一種流行性乙型腦炎病毒的微流體基因芯片檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速、靈敏的流行性乙型腦炎病毒微流體基因芯片檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法整合了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR和微陣列Microarray這兩種強(qiáng)大的分子生物學(xué)技術(shù)，將RT-PCR與微陣列芯片雜交反應(yīng)腔整合到一張芯片上，PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中。檢測(cè)方法包括如下步驟：樣本處理，RNA核酸提取，RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，雜交，清洗，結(jié)果判定。通過(guò)本發(fā)明可大幅度提高出入境口岸一線檢驗(yàn)檢疫人員的檢測(cè)效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法可能存在的陽(yáng)性漏檢問(wèn)題，從而最大限度地防止重大蟲媒傳染病的輸入。
【專利說(shuō)明】一種流行性乙型腦炎病毒的微流體基因芯片檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及體外診斷試劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種流行性乙型腦炎病毒的快速微 流體基因芯片檢測(cè)方法。
[0002] 背景介紹
[0003] 隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和貿(mào)易自由化，國(guó)外的醫(yī)學(xué)媒介生物通過(guò)先進(jìn)的交通工具和 國(guó)際貿(mào)易，可以迅速把傳染病從一個(gè)國(guó)家或地區(qū)傳向全球，造成國(guó)際間傳播。近年來(lái)，新發(fā) 病毒性傳染病在世界各國(guó)頻頻暴發(fā)流行，對(duì)人類健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅，給社會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì) 損失。這些新發(fā)病毒性傳染病的頻發(fā)給我們敲響了警鐘，加強(qiáng)對(duì)其的研宄和監(jiān)測(cè)以及早預(yù) 防控制是至關(guān)重要的。
[0004] 蟲媒病毒是一類通過(guò)吸血節(jié)肢動(dòng)物叮咬敏感脊椎動(dòng)物宿主而在人畜之間進(jìn)行傳 播的病毒，其中100多種可以導(dǎo)致人畜疾病，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致死亡。流行性乙型腦炎病毒是流 行性乙型腦炎的病原體，黃病毒科黃病毒屬。主要癥狀為高熱、頭痛、嘔吐、昏睡、痙攣等。 重癥者可周身高燒、抽痙不止、腦水腫、呼吸或循環(huán)衰竭而死亡，部分患者留有后遺癥。呈球 狀，直徑40nm，核酸為單鏈RNA，外層具包膜，包膜表面有血凝素。在我國(guó)，乙腦病毒的主要 傳播媒介是三帶喙庫(kù)蚊。蚊蟲感染病毒后，叮咬豬、牛、羊、馬等動(dòng)物，產(chǎn)生病毒血癥，可成為 更多的蚊蟲感染病毒的傳染源。主要流行區(qū)有東南亞、西太平洋地區(qū)。發(fā)病情況與蚊蟲數(shù) 量相關(guān)，熱帶地區(qū)全年發(fā)生，亞熱帶和溫帶地區(qū)多為7?9月。在我國(guó)，除新疆、西藏、青海 夕卜，全國(guó)各地均有病例發(fā)生，年發(fā)病人數(shù)2. 5萬(wàn)，病死率10%，大約15%的患者留有不同程 度的后遺癥。隨著我國(guó)商貿(mào)、旅游業(yè)的快速發(fā)展，境內(nèi)外人員交往日益密切，以及動(dòng)物的 進(jìn)口等影響，流行性乙型腦炎病毒輸入的危險(xiǎn)性日益增高。因此，盡快建立快速簡(jiǎn)便、特 異敏感的檢測(cè)方法對(duì)防范流行性乙型腦炎病毒的輸入具有重要意義。
[0005] 基因芯片采用微加工和微電子技術(shù)將大量的人工設(shè)計(jì)好的基因片段有序地、高密 度地排列在纖維膜等載體上?；蛐酒梢酝瑫r(shí)固定大量的探針?lè)肿?，可以在一次?shí)驗(yàn)中 檢出多種病原體；同時(shí)檢測(cè)的靈敏度、特異性和快速便捷性也很高，因而在病原體分析檢測(cè) 中有很好的應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明整合了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR和微陣列Microarray這兩種強(qiáng)大的 分子生物學(xué)技術(shù)，將RT-PCR與微陣列芯片雜交反應(yīng)艙整合到一張芯片上，PCR雜交的探針 直接固定在微陣列中的雜交艙中。操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間，靈敏度高，特異性好。為流行性乙 型腦炎病毒的檢測(cè)提供了快速，簡(jiǎn)便，靈敏的微流體基因芯片檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速、靈敏的流行性乙型腦炎病毒微流體 基因芯片檢測(cè)方法。通過(guò)本發(fā)明可大幅度提高出入境口岸一線檢驗(yàn)檢疫人員的檢測(cè)效率， 既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法可能存在的陽(yáng)性漏檢問(wèn)題，從而最大 限度地防止外來(lái)輸入性傳染病的發(fā)生。
[0008] 本發(fā)明所提供的流行性乙型腦炎病毒的微流體基因芯片檢測(cè)方法，包括如下檢測(cè) 步驟：
[0009] (1)樣本混勻處理；
[0010] (2) RNA 核酸提??；
[0011] (3) RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)：
[0012] a. RT-PCR反應(yīng)體系包括：RT-PCR反應(yīng)液，特異性正、反向引物混合液，逆轉(zhuǎn)錄酶/ DNA聚合酶，DEPC水，RT-PCR質(zhì)控品，樣本RNA核酸；
[0013] b.將RT-PCR反應(yīng)液加入已固化特異性探針的芯片內(nèi)，將芯片放入反應(yīng)室內(nèi)進(jìn)行 擴(kuò)增反應(yīng)；
[0014] 所述的特異性引物和探針是根據(jù)Nonstructural gene 4基因特異性引物擴(kuò)增區(qū) 內(nèi)設(shè)計(jì)，能夠區(qū)別其他病毒株，特異性引物和探針為：
[0015] JEV-F:5-GGTGTAAGGACTAGAGGTTAGAGG-3(SEQ ID NO 1)
[0016] JEV-R:5-ATTCCCAGGTGTCAATATGCTGTT-3(SEQ ID NO 2)
[0017] JEV-Probe:5-CCCGTGGAAACAACATCATGCGGC-3(SEQ ID NO 3)
[0018] (4)雜交：RT-PCR擴(kuò)增完后，加入雜交反應(yīng)液，使雜交液和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜交艙 內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)；
[0019] (5)清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測(cè)；
[0020] (6)結(jié)果判定：根據(jù)雜交結(jié)果，判定感染情況。
[0021] 步驟（2)中所述的RNA提取可使用病毒RNA提取試劑盒提取。取HOul血液樣本， 裂解后，按照試劑盒說(shuō)明書中的提取步驟提取RNA。
[0022] 步驟（3)中所述的RT-PCR反應(yīng)體系為：2X RT-PCR反應(yīng)液12. 5ul，引物混合液 2. 5ul，14mM MgS04 2. 5ul，PCR Grade H20 Iul,逆轉(zhuǎn)錄酶 /DNA 聚合酶 lul, PCR 質(zhì)控 2ul, 樣本3. 5ul。
[0023] 步驟（3)中所述的RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件是：50°C逆轉(zhuǎn)錄20min ;95°C預(yù)變性 2!1^11;95°0變性1〇8,60°0退火4〇8,72°0延伸5〇8;11個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°〇， 直至退火溫度變成50°0;95°0變性158,56°0退火4〇8,72°0延伸5〇8,40個(gè)循環(huán)。
[0024] 步驟（4)中所述的雜交反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性3min ;58°C雜交30min。
[0025] 步驟（5)中所述的清洗條件是3000rpm，離心2min。
[0026] 步驟（3)所述的PCR擴(kuò)增與步驟（4)所述的雜交在芯片儀上完成。
[0027] 本發(fā)明與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比，將RT-PCR的擴(kuò)增過(guò)程和分子雜交檢測(cè)過(guò)程濃縮到 一張基因
[0028] 芯片上檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)在3個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，大大縮減了檢測(cè)的時(shí)間和復(fù)雜性，檢測(cè) 設(shè)備簡(jiǎn)單也易于攜帶。本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，特異性好，為流行性乙型腦 炎病毒的檢測(cè)提供了快速，簡(jiǎn)便，靈敏的方法。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1實(shí)施例1流行性乙型腦炎病毒病人血清陽(yáng)性樣本微流體基因芯片檢測(cè)結(jié)果。
[0030] 圖2實(shí)施例1流行性乙型腦炎病毒蚊蟲研磨液陽(yáng)性樣本微流體基因芯片檢測(cè)結(jié) 果。
[0031] 本實(shí)施例中測(cè)檢測(cè)結(jié)果顯示本樣本在流行性乙型腦炎病毒屬和流行性乙型腦炎 病毒株均顯示為陽(yáng)性。
[0032] 圖3實(shí)施例1流行性乙型腦炎病毒陰性對(duì)照樣本微流體基因芯片檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0034] 實(shí)施例1流行性乙型腦炎病毒樣本微流體基因芯片檢測(cè)
[0035] -、實(shí)驗(yàn)步驟
[0036] 1.樣本準(zhǔn)備
[0037] 本實(shí)施例中，陽(yáng)性樣本為流行性乙型腦炎病人血清和攜帶有流行性乙型腦炎病毒 的蚊蟲研磨液，陰性對(duì)照樣本為健康人的血清。
[0038] 2. RNA 的提取
[0039] 使用病毒RNA提取試劑盒（離心柱型）提取樣本RNA。取HOul樣本，按照試劑盒 說(shuō)明書中的操作步驟提取RNA，最后用60ul洗脫液洗脫RNA。
[0040] 3.靶基因的擴(kuò)增
[0041] 3.1引物和探針的設(shè)計(jì)
[0042] 根據(jù)Nonstructural gene 4基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針為：
[0043] JEV-F:5-GGTGTAAGGACTAGAGGTTAGAGG-3(SEQ ID NO 1)
[0044] JEV-R:5-ATTCCCAGGTGTCAATATGCTGTT-3(SEQ ID NO 2)
[0045] JEV-Probe:5-CCCGTGGAAACAACATCATGCGGC-3(SEQ ID NO 3)
[0046] 特異性探針按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，分別點(diǎn)入芯片上各自孔中。
[0047] 3. 2RT-PCR 反應(yīng)平臺(tái)
[0048] 在溫度控制儀上進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增與雜交反應(yīng)。為防止引物間的互相干擾，RT-PCR 反應(yīng)同
[0049] 時(shí)在兩個(gè)反應(yīng)室中進(jìn)行，兩個(gè)反應(yīng)室都可以聯(lián)通到雜交室，RT-PCR后的擴(kuò)增液可 以通過(guò)注射推送方式使其流入雜交室進(jìn)行雜交反應(yīng)。
[0050] RT-PCR 反應(yīng)體系為：2X RT-PCR 反應(yīng)液 12. 5ul,引物混合液 2. 5ul，14mM MgS04 2.5ul，PCR Grade H20 lul,逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA 聚合酶 lul，PCR 質(zhì)控 2ul,樣本 3.5ul。
[0051] 反應(yīng)條件為：50°C逆轉(zhuǎn)錄20min ;95°C預(yù)變性2min ;95°C變性10s，60°C退火40s， 72°C延伸50s ; 11個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C，直至退火溫度變成50°C。95°C變性 15s，56°C 退火 40s，72°C延伸 50s，40 個(gè)循環(huán)。
[0052] 4.雜交反應(yīng)
[0053] 分別向兩個(gè)RT-PCR反應(yīng)室中加入14. 5ul雜交液，使雜交液和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜 交反應(yīng)艙內(nèi)。雜交反應(yīng)條件是95°C預(yù)變性3min，58°C雜交30min。雜交后的芯片用洗液離 心（3000rpm，2min)洗絳，在芯片掃描儀上進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。
[0054] 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0055] 從圖1、圖2和圖3的檢測(cè)信號(hào)圖來(lái)看，RT-PCR質(zhì)控點(diǎn)信號(hào)正常，陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào) 正常，雜交對(duì)照點(diǎn)信號(hào)正常，說(shuō)明從RT-PCR到雜交的整個(gè)反應(yīng)過(guò)程均正常，從而說(shuō)明整個(gè) 反應(yīng)有效。根據(jù)每個(gè)點(diǎn)的熒光信號(hào)值（詳見(jiàn)表1、表2和表3)，對(duì)照整個(gè)反應(yīng)艙的探針設(shè)計(jì)， 陽(yáng)性樣本在流行性乙型腦炎病毒探針位置有明顯的雜交信號(hào)，而在陰性對(duì)照樣本的相應(yīng)流 行性乙型腦炎病毒探針位置處未發(fā)現(xiàn)有雜交信號(hào)。通過(guò)軟件分析，判定樣本為流行性乙型 腦炎病毒感染陽(yáng)性，而陰性對(duì)照樣本判定為陰性。跟預(yù)期的樣本感染情況一致。這表明本 發(fā)明的微流體基因芯片的檢測(cè)性能良好，能準(zhǔn)確地區(qū)分陰性及陽(yáng)性樣本，特異性良好，沒(méi)有 出現(xiàn)錯(cuò)判現(xiàn)象。
[0056] 表1病人血清陽(yáng)性樣本的檢測(cè)信號(hào)數(shù)值
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種流行性乙型腦炎病毒的微流體基因芯片檢測(cè)方法，其特征在于：包括以下檢測(cè) 步驟： (1) 樣本混勻處理； (2) RNA核酸提??； (3) RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)： a. RT-PCR反應(yīng)體系包括：RT-PCR反應(yīng)液，特異性正、反向引物混合液，逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA 聚合酶，DEPC水，RT-PCR質(zhì)控品，樣本RNA核酸； b. 將RT-PCR反應(yīng)液加入已固化特異性探針的芯片內(nèi)，將芯片放入反應(yīng)室內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增 反應(yīng)； 所述的特異性引物和探針是根據(jù)Nonstructural gene 4基因特異性引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè) 計(jì)，能夠區(qū)別其他病毒株，特異性引物和探針為： JEV-F:5-GGTGTAAGGACTAGAGGTTAGAGG-3(SEQ ID NO 1) JEV-R:5-ATTCCCAGGTGTCAATATGCTGTT-3(SEQ ID NO 2) JEV-Probe:5-CCCGTGGAAACAACATCATGCGGC-3(SEQ ID NO 3) (4) 雜交：RT-PCR擴(kuò)增完后，加入雜交反應(yīng)液，使雜交液和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜交艙內(nèi)進(jìn) 行雜交反應(yīng)； (5) 清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測(cè)； (6) 結(jié)果判定：根據(jù)雜交結(jié)果，判定感染情況。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流行性乙型腦炎病毒的微流體基因芯片檢測(cè)方法，其特征在 于：步驟（2)中所述的RNA提取使用病毒RNA提取試劑盒提?。凰龅腞NA提取步驟為：取 140ul血液樣本，裂解后，按照試劑盒說(shuō)明書中的提取步驟提取RNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流行性乙型腦炎病毒的微流體基因芯片檢測(cè)方法，其特 征在于：步驟（3)中所述的PCR反應(yīng)體系為：2X RT-PCR反應(yīng)液12. 5ul，引物混合液 2. 5ul，14mM MgS042.5ul，PCR Grade H20 lul,逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA 聚合酶 lul，PCR Control 2ul，Sample3. 5ul〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流行性乙型腦炎病毒的微流體基因芯片檢測(cè)方法，其特征在 于：步驟（3)中所述的RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件是：50°C逆轉(zhuǎn)錄20min ;95°C預(yù)變性2min ; 95°C變性10s，60°C退火40s，72°C延伸50s ; 11個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1°C，直至退 火溫度變成50°〇;951：變性158,561：退火408,721：延伸508,40個(gè)循環(huán)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流行性乙型腦炎病毒的微流體基因芯片檢測(cè)方法，其特征在 于：步驟（4)中所述的雜交反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性3min ;58°C雜交30min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的流行性乙型腦炎病毒的微流體基因芯片檢測(cè)方法，其特征在 于：步驟（5)中所述的清洗條件是3000rpm，離心2min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的行性乙型腦炎病的微流體基因芯片檢測(cè)方法，其特征在于： 步驟（3)所述的PCR擴(kuò)增與步驟（4)所述的雜交在芯片儀上完成。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK104498620SQ201410654934
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】田楨干, 張曉航, 李俊, 李深偉, 李平, 曹敏, 張子龍 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局