專利名稱：位點(diǎn)突變的高活熱穩(wěn)定性納豆激酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種新型納豆激酶編碼基因及多肽，特別是一種因位點(diǎn)突變引起的活性和熱穩(wěn)定性均提高的納豆激酶基因。本發(fā)明還涉及此基因在制備納豆激酶方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
:當(dāng)前高活、廉價(jià)、安全的溶栓藥物發(fā)現(xiàn)是解決血栓疾病的關(guān)鍵。納豆激酶(nattokinase，NK)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最好的具有溶栓作用的生物酶之一，在溶解血栓方面具有高效、安全、價(jià)格低廉、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，一直備受食品、生物及醫(yī)藥界研究人士的關(guān)注和重視。納豆激酶是由納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus natto)分泌表達(dá)的堿性絲氨酸蛋白酶，具有高效的纖維蛋白溶解活性。納豆激酶由aprN基因編碼，含有由29個(gè)亞基組成的信號(hào)肽，77個(gè)亞基組成的前導(dǎo)肽和275個(gè)亞基組成的成熟多肽，成熟肽分子量27.7KDa。NK活性中心包括催化三聯(lián)體(Asp32、His64和Ser221)，氧離子洞(Asnl55)和底物結(jié)合位點(diǎn)(Serl25、Leul26和Glyl27)0獲得高活、熱穩(wěn)定性納豆激酶基因是研究溶栓納豆激酶類保健食品及藥品的關(guān)鍵；發(fā)現(xiàn)納豆激酶中的相關(guān)活性區(qū)域或者位點(diǎn)，對(duì)于研究該酶的相關(guān)分子機(jī)制，及定向改造出更好的納豆激酶類保健食品及新藥具有重要的意義
發(fā)明內(nèi)容
:
本發(fā)明的目的是提供一種能夠提高納豆激酶活性和熱穩(wěn)定性的基因以及蛋白。本發(fā)明的第一方面，提供高活熱穩(wěn)定性納豆激酶多肽，它包含:具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組:(a)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO:2氨基酸序列不穩(wěn)定區(qū)169-178、203-216、223-230、234-243、260-274和345-363經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換而形成的，且具有更高納豆激酶活性和/或熱穩(wěn)定性的由(a)衍生的多肽。本發(fā)明的第二方面，提供編碼這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組:(a)編碼上述納豆激酶的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首先通過分子克隆方法從高活熱穩(wěn)定性納豆激酶生產(chǎn)菌 Bacillus subitilis BSNK-T160 (CGMCC N0.6714)獲得納豆激酶全基因(SEQ IDNO:1所示序列，編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0:2)，構(gòu)建該基因的大腸桿菌重組表達(dá)體系，重組酶活性和熱穩(wěn)定性分析證實(shí)位于不穩(wěn)定區(qū)段169-178和223-230的175和225位氨基酸殘基替換導(dǎo)致納豆激酶活性和熱穩(wěn)定性提高。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本發(fā)明還提供納豆激酶的類似物，這些類似物與納豆激酶的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然的、突變的或者合成的遺傳變異體。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。編碼多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ IDNO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括 單點(diǎn)或多點(diǎn)取代變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明的納豆激酶核苷酸全長(zhǎng)序列通常可以用PCR擴(kuò)增法、人工合成、或重組法的方法獲得。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可用重組法大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列來表達(dá)或生產(chǎn)重組的納豆激酶多肽。一般來說有以下步驟:(I).用本發(fā)明的編碼納豆激酶多肽的多核苷酸，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體和宿主細(xì)胞，如何進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白表達(dá)及分離純化。


圖1為BSNK-T160納豆激酶全基因aprN’的PCR擴(kuò)增電泳圖。圖中，從左到右分別為核酸marker和aprN’ ；目標(biāo)片段長(zhǎng)度1164bp,核酸marker分子量分別為 5000、3000、2000、1500、1000、800、500 和 300bp ；圖2為BSNK-T160納豆激酶全基因aprN’與T載體鏈接的酶切驗(yàn)證圖。圖中，EcoRI和 SacI 雙酶切 pEASY-Tl 與 aprN’ 連接載體；pEASY_Tl 為 3928bp，aprN，為 1164bp,核酸 marker 同圖1。圖3為NK與NK ’序列比較圖。NK’是aprN’編碼的氨基酸序列，即SEQ ID NO:2所示序列，NK’中突變氨基酸用矩形方框標(biāo)記，共計(jì)兩個(gè)位點(diǎn)，175位Thr變?yōu)锳la，位于成熟肽的第66位；225位Ser變?yōu)镻ro，位于成熟肽的116位。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明的方法，而不用于限制本發(fā)明的范圍。凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件。實(shí)施例1BSNK-T160納豆激酶全基因(核苷酸序列SEQ ID NO:1)的克隆根據(jù)aprN核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性引物，上下游引物分別含有EcoRI和SacI雙酶切位點(diǎn)。從BSNK-T160基因組DNA中擴(kuò)增出完整的核苷酸序列SEQ ID NO:1。其中，BSNK-T160是發(fā)明人通過6tlCo-Y輻照實(shí)驗(yàn)室分離保存的納豆激酶生產(chǎn)菌BSNK-5后篩選獲得的一株高活熱穩(wěn)定性菌株，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為=CGMCC N0.6714。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如附圖1所示。切取目標(biāo)片段，連接到pEASY-Tl載體上。利用氯化鈣轉(zhuǎn)化法，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TransI感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡那霉素(50μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)。挑取白色菌落，接種于3ml LB+Km液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，堿裂解法提取重組質(zhì)粒，EcoRI和SacI雙酶切驗(yàn)證(圖2)。測(cè)序獲得基 因序列。實(shí)施例2序列比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果分析可知BSNK-T160編碼的納豆激酶全基因aprN’ (SEQ ID NO:1)全長(zhǎng)1164bp。翻譯的蛋白序列NK’ (SEQ ID NO:2)含有387個(gè)氨基酸；信號(hào)肽序列從4到32，共計(jì)29個(gè)氨基酸；前導(dǎo)肽從33到109，共計(jì)77個(gè)氨基酸；成熟肽從110到384，共計(jì)275個(gè)
氨基酸。與aprN相比，aprN’共有4個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生突變，106位核苷酸由A變?yōu)镚，密碼子由AAA到AAG，481位核苷酸由T變?yōu)镃，密碼子由GTT變?yōu)镚TC，只是第三位密碼子變化，未發(fā)生氨基酸變化，為同義突變；524位核苷酸由A變?yōu)镚，密碼子由ACG變?yōu)镚CG，氨基酸由T175變?yōu)锳175，位于成熟肽的第66位；674位核苷酸由T變?yōu)镃，密碼子由TCC變?yōu)镃CC，氨基酸由S225變?yōu)镻225，位于成熟肽的116位。具體比對(duì)結(jié)果如附圖3所示，NK’是aprN’編碼的氨基酸序列，即SEQ ID N0:2所示序列，NK’中突變氨基酸用矩形方框標(biāo)記，共計(jì)兩個(gè)位點(diǎn)，即175位由Thr變?yōu)锳la，位于不穩(wěn)定區(qū)段169-178之間；225位由Ser變?yōu)镻ro，位于不穩(wěn)定區(qū)段223-230之間。實(shí)施例3構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)體系及分子驗(yàn)證EcoRI和SacI雙酶切pEASY-Tl上連接的aprN’基因，與經(jīng)過相同酶切的E.coll表達(dá)載體pET28a連接，構(gòu)建表達(dá)此基因的大腸桿菌表達(dá)載體。利用氯化鈣轉(zhuǎn)化法，將重組載體轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)12小時(shí)。轉(zhuǎn)化方法如下:I)取10μ L過夜連接產(chǎn)物加到I管感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰上放置 30min ；2)將離心管置于42°C水浴中熱激90s，不要晃動(dòng)離心管；
3)迅速將離心管置于冰上，冷卻2min ；4)加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基，37°C，150rmp搖床培養(yǎng)45min ；5)取200 μ L培養(yǎng)液涂布于相應(yīng)的抗生素平板篩選轉(zhuǎn)化子。挑取菌落，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，EcoRI和SacI雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證，得到一株含該核苷酸序列表達(dá)載體的重組菌株BL21pLysS (pET28a_aprN’)。實(shí)施例4重組納豆激酶的活性和熱穩(wěn)定性分析1、方法將BL21pLysS (pET28a_aprN’ )以2%的接菌量接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素濃度50 μ g/mL)中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度
0.1mM, 16°C誘導(dǎo)18h，離心收集菌體，超聲波破碎得上清。Ni樹脂分離純化的重組酶NK’。以重組酶NK為對(duì)照，分析NK’的活性和熱穩(wěn)定性。纖維蛋白平板法檢測(cè)納豆激酶活力，具體實(shí)施方法參照Astrup法(Astrup T.andMullertz S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity.Arch.Biochem.Biophys.(1952)40(2).);根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶的活力單位,尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考馬明等的方法(馬明等.高納豆激酶酶活枯草芽孢桿菌的篩選及菌種鑒定.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2006, (8):29-32.)。65°C熱處理20min,纖維蛋白平板法檢測(cè)熱穩(wěn)定性。2、結(jié)果對(duì)分離純化的BL21pLysS (pET28a_aprN，)和對(duì)照菌株 BL21pLysS (pET28a_aprN)表達(dá)的重組酶NK’和NK進(jìn)行了活性和熱穩(wěn)定性分析，突變酶NK’在37°C的纖維蛋白溶解活性比對(duì)照酶NK提高了 11.18% ;65°C處理20min后對(duì)照酶NK完全失去活性，而突變酶NK’仍保留18U/mg的活性，具體結(jié)果見附表I。以上結(jié)果表明NK中與活性和熱穩(wěn)定性有關(guān)的位點(diǎn)分別為175位Ala，位于不穩(wěn)定區(qū)段169-178之間；225位Pro，位于不穩(wěn)定區(qū)段223-230之間。兩個(gè)不穩(wěn)定區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基替換使得NK的活性和熱穩(wěn)定性發(fā)生明顯提高。表INK與NK’的活性和熱穩(wěn)定性分析(活力單位為U/mg)
權(quán)利要求
1.一種納豆激酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.權(quán)利要求I所述的基因,其活性位點(diǎn)位于如SEQID NO: I的核苷酸序列的106位、481位、524位和674位。
3.權(quán)利要求I所述的基因，與野生型納豆激酶基因aprN相比，共有4個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生突變106位核苷酸由A變?yōu)镚，密碼子由AAA到AAG ；481位核苷酸由T變?yōu)镃，密碼子由GTT變?yōu)镚TC ；524位核苷酸由A變?yōu)镚，密碼子由ACG變?yōu)镚CG ；674位核苷酸由T變?yōu)镃，密碼子由TCC變?yōu)镃CC。
4.權(quán)利要求I所述基因在制備高活、熱穩(wěn)定性納豆激酶中的應(yīng)用。
5.—種納豆激酶多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
6.權(quán)利要求5所述的多肽，與天然納豆激酶相比，特征是SEQID NO:2的一個(gè)或一個(gè)以上不穩(wěn)定區(qū)經(jīng)過氨基酸殘基的替換形成具有更高納豆激酶活性和/或熱穩(wěn)定性的多肽，所述不穩(wěn)定區(qū)選自 SEQ ID NO:2 ψ 169-178、203-216、223-230、234-243、260-274 和345-363。
7.權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述替換是不穩(wěn)定區(qū)169-178和不穩(wěn)定區(qū)223-230發(fā)生單個(gè)氨基酸替換。
8.權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述替換是不穩(wěn)定區(qū)169-178的175位Thr變?yōu)锳la；不穩(wěn)定區(qū)223-230的225位Ser變?yōu)镻ro。
9.權(quán)利要求5 8任一所述的多肽在制備納豆激酶類產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明從高活熱穩(wěn)定性納豆激酶生產(chǎn)菌中獲得了一種活性和熱穩(wěn)定性均提高的納豆激酶基因。經(jīng)酶活性和熱穩(wěn)定性分析，證實(shí)位于不穩(wěn)定區(qū)段169-178和223-230的175和225位氨基酸殘基替換導(dǎo)致納豆激酶活性和熱穩(wěn)定性提高。本發(fā)明還涉及此基因在制備納豆激酶方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/57GK103255156SQ20131021113
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月30日
發(fā)明者唐選明, 李淑英, 聶瑩 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所