一種提取鐵皮石斛rna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鐵皮石斛RNA的提取方法，包括下述過(guò)程：鐵皮石斛幼嫩葉片低溫研磨，利用CTAB提取緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解、離心分離過(guò)程，其特征在于：所述的鐵皮石斛組織與提取液混合物經(jīng)離心后的上清液，以等量的10MLiCl混合，靜置后再離心分離、沉淀，再用Trizol法提取RNA的過(guò)程。由于本發(fā)明通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的CTAB法進(jìn)行改良，加入CTAB提取液充分裂解后直接利用等體積高濃度LiCl進(jìn)行RNA沉淀，并同時(shí)利用高濃度LiCl去掉分離液中的多糖，不僅最大程度保留了RNA，同時(shí)也去除了大部分多糖，提高了RNA純度。
【專利說(shuō)明】—種提取鐵皮石斛RNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種RNA的提取方法，尤其涉及到一種利用改良CTAB法與Trizol法相結(jié)合提取鐵皮石斛RNA的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，2010年版《中國(guó)藥典》單獨(dú)收載，具有獨(dú)特的藥用價(jià)值，為石斛之極品。在研究鐵皮石斛遺傳學(xué)基礎(chǔ)中，RNA的提取是一項(xiàng)基礎(chǔ)性的工作。目前國(guó)內(nèi)外提取RNA通常采用CTAB法進(jìn)行:提取材料中加入CTAB提取液后充分裂解，離心之后，取其上清液先用氯仿異戊醇抽提21次，去除蛋白及一些色素及雜質(zhì)；然后取上清液，加入四分之一體積10 M LiCl 4°〇過(guò)夜沉淀，沉淀完之后用SSTE溶解，然后再用無(wú)水乙醇沉淀最終得到RNA。由于鐵皮石斛多糖含量很高，普通的CTAB法中，少量的LiCl不能充分沉淀RNA，另外氯仿異戊醇主要作用是去蛋白，而鐵皮石斛蛋白含量很低，在加入CTAB提取液充分裂解后加入氯仿異戊醇抽提2~3次不僅沒(méi)有必要，而且可造成RNA的大量損失。因此，用現(xiàn)有的CTAB法提取鐵皮石斛RNA效率比較低，且所獲得的RNA的純度也不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供的是一種高效提取鐵皮石斛的RNA的方法，將改良的CTAB法與Trizol法結(jié)合，可以提取高質(zhì)量的鐵皮石斛RNA，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以便于鐵皮石斛在分子領(lǐng)域中的后續(xù)研究。
[0004]本發(fā)明是通過(guò)下述方式實(shí)現(xiàn)的:一種提取鐵皮石斛RNA的方法，包括下述過(guò)程: 用液氮冷卻研缽將鐵皮石斛幼嫩葉片研磨，充分研磨后，立即加入到預(yù)熱好的CTAB提`取緩沖液中，均勻搖動(dòng)；
將鐵皮石斛組織與提取液混合物置于65°C水浴條件下20 min后，冷卻至室溫，4 V，12000 rpm 離心 10 min ；
其特征在于:所述的鐵皮石斛組織與提取液混合物經(jīng)離心后的上清液，以等量的10 MLiCl混合，溶液在4 °C條件靜置8-12小時(shí)，4 °C條件下，12000 rpm離心20 min ；
棄上清液，用75%乙醇清洗沉淀,在4 °C條件下，12000 rpm離心5 min,棄上清液；
用SSTE溶解沉淀,然后加入Trizol,搖勻后加入氯仿,4 O條件下，12000 rpm離心10
min ；
取上清液，加入與上清液等體積氯仿與異戊醇的混合液，其中氯仿:異戊醇按24:1比例配合，在4 °C條件下，12000 rpm離心10 min ；
取上清液，加與上清液等體積異丙醇，-20 1:沉淀至少20 min, 4 1:條件下，12000rpm 離心 10 min ；
棄上清液，用75%乙醇清洗沉淀，連續(xù)洗滌兩次，干燥沉淀，得純鐵皮石斛RNA。
[0005]由于本發(fā)明通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的CTAB法進(jìn)行改良，加入CTAB提取液充分裂解后直接利用等體積高濃度LiCl進(jìn)行RNA沉淀，并同時(shí)利用高濃度LiCl去掉分離液中的多糖，不僅最大程度保留了 RNA，同時(shí)也去除了大部分多糖，提高了 RNA純度。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0006]圖1為本發(fā)明的工藝流程圖
圖2為樣本78X72用本發(fā)明方法提取總RNA凝膠電泳圖；
圖3為樣本78X72以用CTAB法提取總RNA凝膠電泳圖；
圖4為樣本A39用本發(fā)明方法提取總RNA凝膠電泳圖；
圖5為樣本A39用CTAB法提取總RNA凝膠電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0007]實(shí)施例:
一、材料準(zhǔn)備:
試驗(yàn)所用的鐵皮石斛種植于浙江農(nóng)林大學(xué)遺傳學(xué)科實(shí)驗(yàn)基地，本實(shí)驗(yàn)選用兩種種質(zhì):78X72 (多糖含量較高)和A39 (多糖含量較低)，采集其幼嫩葉片，于液氮中快速冷凍后保存于_70°C的超低溫冰箱備用.CTAB 溶液:2% CTAB，2% PVP，100 mmol.L-1 Tris-HCL(PH 8.0),25 mmol.L-1 EDTA, 2.0mol*L 1 NaCl0
[0008]SSTE:1.0 mol.!/1 NaCl, 0.5% SDS, I mmol.!/1 EDTA(PH 8.0),10 mmol.!/1Tris-HCl (PH 8.0)。TrizoKRNAiso Plus(D9108B))為 Takara 公司產(chǎn)品，瓊脂糖為 Promega公司產(chǎn)品，其他試劑均為分析純。
[0009]二、總RNA提取，具體提取步驟如下(見(jiàn)圖1):
1.將Iml CTAB提取液、20 uLP-巰基乙醇于2 mL離心管中，65°C水浴20 min ；
2.用液氮冷卻研缽，取100mg左右鐵皮石斛幼嫩葉片(嫩葉提取效果最佳)，迅速置于研缽中，不時(shí)加入液氮以防止研磨過(guò)程中葉片融化，充分研磨后，立即加入到預(yù)熱好的提取緩沖液中，均勻搖動(dòng)；
3.65°C水浴20 min后冷卻至室溫,4 °C 12000 rpm離心10 min ；
4.取上清，加入等體積的10M的LiCl混合，4°〇溶液過(guò)夜，然后4 °C 12000 rpm離心20 min ；
5.棄上清，用500uL的75%乙醇清洗沉淀，4 V 12000 rpm離心5 min，棄上清；
6.用500uL的SSTE溶解沉淀，然后加800 mL的trizol，搖勻后加200 mL氯仿，4°C 12000 rpm 離心 10 min ；
7.取上清，加入等體積氯仿:異戍醇(24:1),潤(rùn)旋混勻。4 °C, 12000 rpm離心10 min ；
8.取上清,加等體積異丙醇，-20。(!'沉淀至少20min, 4 °C, 12000 rpm離心10 min ；
9.棄上清，用500uL的75%乙醇清洗沉淀，連續(xù)洗滌兩次，干燥沉淀，得純鐵皮石斛
RNA。
[0010]三、結(jié)果與分析
1、對(duì)鐵皮石斛種質(zhì)78X72和A39用本發(fā)明方法提取的總RNA進(jìn)行OD值檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表1。
【權(quán)利要求】
1.一種提取鐵皮石斛RNA的方法，其特征在于包括下述過(guò)程: 用液氮冷卻研缽將鐵皮石斛幼嫩葉片研磨，充分研磨后，立即加入到預(yù)熱好的CTAB提取緩沖液中，均勻搖動(dòng)；將鐵皮石斛組織與提取液混合物置于65°C水浴條件下20 min后，冷卻至室溫，4 °C, 12000 rpm離心10 min,其特征在于:它還包括下述步驟: a.所述的鐵皮石斛組織與提取液混合物經(jīng)離心后的上清液，以等量的10M LiCl混合，溶液在4 1:條件靜置8-12小時(shí)，4 1:條件下，12000 rpm離心20 min ； b.上清液,用75%乙醇清洗沉淀,在4°C條件下，12000 rpm離心5 min,棄上清液； c.SSTE溶解沉淀,然后加入trizol,搖勻后加入氯仿,4 O條件下，12000 rpm離心10min ； d.上清液，加入與上清液等體積氯仿與異戊醇的混合液，其中氯仿:異戊醇按24:1比例配合，在4 1:條件下，12000 rpm離心10 min ； e.取上清液，加與上清液等體積異丙醇，-201:沉淀至少20 min, 4 1:條件下，12000rpm 離心 10 min ； f.棄上清，用500uL的75%乙醇清洗沉淀，連續(xù)洗滌兩次，干燥沉淀，得純鐵皮石斛RNA。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103484448SQ201310103040
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月28日
【發(fā)明者】李聰, 斯金平, 朱玉球, 高燕會(huì) 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)