專利名稱：一種谷氨酸棒桿菌基因及其突變基因的原核表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高新生物技術(shù)，尤其涉及一種谷氨酸棒桿菌基因及其突變基因的原核表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
在細(xì)菌和植物中，由公共途徑莽草酸途徑以及三個專一性途徑分別合成色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸三種芳香族氨基酸，公共途徑第一步反應(yīng)，被認(rèn)為是芳香族氨基酸合成的限速步驟，由DAHP合成酶催化。目前，對谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)DAHPSCgTyr的立體結(jié)構(gòu)還未見報道，但大腸桿菌Escherichia col1、海棲熱袍菌Thermotoga maritima、啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae的(β /a )8立體桶狀結(jié)構(gòu)均以報道，這些來源不同的DAHPS高度同源，功能相同，只是受不同底物的反饋抑制，但底物抑制的結(jié)合位點基本相同，表明它們可能是由同一個桶狀結(jié)構(gòu)的祖先進(jìn)化而來，或者是由不定的結(jié)構(gòu)收斂進(jìn)化到同一種穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)的結(jié)果，或者是二者兼有的結(jié)果。1991年的大腸桿菌中進(jìn)化高度保守的苯丙氨酸反饋抑制的DAHPS的(DAHPSEcPhe)金屬離子結(jié)合位點Cys61、Glu302、Asp326、Lys97中的Cys61進(jìn)行突變研究，結(jié)果該氨基酸的突變導(dǎo)致酶活性喪失，推測谷氨酸棒桿菌酪氨酸反饋抑制的DAHPSCgTyr活性同樣對金屬離子也有依賴性，保守N末端Cys69的突變，可能也會導(dǎo)致酶活性喪失。1999,2002年，研究人員根據(jù)AroG-PEP-(Pb2+、Mn2+)共結(jié)晶的晶體結(jié)構(gòu)指出了 Glu24、Lys25、Argl24、His217對DAHPSEcPhe的四連體結(jié)構(gòu)起到重要的作用，從DAHPSCgTyr氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)這幾個氨基酸進(jìn)化過程中并不保守，預(yù)示DAHPSCgTyr不是四連體結(jié)構(gòu)，可能是以緊密的二聚體結(jié)構(gòu)存在。研究人員確定了 DAHPSEcPhe的活性中心位于(β/α)8桶的C末端，由于PEP和Ε4Ρ都是帶有負(fù)電的反應(yīng)底物，所以在活性中心附近帶正電荷的氨基酸比負(fù)電荷的多，在距離Pb2+8A范圍內(nèi)多為Arg和Lys，而DAHPSCgTyr中這些帶電的氨基酸都是高度保守的，說明D AHPSCgTyr的活性中心位置與DAHPSEcPhe基本相同，但對這些帶正電的Arg和Lys的突變研究鮮見報道。研究人員還認(rèn)為DAHPSEcPhe反饋抑制子苯丙氨酸的苯環(huán)結(jié)合在氨基酸Phel44、Prol50、Leul75和Leul79的側(cè)鏈形成疏水“pocket”的底部，苯丙氨酸結(jié)合這些氨基酸以后，引起一些氨基酸殘基間的新接觸的形成以及原有接觸的破壞，引起酶催化活性的降低，而在DAHPSCgTyr氨基酸序列中沒有保守的Leul79 (E.Coli)，而對應(yīng)為Met，其余幾個氨基酸均保守，固推測是該位氨基酸在進(jìn)化過程中的改變，導(dǎo)致反饋抑制子的不同。我國研究人員確定大腸桿菌DAHPSEcPhe Leul75的所有突變體的比活都比野生型高，并部分或完全解除反饋抑制。本研究對與大腸桿菌AroG基因Leul75相對應(yīng)的谷氨酸棒桿菌aro I基因Leul83進(jìn)行突變，所得突變體L183Q比活同樣比野生型高，分析原因可能是該氨基酸殘基的突變使得反饋抑制子酪氨酸不易結(jié)合，或是底物PEP更容易結(jié)合到活性位點，或是另一個底物E4P更容易與已結(jié)合在活性位點的PEP發(fā)生反應(yīng)，但具體原因還有待于深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供了一種谷氨酸棒桿菌AroI基因及突變基因AroI*的原核表達(dá)方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過以下方案來實現(xiàn):谷氨酸棒桿菌基因及其突變基因的原核表達(dá)方法，所述方法所使用的材料為菌株大腸桿菌BL21及pET-28a(+)原核表達(dá)載體，由以下步驟實現(xiàn):I)、DAHP合成酶基因及突變基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建；2)、目的基因與表達(dá)載體pET_28a(+)的酶切，限制性內(nèi)切酶Nde I和XhoI雙酶切重組質(zhì)粒pMD18T-simple_Aro ]^PpMD18T-simple-Aro I*,回收目的基因片段，分別按照下表中體系進(jìn)行加樣，對目的基因和pET-28a(+)載體于37°C恒溫4h進(jìn)行雙酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，回收目的基因和載體的目的片段；
權(quán)利要求
1.谷氨酸棒桿菌基因及其突變基因的原核表達(dá)方法，其特征在于:所述方法所使用的材料為菌株大腸桿菌BL21及pET-28a(+)原核表達(dá)載體，由以下步驟實現(xiàn): 1)、DAHP合成酶基因及突變基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建； 2)、目的基因與表達(dá)載體pET-28a(+)的酶切，限制性內(nèi)切酶NdeI和Xho I雙酶切重組質(zhì)粒pMD18T-simple_Aro I和pMD18T_simpIe-Aro I*,回收目的基因片段,分別按照下表中體系進(jìn)行加樣，對目的基因和pET-28a(+)載體于37°C恒溫4h進(jìn)行雙酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，回收目的基因和載體的目的片段；
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高新生物技術(shù)，尤其涉及一種谷氨酸棒桿菌基因及其突變基因的原核表達(dá)方法，pET系統(tǒng)是有史以來在E.coli中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強大的系統(tǒng)。目的基因被克隆到pET質(zhì)粒載體上，受噬菌體T7強轉(zhuǎn)錄及翻譯(可選擇)信號控制；表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。T7RNA聚合酶機制十分有效并具選擇性充分誘導(dǎo)時，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個小時，目的蛋白通常可以占到細(xì)胞總蛋白的50％以上。盡管該系統(tǒng)極為強大，卻仍能很容易地通過降低誘導(dǎo)物的濃度來削弱蛋白表達(dá)。降低表達(dá)水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分產(chǎn)量。
文檔編號C12N15/70GK103215287SQ20131007459
公開日2013年7月24日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者佟毅, 劉俊梅, 王宏齡, 胡耀輝, 李琢偉, 王丹, 王玉華, 樸春紅, 代偉長, 于寒松 申請人:吉林中糧生化科技有限公司