專利名稱：一種檢測豬流行性乙型腦炎病毒的引物及可視化試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及豬感染乙型腦炎病毒的快速檢測試劑盒及引物。
背景技術(shù)：
流行性乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),簡稱乙腦病毒，所引起的疾病簡稱乙腦，乙腦是一種人畜共患的病毒性傳染病，可以感染人類和多種動物，可以導(dǎo)致人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和豬的繁殖障礙，嚴重危害著人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。乙腦病原學實驗室診斷方法可以檢測病例的腦組織、胎兒、胎盤以及體液等中的病毒抗原。目前的診斷方法有:免疫細胞化學法、反向被動血凝試驗、熒光抗體染色法和RT-PCR技術(shù)。日本長崎大學運用基因擴增的傳統(tǒng)方法，發(fā)展了實時環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增技術(shù)(reverse transcription loop-mediatedisothemal amplification,RT-LAMP),檢測JEV的敏感性可以達到IPFU。然而，上述現(xiàn)有技術(shù)仍存在著缺點和不足:①實驗結(jié)果的判斷不夠迅速直觀需要貴重儀器設(shè)備，不利于推廣檢出效率還不夠高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是，針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷提供一種可以用肉眼迅速判定實驗結(jié)果，并利用環(huán)引物加強反應(yīng)的檢測試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:—對檢測豬流行性乙型腦炎病毒的環(huán)引物，其應(yīng)用于環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)中，其特征在于，該對環(huán)引物包括:上游環(huán)引物(FL)，其序列如序列表SEQ ID N0.5 所示:5’-CAGAAITTTCCTGGnTTCCCTGA-3’ ；下游環(huán)引物(BL)，其序列如序列表SEQ ID N0.6 所示:5’-GGTGGTAGCAGCAGAAATGGCA-3，。一組檢測豬流行性乙型腦炎病毒的引物，其應(yīng)用于環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)中，其特征在于，該組引物包括:上游內(nèi)部引物(FIP)，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示:5’ -CGCTGCTGGATAGCGTCCTT GAATTCGTGC TAGATTTGCA CCCTGG-3’ ；下游內(nèi)部引物(BIP)，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示:5’ -AAGAACAGCTGTGTTGGCAC CGGATATCGT ACTGGGAGCC CT-3’ ；上游外部引物(F3)，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示:5’ -ACACCCCAAACATGTTGAGA-3’ ；下游外部引物(B3)，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示:5’ -CTCTCTGCACTGCTGAAGTT-3’ ；上游環(huán)引物(FL)，其序列如序列表SEQ ID N0.5 所示:5’-CAGAAITTTCCTGGnTTCCCTGA-3’；下游環(huán)引物(BL)，其序列如序列表SEQ ID N0.6 所示:5’-GGTGGTAGCAGCAGAAATGGCA-3，。檢測豬流行性乙型腦炎病毒的可視化試劑盒，其特征在于，其組成為:10 X Thermopol 反應(yīng)緩沖液；10mmol /T, dNTPs ；乙腦病毒總RNA ；上游內(nèi)部引物FIP，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示；下游內(nèi)部引物BIP，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示；上游外部引物F3，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示；下游外部引物B3，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示；上游環(huán)引物FL，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示；下游環(huán)引物BL，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示；Bst DNA聚合酶大 片段；AMV反轉(zhuǎn)錄酶；20 X SYBR Green I ；DEPC ddH20。如上所述的可視化試劑盒在非活體樣品的豬流行性乙型腦炎病毒檢測中的應(yīng)用，其特征在于，其步驟為:(I)在反應(yīng)管中加入以下組分并混勻:10 X Thermopol 反應(yīng)緩沖液，2.5 U L ；待測樣品總RNA5.25 U L，陽性對照反應(yīng)管中則加入陽性樣品總RNA5.25 U L ；8U/管Bst DNA聚合酶大片段，IuL ；AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.25 ii L ;10mmol /T, dNTPs, 2.5 U L ；20pmol/管上游內(nèi)部引物，0.8iiL ;20pmol/管下游內(nèi)部引物，0.8iiL ;5pmol/管上游外部引物,0.2 ii L ;5pmol/管下游外部引物,0.2 ii L ;20pmol/管上游環(huán)引物，0.L ;20pmol/管下游環(huán)引物，0.L ;DEPC ddH20 補齊至 25 ii L ;(2)置于42°C下保溫30min，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；(3)置于6(T65°C下保溫3(T90min，進行LAMP擴增反應(yīng)；(4)置于 80°C下 IOmin,滅活 Bst DNA 聚合酶；(5)懸置I ii L20XSYBR Green I于反應(yīng)管蓋，將之彈入反應(yīng)液中并混勻；(6)將反應(yīng)管置于紫外透射儀下，可見綠色熒光產(chǎn)生則待測樣品為陽性。
如上所述的應(yīng)用，步驟(4)后得到的LAMP擴增反應(yīng)產(chǎn)物也可以利用凝膠成像系統(tǒng)進行檢測，其特征在于:在檢測時，使用TAE/TBE緩沖液試驗伴侶配制瓊脂膠，添加約20g/LGoldView 核酸染料染色，對反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳檢測，電泳(260V/2000mA)約45分鐘，觀察結(jié)果，出現(xiàn)如圖4所示的特異條帶則待測樣品為陽性。本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供了一種豬乙型腦炎病毒診斷環(huán)引物加強型可視化試劑盒，同時提供了一種檢測程序簡單、靈敏度和特異性較高的基因檢測手段。本發(fā)明設(shè)計并使用了 RT-LAMP引物和環(huán)引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，結(jié)果判定實現(xiàn)可視化，環(huán)引物加強反應(yīng)。對豬乙型腦炎檢測診斷防治具有較大意義。


圖1為NS3基因保守區(qū)LAMP擴增結(jié)果。圖2為LAMP擴增后產(chǎn)物的可視化結(jié)果，a為可見光下的結(jié)果，b為紫外光下的結(jié)果。圖3為LAMP擴增后產(chǎn)物的酶切鑒定結(jié)果。圖4為不同反轉(zhuǎn)錄時間的LAMP擴增結(jié)果。圖5為不同反應(yīng)時間LAMP擴增的結(jié)果。圖6為NS3基因的LAMP檢測特異性凝膠成像結(jié)果。圖7a、b、c依次為RT-LAMP、RT-PCR和熒光RT-PCR的檢測結(jié)果圖。圖8為乙型腦炎病毒檢測實時RT-LAMP熒光走勢圖。
具體實施例方式一、JEV NS3基因保守區(qū)的LAMP擴增:以JEV總RNA為模板，用本發(fā)明提供的引物進行JEV NS3基因保守區(qū)的擴增，反應(yīng)體系為:25 U L反應(yīng)體系中含有:IOXThermopol 反應(yīng)緩沖液(NEB 公司)，2.L ；JEV 總 RNA5.25 U L ；8U/管Bst DNA聚合酶大片段(NEB公司)，IiiL;AMV 反轉(zhuǎn)錄酶(NEB 公司)0.25 ii L ;10mmol /T, dNTPs, 2.5 U L ；20pmol/ 管上游內(nèi)部引物(FIP)，0.8 ii L ；20pmol/ 管下游內(nèi)部引物(BIP)，0.8 ii L ；5pmol/ 管上游外部引物(F3)，0.L ；5pmol/ 管下游外部引物(B3)，0.2 ii L ；20pmol/ 管上游環(huán)引物(FL)，0.4 ii L ；

20pmol/ 管下游環(huán)引物(BL)，0.4 ii L ；(上述引物均為寶生物工程(大連)有限公司合成)DEPC ddH20 補齊至 25 ii L。
按上述反應(yīng)體系分多組進行實驗，各組一同在42°C下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30min后；然后分別在溫度為63°C、64°C、65°C的水浴鍋中保溫進行LAMP擴增反應(yīng)Ih，80°C下滅活Bst DNA聚合酶IOmin后，進行電泳檢測；檢測結(jié)果顯示，在63°C、64°C條件下，都能擴增到條帶，電泳條帶呈梯狀分布，與理論結(jié)果相符，陰性對照的擴增結(jié)果只有引物聚體帶出現(xiàn)。如圖1所示，M道為DNA分子量標記DL2000 ;1、2、3道分別為63°C、64°C、65°C條件下的擴增結(jié)果；4道為陰性對照。若在反應(yīng)管中加入L20X的SYBR Green I，可見陽性管出現(xiàn)黃綠色，陰性管為褐色。將加入了 20X的SYBR Green I的反應(yīng)管放置到紫外燈下照射，陽性反應(yīng)管發(fā)出熒光，而陰性對照無明顯變化。4000rpm離心30s后，可見陽性管的反應(yīng)液有明顯白色沉淀，這是因為擴增后形成的焦磷酸離子和溶液中的鎂離子結(jié)合而形成焦磷酸鎂沉淀所致。如圖2所示，N管為陰性對照，P管為LAMP的擴增產(chǎn)物。
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二、LAMP擴增產(chǎn)物的酶切鑒定:擴增的產(chǎn)物是環(huán)狀的重復(fù)的長度不等的啞鈴狀的DNA雙鏈，需經(jīng)酶切后產(chǎn)生大小特異的條帶以進一步驗證其LAMP擴增的特異性。酶切反應(yīng)的反應(yīng)體系為:25 U L反應(yīng)體系中含有:IOX內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，2 ii L ；EcoR I 酶，I U L ;RT-LAMP 的擴增產(chǎn)物，5u L ；ddH20 補至 25 U L。將上述反應(yīng)物混勻離心后，37 °C反應(yīng)2h。反應(yīng)后取5iiL反應(yīng)液，用含0.5iig/mL的EB的2%瓊脂糖凝膠電泳對酶切反應(yīng)產(chǎn)物進行檢測。LAMP擴增產(chǎn)物酶切鑒定的結(jié)果如圖3所示，其中M道為DNA分子量標準DL2000 ； I道為NS3基因LAMP擴增后產(chǎn)物經(jīng)EcoR I酶消化后的結(jié)果；2道為NS3基因LAMP擴增后產(chǎn)物。理論上，LAMP擴增產(chǎn)物存在兩個EcoRI內(nèi)切酶位點，酶切后生成兩種產(chǎn)物，大小分別為IlObp和130bp。由圖3可見，檢測結(jié)果與理論值相符。三、逆轉(zhuǎn)錄時間的優(yōu)化:將反應(yīng)物分為六組，一同放入42 °C水浴鍋中反應(yīng)，分別在反應(yīng)后Omin、IOmin、20min、30min、40min和50min后取出，再在63°C反應(yīng)lh，待反應(yīng)產(chǎn)物全部取出后，取5 y L反應(yīng)液，用含0.g/mL EB的2%瓊脂糖凝膠電泳對反應(yīng)產(chǎn)物進行檢測。電泳檢測結(jié)果如圖4所示，其中，M道為DNA分子量標準DL2000 ;1_6道分別為反轉(zhuǎn)錄時間為Omin、10min、20min、30min、40min和50min的反應(yīng)物；7道為陰性對照。由圖4結(jié)果可見，省略逆轉(zhuǎn)錄步驟會對后續(xù)的等溫擴增有一定的影響，但逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)10-50min后，不同的逆轉(zhuǎn)錄時間對后續(xù)的反應(yīng)沒有顯著的影響。四、LAMP擴增反應(yīng)時間的優(yōu)化:在相同的反轉(zhuǎn)錄條件下，采用不同反應(yīng)時間進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，反應(yīng)結(jié)果如圖5所示，其中，M道為DNA分子量標準DL2000 ；1道為陰性對照；2_5道分別為NS3基因在反應(yīng)30min、40min、50min、60min后的LAMP擴增結(jié)果。由圖5結(jié)果可見:在反應(yīng)時間為30min左右時，可見微弱的梯狀條帶；反應(yīng)時間在30-60min之間時，梯狀條帶逐漸變亮；反應(yīng)時間在60min左右時，梯狀條帶表現(xiàn)最明顯。因此，LAMP擴增反應(yīng)的最佳時間為60mim。五、特異性試驗:分別提取豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、藍耳病病毒、口蹄疫病毒、豬圓環(huán)2型病毒的RNA或DNA，用本發(fā)明的RT-LAMP試劑盒及方法進行檢測。檢測結(jié)果如圖6所示，其中M道為DNA分子量標準DL2000 ；1道為流行性乙型腦炎病毒；2道為陰性對照；3道為豬瘟病毒；4道為豬偽狂犬病毒；5道為豬細小病毒；6道為藍耳病病毒；7道為口蹄疫病毒；8道為豬圓環(huán)2型病毒；9道為豬丹毒；10道為豬大腸桿菌。由圖6結(jié)果可見，本發(fā)明的試劑盒及檢測方法特異性較好，與其它疾病沒有交叉反應(yīng)。六、敏感性對比實驗:取JEV總RNA (8.13 X 108PFU/mL),按5倍比例連續(xù)稀釋后，將各組RNA分別應(yīng)用于RT-LAMP、RT-PCR和熒光定量PCR反應(yīng)。其中:RT-LAMP的實驗條件與具體實施方式
第一部分相同。RT-PCR所用引物為:JE-E-Pl:5，-TGCTGTTGGTCGCTCCGG CT TA-3，；JE-E-P2:5， -TGTCAATGGCACATCCAGTG-3，；使用一步法RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司，大連)，按說明書進行操作。熒光定量PCR使用熒光定量PCR試劑盒(華銀公司，廣州)，按說明書進行操作。如圖7a_c所示，RT-LAMP的檢測極限為稀釋57倍，RT-PCR的檢測極限為稀釋55倍，熒光定量PCR為53倍(結(jié)果顯示稀釋53倍的檢測結(jié)果出現(xiàn)華銀公司試劑盒陽性判定曲線)。因此，RT-LAMP比RT-PCR大約敏感25倍，比熒光定量PCR大約敏感625倍。七、乙型腦炎病毒檢測的實時RT-LAMP方法:按照具體實施方式
第一部分記載的方法配制反應(yīng)體系，在反應(yīng)管中添加I u LQuant-1T PicoGreen,置于 Roche LightCycle2.0 熒光定量 PCR 儀中，每隔 I 分鐘收集一次熒光。結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，在反應(yīng)的第37分鐘，熒光值開始迅速上升。在反應(yīng)I小時左右，熒光值達到最大值。結(jié)果與具體實施方式
第四部分中的LAMP擴增時間梯度電泳圖基本一致。八、本發(fā)明RT-LAMP檢測方法對不同JEV毒株的檢測結(jié)果:
采用本發(fā)明RT-LAMP方法對SA14-14-2株、SA103株、⑶06株3株不同毒株的檢測結(jié)果均為陽性。且與RT-PCR檢測結(jié)果一致。說明本發(fā)明的RT-LAMP試劑盒及檢測方法在病毒流行性乙型腦炎病毒的檢測中具有較好的適用性和應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一對檢測豬流行性乙型腦炎病毒的環(huán)引物，其特征在于，該對環(huán)引物包括: 上游環(huán)引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下游環(huán)引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示。
2.一組檢測豬流行性乙型腦炎病毒的引物，其特征在于，該組引物包括: 上游內(nèi)部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示； 下游內(nèi)部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示； 上游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示； 下游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示； 上游環(huán)引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下游環(huán)引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示。
3.檢測豬流行性乙型腦炎病毒的可視化試劑盒，其特征在于，其組成為: IOXThermopol反應(yīng)緩沖液；`10mmol /T, dNTPs ； 乙腦病毒RNA ； 上游內(nèi)部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示； 下游內(nèi)部引物，其序列如序列`表SEQ ID N0.2所示； 上游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示； 下游外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示； 上游環(huán)引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下游環(huán)引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示； Bst DNA聚合酶大片段； AMV反轉(zhuǎn)錄酶； 20XSYBR Green I ；DEPC ddH20。
4.如權(quán)利要求3所述的可視化試劑盒在非活體樣品的豬流行性乙型腦炎病毒檢測中的應(yīng)用，其特征在于，其步驟為: (I)在反應(yīng)管中加入以下組分并混勻: `10 X Thermopol 反應(yīng)緩沖液，2.5 u L ； 待測樣品總RNA5.25 u L，陽性對照反應(yīng)管中則加入陽性樣品總RNA5.25 u L ； 8U/管Bst DNA聚合酶大片段，IuL ； AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.25u L ；10mmol /T, dNTPs, 2.5 U L ； 20pmol/管上游內(nèi)部引物,0.8 u L ； 20pmol/管下游內(nèi)部引物,0.8 u L ； 5pmol/管上游外部引物，0.2uL； 5pmol/管下游外部引物，0.2uL； 20pmol/管上游環(huán)引物,0.4u L ； 20pmol/管下游環(huán)引物,0.4u L ； DEPC ddH20 補齊至 25u L ；(2)置于42°C下保溫30min，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；(3)置于6(T65°C下保溫3(T90min，進行LAMP擴增反應(yīng)；(4)置于80°C下IOmin,滅活BstDNA聚合酶；(5)懸置Iii L20XSYBR Green I于反應(yīng)管蓋，將之彈入反應(yīng)液中并混勻；(6)將反應(yīng)管置于紫 外透射儀下，可見綠色 熒光產(chǎn)生則待測樣品為陽性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組檢測豬流行性乙型腦炎病毒的引物，包括上游內(nèi)部引物、下游內(nèi)部引物、上游外部引物、下游外部引物、上游環(huán)引物和下游環(huán)引物，其序列依次如序列表SEQ ID No.1-6所示。本發(fā)明還提供了包含該組引物的檢測豬流行性乙型腦炎病毒的可視化試劑盒及利用該試劑盒檢測非活體樣品上是否含有豬流行性乙型腦炎病毒的方法。本發(fā)明提供的引物、試劑盒和檢測方法，優(yōu)化了反應(yīng)體系，結(jié)果判定實現(xiàn)了可視化，對豬乙型腦炎檢測診斷防治具有較大意義。
文檔編號C12Q1/70GK103103294SQ20131005376
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月19日
發(fā)明者林志雄, 田純見, 何曉明, 羅瓊, 魚海瓊, 羅長保, 陳茹, 劉志玲, 王宏, 吳曉薇, 畢英佐, 馬靜云 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心