶，清洗，放入臍帶保護(hù)液中2-8°C保存?zhèn)溆茫龅哪殠ПＷo(hù)液是在AIM-V培養(yǎng)基中加入青霉素鈉和硫酸鏈霉素得到的，其中青霉素鈉和硫酸鏈霉素在臍帶保護(hù)液中的終濃度分別為100-200 U/mL和100-200 U /mL ；
(2)取浸泡在臍帶保護(hù)液中不超過48小時的人臍帶，清洗，再依次置臨用新配的青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液中進(jìn)行浸洗，最后再清洗后置于一次性無菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行備用；(3)將無菌清洗過的人臍帶剪成肉糜狀，加入AIM-V培養(yǎng)基，置分離管中用全自動組織分離器進(jìn)行分離，得臍帶組織勻漿；
(4)將全自動組織分離器處理好的臍帶組織勻漿進(jìn)行離心，棄上清，收集下層，置于培養(yǎng)瓶中，然后向其中加入無血清培養(yǎng)基，置于36-38°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)，至觀察到瓶壁上形成多個大小不一、細(xì)胞數(shù)量密集的細(xì)胞島時，則獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞混合液，然后經(jīng)離心，即可獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞，再經(jīng)傳代培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80-90%即得。
[0006]按上述方案，所述步驟(I)中的臍帶保護(hù)液是將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素預(yù)先溶解后再加入到AIM-V培養(yǎng)基(治療級)中得到的；所述步驟(2)中青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液是將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素按一定量加入0.9%氯化鈉注射液中混合得到的；所述每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液的配制是將注射用兩性霉素B先用0.9%氯化鈉注射液溶解后，再和特定量的甲硝唑注射液混合得到的；所述人臍帶在青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液中的浸洗時間均為8-12min。
[0007]按上述方案，所述步驟(I)和步驟(2)中的清洗均為0.9%氯化鈉注射液清洗。
[0008]按上述方案，所述的步驟(4)為培養(yǎng)5-6天后，取出未貼壁的上層置另一新培養(yǎng)瓶中，向原培養(yǎng)瓶和新培養(yǎng)瓶中均加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并每隔3-4天換液一次，待培養(yǎng)10-15天后即可獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞；
然后將原培養(yǎng)瓶和新培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基完全移出，往原培養(yǎng)瓶和新培養(yǎng)瓶中加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.25%的重組動物胰蛋白酶 的磷酸鹽緩沖液浸沒貼壁細(xì)胞，放入36-38°C培養(yǎng)箱保溫消化7-9分鐘，當(dāng)觀察到貼壁細(xì)胞圓縮，且已經(jīng)脫離瓶底后，加入消化液同等體積的無血清培養(yǎng)基終止消化，然后轉(zhuǎn)移至離心管中，離心棄上清，吹勻沉淀在離心管底部的細(xì)胞，再根據(jù)4000-6000個細(xì)胞/cm2接種到培養(yǎng)瓶中，并向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充無血清培養(yǎng)基，置36-38°C、飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)，每3-4天全量換液一次，至貼壁細(xì)胞彼此融合，且融合度達(dá)80-90%，即得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，在有需要時，可重復(fù)上述操作進(jìn)行多代細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增。
[0009]按上述方案，所述T25培養(yǎng)瓶可放置不超過5g的人臍帶經(jīng)全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進(jìn)行培養(yǎng)；所述T75培養(yǎng)瓶可放置10-15 g的人臍帶經(jīng)全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進(jìn)行培養(yǎng)；所述T175培養(yǎng)瓶可放置30-35 g的人臍帶經(jīng)全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進(jìn)行培養(yǎng)；
所述T25培養(yǎng)瓶中需要的無血清培養(yǎng)基的體積為6-8mL ;所述T75培養(yǎng)瓶中需要的無血清培養(yǎng)基的體積為20-25mL ;所述T175培養(yǎng)瓶中需要的無血清培養(yǎng)基的體積為30_35mL。
[0010]人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離制備首先要求臍帶組織具有一定的活性，一般為保證臍帶組織的活性，需要對臍帶進(jìn)行及時處理，而這也給實(shí)際應(yīng)用帶來了障礙。本發(fā)明通過將新鮮采集的臍帶置于臍帶保護(hù)液中保存，即可達(dá)到對臍帶中殘留的微生物殺菌的作用，又能維持臍帶組織的活性的目的。使用本發(fā)明的臍帶保護(hù)液2-8°C進(jìn)行保存的臍帶在48小時內(nèi)均可用于出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，這給實(shí)際制備生產(chǎn)帶來了極大的可操作性。
[0011]除此，本發(fā)明在對臍帶進(jìn)行無菌清洗時，除使用青霉素鈉和硫酸鏈霉素的氯化鈉溶液進(jìn)行無菌處理外，本發(fā)明還特別結(jié)合臍帶的自身污染特點(diǎn)，尤其是順產(chǎn)收集的人臍帶易受厭氧菌和霉菌污染的問題，特別添加了注射用兩性霉素B的甲硝唑注射液中進(jìn)行無菌處理，而由此可明顯提高人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的成功率。其中，甲硝唑注射液主要可用于抗厭氧菌感染、抗滴蟲的治療，注射用兩性霉素B是多烯類抗真菌藥物，其可破壞新型隱球菌、皮炎芽生菌、組織胞漿菌、球孢子菌屬、孢子絲菌屬、念珠菌屬等真菌細(xì)胞的正常代謝從而抑制其生長。但是注射用兩性霉素B對細(xì)胞有一定的毒性，本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過控制兩性霉素B的濃度，可達(dá)到使其發(fā)揮作用但又不影響臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的活性的目的。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
(1)本發(fā)明全程使用無血清無動物來源的試劑及利用全自動組織處理器，替代傳統(tǒng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中使用的的胎牛血清、動物來源的胰蛋白酶及膠原酶，在臨床應(yīng)用中能避免動物血清及動物來源的試劑帶來的潛在的危險(xiǎn)性；
(2)采集后放入臍帶保護(hù)液，能起到保持離體組織活性的作用，使得生產(chǎn)制備有更強(qiáng)的操作性，在48小時內(nèi)分離制備，仍能分離出活性好的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
(3)臍帶清洗過程除使用廣譜的青鏈霉素進(jìn)行無菌處理外，加入兩性霉素B和甲硝唑注射液，對分娩過程中帶有霉菌、厭氧菌的臍帶處理非常有效，可大大減少因霉菌、厭氧菌污染造成的間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)不合格的幾率。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
1.胎兒娩出后結(jié)扎，胎盤娩出前或娩出后剪臍帶約10cm，經(jīng)0.9%氯化鈉注射液清洗后加入到臍帶保護(hù)液中于2-8°C保存，所述的臍帶保護(hù)液將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素分別先用少量AIM-V培養(yǎng)基溶解后加入到AIM-V培養(yǎng)基(治療級)中，其中青霉素鈉和硫酸鏈霉素在臍帶保護(hù)液中的終濃度分別為200U/mL和200U/mL。如此，將臍帶放于臍帶保護(hù)液中于2-8°C保存進(jìn)行保存，可使臍帶在臍帶保護(hù)液的保護(hù)下48小時內(nèi)皆可用于分離制備間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0014]2.人臍帶的無菌清洗
用無菌鑷子從臍帶保存液中取出人臍帶放入滅菌容器中，加入250mL 0.9%氯化鈉注射液，用8cm無菌鑷子將人臍帶來回震蕩漂洗一次。后再用無菌鑷子將人臍帶轉(zhuǎn)移到另一滅菌容器中，加入250mL臨用新配的青霉素鈉和硫酸鏈霉素分別為3200U/mL、4000U/mL的氯化鈉溶液(濃雙抗溶液)，每隔1-2分鐘用無菌鑷子將人臍帶來回震蕩幾次，共浸洗10分鐘。再用無菌鑷子將人臍帶夾起，轉(zhuǎn)移到滅菌容器中加入每毫升含50單位注射用兩性霉素B的甲硝唑注射液，以同樣的方法浸洗10分鐘。浸洗后用8cm無菌鑷子將人臍帶夾起，再置另一滅菌容器中，加入0.9%氯化鈉注射液，并將人臍帶來回震蕩清洗三次，清洗后的人臍帶分置于一次性無菌培養(yǎng)皿中。
[0015]上述濃雙抗溶液為臨用前新配，具體配制方法為:取80萬單位的注射用青霉素鈉和100萬單位的注射用硫酸鏈霉素各一支加入到250mL 0.9%氯化鈉注射液中而得。
[0016]上述每毫升含50U兩性霉素B的甲硝唑注射液的配制:取2.5萬單位的注射用兩性霉素B —支，加入5mL 0.9%氯化鈉注射液溶解，然后取前述溶液ImL和IOOmL甲硝唑注射液中混勻而得。
[0017]將最后清洗臍帶用的0.9%氯化鈉注射液抽取樣品并經(jīng)薄膜過濾法進(jìn)行微生物情況檢測，得:經(jīng)14天培養(yǎng)樣品未見細(xì)菌、霉菌生長。
[0018]3.人臍帶干細(xì)胞的分離制備
將一次性無菌培養(yǎng)皿中無菌處理過的人臍帶用5cm無菌鑷子和剪刀去除其中的血管和粘膜，然后用5cm無菌剪刀剪成肉糜狀。每次取IOg置C管(全自動組織處理器配套分離管)，加入SmLAM-V培養(yǎng)基，經(jīng)全自動組織分離器處理如在全自動組織處理器(C一01)程序下攪拌2次進(jìn)行處理，然后轉(zhuǎn)移至50mL離心管中；用同樣的方法處理剩余的肉糜狀人臍帶組織，直至全部分離完所有的人臍帶組織。
[0019]將全自動組織處理器處理獲得的人臍帶勻漿在300g下離心15min，棄上清，收集下層，分別置于2個T25培養(yǎng)瓶中，然后向其中加入無血清培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)瓶置36-38°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶的數(shù)量可根據(jù)處理臍帶的重量來選擇，一般T25培養(yǎng)瓶可約放置不超過5g的人臍帶經(jīng)全自動組織分離器處理、離心后的組織。T25培養(yǎng)瓶加入的培養(yǎng)基為6-8mL。
[0020]4.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)
培養(yǎng)5天后，取上層置另一培養(yǎng)瓶中，然后在兩培養(yǎng)瓶中均加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，并每隔3-4天換液一次，約10-15天后可用倒置顯微鏡觀察到有貼壁細(xì)胞生長，接著繼續(xù)培養(yǎng)，能觀察到貼壁細(xì)胞逐漸增殖成較大的細(xì)胞集落。當(dāng)觀察到細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁形成多個大小不一、細(xì)胞數(shù)量密集的細(xì)胞島時，即獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞混合液，再經(jīng)離心，即可獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞。
[0021]5.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代` 將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基完全移出，往培養(yǎng)瓶中加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.25%的重組動物胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液(T25加3mL，T75加4mL，T175加6mL)，然后放入36-38°C培養(yǎng)箱保溫消化約7-9分鐘，在此過程中在倒置顯微鏡下觀察到貼壁細(xì)胞圓縮，且細(xì)胞已經(jīng)脫離瓶底后，加入消化液同等體積的無血清培養(yǎng)基終止消化，然后轉(zhuǎn)移至離心管中，用雙目顯微鏡上用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)及其苔盼藍(lán)染色計(jì)細(xì)胞活性。然后將離心管置300g條件下離心5min，離心后棄上清，用巴氏管輕輕吹勻沉淀在離心管底部的細(xì)胞，再根據(jù)4000-6000個細(xì)胞數(shù)/cm2接種到培養(yǎng)瓶中，并做好標(biāo)記，向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充無血清培養(yǎng)基，置36-38°C、飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)，每3-4天全量換液一次。當(dāng)培養(yǎng)24h后，傳代細(xì)胞開始貼壁，成單個分散長條形細(xì)胞，3-4天后通過全量換液可去除未貼壁細(xì)胞，此時細(xì)胞為融合度達(dá)到50%左右的長梭形細(xì)胞。約6天后細(xì)胞基本能達(dá)到80%以上的融合，即可得間充質(zhì)干細(xì)胞，然后根據(jù)需要可重復(fù)上述操作進(jìn)行P2、P3、P4……傳代。
[0022]實(shí)施例2
1.胎兒娩出后結(jié)扎，胎盤娩出前或娩出后剪臍帶約10cm，經(jīng)0.9%氯化鈉注射液清洗后加入到臍帶保護(hù)液中于2-8°C保存，所述的臍帶保護(hù)液為AIM-V培養(yǎng)基(治療級)中加入青霉素納和硫Ife鏈霉素，其中青霉素納和硫Ife鏈霉素在胳帶保護(hù)液中的終濃度分別為100U/mL和100U/mL。如此，將臍帶放于臍帶保護(hù)液中于2_8°C保存進(jìn)行保存，可使臍帶在臍帶保護(hù)液的保護(hù)下48小時內(nèi)皆可用于分離制備間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0023]2.人臍帶的無菌清洗用無菌鑷子從臍帶保存液中取出人臍帶放入滅菌容器中，加入0.9%氯化鈉注射液，用8cm無菌鑷子將人臍帶來回震蕩漂洗一次。后再用無菌鑷子將人臍帶轉(zhuǎn)移到另一滅菌容器中，加入臨用新配的青霉素鈉和硫酸鏈霉素分別為2500U/mL、3500U/mL的氯化鈉溶液(濃雙抗溶液)，每隔1-2分鐘用無菌鑷子將人臍帶來回震蕩幾次，共浸洗8分鐘。再用無菌鑷子將人臍帶夾起，轉(zhuǎn)移到滅菌容器中加入每毫升含30U兩性霉素B的甲硝唑注射液，以同樣的方法浸洗8分鐘。浸洗后用8cm無菌鑷子將人臍帶夾起，再置另一滅菌容器中，加入0.9%氯化鈉注射液，并將人臍帶來回震蕩清洗三次，清洗后的人臍帶分置于一次性無菌培養(yǎng)皿中。
[0024]上述濃雙抗溶液為臨用前新配，其具體配制和每毫升含30U注射用兩性霉素B的甲硝唑注射液的配制方法參考實(shí)施例1。
[0025]將最后清洗臍帶用的0.9%氯化鈉注射液抽取樣品并經(jīng)薄膜過濾法進(jìn)行微生物情況檢測，得:經(jīng)14天培養(yǎng)樣品未見細(xì)菌、霉菌生長。
[0026]3.人臍帶干細(xì)胞的分離制備
將一次性無菌培養(yǎng)皿中無菌處理過的人臍帶用5cm無菌鑷子和剪刀去除其中的血管和粘膜，然后用5cm無菌剪刀剪成肉糜狀。每次取IOg置C管(全自動組織處理器配套分離管)，加入8mL AM-V培養(yǎng)基，經(jīng)全自動組織分離器處理，然后轉(zhuǎn)移至50mL離心管中；用同樣的方法處理剩余的肉糜狀人臍帶組織，直至全部分離完所有的人臍帶組織。
[0027]將全自動組織處理器處理獲得的人臍帶勻漿在300g下離心15min，棄上清，收集下層，置于培養(yǎng)瓶中，然后向其中加入無血清培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)瓶置36-38°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)。
[0028]4.人臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞原代培養(yǎng)
培養(yǎng)5天后，取上層置另一培養(yǎng)瓶中，然后在兩培養(yǎng)瓶中均加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，并每隔3-4天換液一次，約10-15天后可用倒置顯微鏡觀察到有貼壁細(xì)胞生長，接著繼續(xù)培養(yǎng)，能觀察到貼壁細(xì)胞逐漸增殖成較大的細(xì)胞集落。當(dāng)觀察到細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁形成多個大小不一、細(xì)胞數(shù)量密集的細(xì)胞島時，即獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞混合液，再經(jīng)離心，即可獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞。
[0029]5.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代
將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基完全移出，往培養(yǎng)瓶中加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.25%的重組動物胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液，然后放入36-38°C培養(yǎng)箱保溫消化約7-9分鐘，在此過程中在倒置顯微鏡下觀察到貼壁細(xì)胞圓縮，且細(xì)胞已經(jīng)脫離瓶底后，加入消化液同等體積的無血清培養(yǎng)基終止消化，然后轉(zhuǎn)移至離心管中，用雙目顯微鏡上用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)及苔盼藍(lán)染色計(jì)細(xì)胞活性。然后將離心管置300g條件下離心5min，離心后棄上清，用巴氏管輕輕吹勻沉淀在離心管底部的細(xì)胞，再根據(jù)4000-6000個細(xì)胞數(shù)/cm2接種到培養(yǎng)瓶中，并做好標(biāo)記，培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充無血清培養(yǎng)基，置36-38°C、飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)，每3-4天全量換液一次。當(dāng)培養(yǎng)24h后，傳代細(xì)胞開始貼壁，成單個分散長條形細(xì)胞，3-4天后通過全量換液可去除未貼壁細(xì)胞，此時細(xì)胞為融合度達(dá)到50%左右的長梭形細(xì)胞。約6天后細(xì)胞基本能達(dá)到80%以上的融合，即可得間充質(zhì)干細(xì)胞，然后根據(jù)需要可重復(fù)上述操作進(jìn)行P2、P3、P4……傳代。
[0030]將實(shí)施例1和2得到的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，檢測方法及結(jié)果見下:實(shí)驗(yàn)原理:利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測熒光標(biāo)記抗體。根據(jù)抗原抗體結(jié)合原理，用特定熒光素標(biāo)記的抗體對已知攜有相應(yīng)抗原的細(xì)胞進(jìn)行染色。經(jīng)熒光素標(biāo)記抗體染色的細(xì)胞可以被流式細(xì)胞儀識別，并根據(jù)已知細(xì)胞所攜帶的熒光素的強(qiáng)度，對標(biāo)記抗體進(jìn)行定性，定量分析。
[0031]檢測步驟:
(I)取5根流式管，分別標(biāo)記為對照管①FITC/PE/APC②FITC/PE樣本管③90/34/14④DR/105/19 ⑤ 45/34。
[0032](2)各流式管分別加入相同量的傳代細(xì)胞(有核細(xì)胞數(shù)2-5X IO5個)，不可粘到管壁。
[0033](3)對照管①加入 Mouse IgG2a_PE、Mouse IgGl-FITC、Mouse IgGl-APC 分別5 ul，混勻；對照管②加入Mouse IgG2a_PE、Mouse IgGl-FITC分別5 ul，混勻；樣本管③加入 CD90-FITC、CD73-PE、CD14-APC 分別 5 ul，混勻；樣本管④加入 DR-FITC、CD105-PE、⑶19-APC分別5 ul，混勻；樣本管⑤加入⑶45-FITC、⑶34-PE分別5 ul，混勻。
[0034](4)室溫避光放置 15min,加入 2mL PBS/ 管，1400 rpm/min,離心 5min。
[0035](5)上清，將管內(nèi)細(xì)胞彈起，加入0.5mL PBS,混勻，上機(jī)檢測(若不能及時上機(jī)，應(yīng)加入多聚甲醛固定)。
[0036](6)上機(jī)分析結(jié)果如下:CD73、CD90、CD105 大于 95%，為陽性；CD14、CD19、CD34、CD4、5HLA-DR小于2%，為陰性。
[0037]上述說明:按照實(shí)施例中的方法分離培養(yǎng)得到的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，滿足CD73、CD90、CD105 大于 95%，為`陽性；CD14、CD19、CD34、CD4、5HLA_DR 小于 2%，為陰性的結(jié)
果，經(jīng)鑒定為間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0038]上述無菌檢測過程中使用的薄膜過濾法如下:
無菌檢查法包括比薄膜過濾法和直接接種法，薄膜過濾法能避免能有效去除抗生素及其他水溶性物質(zhì)對無菌檢測的干擾，能更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞培養(yǎng)過程中微生物存在的狀態(tài)。
[0039]本實(shí)施方案的無菌檢測采依照《中國藥典2010版》薄膜過濾法檢測，采用HTY-601集菌儀和APY系列培養(yǎng)器。無菌檢測的全過程均在環(huán)境潔凈度10000級下局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，其全過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。隔離系統(tǒng)內(nèi)部環(huán)境的潔凈度符合無菌檢查的要求。
[0040]具體實(shí)施步驟如下:
(I)取出培養(yǎng)器先檢查包裝是否完好無損。檢查用濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45 μ m，直徑約為50_。根據(jù)供試品特性選擇濾膜材質(zhì)，濾器及濾膜使用前應(yīng)經(jīng)適宜的方法滅菌。使用時，應(yīng)保證濾I旲在過濾如后的完整性。
[0041](2)將培養(yǎng)器逐個插放在不銹鋼座上，將培養(yǎng)器的彈性軟管裝入集菌儀泵頭，注意定位準(zhǔn)確，軟管走勢順暢。
[0042](3)潤濕濾膜:選用PH7.0的氯化鈉_蛋白胨緩沖液作為沖洗液，用75%乙醇或0.2%洗潔爾滅仔細(xì)對帶膠塞的沖洗液瓶表面進(jìn)行消毒(特別是容器頂部需要穿刺的部位)，干燥。然后將培養(yǎng)器導(dǎo)管上的針頭插至沖洗液容器膠塞內(nèi)，開啟集菌儀，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為160RMP，啟動約3秒之后倒置沖洗液瓶并置于載瓶架上，每只杯體內(nèi)注入約50ml沖洗液，潤濕濾膜(潤濕液無需濾干)，取下沖洗液瓶直立于操作臺面上，排空液體后停止集菌儀。[0043](4)供試品的稀釋、轉(zhuǎn)移、過濾:用75%乙醇或0.2%洗潔爾滅仔細(xì)對樣品管裝供試品表面進(jìn)行消毒，干燥。打開樣品管的蓋子，將樣品管身以45°C角握住，然后將培養(yǎng)器導(dǎo)管上的針頭插至樣品管的底部，開啟集菌儀，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為160RMP，將供試液轉(zhuǎn)移至杯體內(nèi)并進(jìn)行過濾，待供試液排放盡，停止集菌儀。
[0044](5)沖洗:取下杯體濾杯上端口的彈性護(hù)帽。將針頭插入沖洗液瓶內(nèi)，開啟集菌儀，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為160RMP，再將沖洗液瓶倒置，向每只杯體內(nèi)注入約IOOmL左右沖洗液，沖洗3次。沖洗完成后取下紅色護(hù)帽泄壓，使用黃色帽塞封閉出液口(旋轉(zhuǎn)推緊)，然后將培養(yǎng)基重新放入排液槽中。特別注意:在沖洗時，不建議對杯體進(jìn)行過度振搖，否則導(dǎo)致沖洗液進(jìn)入空氣過濾器。[0045](6)加培養(yǎng)基:
用紅色夾片夾住培養(yǎng)器四通和定位扣處的另外一管。以100R轉(zhuǎn)速啟動集菌儀，再倒置培養(yǎng)基瓶，使所有硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)器杯體內(nèi)。先用綠色夾片夾住另兩管，再把紅色夾片拿掉，注入改良馬丁培養(yǎng)基，儀器操作方法同加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基。當(dāng)兩個杯體全加滿培養(yǎng)基時，用相對應(yīng)的夾片夾住離培養(yǎng)器杯體上方2-3cm處的軟管，同時剪下兩根軟管，留下5-6cm，并將另一頭插入杯體的空氣過濾器處。(剪刀需過酒精燈火焰)
(7)取相應(yīng)的沖洗液同法操作，作為陰性對照。
[0046](8)將已操作完畢的含培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器移出無菌室，取其一管作陽性對照，依陽性對照菌選擇原則加入相應(yīng)對照菌液。
[0047](9)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基在30-35°C培養(yǎng)14天，改良馬丁培養(yǎng)基在23-28°C培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日檢查是否有菌生長，并填寫無菌檢查記錄。如供試品管出現(xiàn)渾濁或沉淀，經(jīng)培養(yǎng)后不能從外觀判斷時，可取該培養(yǎng)液接種在另一支相同新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)2天，真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。
[0048](10)結(jié)果判斷:陽性對照管應(yīng)生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗(yàn)無效。
[0049]若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含。當(dāng)符合下列至少一個條件時，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效:
①無菌檢查試驗(yàn)所用設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查要求；
②回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；
②供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和(或)無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。
【權(quán)利要求】
1.一種培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于:它包括如下步驟: (1)取新鮮采集的人臍帶，清洗，放入臍帶保護(hù)液中2-8°C保存?zhèn)溆?，所述的臍帶保護(hù)液是在AIM-V培養(yǎng)基中加入青霉素鈉和硫酸鏈霉素得到的，其中青霉素鈉和硫酸鏈霉素在臍帶保護(hù)液中的終濃度分別為100-200 U/mL和100-200 U /mL ； (2)取浸泡在臍帶保護(hù)液中不超過48小時的人臍帶，清洗，再依次置臨用新配的青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液中進(jìn)行浸洗，最后再清洗后置于一次性無菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行備用； (3)將無菌清洗過的人臍帶剪成肉糜狀，加入AIM-V培養(yǎng)基，置分離管中用全自動組織分離器進(jìn)行分離，得臍帶組織勻漿； (4)將全自動組織分離器處理好的臍帶組織勻漿進(jìn)行離心，棄上清，收集下層，置于培養(yǎng)瓶中，然后向其中加入無血清培養(yǎng)基，置于36-38°C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)，至觀察到瓶壁上形成多個大小不一、細(xì)胞數(shù)量密集的細(xì)胞島時，則獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞混合液，然后經(jīng)離心，即可獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞，再經(jīng)傳代培養(yǎng)至細(xì)胞融合 度達(dá)80-90%即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述步驟(O中的臍帶保護(hù)液是將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素預(yù)先溶解后再加入到AIM-V培養(yǎng)基(治療級)中得到的；所述步驟(2)中青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液是將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素按一定量加入0.9%氯化鈉注射液中混合得到的；所述每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液的配制是將注射用兩性霉素B先用0.9%氯化鈉注射液溶解后，再和特定量的甲硝唑注射液混合得到的；所述人臍帶在青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50 U兩性霉素B的甲硝唑注射液中的浸洗時間均為8-12min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述步驟(I)和步驟(2)中的清洗均為0.9%氯化鈉注射液清洗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述的步驟(4)為培養(yǎng)5-6天后，取出未貼壁的上層置另一新培養(yǎng)瓶中，向原培養(yǎng)瓶和新培養(yǎng)瓶中均加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并每隔3-4天換液一次，待培養(yǎng)10-15天后即可獲得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代細(xì)胞； 然后將原培養(yǎng)瓶和新培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基完全移出，往原培養(yǎng)瓶和新培養(yǎng)瓶中加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.25%的重組動物胰蛋白酶的磷酸鹽緩沖液浸沒貼壁細(xì)胞，放入36-38°C培養(yǎng)箱保溫消化7-9分鐘，當(dāng)觀察到貼壁細(xì)胞圓縮，且已經(jīng)脫離瓶底后，加入消化液同等體積的無血清培養(yǎng)基終止消化，然后轉(zhuǎn)移至離心管中，離心棄上清，吹勻沉淀在離心管底部的細(xì)胞，再根據(jù)4000-6000個細(xì)胞/cm2接種到培養(yǎng)瓶中，并向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充無血清培養(yǎng)基，置36-38°C、飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)，每3-4天全量換液一次，至貼壁細(xì)胞彼此融合，且融合度達(dá)80-90%，即得人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，在有需要時，可重復(fù)上述操作進(jìn)行多代細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述T25培養(yǎng)瓶可放置不超過5g的人臍帶經(jīng)全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進(jìn)行培養(yǎng)；所述T75培養(yǎng)瓶可放置10-15 g的人臍帶經(jīng)全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進(jìn)行培養(yǎng)；所述T175培養(yǎng)瓶可放置30-35 g的人臍帶經(jīng)全自動組織分離器處理、離心后的下層組織進(jìn)行培養(yǎng)；所述T25培養(yǎng)瓶中需要的無血清培養(yǎng)基的體積為6-8mL ;所述T75培養(yǎng)瓶中需要的無血清培養(yǎng)基的體積 為20-25mL ;所述T175培養(yǎng)瓶中需要的無血清培養(yǎng)基的體積為30_35mL。
【文檔編號】C12N5/0775GK103451151SQ201310243569
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月19日
【發(fā)明者】蔡鵬 , 操春紅, 余順 申請人:武漢道培胎盤干細(xì)胞生物技術(shù)有限公司