專利名稱：固定化乙醛脫氫酶及其制備方法
固定化乙醛脫氫酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及固定化乙醛脫氫酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖(chitosan)是從奸、蟹等甲殼類動(dòng)物的外殼中提取的一種氨基多糖,其來源豐富，應(yīng)用十分廣泛。殼聚糖分子中游離氨基較多且無毒、生物相容性好。殼聚糖作為固定化酶載體還具有機(jī)械性能好，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱性好以及使酶免受金屬離子抑制等優(yōu)點(diǎn)。雙功能試劑如戊二醛等與殼聚糖及酶蛋白上的氨基均能發(fā)生Schiff反應(yīng)，因此可用來作為固定化酶的交聯(lián)劑。目前國(guó)內(nèi)外已有不少研究者將殼聚糖作為酶固定化的載體，其開發(fā)應(yīng)用前景十分廣泛。乙醒脫氫酶(EC1.2.1.10, Acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)屬于氧化還原酶類，廣泛存在于真核生物和原核生物中，在輔酶I存在的條件下，它催化包括乙醇在內(nèi)的某些一級(jí)或二級(jí)醇、醛、酮的脫氫反應(yīng)。在人類和其他許多動(dòng)物體內(nèi)，線粒體乙醛脫氫酶能把對(duì)生物體有害的醇類轉(zhuǎn)化，所以在細(xì)胞解毒研究中乙醛脫氫酶受到高度關(guān)注；同時(shí)乙醛脫氫酶在分子生物學(xué)及相關(guān)疾病的檢測(cè)方面也有很多應(yīng)用。因此，乙醛脫氫酶的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。目前，有關(guān)乙醛脫氫酶固定化的報(bào)道相對(duì)較少，本文以殼聚糖作為載體，采用吸附交聯(lián)法固定乙醛脫氫酶，確定了酶固定化的最佳條件，并對(duì)固定化乙醛脫氫酶的部分性質(zhì)進(jìn)行了探討。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種固定化乙醛脫氫酶的制備方法，其簡(jiǎn)便易行、成本較低。

上述技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種固定化乙醛脫氫酶的制備方法，其特征在于包括:I):乙醛脫氫酶溶液的制備:稱取2g的粗酶粉，先加入20ml_40ml的濃度為5mmol/L的NaHCO3溶液進(jìn)行研磨,然后用濃度為5mmol/L NaHCO3溶液定容至IOOmL, 4000r/min離心5min-10min,取上清液于4 下保存?zhèn)溆茫?):將殼聚糖載體用濃度為5mmol/L的NaHCO3溶液浸洗平衡，抽干，得預(yù)處理的殼聚糖載體；3):在所述預(yù)處理的殼聚糖載體中加入所述乙醛脫氫酶溶液，在4°C下吸附固定6h，得初步吸附的殼聚糖載體，其中，所述預(yù)處理的殼聚糖載體的質(zhì)量g與所述乙醛脫氫酶溶液的體積mL之比為1: 2;4):用濃度為的5mmol/L的NaHCO3溶液反復(fù)沖洗所述初步吸附的殼聚糖載體至洗脫液在A28tl處無光吸收后，抽干，得吸附處理的殼聚糖載體；5):在所述吸附處理的殼聚糖載體中加入體積濃度為2%的戊二醛在4°C下交聯(lián)2h，得吸附交聯(lián)的殼聚糖載體，其中，所述吸附處理的殼聚糖載體的質(zhì)量g與所述戊二醛的體積mL之比為=1: 4 ；
6):用濃度為的5mmol/L的NaHCO3溶液沖洗所述吸附交聯(lián)的殼聚糖載體以洗去多余的戊二醛，抽干，得到即為固定化乙醛脫氫酶。由上述方案可知，本發(fā)明以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，用吸附交聯(lián)法固定乙醛脫氫酶，本發(fā)明提供的制備方法簡(jiǎn)便易行，成本較低，為乙醛脫氫酶的應(yīng)用提供了良好前
旦
-5^ O本發(fā)明同時(shí)還提供由上述方法制備得到的固定化乙醛脫氫酶。

圖1為加酶量對(duì)固定化酶活力的影響的測(cè)試結(jié)果圖；圖2為吸附時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響的測(cè)試結(jié)果圖；圖3為戊二醛濃度對(duì)固定化酶活力的影響的測(cè)試結(jié)果圖；圖4為交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響的測(cè)試結(jié)果圖；圖5為溶液酶和固定化酶的最適pH的測(cè)試結(jié)果·
圖6為溶液酶和固定化酶的最適反應(yīng)溫度的測(cè)試結(jié)果圖；圖7為溶液酶和固定化酶的pH穩(wěn)定性的測(cè)試結(jié)果圖；圖8為溶液酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性的測(cè)試結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式實(shí)施例一本實(shí)施例提供的固定化乙醛脫氫酶的制備方法，具體包括:I):乙醛脫氫酶溶液的制備:稱取2g的粗酶粉，先加入20ml_40ml的濃度為5mmol/L NaHCO3溶液進(jìn)行研磨,然后用濃度為5mmol/L的NaHCO3溶液定容至IOOmL, 4000r/min離心5min-10min,取上清液于4 下保存?zhèn)溆?；?jīng)檢測(cè)，此乙醛脫氫酶溶液的酶活力為4.64u/g粗酶，比活力為0.21u/mg蛋白質(zhì)；乙醛脫氫酶溶液的酶活測(cè)定:2.9mL酶活性測(cè)定體系中含1.95mL 0.05mol/LTris-HCl 溶液(ρΗ7.5) ,0.25mL 0.14mol/L 4-MP溶液(用上述 Tris-HCl 溶液配制)，0.2mL
0.015mol/LNAD+溶液，0.25mL乙醛和酶溶液；加入酶之前先將反應(yīng)體系于25°C水浴中保溫，然后加入同樣溫浴的酶液0.25mL,混勻并立即計(jì)時(shí)，在340nm波長(zhǎng)下測(cè)光吸收值，每30s讀一次，共讀3min。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘產(chǎn)生I μ mo I的NADH的酶量為I個(gè)酶活力單位。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Bradford(1976)方法，并以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。2):將殼聚糖載體用濃度為5mmol/L的NaHCO3溶液浸洗平衡，抽干，得預(yù)處理的殼聚糖載體；3):在所述預(yù)處理的殼聚糖載體中加入所述乙醛脫氫酶溶液，在4°C下吸附固定6h，得初步吸附的殼聚糖載體，其中，所述預(yù)處理的殼聚糖載體的質(zhì)量g與所述乙醛脫氫酶溶液的體積mL之比為1: 2;4):用濃度為的5mmol/L的NaHCO3溶液反復(fù)沖洗所述初步吸附的殼聚糖載體至洗脫液在A280處無光吸收后，抽干，得吸附處理的殼聚糖載體；所有洗脫液合并為殘留酶溶液，為計(jì)算偶聯(lián)效率使用；5):在所述吸附處理的殼聚糖載體中加入體積濃度為2%的戊二醛在4°C下交聯(lián)2h，得吸附交聯(lián)的殼聚糖載體，其中，所述吸附處理的殼聚糖載體的質(zhì)量g與所述戊二醛的體積mL之比為=1 4 ；6):用濃度為的5mmol/L的NaHCO3溶液沖洗所述吸附交聯(lián)的殼聚糖載體以洗去多余的戊二醛，抽干，得到即為固定化乙醛脫氫酶。取O. 030g固定化酶，參照乙醛脫氫酶溶液的酶活測(cè)定及公式(I)、公式(2)，經(jīng)測(cè)定，酶活力回收達(dá)49. 8 %，偶聯(lián)效率為45. 4 %。
權(quán)利要求
1.一種固定化乙醛脫氫酶的制備方法，其特征在于包括 1)乙醛脫氫酶溶液的制備稱取2g的粗酶粉，先加入20ml-40ml的濃度為5mmol/L的NaHCO3溶液進(jìn)行研磨，然后用濃度為5mmol/L的NaHCO3溶液定容至IOOmL, 4000r/min離心5min-10min,取上清液于4°C下保存?zhèn)溆茫? 2):將殼聚糖載體用濃度為5mmol/L的NaHCO3溶液浸洗平衡，抽干，得預(yù)處理的殼聚糖載體； 3):在所述預(yù)處理的殼聚糖載體中加入所述乙醛脫氫酶溶液，在4°C下吸附固定6h，得初步吸附的殼聚糖載體，其中，所述預(yù)處理的殼聚糖載體的質(zhì)量g與所述乙醛脫氫酶溶液的體積mL之比為I : 2; 4):用濃度為的5mmol/LNaHCO3溶液反復(fù)沖洗所述初步吸附的殼聚糖載體至洗脫液在A280處無光吸收后，抽干，得吸附處理的殼聚糖載體； 5):在所述吸附處理的殼聚糖載體中加入體積濃度為2%的戊二醛在4°C下交聯(lián)2h，得吸附交聯(lián)的殼聚糖載體，其中，所述吸附處理的殼聚糖載體的質(zhì)量g與所述戊二醛的體積mL之比為=1:4; 6):用濃度為5mmol/L的NaHCO3溶液沖洗所述吸附交聯(lián)的殼聚糖載體以洗去多余的戊二醛，抽干，得到即為固定化乙醛脫氫酶。
2.權(quán)利要求I所述方法制備 得到的固定化乙醛脫氫酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固定化乙醛脫氫酶及其制備方法，其中，制備方法包括1)乙醛脫氫酶溶液的制備；2)將殼聚糖載體用NaHCO3溶液浸洗平衡，抽干，得預(yù)處理的殼聚糖載體；3)在所述預(yù)處理的殼聚糖載體中加入所述乙醛脫氫酶溶液，在4℃下吸附固定6h，得初步吸附的殼聚糖載體；4)用NaHCO3溶液反復(fù)沖洗初步吸附的殼聚糖載體至洗脫液在A280處無光吸收后，抽干，得吸附處理的殼聚糖載體；5)在吸附處理的殼聚糖載體中加入體積濃度為2％的戊二醛在4℃下交聯(lián)2h，得吸附交聯(lián)的殼聚糖載體；6)用NaHCO3溶液沖洗吸附交聯(lián)的殼聚糖載體，抽干，得到即為固定化乙醛脫氫酶。本發(fā)明簡(jiǎn)便易行、成本較低。
文檔編號(hào)C12N11/10GK103224927SQ20131012441
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月25日 公開號(hào)201310124414.0
發(fā)明者馬義福, 萬艷娟, 胡永剛, 徐鳳彩 申請(qǐng)人:珠海市御品堂生物科技有限公司