專利名稱：變形桿菌多種血清型菌株特異性引物及多重pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多重PCR快速檢測的方法及其應(yīng)用，尤其涉及一種可同時(shí)用于檢測變形桿菌血清型1-4型等一直到60型48種菌株的PCR技術(shù)及其所用PCR引物的序列。
背景技術(shù)：
變形桿菌屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛存在于水、土壤腐敗的有機(jī)物以及人和動(dòng)物的腸道中，對分解有機(jī)物和動(dòng)物蛋白起著重要的作用，在有氧或特許條件的厭氧環(huán)境中都具有蛋白水解酶的活性。變形桿菌為條件致病菌，多為繼發(fā)感染，如慢性中耳炎、創(chuàng)傷感染等，也可引起膀胱炎、嬰兒腹瀉、食物中毒等。
目前最新的分類定為普通變形桿菌屬包括普通變形桿菌0°.、奇異變形菌{P.、彭氏變形桿菌{P.、產(chǎn)粘液變形桿菌Qj.myxofaciens)和P.Aaw1Seri五個(gè)種以及3個(gè)未命名的變形桿菌genomospecies 4，5和6。在變形桿菌中普通變形桿菌、奇異變形桿菌和彭氏變形桿菌具有一定致病性，其他種中很少發(fā)現(xiàn)有致病菌。
普通變形桿菌和奇異變形桿菌根據(jù)O抗原的不同最初一共被分為49個(gè)血清型，之后又發(fā)現(xiàn)了 11種新的血清型，因此，目前將普通變形桿菌和奇異變形桿菌一共定義為60種血清型。此外,彭氏變形桿菌具有15種O抗原血清型。
傳統(tǒng)技術(shù)檢測病原微生物的方法是對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)后在生化和血清學(xué)水平進(jìn)行鑒定，需要經(jīng)過至少48小時(shí)的細(xì)菌培養(yǎng)和單菌落的分析，并需要對每一個(gè)樣品的大量單菌落使用多種抗血清進(jìn)行凝集反應(yīng)，耗時(shí)長，并且有漏檢的可能。同時(shí)，血清學(xué)方法還有一個(gè)缺陷，就是受抗血清的限制，世界上沒有一個(gè)公司或單位能生產(chǎn)全部細(xì)菌的抗血清。
PCR技術(shù)是目前公認(rèn)的在病原微生物檢測領(lǐng)域最快、最有效的技術(shù)之一。PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是快速靈敏，已成為微生物檢測技術(shù)的重要發(fā)展趨勢。篩選針對病原微生物的特異DNA分子標(biāo)識(shí)是研制病 原微生物的PCR技術(shù)的核心內(nèi)容。目前，國際上很多企業(yè)和科研單位均在此領(lǐng)域投入了大量的人力物力用于篩選病原微生物的特異分子探針。
在致病微生物的鑒定中，有時(shí)只需要將其鑒定至種或?qū)?，利?6S rRNA、23S rRNA和16S-23S rRNA即可達(dá)到目的；而多數(shù)病原微生物需要鑒定到在分類上比種屬更加精確的血清型水平。如何利用分子生物學(xué)技術(shù)將致病微生物(如細(xì)菌)鑒定到血清型水平是目前國際微生物檢測領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對變形桿菌中常見血清型的多重PCR快速檢測技術(shù)，為快速檢測與鑒定常見致病菌提供有效的手段。涉及一種可同時(shí)用于檢測變形桿菌血清型I型OdTo tei/s serotype I),變形桿菌血清型2型O0Toiew1S serotype 2),變形桿菌血清型3型O0Toiew1S serotype 3),變形桿菌血清型4型O0Toiew1S serotype 4),變形桿菌血清型 型(Proteus serotype 7),變形桿菌血清型8型O0Toiew1S serotype 8),變形桿菌血清型9型(Proteus serotype 9)，變形桿菌血清型10型(Proteus serotype 10)，變形桿菌血清型 11 型{Proteus serotype 11)，變形桿菌血清型 12 型{Proteus serotype 12)，變形桿菌血清 13 型 iProtms serotype 13)，變形桿菌血清型 14 型 iProtms serotype 14)，變形桿菌血清型17型(Proteus serotype 17)，變形桿菌血清型18型iProtms serotype18)，變形桿菌血清型19型iProteus serotype 19)，變形桿菌血清型21型iProteusserotype 21)，變形桿菌血清型23型(Proteus serotype 23)，變形桿菌血清型24型(Proteus serotype 24)，變形桿菌血清型25型iProtms serotype 25)，變形桿菌血清型堂(Proteus serotype 26)，變形桿菌血清型 27 型serotype 27)，變形桿菌血清型 28 型serotype 28)，變形桿菌血清型 29 型serotype 29)，變形桿菌血清型 30 型 iProteus serotype 30)，變形桿菌血清型 31 型 iProteus serotype 31)，變形桿菌血清型32型serotype 32)，變形桿菌血清型33型serotype33)，變形桿菌血清型34型iProteus serotype 34)，變形桿菌血清型36型iProteusserotype 36)，變形桿菌血清型37型(Proteus serotype 37)，變形桿菌血清型38型(Proteus serotype 38)，變形桿菌血清型39型iProtms serotype 39)，變形桿菌血清型40 型serotype 40)，變形桿菌血清型41 型serotype 41)，變形桿菌血清型 44 型serotype 44)，變形桿菌血清型 45 型serotype 45)，變形桿菌血清型 47 型 iProteus serotype 47)，變形桿菌血清型 48 型 iProteus serotype 48)，變形桿菌血清型50型serotype 50)，變形桿菌血清型52型serotype52)，變形桿菌血清型53型iProteus serotype 53)，變形桿菌血清型54型iProteusserotype 54)，變形桿菌血清型55型(Proteus serotype 55)，變形桿菌血清型56型(Proteus serotype 56)，變形桿菌血清型57型iProtms serotype 57)，變形桿菌血清型現(xiàn)堂(Proteus serotype 58)，變形桿菌血清型59型serotype 59)，變形桿菌血清型60型serotype 60)，48種菌株的PCR技術(shù)及其所用PCR引物的序列。所用引物的序列包含以下序列中選取的一種或多種: (1)變形桿菌血清型I型，2型，3型，4型，7型，8型，9型，10型，11型，12型，13型，14型，17型，18型，19型，21型，23型，24型，25型，26型，27型，28型，29型，30型，31型，32型，33型，34型，36型，37型，38型，39型，40型，41型，44型，45型，47型，48型，50型，52型，53型，54型，55型，56型 ，57型，58型，59型，和60型的特異的核苷酸序列； (2)上述(I)中選取的核苷酸序列的互補(bǔ)DNA序列。
上述的引物序列可用于制備檢測變形桿菌多種血清型用PCR試劑盒、基因芯片或微陣列。所述變形菌血清型取樣于變形菌的純培養(yǎng)物所提取的基因組或裂解液。
本發(fā)明還提供一種多重PCR檢測體系，包括10XPCR酶特異性反應(yīng)緩沖液、MgCl2、dNTP、PCR引物、DNA聚合酶，所述PCR引物包括上述的核苷酸序列；其中所述的PCR引物優(yōu)選為如SEQ ID NO: 1-SEQ ID N0:96所示的核苷酸序列。
SEQ NO:1 ATTCCTCCTGAAGAGTTTG特異擴(kuò)增變形桿菌I型的上游引物； SEQ NO:2 TACTCCCCAAGCACCATT特異擴(kuò)增變形桿菌I型的下游引物； SEQ NO:3 TGCCTTTATCCAACAACC特異擴(kuò)增變形桿菌2型的上游引物； SEQ N0:4 ATTAGGCGGGAAATCAAG特異擴(kuò)增變形桿菌2型的下游引物； SEQ NO:5 ATAGCATTTGAACAGCCTTT特異擴(kuò)增變形桿菌3型的上游引物；SEQ NO:6AACTACATATTCTCCAAAATCC特異擴(kuò)增變形桿菌3型的下游引物； SEQ NO: 7ATATTGGCTCGTGGAAAT特異擴(kuò)增變形桿菌4型的上游引物； SEQ NO:8AATTCAATGATGATACGGAG特異擴(kuò)增變形桿菌4型的下游引物； SEQ NO:9ACAGTAATTGGGAATGAGG特異擴(kuò)增變形桿菌7型的上游引物； SEQ NO: 10AATTGTACGGCTTTGAGTT特異擴(kuò)增變形桿菌7型的下游引物。
SEQ NO: 11 GCCTTAGCATCACCCTTT特異擴(kuò)增變形桿菌8型的上游引物； SEQ NO: 12CACCTTTCATTACACCACG特異擴(kuò)增變形桿菌8型的下游引物； SEQ NO: 13ATAACACACCCTTAATAGCC特異擴(kuò)增變形桿菌9型的上游引物； SEQ NO: 14AATCGTTTTTCAGAAGCAC特異擴(kuò)增變形桿菌9型的下游引物； SEQ NO: 15AGCAATGGGAATAAGCG特異擴(kuò)增變形桿菌10型的上游引物； SEQ NO: 16TCCTCCAGCCAAAGGTAT特異擴(kuò)增變形桿菌10型的下游引物； SEQ NO: 17TTGCAGGTAGTAGAGCGG特異擴(kuò)增變形桿菌11型的上游引物； SEQ NO: 18TAGTGATGATAGGATACCGC特異擴(kuò)增變形桿菌11型的下游引物； SEQ NO: 19TTAGGCGTTGACTGGCTC特異擴(kuò)增變形桿菌12型的上游引物； SEQ NO:20ATTAGAGCGGAGACGTGG特異擴(kuò)增變形桿菌12型的下游引物。
SEQ NO:21 TAAATATGGGCGTTGGCT特異擴(kuò)增變形桿菌13型的上游引物； SEQ NO:22TTATAGGGAATCCAGCAAC特異擴(kuò)增變形桿菌13型的下游引物； SEQ NO:23AAGACAATCCCTAGCGACT特異擴(kuò)增變形桿菌14型的上游引物； SEQ NO:24AGACCACTTCCACTATTTCC特異擴(kuò)增變形桿菌14型的下游引物； SEQ NO:25TGCCGGGATTACAGATCC特異擴(kuò)增變形桿菌17型的上游引物； SEQ NO:26TGACTTAC AGGGCCTCCT特異擴(kuò)增變形桿菌17型的下游引物； SEQ NO:27GTTTCGTATTGTGGATCTTG特異擴(kuò)增變形桿菌18型的上游引物； SEQ NO:28TATCGGTGGAATCCTATTG特異擴(kuò)增變形桿菌18型的下游引物；SEQ NO:29TAAACTATCTTATTATTTCCCGA特異擴(kuò)增變形桿菌19型的上游引物； SEQ NO:30TATAGGATACCCACGCGC特異擴(kuò)增變形桿菌19型的下游引物。
SEQ NO:31 ATGAGTGGCTTGCTATCTTTAT特異擴(kuò)增變形桿菌21型的上游引物； SEQ NO:32TCATAATGTTTTTGATAACCTT特異擴(kuò)增變形桿菌21型的下游引物；SEQ NO:33TGTGGTGAAGTATTAGGTGGAT特異擴(kuò)增變形桿菌23型的上游引物； SEQ NO:34TTGAAATAGCAGCGATAGG特異擴(kuò)增變形桿菌23型的下游引物；SEQ NO:35CCATAACATCTTTTAACCCAT特異擴(kuò)增變形桿菌24型的上游引物； SEQ NO:36AAAATGTATGAATGCCTCCT特異擴(kuò)增變形桿菌24型的下游引物； SEQ NO:37TTTGTCCTTACCCGTCAG特異擴(kuò)增變形桿菌25型的上游引物； SEQ NO:38ATCAGCCAAGCCAATCAT特異擴(kuò)增變形桿菌25型的下游引物； SEQ NO:39CTGGCAAATCACAGTGCT特異擴(kuò)增變形桿菌26型的上游引物； SEQ NO:40CGTATAAACCGGAACCTG特異擴(kuò)增變形桿菌26型的下游引物。
SEQ NO:41 GCCCTTATCAGCATCCAT特異擴(kuò)增變形桿菌27型的上游引物；SEQ NO:42CCGAATCTATCAGAATAAGGT特異擴(kuò)增變形桿菌27型的下游引物； SEQ NO:43TTCTAGGATTACCATCGCAT特異擴(kuò)增變形桿菌28型的上游引物； SEQ NO:44TAAAAGTTCTGGCAATGATT特異擴(kuò)增變形桿菌28型的下游引物；SEQ NO:45ATTATATCCGCACTAAATCC特異擴(kuò)增變形桿菌29型的上游引物； SEQ NO:46TCAAGAAGAAGTTCAATAAATGT特異擴(kuò)增變形桿菌29型的下游引物； SEQ NO:47TTTCTTTTCCTTATTTGCAC特異擴(kuò)增變形桿菌30型的上游引物； SEQ NO:48TCAATGGGAAGATATTCTTC特異擴(kuò)增變形桿菌30型的下游引物； SEQ NO:49GGAATATGGCGAAGTAACTC特異擴(kuò)增變形桿菌31型的上游引物； SEQ NO:50CTACTTGCTCCGAATGGG特異擴(kuò)增變形桿菌31型的下游引物。
SEQ NO:51 TATCACTATTCTTAGCAACAGC特異擴(kuò)增變形桿菌32型的上游引物； SEQ NO:52TGATTAAAAGGTGAAATACCAT特異擴(kuò)增變形桿菌32型的下游引物； SEQ NO:53TTTCTGACAGGCTATTTGG特異擴(kuò)增變形桿菌33型的上游引物； SEQ NO:54TTGGGAAGAGTAAAGGAGT特異擴(kuò)增變形桿菌33型的下游引物； SEQ NO:55ATTTACATTCCACCACTTGG特異擴(kuò)增變形桿菌34型的上游引物； SEQ NO:56GTTTGTATAATGCTTCCCAC特異擴(kuò)增變形桿菌34型的下游引物； SEQ NO:57AGGGTTACAGACTCCTTCAC特異擴(kuò)增變形桿菌36型的上游引物； SEQ NO:58ATTTAGATTAGCCCTCAGATT特異擴(kuò)增變形桿菌36型的下游引物； SEQ NO:59TCAACTTTATAGAGTCGCTTTG特異擴(kuò)增變形桿菌37型的上游引物； SEQ NO:60ATAATTCGCGGA·ATCCTGT特異擴(kuò)增變形桿菌37型的下游引物。
SEQ NO:61 TGTTGCTGGACATCCTGG特異擴(kuò)增變形桿菌38型的上游引物； SEQ NO:62TTATGTAAGCCGCAGTCC特異擴(kuò)增變形桿菌38型的下游引物； SEQ NO:63GAGACTACCTTCATCGCAAT特異擴(kuò)增變形桿菌39型的上游引物； SEQ NO:64CAATAACGGAGGAAGCAG特異擴(kuò)增變形桿菌39型的下游引物； SEQ NO:65TCATTCTCTGGATTTAGGTATG特異擴(kuò)增變形桿菌40型的上游引物； SEQ NO:66AATAAACACCAAGCCCAG特異擴(kuò)增變形桿菌40型的下游引物； SEQ NO:67TGCCCAGTTAGTAGTTTTG特異擴(kuò)增變形桿菌41型的上游引物； SEQ NO:68GATGATTTGATAGCCGTGA特異擴(kuò)增變形桿菌41型的下游引物； SEQ NO: 69AGAAGCAATGCGTTTAGG特異擴(kuò)增變形桿菌44型的上游引物； SEQ NO:70CTCTAGTTTGAGTGATTGGTTG特異擴(kuò)增變形桿菌44型的下游引物。
SEQ NO:71 TTTATTGTAACTACGGGTTCT特異擴(kuò)增變形桿菌45型的上游引物； SEQ NO:72CTGAAAAATGGAACATGCT特異擴(kuò)增變形桿菌45型的下游引物； SEQ NO:73TTTGTTAGGAAGTGGTATGC特異擴(kuò)增變形桿菌47型的上游引物； SEQ NO:74TGATAGCCGACCTTGAAC特異擴(kuò)增變形桿菌47型的下游引物； SEQ NO:75GCGGTTTACAGTGGACAT特異擴(kuò)增變形桿菌48型的上游引物； SEQ NO:76GCTAGTATCTGCACCTTGTG特異擴(kuò)增變形桿菌48型的下游引物； SEQ NO:77TATGTTTTATCACTCCCAAACT特異擴(kuò)增變形桿菌50型的上游引物； SEQ NO:78TCTTATTCCAAACCCAGG特異擴(kuò)增變形桿菌50型的下游引物； SEQ NO:79TATGCTGTCTATAATGCGATG特異擴(kuò)增變形桿菌52型的上游引物； SEQ NO:80TCAGAACCGTCAATGCTT特異擴(kuò)增變形桿菌52型的下游引物。
SEQ NO:81 AGATGCCGATGTTCAATGG特異擴(kuò)增變形桿菌53型的上游引物； SEQ NO:82CATAAGGTGATATTCGGGA特異擴(kuò)增變形桿菌53型的下游引物； SEQ NO:83TATCACCAAACCCGACTC特異擴(kuò)增變形桿菌54型的上游引物；SEQ NO:84 AAGATACTTGGAATAAGATTCG特異擴(kuò)增變形桿菌54型的下游引物； SEQ NO:85 AACATATACTTCTCTGATTACTCTT特異擴(kuò)增變形桿菌55型的上游引物； SEQ NO:86 ACGACCTTCCCATTCATC特異擴(kuò)增變形桿菌55型的下游引物； SEQ NO:87 TCTTTATCAAAGCTGCTATTG特異擴(kuò)增變形桿菌56型的上游引物； SEQ NO:88 GAAAATGCCTAACCACCC特異擴(kuò)增變形桿菌56型的下游引物； SEQ NO:89 GCAAATAATGGAGTTCTCTG特異擴(kuò)增變形桿菌57型的上游引物； SEQ NO:90 ATACCGTTCCTCGTGATG特異擴(kuò)增變形桿菌57型的下游引物。
SEQ NO:91 TTATGTATCGACACTTCCAATT特異擴(kuò)增變形桿菌58型的上游引物； SEQ NO:92 AATTGCTCACTAAAGGATCTAC特異擴(kuò)增變形桿菌58型的下游引物； SEQ NO:93 GCCTAATTTTTGGTTCTCC特異擴(kuò)增變形桿菌59型的上游引物； SEQ NO:94 TTCTCATATAGCCTGGATCTG特異擴(kuò)增變形桿菌59型的下游引物； SEQ NO:95 CCTTTTGTTACAGCCTTCT特異擴(kuò)增變形桿菌60型的上游引物； SEQ NO:96 ATTAAACTTGTCCTTGAGTAAGT特異擴(kuò)增變形桿菌60型的下游引物； 上述多重PCR檢測體系每個(gè)反應(yīng)包括如下試劑:IOuM引物按照表3的指示添加、MgCl2 3 μ IUOXbuffer 3 μ IUOm M dNTP 2.4 μ 1、5 U/μ I Taq 聚合酶 0.3 μ I 及 2μ I 的待測樣品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH20補(bǔ)足至30 μ I。
本發(fā)明中所用的核苷酸序列還可用于芯片的研制，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針包括上述的核苷酸。
由上述的技術(shù)方案可見，本發(fā)明建立的一種多重PCR反應(yīng)體系，可同時(shí)檢測48種血清型嗜肺軍團(tuán)菌，該檢測體系有如下優(yōu)點(diǎn): (I)方法簡便，周期短、速度快、可操作性強(qiáng)、檢測成本低:本發(fā)明所配制的PCR體系配制方法簡便，檢測周期短、速度快，可操作性強(qiáng)，檢測成本卻相對較低，市場應(yīng)用前景廣。提供針對DNA為模板和純培養(yǎng)物裂解液為模版的兩套體系，適用于不同情況下的變形桿菌48種血清型的檢測。相比常規(guī)生化檢測方法而言，本方法節(jié)省了人力物力?？梢酝茝V應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生監(jiān)督、商品檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域，并為其他不同致病菌檢測組合提供技術(shù)模式。
(2)準(zhǔn)確性高:本發(fā)明根據(jù)變形桿菌48種血清型的基因的特異區(qū)設(shè)計(jì)出引物。繼而利用引物組合成多重PCR檢測體系，能夠直接將這48種變形桿菌和其他血清型的變形桿菌或變形桿菌的近源菌種分開。
(3)檢測靈敏度高:本發(fā)明提供的多重PCR檢測試劑盒及其檢測方法敏感性較高，可以檢測到25pg/y I的DNA模板。對常見血清型可以進(jìn)行全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確的檢測與鑒定。


圖1為本發(fā)明的多重PCR體系檢測結(jié)果一，其中:M為100 bp DNA Ladder ;1為變形桿菌17型G2619 ；2為變形桿菌25型G2818 ；3為變形桿菌13型G2628 ；4為變形桿菌29型G2630 ；5為變形桿菌33型G3925 ； 圖2為本發(fā)明的多重PCR體系檢測結(jié)果二，其中:M為100 bp DNA Ladder ；1為變形桿菌4型G2608 ；2為變形桿菌41型G2640 ；3為變形桿菌54型G2649 ；4為變形桿菌12型G2615 ；5為變形桿菌9型G2613 ；圖3為本發(fā)明的多重PCR體系檢測結(jié)果三，其中:M為100 bp DNA Ladder ;I為變形桿菌58型G2654 ；2為變形桿菌3型G2292 ；3為變形桿菌10型G2294 ；4為變形桿菌52型G4071 ；5為變形桿菌31型G2632 ； 圖4為本發(fā)明的多重PCR體系檢測結(jié)果四，其中:M為100 bp DNA Ladder ;I為變形桿菌59型G2655 ；2為變形桿菌38型G2637 ；3為變形桿菌19型G2622 ；4為變形桿菌45型G2642 ；5為變形桿菌30型G2631 ； 圖5為本發(fā)明的多重PCR體系檢測結(jié)果五，其中:M為100 bp DNA Ladder ；1為變形桿菌34型G2635 ；2為變形桿菌53型G2648 ；3為變形桿菌36型G3926 ；4為變形桿菌24型G2627 ；5為變形桿菌47型G2643 ； 圖6為本發(fā)明的多重PCR體系檢測結(jié)果六，其中:M為100 bp DNA Ladder ；1為變形桿菌55型G2651 ；2為變形桿菌40型G2639 ；3為變形桿菌27型G2298 ；4為變形桿菌7型G2611 ； 圖7為本發(fā)明的多重PCR體系檢測結(jié)果七，其中:M為100 bp DNA Ladder ；1為變形桿菌57型G2653 ；2為變形桿菌44型G2641 ；3為變形桿菌11型G2614 ；4為變形桿菌48型G2644 ； 圖8為本發(fā)明的多重PCR體系檢測結(jié)果八，其中:M為100 bp DNA Ladder ;I為變形桿菌50型G2647 ；2為變形桿菌2型G2291 ；3為變形桿菌I型G2290 ；4為變形桿菌8型G2612 ；5為變形桿菌23型G2297 ； 圖9為本發(fā)明的多重PCR體系檢測結(jié)果九，其中:M為100 bp DNA Ladder ;1為變形桿菌32型G2634 ；2為變形桿菌26型G2629 ；3為變形桿菌56型G2652 ；4為變形桿菌21型G2625 ；5為變形桿菌37型G2636 ； 圖10為本發(fā)明的多重PCR體系檢測結(jié)果十，其中:M為100 bp DNA Ladder ；1為變形桿菌39型G2638 ；2為變形桿菌28型G2299 ；3為變形桿菌60型G2656 ；4為變形桿菌18型G2621 ；5為變形桿菌14型G2617。
具體實(shí)施方式
: 為保證本發(fā)明的上述和其它目的特征和優(yōu)點(diǎn)更明顯易懂，下面特舉較佳實(shí)施例，并配合說明書附圖，結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。本發(fā)明所用到的各種試劑均有市售。
實(shí)施例1:基因組的提取 在裝有2YT小搖管中培養(yǎng)變形桿菌，在37°C，180rpm搖床中過夜培養(yǎng)之后收集細(xì)胞，采用傳統(tǒng)酚、氯仿抽提法基因組提取方法提取基因組。具體步驟如下: (I)收集Iml菌液至1.5ml離心管中，12000rpm離心IOmin棄上清收集菌體。
(2)向此離心管中加入500 μ I tris-Hcl重懸細(xì)胞，12000rpm離心5min去上清。
(3)重復(fù)步驟(2) (4)向菌體中加入 250ul 50mM Tris-HCl (pH8.0)和 IOul 0.4M EDTA 重懸細(xì)胞，加入IOul 10mg/ml的溶菌酶37°C保溫20分鐘。革蘭氏陽性菌要過夜。
(5)向混合液中3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C溫育2小時(shí)。如果液體沒有變清涼可以再向其中加入適量10%SDS。
(6)加入 3 ul 10mg/ml 的 RNase,65°C溫育 20 分鐘。
(7)用等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)溶液抽提兩次。(8)取上清液，再用等體積的氯仿:異戊醇(49:1)抽提。(9 )上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，
(10)將(9) 4°C,12000rpm離心lOmin，DNA并用70%乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中?；蚪MDNA通過0.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。實(shí)施例2:引物的設(shè)計(jì)
使用實(shí)驗(yàn)室自測的變形桿菌序列，針對血清型I型，2型，3型，4型，7型，8型，9型，10
型，11型，12型，13型，14型，17型，18型，19型，21型，23型，24型，25型，26型，27型，28
型，29型，30型，31型，32型，33型，34型，36型，37型，38型，39型，40型，41型，44型，45
型，47型，48型，50型，52型，53型，54型，55型，56型，57型，58型，59型，和60型的似_7基
因的特異區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物序列如下表I所示:
表I變形桿菌48種血清型的特異引物序列
權(quán)利要求
1.用于檢測變形桿菌多種血清型菌株的特異性PCR引物，其特征在于所述的特異性引物如SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO:96所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的特異性引物，其中的特異性引物為:(1)變形桿菌血清型I型，2型，3型，4型，7型，8型，9型，10型，11型，12型，13型，14型，17型，18型，19型，21型，23型，24型，25型，26型，27型，28型，29型，30型，31型，32型，33型，34型，36型，37型，38型，39型，40型，41型，44型，45型，47型，48型，50型，52型，53型，54型，55型，56型，57型，58型，59型，和60型的胃特異的核苷酸序列；(2)上述(I)中選取的核苷酸序列的互補(bǔ)DNA序列(要有實(shí)施例的支持才能成立)。
3.權(quán)利要求1所述用于檢測變形桿菌多種血清型菌株的特異性PCR引物在制備作為檢測變形桿菌用PCR試劑盒、基因芯片或微陣列方面的應(yīng)用。
4.一種含有權(quán)利要求1所述用于檢測變形桿菌多種血清型菌株的特異性PCR引物的多重PCR體系，其特征在于它是由10XPCR酶特異性反應(yīng)緩沖液、MgCl2, dNTP、PCR引物、DNA聚合酶組成；所述PCR引物如SEQ ID NOil-SEQ ID NO:96所示的核苷酸序列；所述的引物配比濃度如下:
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測變形桿菌多種血清型致病菌的特異性PCR引物及采用多重PCR快速檢測的方法及應(yīng)用，其中的多重PCR檢測體系包括10×PCR反應(yīng)液、MgCl2、dNTP、引物、DNA聚合酶，所用引物的序列包含以下序列中選取的多種(1)變形桿菌血清型1-4型等一直到60型的wzy特異的核苷酸序列；(2)上述(1)中選取的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列。本發(fā)明的對常見變形桿菌血清型的wzy特異的核苷酸及包含該核苷酸的多重PCR檢測方法，多重PCR體系配制方法簡便，檢測周期短、速度快、準(zhǔn)確性高，可操作性強(qiáng)，降低檢測成本。
文檔編號C12Q1/68GK103173555SQ20131011565
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月2日
發(fā)明者王磊, 王荃, 彭志勇, 馮露 申請人:南開大學(xué)