專利名稱：一種產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌kl1活菌制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌KLl活菌制劑的制備方法，適用于家禽畜牧業(yè)中飼用功能性活菌制劑等微生態(tài)制劑的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KLl是從開菲爾粒中分離純化出來的一種具有降低膽固醇作用的乳酸菌?！安仂`燕”(Tibetan Kefir, TK)又稱開菲爾粒，19世紀被人類發(fā)現(xiàn)。開菲爾粒起源于俄羅斯北高加索地區(qū)，當?shù)啬撩駥⑴Ｈ榛蛏窖蛉樽⑷胙蚱た诖?jīng)自然發(fā)酵生產(chǎn)酸乳酒，其殘留物再補加牛乳或山羊乳繼續(xù)發(fā)酵，經(jīng)長期發(fā)酵后在皮口袋中形成不規(guī)則顆粒狀物體，即為開菲爾粒。此后人們便直接將開菲爾粒添加到牛乳中，使之發(fā)酵成具有爽快酸味和起泡性的保健飲料，即為開菲爾。開菲爾具有多種保健功效。開菲爾中的活菌對志賀氏菌、沙門氏菌等病原菌的生長有強烈抑制作用；其中的酵母菌對結(jié)核桿菌、大腸桿菌有較強抗菌活性。故開菲爾對腸道疾病、肺結(jié)核有很好療效。此外，開菲爾中的乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如胞外多糖、膽鹽水解酶等能有效預防腫瘤和高血脂癥的發(fā)生。在藏靈菇的黏多糖基質(zhì)中微生物菌相主要以乳酸菌、酵母菌及少量醋酸菌為基礎(chǔ)的小生態(tài)系。本發(fā)明所用干酪乳桿菌KLl是從藏靈菇中分離純化出來的一種益生乳酸菌，可在生長代謝過程中產(chǎn)生大量高活力的膽鹽水解酶，經(jīng)過體外牛津杯試驗和動物實驗證明有降低機體血清總膽固醇含量的功效。其降低膽固醇機理是緣于干酪乳桿菌KLl代謝產(chǎn)生的膽鹽水解酶(Bile Salt Hydrolase, BSH)。BSH是腸道中的雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬中的多種乳酸細菌在生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。大量實驗證明，膽鹽水解酶能在肝腸循環(huán)中將結(jié)合膽鹽分解，產(chǎn)生氨基酸與溶解度較低的游離膽鹽。后者能與膽固醇結(jié)合形成沉淀復合物而排出體外，從而降低血清總膽固醇的含量。早在1963年人們就證實攝取含有某種乳桿菌或雙歧桿菌發(fā)酵的酸奶具有降低血清膽固醇含量的功效。迄今為止，國內(nèi)外學者對乳酸菌降膽固醇作用機理的研究尚存在不同觀點，主要集中于以下三點:(1)乳酸菌菌體細胞直接吸收同化膽固醇；(2)乳酸菌的膽鹽水解酶活性使結(jié)合態(tài)膽鹽降解為游離態(tài)膽鹽，后者溶解度下降與膽固醇發(fā)生共同沉淀作用；(3)其他理論，如吸收同化與共沉淀聯(lián)合作用。目前，國內(nèi)申請各種活菌制劑制備方法的專利較多，如江蘇省微生物研究所有限責任公司唐寶英和朱曉慧申請的“酪酸菌活菌制劑及其制備方法”(CN101032527)是由酪酸菌制備的人獸兩用活菌制劑；上海信誼藥業(yè)有限公司陳彬華和姚義強申請的“雙歧三聯(lián)活菌制劑及制備方法”(CN98110623.4)是由兩歧雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌和糞鏈球菌冷凍干燥活菌粉作為活性成份與保護劑組成的；上海環(huán)偉生物科技有限公司張琴和陳建呂申請的“一種復合微生物活菌制劑及其制備方法和應(yīng)用”(ZL200810034746)是利用片球菌、酵母菌和芽孢桿菌分別液體擴大培養(yǎng)，然后按所需比例混合，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、干燥、粉碎制得的一種復合微生物活菌制劑。但關(guān)于利用分離篩選自藏靈菇中的產(chǎn)膽鹽水解酶的干酪乳桿菌KLl制備活菌制劑，利用自動發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，以及利用馬鈴薯粉漿保存生物制劑中活菌的方法尚未見國內(nèi)外相關(guān)文獻報道和專利報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用產(chǎn)膽鹽水解酶的干酪乳桿菌KLl菌種制備活菌制劑的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:所述方法中，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) KLl分離篩選自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏靈菇(又稱開菲爾粒)，并已于2006年9月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為=CGMCC N0.1809(菌株KLl)。在含有碳酸鈣和納他霉素的MRS選擇性培養(yǎng)基上,干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KLl菌株的菌落大小2 3mm，表面粗糙如雪花狀，邊緣不規(guī)則，無光澤，扁平，灰白色，半透明，菌落有較高黏性；個體形態(tài)呈桿狀，長短不等，短鏈狀排列，有時菌體呈球形，G+無芽孢桿菌。所述方法中，將脫脂乳試管保種的干酪乳桿菌KLl菌株以新鮮滅菌脫脂乳于37°C培養(yǎng)12h，至脫脂乳凝固，如此活化2 3代后，冷藏備用。所述方法中，在上述試驗的基礎(chǔ)上，將活化好的菌液以2% (V/V，體積分數(shù))的接種量移種至改良MRS培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)12h，得到擴大培養(yǎng)液。所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用三因素三水平正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件。將2L改良MRS培養(yǎng)基加入到5L全自動發(fā)酵罐中，利用發(fā)酵罐滅菌系統(tǒng)于115°C滅菌15min，利用冷水機將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基冷卻至發(fā)酵溫度。將KLl菌株的擴大培養(yǎng)液按3% (V/V，體積分數(shù))的接種量移種至發(fā)酵罐中，利用發(fā)酵罐自動控溫系統(tǒng)維持發(fā)酵溫度為40°C，發(fā)酵過程中以流加10 % (W/V，質(zhì)量體積比濃度)的滅菌N%C03溶液控制發(fā)酵液pH6.4，攪拌轉(zhuǎn)速為55r/min，發(fā)酵20h，得到發(fā)酵液。上述方法中，改良MRS培養(yǎng)基成分:葡萄糖10g、大豆蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母干粉5g、朽1檬酸二銨2g、磷酸氫二鉀2g、乙酸鈉5g、七水合硫酸鎂0.58g、四水合硫酸猛
0.25g、吐溫 _801mL、蒸餾水 IOOOmL,調(diào)節(jié) pH 為 6.4。上述方法中，5L發(fā)酵罐由上海高機生物工程有限公司生產(chǎn)，其型號為B10F6005GBN。所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，將2L發(fā)酵液于4°C條件下，5000r/min離心15min,棄上清液,收集得到菌泥。所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，將收集的菌泥平均加入2只盛有IOOmL馬鈴薯粉漿(凍干保護基質(zhì))的600mL凍干瓶中，加入3.5%谷氨酸鈉、2.0%脫脂奶粉和1.5%甘油作為凍干保護劑，混合均勻后，得到濃縮活菌制劑。上述方法中，采用單因素多水平試驗，確定干酪乳桿菌KLl的凍干保護劑較優(yōu)組合配方為(W/ν，質(zhì)量體積比濃度):3.5%谷氨酸鈉+2.0%脫脂奶粉(伊利)+1.5%甘油(V/V,體積分數(shù))。上述方法中，將新鮮去皮馬鈴薯以九陽牌食物料理機打漿，即成為馬鈴薯粉漿。

所述方法中，將濃縮活菌制劑于_34°C預凍15h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預凍活菌制劑。
所述方法中，在上述試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，利用6L LABC0NC0真空冷凍干燥機(美國)將預凍活菌制劑于凍干溫度_55°C、真空度0.16mBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)，得到凍干活菌制劑。所述方法中，所得產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌KLl活菌制劑的活菌數(shù)量可達1010CFU/g以上，菌種存活率可達85%以上。此種活菌制劑由于用馬鈴薯粉漿作為凍干保護基質(zhì)，使產(chǎn)品價格低廉，活菌含量高，可作為家禽飼料添加劑，具有雞生長速度快、飼料用量省、少生病等特點。它不僅有降低雞蛋膽固醇的效果，而且具有調(diào)節(jié)雞的腸道菌群平衡作用，對雞白痢有較好預防和治療作用。上述方法得到的產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌KLl活菌制劑及其制備方法屬于本發(fā)明保護范圍。
具體實施例方式
下述實施例對本發(fā)明作進一步說明而不限制本發(fā)明的保護范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為體積分數(shù)。實施例1、產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌KLl活菌制劑的制備方法1、菌種的活化和擴大培養(yǎng)將脫脂乳試管保種的干酪乳桿菌KLl菌株以新鮮滅菌脫脂乳于37°C培養(yǎng)12h，至脫脂乳凝固，如此活化2 3代，冷藏備用；將活化好的菌液以2 %的接種量移種至改良MRS培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)12h，得到擴大培養(yǎng)液。2、發(fā)酵培養(yǎng)基的確定分別制備3種發(fā)酵培養(yǎng)基:滅菌的牛奶培養(yǎng)基、改良MRS培養(yǎng)基、牛奶+10%胡蘿卜培養(yǎng)基。將活化好的菌種按2%的接種量分別移種至上述培養(yǎng)基中，于37°C發(fā)酵12h后，
采用MRS培養(yǎng)基以傾注平板培養(yǎng)法檢測發(fā)酵液中的活菌數(shù)量，每個稀釋度設(shè)3次重復，結(jié)果見表I。表I不同發(fā)酵培養(yǎng)基對干酪乳桿菌KLl活菌數(shù)量的影響
權(quán)利要求
1.一種利用菌株KL1CGMCC N0.1809為干釀乳桿菌(Lactobacillus casei)的產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌制備活菌制劑的方法，其特征在于:將干酪乳桿菌KLl擴大培養(yǎng)液按3%的接種量移種至2L改良MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用5L全自動發(fā)酵罐進行滅菌和高密度發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度40°C，發(fā)酵液pH6.4，攪拌轉(zhuǎn)速55r/min，發(fā)酵時間20h，得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液于4°C、5000r/min離心15min，收集得到菌泥；在600mL凍干瓶中按離心前發(fā)酵液1/10體積的量，加入馬鈴薯粉漿作為凍干保護基質(zhì)，再加入3.5%谷氨酸鈉、2.0%脫脂奶粉和1.5%甘油的凍干保護劑與收集的菌泥，混合均勻后，得到濃縮發(fā)酵劑；將每個凍干瓶裝量為IOOmL的濃縮發(fā)酵劑于_34°C預凍15h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預凍活菌制劑；利用美國產(chǎn)6L LABC0NC0真空冷凍干燥機將預凍活菌制劑于_55°C、真空度0.16mBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)，得 到干酪乳桿菌KLl凍干活菌制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌KL1活菌制劑的制備方法，適用于家禽畜牧業(yè)中飼用功能性活菌制劑等微生態(tài)制劑的生產(chǎn)。本發(fā)明利用篩選自藏靈菇中的產(chǎn)膽鹽水解酶的干酪乳桿菌KL1菌株，經(jīng)過活化、擴大培養(yǎng)、高密度發(fā)酵、離心濃縮、加入凍干保護劑、預凍和冷凍干燥等工序制備活菌制劑。本發(fā)明利用全自動發(fā)酵罐優(yōu)化發(fā)酵條件，并利用馬鈴薯粉漿作為凍干保護基質(zhì)，確定凍干保護劑較優(yōu)組合配方，使KL1菌株的活菌數(shù)量可達1010CFU/g以上，存活率達到85％以上。本發(fā)明制備的活菌制劑價格低廉，活菌含量高，可作為家禽飼料添加劑，具有雞生長速度快、飼料用量省、少生病等特點。它不僅有降低雞蛋膽固醇的效果，而且具有調(diào)節(jié)雞的腸道菌群平衡作用，對雞白痢有較好預防和治療作用。
文檔編號C12R1/245GK103146607SQ201310068240
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者劉慧 , 謝遠紅, 張紅星, 周妍, 熊利霞, 高秀芝 申請人:北京農(nóng)學院