專利名稱：新城疫病毒株rLX/H9HA及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用反向遺傳技術(shù)，拯救一株以新城疫病毒為載體表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株rLX/H9HA，用于研制疫苗。
背景技術(shù)：
反向遺傳操作技術(shù)(Reversegenetics manipulation technique)是指將 RNA病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在體外通過采用基因突變、基因插入、基因敲除、基因置換等方法人為構(gòu)建新的具有感染性的病毒，以研究病毒的基因組結(jié)構(gòu)及功能和病毒宿主之間的相互作用等[Conzelmann KK.Reverse genetics of mononegavirales.Curr TopMicrobiol Immunol.2004.283:1_41.]，也叫全長感染性cDNA克隆技術(shù)，又常被稱為“病毒拯救”。解決了 RNA病毒基因組難以操作這一難題，同時為新型疫苗的研發(fā)提供了新的思路[Nakaya T,et al., Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.Journal of Virology, 2001.75(23):p.11868-73.]。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)是單股、不分節(jié)段的負鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科成員。按照標準的致病性指標可以將病毒分為速發(fā)型(強毒)、中發(fā)型(中等毒力)和緩發(fā)型(弱毒)?；蚪M長度大約15kb，其結(jié)構(gòu)為3’ -1eader-NP-P-M-F-HN-L-trailer-5’，依次編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白:核衣殼蛋白(Nucleocapsidprotein, NP)、磷蛋白(Phosphoprotein, P)、基質(zhì)蛋白(Matrix protein, Μ)、融合蛋白(Fusion protein, F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidaseprotein,HN)和大分子蛋白(Largeprotein, L)。 禽流感病毒(AvianInfluenza Virus,AIV)是禽流感(Avian influenza, A I)的病原體，分類上屬于正黏病毒科(Orthomyxovoridae) ,A型流感病毒屬。病毒基因組由8個單股負鏈的RNA片段組成，各自編碼功能性蛋白，分別為PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS基因。一般呈球形，直徑80nnTl20nm，有囊膜，囊膜表面主要有2種糖蛋白纖突，即血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA),迄今已發(fā)現(xiàn)16種HA亞型和9種NA亞型。禽流感病毒對宿主的致病性是由多個基因決定的，其中HA基因及其編碼的蛋白尤為重要，在病毒吸附及穿膜過程中起著關(guān)鍵作用，是重要的表面抗原，它刺激機體產(chǎn)生中和抗體，可中和病毒的感染。H9N2亞型禽流感病毒是危害當前養(yǎng)禽業(yè)的重要病原之一，廣泛存在于家禽中，雖然表現(xiàn)為低致病性，但具有一些獨有的發(fā)病特點，主要表現(xiàn)為高感染率、高發(fā)病率、低死亡率，多引起雛雞和育成雞的隱性感染和產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋下降且產(chǎn)蛋率難以恢復(fù)，對養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的危害，并具有重要的公共衛(wèi)生意義。疫苗接種是防制新城疫和禽流感這兩種疾病的主要有效手段。同滅活苗相比，活載體疫苗具有用量少、成本低、省時省力、免疫保護時間長等優(yōu)點，可達到一針防多病的目的。載體病毒最重要的一個特點是能被用來迅速研制出針對新發(fā)高致病性傳染病的基因工程疫苗。NDV除具備這一特點外，還具有遺傳穩(wěn)定性好、不存在與細胞基因組整合的可能、高繁殖性能、免疫刺激性強等諸多優(yōu)點，可作為疫苗載體[Bukreyev A, Skiadopoulos MH, Murphy B R, et al.Nonsegmented negative-strand viruses as vaccine vectors[J].Journal of Virology, 2006, 80 (21): 10293-10306.] 在 NDV 基因組內(nèi)插入禽流感病毒HA基因后的重組病毒，可在動物體內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定持續(xù)地表達HA蛋白，用此重組病毒作為疫苗，可以誘導機體產(chǎn)生針對Al和ND的雙重免疫保護力[Veits J, Wiesner D, FuchsWj et al.Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin gene protectschickens against Newcastle disease and avian influenza[J].Proc Natl Acad SciUSA, 2006, 103(21):8197-8202.Schroer Dj Veits Jj Grund C，et al.Vaccination withNewcastle disease virus vectored vaccine protects chickens against highlypathogenic H7 avian influenza virus[J].Avian Dis，2009，53 (2):190-197.]。2004年劉曉文等從LBM的健康鴨群中分離到具有高滴度生長特性的NDV毒株LX(遺傳進化上屬于ClassII基因I型)，并成功構(gòu)建其全長克隆pLX[王曉泉，劉曉文，等.新城疫病毒弱毒骨架表達強毒F基因的重組病毒生物學特性研究[J].中國動物傳染病學報.2010, 18 (6): 22-26.]。2012年，古小兵等于常州武進分離到一株具有代表性的H9N2亞型 AIV 流行毒株 A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012，其 HA 效價為 Illog2, EID5tl 為 9.17，熱穩(wěn)定，具有很好的抗原性。因此，本發(fā)明以PLX為骨架，構(gòu)建可表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株，用于應(yīng)對 當前H9亞型禽流感和新城疫的流行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種以新城疫病毒為載體表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組疫苗株，用于制造疫苗。本發(fā)明新城疫病毒(NewcastleDisease Virus) rLX/H9HA,保藏號為 CGMCC No:6652。本發(fā)明新城疫病毒rLX/H9HA用于表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明利用已建立的鴨源新城疫病毒LX株的反向遺傳操作平臺，將H9N2亞型AIVWJ57株的HA基因ORF插入NDV全長轉(zhuǎn)錄載體pLX，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pLX_H9HA，該重組質(zhì)粒與三個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細胞后，獲得了具有較高繁殖性能的表達H9亞型禽流感病毒HA蛋白的重組疫苗株rLX/H9HA，適合疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組新城疫疫苗株rLX/H9HA的構(gòu)建方法，是以NDV弱毒LX株的基因組全長轉(zhuǎn)錄載體pLX為骨架，將H9亞型AIV流行株A/Chicken/JiangSu/WJ57/2012的HA基因的開放閱讀框插入轉(zhuǎn)錄載體PLX的？、1基因之間，經(jīng)反向遺傳技術(shù)獲得重組病毒1*1^/!19撤。具體包括以下步驟:1.全長克隆pLX-H9HA的構(gòu)建I) H9N2亞型禽流感病毒W(wǎng)J57株HA基因的分段克隆構(gòu)建陽性質(zhì)粒pmWJl和pmWJ2:以WJ57株病毒的cDNA為模板，設(shè)計兩對引物分兩段擴增HA基因0RF，即WJl:1 1067nt、WJ2:1068 1683nt，分別克隆獲得陽性質(zhì)粒pmWJl和pmffJ202) pmWJl與NDVLX株P(guān)基因融合克隆的構(gòu)建
以LX株基因組cDNA為模板擴增其2350_3141nt，以pmWJl為模板擴增HA基因ORF的fl067nt，通過Overlap PCR將二者融合在一起并克隆得到質(zhì)粒pPWJl。3) pmffJ2與NDVLX株M基因融合克隆的構(gòu)建分別以陽性質(zhì)粒pmWJ2和LX株基因組cDNA為模板PCR擴增H9HA基因ORF的1068 1683nt和LX株基因組3142 3635nt，Overlap PCR將二者融合在一起，克隆得到陽性質(zhì)粒pWJ2M。4)全長克隆pLX- H9HA的獲得質(zhì)粒pPWJl與pWJ2M同時用Aar I和Spe I進行雙酶切，回收目的片段并連接，構(gòu)建質(zhì)粒pPWJM ;用Sac II和Avr II對質(zhì)粒pPWJM進行雙酶切后替換pLX的對應(yīng)序列，構(gòu)建出重組NDV基因組全長克隆pLX-H9HA，具體的構(gòu)建模式見圖1。2.重組病毒rLX/H9HA株的拯救將質(zhì)粒pLX-H9HA與pCI_NP、pC1-P和pCI_L三個真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細胞，一段時間后接種9 11日齡SPF雞胚，收獲得到重組病毒rLX/H9HA。


圖1重組質(zhì)粒pLX-H9HA構(gòu)建模式圖。圖2重組質(zhì)粒pLX-H9HA的Hind III酶切鑒定圖；M:500bp DNA ladder marker ；1:pLX_H9HA。圖3重組病毒rLX/H9HA的HA基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖；I =WJ-SU WJ-R2 引物擴增產(chǎn)物；M:200bp DNA ladder marker 圖4重組病毒感染CHO細胞外源基因表達的檢測；A-C為LX感染組，D-F為rLX/H9HA感染組。A、D組以抗NDV HN的單克隆抗體為一抗，B、E組以H9N2亞型AIV高免血清為一抗，C、F組以SPF雞陰性血清為一抗進行間接免疫熒光檢測。
具體實施例方式本發(fā)明表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的重組新城疫疫苗株rLX/H9HA于2012年10月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；其保藏號CGMCC No:6652，分類命名為:新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)其長度為:16896bp。構(gòu)建步驟一:以新城疫病毒LX為載體表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的全長表達克隆的構(gòu)建生物材料準備:新城疫病毒LX株的全長表達克隆pLX[王曉泉，劉曉文，等.新城疫病毒弱毒骨架表達強毒F基因的重組病毒生物學特性研究[J].中國動物傳染病學報.2010, 18(6):22-26.]，由揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點開放實驗室構(gòu)建、保存。H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012株(下稱WJ57株)由揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室分離、保存。pGEMT-easy 載體:購自 Promega 公司；AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、High fidelityDNApolymerase、T4 DNA 連接酶、Agarose Gel DNA ExtractionKit 購自 Roche 公司；轉(zhuǎn)染試劑SuperFect和質(zhì)粒抽提試劑盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)為QIAGEN公司產(chǎn)品；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。1、H9N2亞型禽流感病毒HA基因的序列分析與基因突變提取H9N2亞型禽流感病毒W(wǎng)J57株的總RNA，并用12nt隨機引物(5，-AGCAAAAGCAGG-3’ (SEQ ID N0.1))進行RT-PCR反應(yīng)。序列分析發(fā)現(xiàn)需要先對其ORF的31和1063位兩個Spe I酶切位點進行沉默突變。設(shè)計2對引物，分別用于擴增HA基因ORF 的 I 1076nt、1068 1683nt。兩對突變引物分別是:WJ-Sl:5，-TTAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGGAGACAGTATCACTAATAACTATACT O CT O GTAGCAA-3 ’ (SEQ ID N0.2 )WJ-Rl:5’ -TATTCACCTGCATCGACgAGCCCTGACCAACCTCCCTCTAT-3’ (SEQ ID N0.3)WJ-S2:5，-TATTCACCTGCATCGToGTTGCTGGTTGGTATGGATT-3’ (SEQ ID N0.4)WJ-R2:5’ -GTTTGCAGATTATATACAAATGTTGCATCT-3’ (SEQ ID N0.5)突變堿基以斜體標注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng):以 反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板配制如下PCR反應(yīng)體系:
權(quán)利要求
1.一株新城疫病毒(Newcastle Disease Virus) rLX/H9HA,保藏號為 CGMCC No:6652。
2.權(quán)利要求1所述新城疫病毒rLX/H9HA的構(gòu)建方法，其特征在于:以NDV弱毒LX株的基因組全長轉(zhuǎn)錄載體PLX為骨架，將H9亞型AIV流行株A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012的HA基因插入轉(zhuǎn)錄載體pLX的？、1基因之間，經(jīng)反向遺傳技術(shù)獲得重組病毒1*1^/!19撤。
3.權(quán)利要求1 所述新城疫病毒rLX/H9HA用于表達H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明表達H9亞型禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus)血凝素蛋白的重組新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus)rLX/H9HA，保藏號為CGMCCNo6652。本發(fā)明是利用已建立的NDV弱毒LX株的反向遺傳操作平臺，將H9N2亞型AIV流行株 A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012的HA基因插入LX株基因組全長轉(zhuǎn)錄載體pLX中，得到含有H9N2亞型AIVHA基因的重組新城疫病毒基因組全長cDNA克隆pLX-H9HA。經(jīng)轉(zhuǎn)染獲得的重組病毒rLX/H9HA在雞胚上具有較高的繁殖滴度，連續(xù)傳多代仍能穩(wěn)定表達HA蛋白，適合于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，可用于制造疫苗。
文檔編號C12N15/86GK103146751SQ201310042470
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者劉秀梵, 丁平云, 陳雨昕, 劉曉文, 胡順林, 王曉泉 申請人:揚州大學