專利名稱：一種固定化脂肪酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工及酶工程領(lǐng)域，涉及一種固定化脂肪酶及其制備方法和應(yīng)用，具體地涉及了一種以表面修飾的介孔TiO2為載體來制備固定化脂肪酶的方法，以及該固定化脂肪酶在有機(jī)相中催化酯類合成和拆分手性化合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪酶(lipase，EC 3.1.1.3，甘油三酰酯水解酶)是一種可以催化天然底物三酰甘油酯水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯的酶類。脂肪酶可以催化諸如水解、酯化、轉(zhuǎn)酯等多種類型的反應(yīng)，并且具有較高的立體選擇性、底物專一性和區(qū)域選擇性。作為一種具有多種催化功能的酶，脂肪酶被廣泛應(yīng)用在食品、能源、日化、醫(yī)藥等重要的工業(yè)領(lǐng)域。盡管脂肪酶已經(jīng)被許多科學(xué)家證實(shí)為最重要的工業(yè)用酶之一，但其每年的銷售額只占全世界酶制劑市場的4%。由于游離脂肪酶不能重復(fù)利用、不穩(wěn)定且在有機(jī)相中容易“團(tuán)聚”而失活，這些都使得工業(yè)生產(chǎn)過程中脂肪酶的成本居高不下，另外游離脂肪酶還存在后續(xù)與產(chǎn)物分離不易，不利于連續(xù)化生產(chǎn)等缺陷，這些因素共同制約了脂肪酶在工業(yè)上的大量使用。通過化學(xué)或物理方法可以將脂肪酶固定在水不溶性的載體上將其制備成固定化脂肪酶使得其既能保持了脂肪酶的催化特性同時(shí)又具備了可回收利用，后續(xù)過程中容易與產(chǎn)物分離、能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)等特性。因此，固定化酶將能極大提升脂肪酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍。酶的固定化有吸附、交聯(lián)、包埋以及共價(jià)結(jié)合等方法，其中交聯(lián)和共價(jià)結(jié)合的固定化方式可能會影響到酶的活性中心導(dǎo)致固定化過程中酶活的損失。而靠物理吸附來實(shí)現(xiàn)的固定化過程有著條件溫和、吸附量可控、不存在酶活損失等優(yōu)點(diǎn)。游離酶經(jīng)固定化后，其載體表面的微環(huán)境對提高固定化酶的催化活力和穩(wěn)定性有著重要的影響。脂肪酶在催化油脂類底物水解時(shí)在油水界面有明顯的“界面激活”效應(yīng)。這是由于在脂肪酶活性中心上方覆蓋有一些二級結(jié)構(gòu)(通常所稱的“l(fā)id”蓋子結(jié)構(gòu))，當(dāng)脂肪酶不在油水界面時(shí)，這些“l(fā)id”結(jié)構(gòu)覆蓋在活性中心上方，阻礙了催化底物進(jìn)入到脂肪酶的活性中心，然而，當(dāng)脂肪酶存在于一個(gè)疏水的界面時(shí)，它的分子構(gòu)象發(fā)生了轉(zhuǎn)變，活性部位從一種蓋關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)化為敞開狀態(tài)使得底物能夠進(jìn)入到活性中心。這個(gè)構(gòu)象的改變同時(shí)也導(dǎo)致了脂肪酶暴露出其表面的疏水區(qū)域，通過與這些疏水區(qū)域的相互作用也可以使得脂肪酶的活力得到提高。由此看來，脂肪酶可以通過活性中心周圍的疏水殘基定向的吸附到一些經(jīng)過修飾的疏水材料的表面。因此，這種脂肪酶的“界面激活”機(jī)制也可以作為一種脂肪酶固定化的工具，它提供了一種新的簡便易行的脂肪酶定向固定化方式。固定化酶的載體材料一般有無機(jī)材料、天然高分子材料、合成高分子材料等。一種良好的固定化酶載體材料要有一定的機(jī)械強(qiáng)度，良好的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性。近來興起的二氧化鈦介孔材料作為一種新型的高性能材料備受關(guān)注，在操作過程中二氧化鈦介孔材料可以實(shí)現(xiàn)納米級別孔徑的可控調(diào)節(jié)。這種新型的介孔二氧化鈦材料具有很高的比表面積、孔徑 均一等特點(diǎn)，并且表面富含豐富的活性羥基，容易對其表面進(jìn)行活性修飾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的旨在提供一種高效、穩(wěn)定、分散性好的固定化脂肪酶及其制備方法，使得該固定化脂肪酶可以在有機(jī)相中應(yīng)用于水解、酯化、轉(zhuǎn)酯等多種類型的反應(yīng)。為了解決現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)問題，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下?！?、一種固定化脂肪酶的制備方法，是由固定化載體和吸附在固定化載體上的脂肪酶(lipase，EC 3.1.1.3，甘油三酰酯水解酶)吸附結(jié)合而制得，其特征在于具體制備方法如下:
(O載體制備:
利用硅烷偶聯(lián)劑 對預(yù)處理后的介孔TiO2進(jìn)行表面疏水改性，具體方法為:取預(yù)處理后的介孔TiO2，加入甲苯，預(yù)熱5 20min，再加入硅烷偶聯(lián)劑，在N2保護(hù)下，3(T90°C攪拌，回流反應(yīng)f24h，離心棄上清，將沉淀用甲苯、丙酮、無水乙醇依次分別洗滌后，真空干燥得表面改性的介孔Ti02?？疾炱渲?，所述預(yù)處理的介孔TiO2與甲苯的質(zhì)量體積比按g/mL計(jì)為1:100^500 ;優(yōu)選范圍為1:100 300，最優(yōu)配比為1:200 ；
所述預(yù)處理的介孔TiO2與硅烷偶聯(lián)劑的質(zhì)量摩爾比以g/mmol計(jì)為l(Tl:l，優(yōu)選為
2:1。其中，所述介孔TiO2預(yù)處理的具體方法為:向介孔TiO2中加入混合溶液，5(T90°C攪拌回流廣5 h，離心棄上清，沉淀用蒸餾水洗滌至pH值中性，真空干燥，得預(yù)處理后的介孔 TiO2 ；
所述混合溶液由濃硫酸與30%過氧化氫按體積比9 1:1組成；
所述介孔TiO2與混合溶液的質(zhì)量體積比以g/mL計(jì)為1:1(Γ100。其中，所述的濃硫酸是質(zhì)量濃度98%的濃硫酸，即本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的濃硫酸試劑。所述娃燒偶聯(lián)劑包括但不限于:3_氛丙基二乙氧基娃燒、Y - (2，3_環(huán)氧丙氧基)丙基二甲氧基娃燒、3- (2-氨乙基)-氨丙基二甲氧基娃燒、十六燒基二甲氧基娃燒、或者3_ (苯基氨基)丙基二甲氧基娃燒中的一種或兩種以上；優(yōu)選的娃燒偶聯(lián)劑是3_氨丙基二乙氧基娃燒或者3_ (苯基氣基)丙基二甲氧基娃燒；最優(yōu)選的娃燒偶聯(lián)劑是3_ (苯基氣基)丙基二甲氧基娃燒。(2)脂肪酶的固定化:在表面改性后的介孔TiO2中加入脂肪酶溶液，在2(T50°C下攪拌吸附反應(yīng)3 36h，離心，將沉淀用磷酸緩沖液洗滌直至無蛋白檢出，冷凍干燥，得到固定化脂肪酶。所述表面改性的介孔TiO2與脂肪酶溶液的質(zhì)量體積比以g/mL計(jì)為1: 5飛O。所述脂肪酶溶液的蛋白含量在0.05-5 mg/mL之間。其中，所述的脂肪酶溶液可以選自預(yù)處理后的脂肪酶發(fā)酵液，或者選自經(jīng)緩沖液溶解脂肪酶粉或酶液后的得到的溶液。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識可知，所述的脂肪酶發(fā)酵液，即是通過可分泌脂肪酶的微生物的發(fā)酵后，得到的發(fā)酵體系中包括水、微生物菌體、分泌在發(fā)酵體系中的脂肪酶、以及殘余的培養(yǎng)基成分和其他痕量發(fā)酵副產(chǎn)物的體系。而所述的經(jīng)緩沖液溶解脂肪酶粉或酶液后的得到的溶液，即是將市售的、或者通過其他諸如贈與、制備等途徑得到的脂肪酶的酶粉或酶液溶于緩沖液中，得到的酶溶液。進(jìn)一步地，所述的預(yù)處理后的脂肪酶發(fā)酵液的制備方法是:將脂肪酶發(fā)酵液用IOkDa分子量大小的超濾膜超濾濃縮，再用緩沖液稀釋至蛋白含量在0.05-5 mg/mL,即得到預(yù)處理后的脂肪酶發(fā)酵液。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識可知，用于稀釋酶液的緩沖液，可以選擇蒸餾水、磷酸緩沖、Tris-HCl緩沖、PBS、或者TBS等，即只要能實(shí)現(xiàn)將酶液的蛋白含量和酶液PH值稀釋至本發(fā)明設(shè)定的范圍內(nèi)的本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的緩沖液的，都應(yīng)當(dāng)可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果?；蛘?，所述的經(jīng)緩沖液溶解脂肪酶粉或酶液后的得到的溶液，其蛋白含量同樣為
0.05 5mg/mL。二、本發(fā)明還提供一種采用上述方法制備得到的固定化脂肪酶。三、本發(fā)明所述的固定化脂肪酶在水相中催化水解反應(yīng)的應(yīng)用。作為本應(yīng)用中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式可知，本發(fā)明提供了一個(gè)將所述的固定化脂肪酶在水相中催化油脂類化合物水解制備脂肪酸和甘油的應(yīng)用實(shí)施例。具體地，所述的固定化脂肪酶在PH7.0的磷酸緩沖液中催化底物天然油脂進(jìn)行油脂水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20^600C，反應(yīng)時(shí)間為3 48h，水解率可達(dá)20% 96%。其中，所述的天然油脂包括但不限于:蓖麻油、橄欖油、大豆油、玉米油以及牛油。四、本發(fā)明所述的固定化脂肪酶在有機(jī)相中催化酯化反應(yīng)的應(yīng)用。作為本應(yīng)用中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式可知，本發(fā)明提供了一個(gè)將所述的固定化脂肪酶在有機(jī)相中催化乳酸酯合成的應(yīng)用實(shí)施例。具體地，所述的固定化脂肪酶在有機(jī)溶劑叔丁醇體系中，催·化底物乳酸和醇類進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為2(T60°C，反應(yīng)時(shí)間為24 48h，并向反應(yīng)體系中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的4A分子篩以除去反應(yīng)過程中生成的水，在反應(yīng)結(jié)束后底物乳酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)50°/Γ95%。其中，所述的有機(jī)溶劑、乳酸以及醇類均經(jīng)預(yù)先脫水處理，所述的醇類包括但不限于:甲醇、乙醇、正丁醇。五、本發(fā)明所述的固定化脂肪酶在有機(jī)相中催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的應(yīng)用。作為本應(yīng)用中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式可知，本發(fā)明提供了一個(gè)將所述的固定化脂肪酶在有機(jī)相中催化乙酸肉桂酯合成的應(yīng)用實(shí)施例。具體地，所述的固定化脂肪酶在有機(jī)溶劑異丙醚體系中，催化底物肉桂醇和?；w進(jìn)行酯交換反應(yīng)，反應(yīng)溫度為2(T60°C，反應(yīng)時(shí)間為3 48h，轉(zhuǎn)化率可達(dá)20% 96%。其中，所述的?；w包括但不限于:乙酸乙烯酯、乙酸異丙烯酯、乙酸酐、乙酸乙酯、乙酸丁酯。六、本發(fā)明所述的固定化脂肪酶在有機(jī)相中催化手性拆分的應(yīng)用。作為本應(yīng)用中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式可知，本發(fā)明所述的固定化脂肪酶在正己烷體系中，催化底物1- (2-萘基)乙醇與脂肪酸乙烯酯進(jìn)行酯交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化為脂肪酸-1- (2-萘基)乙酯，反應(yīng)溫度為2(T50°C，反應(yīng)時(shí)間為12tT48h，轉(zhuǎn)化率為50%，產(chǎn)物為R型脂肪酸-1- (2-萘基)乙醇，值>99.9%，拆分后底物為S型1- (2-萘基)乙醇，6 值>99.9%ο其中，所述脂肪酸乙烯酯包括:乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯或者硬脂酸乙烯酯。七、本發(fā)明所述的經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑疏水改性后的介孔TiO2載體在脂肪酶純化中的應(yīng)用。本發(fā)明采用疏水的硅烷偶聯(lián)劑對介孔二氧化鈦材料進(jìn)行修飾后可實(shí)現(xiàn)二氧化鈦微米級別顆粒在有機(jī)相中的均勻分散，避免其由于表面羥基的存在發(fā)生團(tuán)聚，從而提高了將來在有機(jī)相中催化過程中的傳質(zhì)速率。通過這種疏水硅烷偶聯(lián)劑修飾的介孔二氧化鈦材料來對脂肪酶進(jìn)行吸附來實(shí)現(xiàn)脂肪酶的定向固定化，不僅可以直接從脂肪酶發(fā)酵粗酶液中選擇性的吸附脂肪酶，而且可能觸發(fā)脂肪酶的“界面激活”效應(yīng)，另外這種材料較小的顆粒和大的比表面積也使得固定化后的脂肪酶能很好的均勻分散在反應(yīng)體系當(dāng)中從而提高反應(yīng)過程中的傳質(zhì)速率，使得脂肪酶的催化效率得到提升。本實(shí)驗(yàn)對固定化脂肪酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性進(jìn)行考察:最適反應(yīng)溫度的測定在0.05 M Na2HP04*12H20-NaH2P04*2H20緩沖體系(pH 7.0)中進(jìn)行，在不同的溫度下以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)。結(jié)果如圖3所示，固定化脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為50°C，與游離酶相同，與游離酶相比，固定化脂肪酶的溫度適應(yīng)范圍更廣。溫度穩(wěn)定性考察:將固定化脂肪酶和游離脂肪酶分別在30°C、40°C、50°C、6(rC、70°C、80°C條件下水浴鍋中保溫Ih和3h，測定其在40°C條件下的脂肪酶殘余活力。由圖4可以看出，固定化脂肪酶表現(xiàn)出了更好的穩(wěn)定性，在60°C條件下處理3h后，固定化脂肪酶保留了大約84.4%的活力，而在此條件下的游離酶則僅保留了 40.7%的初始酶活。固定化酶在60°C條件下處理3h相比處理Ih僅下降了 3.7%的酶活力，而游離酶在2h內(nèi)下降了約16%的活力。固定化脂肪酶和游離酶的 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性的檢測:以不同pH緩沖液溶解的對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物，以最高的酶活力為對照(100%)。不同pH體系中的酶活如圖5所示，固定化脂肪酶YCJOl的最適反應(yīng)pH為7.0，游離酶最適反應(yīng)pH為7.5。以原始酶液的脂肪酶活力為對照，檢測固定化脂肪酶和游離酶的PH穩(wěn)定性。將固定化脂肪酶和游離酶加入到不同PH的緩沖溶液中30°C保溫Ih后測殘余酶活，實(shí)驗(yàn)表明固定化脂肪酶在pH
6.(T9.0的范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性(如圖6所示)。本發(fā)明的有益效果在于:
1.本發(fā)明采用經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑修飾的介孔TiO2為載體，對脂肪酶進(jìn)行了固定化，經(jīng)修飾后的載體可以選擇性的從脂肪酶發(fā)酵粗酶液中選擇性的吸附脂肪酶蛋白以達(dá)到純化的目的且固定化過程中脂肪酶活力回收率高，并且載體表面的微環(huán)境對脂肪酶有一個(gè)明顯的激活作用。2.經(jīng)固定化后的脂肪酶較游離酶相比展現(xiàn)出了更好的溫度和pH穩(wěn)定性。3.經(jīng)固定化后的脂肪酶在非水相催化過程中的反應(yīng)速率相比游離脂肪酶得到了很大提高，并且重復(fù)使用性能好。4.本發(fā)明中所制得的硅烷偶聯(lián)劑修飾的介孔TiO2載體可用作一種專一性的脂肪酶純化載體，并且該載體機(jī)械強(qiáng)度高，生物相容性好，粒徑小而均勻，且可耐酸耐鹽腐蝕。5.本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，還證實(shí)了本發(fā)明所述的固定化脂肪酶能轉(zhuǎn)移性地吸附脂肪酶發(fā)酵液中的脂肪酶，該技術(shù)效果使得發(fā)明的固定化脂肪酶中的固定化載體可以直接應(yīng)用于脂肪酶發(fā)酵液中吸附脂肪酶直接制得固定化脂肪酶，而現(xiàn)有技術(shù)的固定化脂肪酶還無法直接在脂肪酶發(fā)酵液中直接制備，基本需要先將脂肪酶發(fā)酵液中的脂肪酶進(jìn)行純化后，再進(jìn)行純化酶的固定化。實(shí)施例證明，所述的載體經(jīng)添加(NH4)2SOJ^pH 7.25的Tris-HCl緩沖平衡后加入經(jīng)上述緩沖透析處理后的脂肪酶發(fā)酵粗酶液上樣，采用含有乙醇的Tris-HCl緩沖進(jìn)行洗脫，收集脂肪酶活力洗脫峰，測定脂肪酶酶活以及蛋白含量，計(jì)算純化過程中的參數(shù)。結(jié)果顯示純化前后脂肪酶的比活力可提升3.4^6倍，純化過程中活性回收率可達(dá)40% 80%。6.本發(fā)明方法簡單，易于操作，制備成本低廉，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。


圖1顯示本發(fā)明中固定化脂肪酶和介孔TiO2的掃描電鏡照片(SEM)；
圖2顯示本發(fā)明中固定化脂肪酶固定化過程中電泳圖，其中泳道1:吸附前的粗酶液；泳道2:吸附后的酶液；泳道3:固定化脂肪酶解吸后蛋白溶液；泳道4:濃縮后脂肪酶粗酶液；
圖3顯示本發(fā)明中固定化脂肪酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度，固定化脂肪酶(.)、游離酶(■);
圖4顯示本發(fā)明中固定化脂肪酶和游離酶的溫度穩(wěn)定性(在各溫度條件下分別放置Ih和3h后的殘余活力)，固定化酶Ih (▲)、游離酶Ih (■)、固定化酶3h (▼)、游離酶3h(.);
圖5顯示本發(fā)明中固定化脂肪酶和游離酶的最適反應(yīng)pH，固定化酶(■)、游離酶(.)；圖6顯示本發(fā)明中固定化脂肪酶和游離酶的pH穩(wěn)定性(在各pH條件下分別放置Ih后的殘余活力)，緩沖液為 0.05M Citiric acid-citrate sodium (pH 5.0-6.0)(固定化酶(▲)、游離酶(Λ))、0.05M Na2HPO4-NaH2PO4(pH 6.0-7.5)(固定化酶( )、游離酶( ))、0.05M Tris-HCKpH 7.5-9.0)(固定化酶(■)、游離酶(□))、().05M Glycine-NaOH (pH9.0-10.6)(固定化酶(.)、游離酶`(〇));
圖7顯示本發(fā)明中固定化脂肪酶和脂肪酶粉在乙酸肉桂酯合成中的重復(fù)利用率。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體詳細(xì)實(shí)例對本發(fā)明所采用的固定化方法及其帶來的技術(shù)效果作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于此:
實(shí)施例一
本實(shí)驗(yàn)說明脂肪酶粗酶液的制備過程。^XBurkholderia ambifaria YCJOl (保藏編號 CCTCC NO:M 2011058，專利
發(fā)明者何冰芳, 李文豪, 汪斌, 趙洋陽, 吳斌 申請人:南京工業(yè)大學(xué)