專利名稱：2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及大黃魚分子育種，尤其是涉及2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記及其制備方法。
背景技術：
大黃魚是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類，自1987年突破人工繁殖以來，大黃魚養(yǎng)殖規(guī)模和范圍不斷擴大，至2010年，已形成年產(chǎn)8.6萬噸，產(chǎn)值約65億元的產(chǎn)業(yè)。但隨之而來的種質(zhì)退化、生長減緩、病害頻發(fā)等問題也日益嚴重，因此亟待對大黃魚進行遺傳改良。集美大學、寧德市水產(chǎn)技術推廣站等單位在各類項目的資助下，從“十五”期間開展大黃魚的人工選育技術，至“十一五”末通過選擇育種結合雌核發(fā)育技術培育出大黃魚的第I個品種“閩優(yōu)I號”，該品種生長速度提高23.9%，成活率提高13.7%，“閩優(yōu)I號”選育的成功對于提升大黃魚產(chǎn)業(yè)起到良好的促進作用。然而，“閩優(yōu)I號”的選育歷經(jīng)10年五代時間，費時費力，主要原因是常規(guī)的選育是根據(jù)性狀的表型而不是基因型進行選擇，對目標性狀缺乏預選手段，育種周期長、效率低?，F(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展，使直接根據(jù)與性狀相關的基因或分子標記進行選擇成為可能。分子標記有廣義和狹義之分，廣義的分子標記是指遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白；狹義的分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。分子標記由于不受發(fā)育階段、不同組織的影響，能夠在早期實現(xiàn)快速、準確的選擇，大大縮短育種周期。迄今為止，發(fā)展起來的分子標記主要有以RFLP為代表的第一代分子標記，以微衛(wèi)星為代表的第二代分子標記和以SNP為代表的第三代分子標記([3]劉云國(主編)，劉賢德，高煥,李朝霞,杜常青(副主編)，水產(chǎn)生物DNA分子標記技術[M],北京:科學出版社，2009 ;[4]鮑寶龍，王志勇，張士璀等，水產(chǎn)基因組學技術[M].北京:化學工業(yè)出版社，2011)。第一代RFLP標記由于檢測步驟過于繁瑣現(xiàn)已淘汰，第三代分子標記對檢測手段要求較高，常規(guī)實驗室大多還沒有這個條件，因而目前在水產(chǎn)方面的應用還不是很多。微衛(wèi)星作為第二代分子標記，由于具有容易檢測、多態(tài)性高、重復性好、共顯性遺傳等特點，在水產(chǎn)生物遺傳圖譜構建、親緣關系剖分、遺傳參數(shù)估計、生長或抗逆標記篩查等研究中得到了廣泛地應用([5]葉華，大黃魚SSR遺傳連鎖圖譜的構建及生長相關性狀的QTL定位[D].湖南農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2010 ;[6]Liu，X.D.，Zhao，G.T.，Wang, Z.Y.，Caij M.Y.，Yej H.，Wang, Q.R.，Parentage assignment and parentalcontribution analysis in large yellow croaker (Larimichthys crocea)usingmicrosatellite markers[J].Current Zoology,2012，58:244-249 ； [7]Liu，X.，Zhao, G.T.，CaijM.Y.，Wang, Z.，Estimated genetic parameters for growth-related traitsin large yellow croaker Larimichthys crocea using microsatellites to assignparentage [J] .Journal of fish biology，2013，82:34-41)，如:薛良義等([8]薛良義，孫升，肖章奎，楊巧一，葉放，童麗娟，大黃魚肌肉生長抑制素基因微衛(wèi)星序列多態(tài)性分析[J].中國生物化學與分子生物學報，2008,24:980-985)研究了大黃魚肌肉生長抑制素基因3’端非編碼區(qū)微衛(wèi)星序列多態(tài)性與體長、體質(zhì)量的關系，發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列長度與大黃魚體長、體質(zhì)量之間的相關系數(shù)沒有達到顯著水平(P>0.05);高國強等([9]高國強，常玉梅，韓啟霞，池炳杰，李明云，薛良義，梁利群，大黃魚耐低溫性狀相關微衛(wèi)星標記的篩選[J].遺傳，2010，32 =248-253)進行了大黃魚耐低溫標記的篩選，找到一個標記(LYC0002)可能與耐低溫有關；劉賢德等([10]劉賢德，韋信鍵，蔡明夷，劉洋，王志勇，大黃魚22個微衛(wèi)星標記在F1家系中的分離方式及與生長性狀的相關分析[J].水產(chǎn)學報，2012，36:1322-1329)研究了 I個大黃魚F1家系150個個體22個微衛(wèi)星位點的基因型分布，并分析了標記位點與生長性狀的相關性，結果得出LYC0077位點與體質(zhì)量、體長和體高均呈顯著相關(P〈0.05)、LYCOO15和LYC0243與體高呈顯著相關(P〈0.05)，對體長、體質(zhì)量的影響不顯著(P>0.05)。以上研究都是基于一個群體的研究，對其在其他群體的通用性如何，沒有進行系統(tǒng)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記及其制備方法。所述2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記為LYC0088和LYC0143，所述LYC0088 的引物序列如 SEQUENCE LISTING I 和 SEQUENCE LISTING 2 所示，所述 LYCO143 的引物序列如 SEQUENCE LISTING 3 和 SEQUENCE LISTING 4 所示；在 LYC0088 和 LYC0143 位點，按照擴增產(chǎn)物從小到大的順序，對生長有利的基因型均為AB，基因型組合為AB/AB。所述2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記的制備方法包括以下步驟:I)快速生長微衛(wèi)星標記篩選:從I個全同胞家系中選出體質(zhì)量最大的30尾和最小的30尾，測定體長、體高和體質(zhì)量，提取基因組DNA，以選定的標記進行基因分型，根據(jù)個體基因型的分析結果結合個體體長、體高和體質(zhì)量數(shù)據(jù)，應用方差分析或者t檢驗的方法，篩選與體長、體高和體質(zhì)量相關 的微衛(wèi)星標記，最后得出LYC0143、LYC0088與大黃魚體長、體高和體質(zhì)量均相關極顯著(P〈0.01), LYC0200與體長相關顯著(P〈0.05)；在步驟I)中，所述全同胞家系的家系數(shù)量超過200尾；所述以選定的標記進行基因分型，可選定32個微衛(wèi)星標記進行基因分型，其中微衛(wèi)星引物序列見附表SEQUENCELISTING I SEQUENCE LISTING 64。2)快長微衛(wèi)星標記的初步驗證:為確保所獲標記的有效性，將篩選到的標記在同一家系更多的個體中進行初步驗證，從所述同一家系余下的個體中選擇60個體質(zhì)量值居中的個體，針對篩選到的微衛(wèi)星標記進行基因分型后，與步驟I)標記篩選所用數(shù)據(jù)合并在一起進行分析，檢測是否還存在相關性，最終得出位點LYC0088和LYC0143與體長、體高、體質(zhì)量相關均極顯著(P〈0.01)；3)再次驗證:對在家系擴大驗證后依然存在相關性的標記，在群體(與步驟1，2所用材料不同)中進行進一步驗證，從群體中選出體質(zhì)量最大的30尾和最小的30尾，對步驟I)和步驟2)篩選到的標記(即LYC0088和LYC0143)進行基因分型后，結合體長、體高和體質(zhì)量數(shù)據(jù)進行驗證分析，經(jīng)再次驗證，LYC0088、LYC0143與生長性狀仍存在緊密相關性，其中LYC0088與體高、體質(zhì)量均相關極顯著(P〈0.01)，與體長相關顯著(？〈0.05)，LYCO143與體長和體質(zhì)量相關顯著(P〈0.05)，與體高相關性極顯著(P〈0.01)。在步驟3)中，所述群體的數(shù)量超過200尾。
所述2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記可在大黃魚體長、體高和體質(zhì)量選擇育種中和在大黃魚快速生長微衛(wèi)星標記篩選中應用。本發(fā)明給出了大黃魚快速生長性狀相關的微衛(wèi)星標記的篩選、鑒定以及利用這些標記輔助大黃魚快速生長品系的選育工作。篩選到2個與大黃魚生長性狀緊密相關的微衛(wèi)星標記，并建立一種快速、有效地利用微衛(wèi)星標記檢測大黃魚優(yōu)良個體的方法，為優(yōu)良親本篩選提供參考。與常規(guī)育種方法相比，該方法的最大優(yōu)點是可以縮短育種進程，提高選育效率。
具體實施例方式以下實施例將對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1:快長微衛(wèi)星標記的篩選方法所用大黃魚材料系福建省某實驗基地利用人工授精方法培育的全同胞家系(記為FS)，從FS中采集208尾大黃魚，以體質(zhì)量為衡量指標，挑選最重的和最輕的各30尾，測定每尾大黃魚的體長、體高和體質(zhì)量。剪取部分尾鰭，固定于95%乙醇中用于DNA提取。DNA的提取與檢測用常規(guī)的苯酚/氯仿/異戊醇法抽提DNA，紫外分光光度計測定OD260與OD28tl,確定DNA的質(zhì)量并將DNA濃度調(diào)至50ng/ μ L，保存于一 20°C備用。PCR及檢測PCR反應體系:反應總體積為20 μ L，其中模板DNA l.0yL (50ng),10XPCR buffer 2.0 μ L, 25mmol/L MgCl2 1.6 μ L，lOmmol/L dNTPs 0.14 μ L，lOmmol/L 引物對各0.2yL，5U/yL Taq酶0.1 μ L，純水14.76 μ L。實驗中所用的微衛(wèi)星引物如序列表SEQUENCE LISTING1 SEQUENCE LISTING64 所示。PCR 反應程序:95°C 5min ；94°C 30s，退火溫度 30s，72 °C 30s，循環(huán) 30 次；72°CIOmin ;15°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用銀染方法進行檢測。等位基因大小用IObp DNA Ladder (Invitrogen, USA)為參照標準對電泳條帶進行判讀。結果判讀將電泳圖譜拍照，依據(jù)Marker確定每個擴增條帶(等位基因)的大小，按照從小到大的順序，將等位基因分別標為A、B、C、D...。統(tǒng)計分析利用SAS V8.0軟件對微衛(wèi)星位點與大黃魚主要生長性狀(包括體長、體高和體質(zhì)量)之間的相關性進行分析，如果該位點只含有2個基因型，采用雙側T檢驗(two-tailed T test)，如果該位點含有3個以上基因型，則進行ANOVA分析，F(xiàn)檢驗顯著的進行多重比較(Duncan法)。用于基因型效應分析的線性模型公式如下:Yij = μ +gi+ ε式中:yu為大黃魚某性狀第i個標記第j個個體表型值，μ為群體平均值，gi為第i個標記的效應值，ε Jj為隨機誤差。經(jīng)分析，得出LYC0143、LYC0088與大黃魚體長、體高和體質(zhì)量均相關極顯著(Ρ〈0.01)，LYC0200與體長相關顯著(Ρ〈0.05)，與體質(zhì)量、體高相關不顯著(Ρ>0.05)，大黃魚快長標記初步篩選結果參見表I。 表I
權利要求
1.2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記，其特征在于為LYC0088和LYC0143，所述LYC0088 的引物序列如 SEQUENCE LISTING I 和 SEQUENCE LISTING 2 所示，所述 LYCO143 的引物序列如 SEQUENCE LISTING 3 和 SEQUENCE LISTING 4 所示；在 LYC0088 和 LYC0143 位點，按照擴增產(chǎn)物從小到大的順序，對生長有利的基因型均為AB，基因型組合為AB/AB。
2.如權利要求1所述2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記的制備方法，其特征在于包括以下步驟: O快速生長微衛(wèi)星標記篩選:從I個全同胞家系中選出體質(zhì)量最大的30尾和最小的30尾，測定體長、體高和體質(zhì)量，提取基因組DNA，以選定的標記進行基因分型，根據(jù)個體基因型的分析結果結合個體體長、體高和體質(zhì)量數(shù)據(jù)，應用方差分析或者t檢驗的方法，篩選與體長、體高和體質(zhì)量相關的微衛(wèi)星標記，最后得出LYC0143、LYC0088與大黃魚體長、體高和體質(zhì)量均相關極顯著，P<0.01, LYC0200與體長相關顯著，P<0.05 ； 2)快長微衛(wèi)星標記的 初步驗證:為確保所獲標記的有效性，將篩選到的標記在同一家系更多的個體中進行初 步驗證，從所述同一家系余下的個體中選擇60個體質(zhì)量值居中的個體，針對篩選到的微衛(wèi) 星標記進行基因分型后，與步驟I)標記篩選所用數(shù)據(jù)合并在一起進行分析，檢測是否還存在相關性，最終得出位點LYC0088和LYC0143與體長、體高、體質(zhì)量相關均極顯著，P〈0.01 ； 3)再次驗證:對在家系擴大驗證后依然存在相關性的標記，在群體中進行進一步驗證，從群體中選出體質(zhì)量最大的30尾和最小的30尾，對步驟I)和步驟2)篩選到的標記，即LYC0088和LYC0143進行基因分型后，結合體長、體高和體質(zhì)量數(shù)據(jù)進行驗證分析，經(jīng)再次驗證，LYC0088、LYCO143與生長性狀仍存在緊密相關性，其中LYC0088與體高、體質(zhì)量均相關極顯著，P〈0.01，與體長相關顯著，P〈0.05，LYCO143與體長和體質(zhì)量相關顯著，P〈0.05，與體高相關性極顯著，P〈0.01。
3.如權利要求2所述2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述全同胞家系的家系數(shù)量超過200尾；所述以選定的標記進行基因分型，選定32個微衛(wèi)星標記進行基因分型，其中微衛(wèi)星引物序列見SEQUENCE LISTING I SEQUENCE LISTING 64。
4.如權利要求2所述2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述群體的數(shù)量超過200尾。
5.如權利要求1所述2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記在大黃魚體長、體高和體質(zhì)量選擇育種中應用。
6.如權利要求1所述2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記在大黃魚快速生長微衛(wèi)星標記篩選中應用。
全文摘要
2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記及其制備方法，涉及大黃魚分子育種。所述2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記為LYC0088和LYC0143，所述LYC0088的引物序列如SEQUENCE LISTING 1和SEQUENCE LISTING 2所示，所述LYC0143的引物序列如SEQUENCE LISTING 3和SEQUENCE LISTING 4所示。1)快速生長微衛(wèi)星標記篩選；2)快長微衛(wèi)星標記的初步驗證；3)再次驗證。所述2個與大黃魚快速生長相關的微衛(wèi)星標記可在大黃魚體長、體高和體質(zhì)量選擇育種中和在大黃魚快速生長微衛(wèi)星標記篩選中應用。
文檔編號C12Q1/68GK103224931SQ20131013495
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權日2013年4月18日
發(fā)明者劉賢德, 王志勇, 隋班良, 蔡明夷 申請人:集美大學