專利名稱：三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法及基因工程菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乙醇的生物制備領域，具體地涉及三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法及基因工程菌株。
背景技術：
隨著人類文明的不斷進步，全球能源問題彰顯，現(xiàn)已成為制約全球經(jīng)濟持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的重要因素。燃料乙醇是一種清潔、可再生的生物質(zhì)能源，纖維素燃料乙醇技術原料來源廣泛，是一項可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境友好型技術，其核心技術體系的建設已成為一個全球能源戰(zhàn)略必爭之地。木質(zhì)纖維素分解之后主要轉化為葡萄糖和木糖，葡萄糖和木糖在厭氧條件下經(jīng)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)發(fā)酵生成乙醇。本發(fā)明旨在以木質(zhì)纖維生物質(zhì)為原料，對經(jīng)過多重基因改良獲得釀酒酵母工程菌株進行發(fā)酵獲得的纖維素乙醇關鍵技術進行系統(tǒng)地研究，通過篩選并獲得一系列優(yōu)化的高產(chǎn)和高效率的纖維素乙醇目標菌株，為纖維素乙醇商業(yè)化生產(chǎn)奠定技術基礎。木糖發(fā)酵時先經(jīng)木糖還原酶基因XR,木糖醇脫氫酶基因XDH，木酮糖激酶基因XK連續(xù)催化生成5-磷酸-木酮糖，然后在磷酸戊糖途徑主要基因RPE1，RKII, TALI, TKLl催化作用下進入糖酵解途徑，最后轉化為乙醇。在上述發(fā)酵過程中，目前許多研究者對XR進行蛋白工程，例如單突變體XR (K270R)和四突變體XR (K270S/N272P/S271G/R276F)，希望通過調(diào)節(jié)XR的氧化還原水平來提高木糖的消耗速率。有一些研究者對木糖利用代謝途徑關鍵基因XR/XDH/XK/TAL1中的一個或者兩個進行不同拷貝的探索，期望更有效的提高木糖和葡萄糖的利用率?，F(xiàn)有技術研究表明木糖乙醇發(fā)酵過程中大部分基因的轉錄水平發(fā)生了顯著改變，因此轉錄調(diào)控是進一步提高乙醇產(chǎn)量的有效途徑?，F(xiàn)有基因轉錄調(diào)控技術主要是通過經(jīng)典的組成型強啟動子PGKl和ADHl來介導上述重要的七基因轉錄，期望提高七基因的表達水平，從而實現(xiàn)纖維素乙醇產(chǎn)量的提高。但上述現(xiàn)有技術改造的釀酒酵母工程菌株發(fā)酵木糖時生長速率緩慢，乙醇產(chǎn)量及轉化率偏低，乙醇的產(chǎn)量水平在0.36-0.42g/g總糖。然而，基因轉錄調(diào)控技術帶來的基因工程發(fā)酵代謝過程中的質(zhì)粒負擔，代謝負擔，各種環(huán)境壓力響應都有可能影響最終的乙醇產(chǎn)量和產(chǎn)率，這是該研究技術的不確定性。同時木糖利用的低消耗速率，低轉化速率，盡管研究者嘗試了不同的啟動子，不同的拷貝數(shù)目，不同的微生物菌株背景來源，不同的基因蛋白工程，都沒有改變纖維素乙醇技術目前面臨的瓶頸和難點。

發(fā)明內(nèi)容
因此為了解決上述問題提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明的首要目的是提供三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法。本發(fā)明的另一目的是提供三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的基因工程菌株。根據(jù)本發(fā)明的三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法包括通過構建基因XR、XDH、XK、RPEl、RKIl和TALl的表達質(zhì)粒，在釀酒酵母中表達上述基因的步驟，其中，用KGDl啟動子介導限速基因XK，用HSP26啟動子介導關鍵限速基因TALl。根據(jù)本發(fā)明具體實施方式
，所述三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法包括步驟:(1)將質(zhì)粒p61轉入釀酒酵母WT，得到WXY1，其菌株含有兩基因pADHl-RPEl和pPGKl-XDH,質(zhì)粒p61的構建過程:721bp的啟動子克隆進入pbluescript,接下來71bp7的ADHl 啟動子，434bp 的 PGKl 終止子，410bp 的 RPEl 啟動子，629bp (自 ATG 起 629bp)的 RPEl結構基因一部分，XDH結構基因，選擇標記RKUR，依次克隆進來，形成質(zhì)粒p61 ；(2)將質(zhì)粒p62轉入WXYl，得到WXY2，該菌株額外含有pADHl_XR和pPGKl_XK，質(zhì)粒P62的構建過程:在上述p61質(zhì)粒的基礎上，500bp的XK啟動子替換RPEl啟動子，419bp(自ATG起419bp)的XK結構基因一部分替換RPEl結構基因一部分(自ATG)，含有四個突變的 xRk27cis/n272P/S271G/R276F 替換 XDH 結構基因，形成質(zhì)粒 P62 ；(3)將質(zhì)粒p64轉入WXY2，得到WXY3，該菌株額外含有多拷貝的pPGKl-RKIl和pADHl-TALl，并且該菌株能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇，質(zhì)粒p64的構建過程:用717的ADHl啟動子替換PESC-LEU中的反向啟動子PGAL10/PGAL1，接下來72Ibp的PGKl啟動子，選擇標記Zeocin, 1723bp的r DNA，TALl和RKIl結構基因依次克隆進來，形成質(zhì)粒p64 ；(4)將質(zhì)粒pUC-3XK270R轉入釀酒酵母WT，得到WXY4，該菌株含有三基因pADH1-XR/pPGK1-XDH/pPGK1-XK,能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇；將質(zhì)粒pUC_3XK270R轉入WXY3，得到WXY5，該菌株能很好地利用木糖，產(chǎn)生更多的乙醇；(5) pv3質(zhì)粒的構建過程如下:首先將TALl結構基因連接在pBluscript原始質(zhì)粒上，接下來依次將啟動子CRE1，啟動子KGDlr，XK-ORFr，選擇標記基因RUR結構，啟動子HSP26r，終止子CREl克隆進來，形成pv3質(zhì)粒，其表型見表I，整合插入位點為CREl結構基因，被分別轉進WXY3和WXY5，得到了工程菌株WXY6和WXY7 ；(6)將pUC_3X(野生型XR)分別轉入酵母菌株釀酒酵母WT，WXY3，WXY6，分別得到工程菌株 WXY8，WXY9, WXYlO。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，以安琪酵母公司的工業(yè)釀酒酵母YC-DM拆分孢子獲得的單倍體菌株為出發(fā)菌株WT，首先構建了一個能夠有效利用木糖的工程菌株即WXY3，含有 XRK27as/N272P/s27iG/R276F/XDH/XK/RpE1/RKn/TAL1。在此基礎上，進一步轉入了一個已驗證過
的質(zhì)粒PUC-3XK270R含有木糖利用三基因XRK27°7XDH/XK，得到了工程菌株WXY5，此即第一階段葡萄糖階段。接下來以WXY5為研究對象，委托深圳華大基因對其在高濃度混合糖發(fā)酵過程中的4小時，24小時和48小時進行了 RNA-Seq分析。根據(jù)發(fā)表的DNA芯片數(shù)據(jù)，獲得RNA-seq的絕對表達量RPKM，我們自己驗證的RT-qPCR數(shù)據(jù)，篩選獲得了好氧狀態(tài)下的啟動子K⑶I和發(fā)酵后期的熱休克啟動子HSP26。用KGDl啟動子介導限速基因)(K，HSP26啟動子介導關鍵限速基因TAL1，構建了質(zhì)粒pv3，含有木糖階段和熱休克階段。將pv3轉入WXY5，得到了一個有良好發(fā)酵特征的WXY7。用PUC-3X替換WXY7中的pUC_3XK270R，得到了階段性的高產(chǎn)乙醇工程菌株WXY10，該菌株在5% (木糖+葡萄糖)厭氧發(fā)酵過程中，6小時消耗完了葡萄糖，大概60小時左右消耗完了木糖，乙醇轉化率達到了 0.48g乙醇/g總糖。根據(jù)本發(fā)明的三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的基因工程菌株其保藏編號為 CGMCC N0.7191。根據(jù)本發(fā)明的技術方案，其中所用木糖還原酶基因XR的序列如SEQ ID N0.1所示:atgccttctattaagttgaa ctctggttacgacatgccagccgtcggtttcggctgttggaaagtcgacgtcgacacctgttctgaacagatctaccgtgctatcaagaccggttacagattgttcgacggtgccgaagattacgccaacgaaaagttagttggtgccggtgtcaagaaggccattgacgaaggtatcgtcaagcgtgaagacttgttccttacctccaagttgtggaacaactaccaccacccagacaacgtcgaaaaggccttgaacagaaccctttctgacttgcaagttgactacgttgacttgttcttgatccacttcccagtcaccttcaagttcgttccattagaagaaaagtacccaccaggattctactgtggtaagggtgacaacttcgactacgaagatgttccaattttagagacctggaaggctcttgaaaagttggtcaaggccggtaagatcagatctatcggtgtttctaacttcccaggtgctttgctcttggacttgttgagaggtgctaccatcaagccatctgtcttgcaagttgaacaccacccatacttgcaacaaccaagattgatcgaattcgctcaatcccgtggtattgctgtcaccgcttactcttcgttcggtcctcaatctttcgttgaattgaaccaaggtagagctttgaacacttctccattgttcgagaacgaaactatcaaggctatcgctgctaagcacggtaagtctccagctcaagtcttgttgagatggtcttcccaaagaggcattgccatcattccaaagtccaacactgtcccaagattgttggaaaacaaggacgtcaacagcttcgacttggacgaacaagatttcgctgacattgccaagttggacatcaacttgagattcaacgacccatgggactgggacaagattcctatcttcgtctaa木糖醇脫氫酶基因XDH的序列如SEQ ID N0.2所示:atgactgctaacccttccttggtgttgaacaagatcgacgacatttcgttcgaaacttacgatgccccagaaatctctgaacctaccgatgtcctcgtccaggtcaagaaaaccggtatctgtggttccgacatccacttctacgcccatggtagaatcggtaacttcgttttgaccaagccaatggtcttgggtcacgaatccgccggtactgttgtccaggttggtaagggtgtcacctctcttaaggttggtgacaacgtcgctatcgaaccaggtattccatccagattctccgacgaatacaagagcggtcactacaacttgtgtcctcacatggccttcgccgctactcctaactccaaggaaggcgaaccaaacccaccaggtaccttatgtaagtacttcaagtcgccagaagacttcttggtcaagttgccagaccacgtcagcttggaactcggtgctcttgttgagccattgtctgttggtgtccacgcctctaagttgggttccgttgctttcggcgactacgttgccgtctttggtgctggtcctgttggtcttttggctgctgctgtcgccaagaccttcggtgctaagggtgtcatcgtcgttgacattttcgacaacaagttgaagatggccaaggacattggtgctgctactcacaccttcaactccaagaccggtggttctgaagaattgatcaaggctttcggtggtaacgtgccaaacgtcgttttggaatgtactggtgctgaaccttgtatcaagttgggtgttgacgccattgccccaggtggtcgtttcgttcaagtcggtaacgctgctggtccagtcagcttcccaatcaccgttttcgccatgaaggaattgactttgttcggttctttcagatacggattcaacgactacaagactgctgttggaatctttgacactaactaccaaaacggtagagaaaatgctccaattgactttgaacaattgatcacccacagatacaagttcaaggacgctattgaagcctacgacttggtcagagccggtaagggtgctgtcaagtgtctcattgacggccctgagtaa介導限速基因XK的序列如SEQ ID N0.3所示:atgttgtgttcagtaattcagagacagacaagagaggtttccaacacaatgtctttagactcatactatcttgggtttgatctttcgacccaacaactgaaatgtctcgccattaaccaggacctaaaaattgtccattcagaaacagtggaatttgaaaaggatcttccgcattatcacacaaagaagggtgtctatatacacggcgacactatcgaatgtcccgtagccatgtggttagaggctctagatctggttctctcgaaatatcgcgaggctaaatttccattgaacaaagttatggccgtctcagggtcctgccagcagcacgggtctgtctactggtcctcccaagccgaatctctgttagagcaattgaataagaaaccggaaaaagatttattgcactacgtgagctctgtagcatttgcaaggcaaaccgcccccaattggcaagaccacagtactgcaaagcaatgtcaagagtttgaagagtgcataggtgggcctgaaaaaatggctcaattaacagggtccagagcccattttagatttactggtcctcaaattctgaaaattgcacaattagaaccagaagcttacgaaaaaacaaagaccatttctttagtgtctaattttttgacttctatcttagtgggccatcttgttgaattagaggaggcagatgcctgtggtatgaacctttatgatatacgtgaaagaaaattcagtgatgagctactacatctaattgatagttcttctaaggataaaactatcagacaaaaattaatgagagcacccatgaaaaatttgatagcgggtaccatctgtaaatattttattgagaagtacggtttcaatacaaactgcaaggtctctcccatgactggggataatttagccactatatgttctttacccctgcggaagaatgacgttctcgtttccctaggaacaagtactacagttcttctggtcaccgataagtatcacccctctccgaactatcatcttttcattcatccaactctgccaaaccattatatgggtatgatttgttattgtaatggttctttggcaagggagaggataagagacgagttaaacaaagaacgggaaaataattatgagaagactaacgattggactctttttaatcaagctgtgctagatgactcagaaagtagtgaaaatgaattaggtgtatattttcctctgggggagatcgttcctagcgtaaaagccataaacaaaagggttatcttcaatccaaaaacgggtatgattgaaagagaggtggccaagttcaaagacaagaggcacgatgccaaaaatattgtagaatcacaggctttaagttgcagggtaagaatatctcccctgctttcggattcaaacgcaagctcacaacagagactgaacgaagatacaatcgtgaagtttgattacgatgaatctccgctgcgggactacctaaataaaaggccagaaaggactttttttgtaggtggggcttctaaaaacgatgctattgtgaagaagtttgctcaagtcattggtgctacaaagggtaattttaggctagaaacaccaaactcatgtgcccttggtggttgttataaggccatgtggtcattgttatatgactctaataaaattgcagttccttttgataaatttctgaatgacaattttccatggcatgtaatggaaagcatatccgatgtggataatgaaaattgggatcgctataattccaagattgtccccttaagcgaactggaaaagactctcatctaa基因R削I的序列如SEQ ID N0.4所示:atggctgccggtgtcccaaaaattgatgcgttagaatctttgggcaatcctttggaggatgccaagagagctgcagcatacagagcagttgatgaaaatttaaaatttgatgatcacaaaattattggaattggtagtggtagcacagtggtttatgttgccgaaagaattggacaatatttgcatgaccctaaattttatgaagtagcgtctaaattcatttgcattccaacaggattccaatcaagaaacttgattttggataacaagttgcaattaggctccattgaacagtatcctcgcattgatatagcgtttgacggtgctgatgaagtggatgagaatttacaattaattaaaggtggtggtgcttgtctatttcaagaaaaattggttagtactagtgctaaaaccttcattgtcgttgctgattcaagaaaaaagtcaccaaaacatttaggtaagaactggaggcaaggtgttcccattgaaattgtaccttcctcatacgtgagggtcaagaatgatctattagaacaattgcatgctgaaaaagttgacatcagacaaggaggttctgctaaagcaggtcctgttgtaactgacaataataactteattatcgatgcggatttcggtgaaatttccgatccaagaaaattgcatagagaaatcaaactgttagtgggcgtggtggaaacaggtttattcatcgacaacgcttcaaaagcctacttcggtaattctgacggtagtgttgaagttaccgaaaagtga`
基因RPEl的序列如SEQ ID N0.5所示:atggtcaaaccaattatagctcccaggtatccttgcttctgacttcgccaacttgggttgcgaatgtcataaggtcatcaacgccggcgcagattggttacatatcgatgtcatggacggccattttgttccaaacattactctgggccaaccaattgttacctccctacgtcgttctgtgccacgccctggcgatgctagcaacacagaaaagaagcccactgcgttcttcgattgtcacatgatggttgaaaatcctgaaaaatgggtcgacgattttgctaaatgtggtgctgaccaatttacgttccactacgaggccacacaagaccctttgcatttagttaagttgattaagtctaagggcatcaaagctgcatgcgccatcaaacctggtacttctgttgacgttttatttgaactagctcctcatttggatatggctcttgttatg
actgtggaacctgggtttggaggccaaaaattcatggaagacatgatgccaaaagtggaaactttgagagccaagtt
cccccatttgaatatccaagtcgatggtggtttgggcaaggagaccatcccgaaagccgccaaagccggtgccaacg
ttattgtcgctggtaccagtgttttcactgcagctgacccgcacgatgttatctccttcatgaaagaagaagtctcg
aaggaattgcgttctagagatttgctagattag:基因TALl的序列如SEQID N0.6所示:atgtctgaaccagctcaaaagaaacaaaaggttgctaacaactctctagaacaattgaaagcctccggcactgtcgttgttgccgacactggtg atttcggctctattgccaagtttcaacctcaagactccacaactaacccatcattgatcttggctgctgccaagcaaccaacttacgccaagttgatcgatgttgccgtggaatacggtaagaagcatggtaagaccaccgaagaacaagtcgaaaatgctgtggacagattgttagtcgaattcggtaaggagatcttaaagattgttccaggcagagtctccaccgaagttgatgctagattgtcttttgacactcaagctaccattgaaaaggctagacatatcattaaattgtttgaacaagaaggtgtctccaaggaaagagtccttattaaaattgcttccacttgggaaggtattcaagctgccaaagaattggaagaaaaggacggtatccactgtaatttgactctattattctccttcgttcaagcagttgcctgtgccgaggcccaagttactttgatttccccatttgttggtagaattctagactggtacaaatccagcactggtaaagattacaagggtgaagccgacccaggtgttatttccgtcaagaaaatctacaactactacaagaagtacggttacaagactattgttatgggtgcttctttcagaagcactgacgaaatcaaaaacttggctggtgttgactatctaacaatttctccagctttattggacaagttgatgaacagtactgaacctttcccaagagttttggaccctgtctccgctaagaaggaagccggcgacaagatttcttacatcagcgacgaatctaaattcagattcgacttgaatgaagacgctatggccactgaaaaattgtccgaaggtatcagaaaattctctgccgatattgttactctattcgacttgattgaaaagaaagttaccgcttaa本發(fā)明擬采用DNA芯片及qRT-PCR方法對酵母細胞在葡萄糖發(fā)酵階段，木糖發(fā)酵階段包括發(fā)酵后期等不同階段的轉錄組表達譜進行構建。針對不同代謝階段發(fā)現(xiàn)的轉錄水平大幅上調(diào)的特征基因，擬利用其啟動子驅動木糖代謝中相關目標基因XR，XDH，XKS1，TAL1在相應階段繼續(xù)進行高水平表達，以使目標基因在發(fā)酵的各階段都能持續(xù)高效表達。酵母在混合糖發(fā)酵的前期及對數(shù)生長期優(yōu)先利用葡萄糖，本發(fā)明根據(jù)RT-PCR篩選并確認了厭氧狀態(tài)下強啟動子pPGKl，pADHl。當葡萄糖耗盡后，本發(fā)明篩選了 TCA中代謝轉錄水平發(fā)生較大改變的基因的啟動子，用來調(diào)控具有呼吸特征的木糖基因轉錄，確定了木糖發(fā)酵狀態(tài)下強啟動子有PKGD1。發(fā)酵后期也稱應激階段，其中環(huán)境溫度上升5°C引起的熱休克效應對乙醇產(chǎn)量變化非常明顯。將篩選獲得的熱休克蛋白強啟動子pHSP26，pHSP70整合到目標基因上，以增強酵母細胞對發(fā)酵后期不利環(huán)境的抗性和適應性，提前到達發(fā)酵終點。總之，本發(fā)明通在葡萄糖階段，木糖階段及發(fā)酵后期階段引入強啟動子來優(yōu)化乙醇的生物合成途徑中目標基因的轉錄調(diào)控，并通過調(diào)控靶點基因mRNA轉錄水平這一核心思路解決發(fā)酵中后期的代謝瓶頸。因此，本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術的改進和優(yōu)點如下:本發(fā)明將纖維素酒精發(fā)酵過程分為厭氧的葡萄糖發(fā)酵階段，好氧的木糖呼吸代謝階段，具有熱休克特征的高溫抑制為主的發(fā)酵后期階段，共三個階段。針對現(xiàn)有基因工程菌株的具體問題，本發(fā)明提出在三個階段用上述各階段篩選出的目標基因轉錄上調(diào)的特征啟動子全面啟動木糖利用的七基因或者主要基因的轉錄調(diào)控，讓目標基因在三個階段的每一個階段都能得到高效的表達，從而讓纖維素底物更加高效地轉化為纖維素乙醇。綜上所述，我們提出了這樣的三階段轉錄調(diào)控理論(three stage transcription regulations,簡稱為 TSTR)。本理論的創(chuàng)新點及改進之處:1第一次優(yōu)化總結并提出了三階段轉錄調(diào)控關鍵基因提高纖維素乙醇產(chǎn)量的理論體系；2第一次將熱休克啟動子HSP26和TCA循環(huán)啟動子KGDl等相關啟動子用于介導木糖利用的關鍵基因XR/XDH/XK/TAL1提高乙醇的產(chǎn)量；3本發(fā)明實現(xiàn)了通過快速耗盡葡萄糖來降低葡萄糖在乙醇發(fā)酵過程中對木糖的代謝抑制；4我們構建的工程菌株WXYlO在各5%左右的混合糖發(fā)酵過程中，60小時左右實現(xiàn)了 0.48g乙醇/g總糖的糖醇轉化率，達到了理論最大值的94%，具有一定的工業(yè)化潛力，處于國內(nèi)外前沿水平。
附圖 說明

圖1顯示了在45g/L (葡萄糖+木糖)厭氧發(fā)酵各時間段各酵母菌株WT⑷，WXY3⑶，WXY4 (C)，WXY5⑶的乙醇代謝圖譜。圖2顯示對TCA循環(huán)基因和HSP家族基因考察的結果，在50g/L (葡萄糖+木糖)厭氧發(fā)酵各時間段各酵母菌株的乙醇代謝圖譜。圖3顯示為菌株發(fā)酵結果，在45g/L和50g/L (葡萄糖+木糖)厭氧發(fā)酵各時間段各酵母菌株的乙醇代謝圖譜。圖4為WXY7和WXYlO在50g/L葡萄糖和50g/L木糖的培養(yǎng)基下進行發(fā)酵的結果。圖5顯示各菌株在￥^)培養(yǎng)基中發(fā)酵12小時，菌株訂1乂￥(3-54)和1乂￥(6，7，10, B)的基因XR/XDH/XK/TAL1的相對轉錄水平。釀酒酵母WXYlO (Saccharomyces cerevisiae),于 2013 年 I 月 23 日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏編號是:CGMCC N0.7191。
具體實施例方式實施例11、混合糖共發(fā)酵菌株的構建出發(fā)菌株WT來自安琪酵母公司的釀酒酵母工業(yè)菌株，經(jīng)過從工業(yè)二倍體拆分孢子轉化為單倍體，經(jīng)過發(fā)酵篩選具有更好發(fā)酵特性的優(yōu)勢菌株，作為我們試驗的原始工業(yè)出發(fā)菌株。將質(zhì)粒p61轉入WT，得到WXY1，其菌株含有兩基因pADHl-RPEl和pPGKl_XDH ；將質(zhì)粒P62轉入WXY1，得到WXY2，該菌株額外含有pADHl_XR4m和pPGKl_XK ;將質(zhì)粒p64轉入WXY2，得到WXY3，該菌株額外含有多拷貝的pPGKl-RKIl和pADHl_TALl，并且該菌株能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇；將質(zhì)粒PUC-3XK270R轉入WT，得到WXY4，該菌株含有三基因pADHl-XR(K270R)/pPGKl-XDH/pPGKl-XK,能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇；將質(zhì)粒 pUC_3XK270R轉入WXY3，得到WXY5，該菌株能很好地利用木糖，產(chǎn)生更多的乙醇。圖1顯示了工程菌株WT和WXY (3-5)在約45克/升葡萄糖和45g/L的木糖培養(yǎng)基的發(fā)酵結果。WT菌株在24小時后，消耗完了 43.5g/L的葡萄糖，在發(fā)酵結束后利用了約8g/L (17.8%)木糖，產(chǎn)生了約21.4g/L的乙醇和2.7g/L的木糖醇(圖1A)。WXY4在24小時內(nèi)完全消耗43.5g/L的葡萄糖，在發(fā)酵結束時利用了約16g/L (35.7%)的木糖，產(chǎn)生了 26.4g/L的乙醇和1.7g/L木糖醇(圖1C)。發(fā)酵結束后，菌株WXY3和WXY5消耗了 16.2(36%)和31.4 (70.l%)g/L的木糖，產(chǎn)生了 3.0和1.5g/L木糖醇，并產(chǎn)生較高的25.1和34.2g/L的乙醇，分別為(圖1B和D)。與WT和WXY3菌株相比，WXY4和WXY5擁有更多的細胞數(shù)量(圖1E)。相關的菌株基因型和發(fā)酵數(shù)據(jù)也參見表I和表2。與發(fā)表的工業(yè)菌株基因修飾策略相比，本發(fā)明在整體水平上，特別是關鍵基因拷貝數(shù)量進行了優(yōu)化通過RT-PCR證實了基因拷貝數(shù)目的增加及相關基因得到了相對高的表達量:WXY5有兩拷貝突變體XR(K270R)和 XR (K270S/N272P/S271G/R276F)，兩拷貝野生型 XDH，兩拷貝 XK，多拷貝 TALl 及其他相關基因。厭氧批發(fā)酵結果顯示，混合糖到乙醇的轉化率為0.39g/g總糖。
表I質(zhì)粒
權利要求
1.一種三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述方法包括通過構建基因XR、XDH、XK、RPEl、RKIl和TALl的表達質(zhì)粒，在釀酒酵母中表達上述基因的步驟，其中，用KGDl啟動子介導限速基因》(，用HSP26啟動子介導關鍵限速基因TALl。
2.根據(jù)權利要求1所述的三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，對于基因XDH使用啟動子pPGKl，對于基因RPEl使用啟動子pADHl，對于RKII使用啟動子PGKl，對于基因XR使用啟動子pADHl。
3.根據(jù)權利要求1所述的三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，基因XR的序列如SEQ ID N0.1所示，基因XDH的序列如SEQ ID N0.2所示，基因XK的序列如SEQ ID N0.3所示，基因RKIl的序列如SEQ ID N0.4所示，基因TALl的序列如SEQID N0.6 所示。
4.根據(jù)權利要求1所述的三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述方法包括步驟: Cl)將質(zhì)粒p61轉入釀酒酵母WT，得到WXY1，其菌株含有兩基因pADHl-RPEl和pPGKl-XDH ； (2)將質(zhì)粒p62轉入WXYl，得到WXY2，該菌株額外含有pADHl_XR和pPGKl_XK ； (3 )將質(zhì)粒p64轉入WXY2，得到WXY3，該菌株額外含有多拷貝的pPGKl-RKI I和pADHl-TALl，并且該菌株能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇； (4)將質(zhì)粒pUC-3XK轉入釀酒酵母WT，得到WXY4，該菌株含有三基因pADHl_XR/pPGKl-XDH/pPGKl-XK，能初步利用木糖產(chǎn)生乙醇；將質(zhì)粒pUC_3XK轉入WXY3，得到WXY5，該菌株能很好地利用木糖，產(chǎn)生更多的乙醇； (5)pv3質(zhì)粒的構建過程如下:首先將TALl結構基因連接在pBluscript原始質(zhì)粒上，接下來依次將啟動子CREl，啟動子KGDIr，XK-ORFr，選擇標記基因RUR結構，啟動子HSP26r，終止子CREl克隆進來，形成pv3質(zhì)粒，其表型見表I，整合插入位點為CREl結構基因，被分別轉進WXY3和WXY5，得到了工程菌株WXY6和WXY7 ； (6)將pUC-3X(野生型XR)分別轉入酵母菌株釀酒酵母WT，WXY3，WXY6，分別得到工程菌株 WXY8，WXY9, WXYlO。
5.三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的基因工程菌株，其保藏編號為:CGMCCN0.7191。
6.一種通過生物發(fā)酵制備乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括發(fā)酵菌株CGMCCN0.7191的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙醇的生物制備領域，具體地涉及三階段基因轉錄調(diào)控提高纖維素乙醇產(chǎn)量的方法及基因工程菌株。所述方法包括通過構建基因XR、XDH、XK、RPE1、RKI1和TAL1的表達質(zhì)粒，在釀酒酵母中表達上述基因的步驟，其中，用KGD1啟動子介導限速基因XK，用HSP26啟動子介導關鍵限速基因TAL1。本發(fā)明將纖維素酒精發(fā)酵過程分為厭氧的葡萄糖發(fā)酵階段，好氧的木糖呼吸代謝階段，具有熱休克特征的高溫抑制為主的發(fā)酵后期階段，共三個階段。讓目標基因在三個階段的每一個階段都能得到高效的表達，從而讓纖維素底物更加高效地轉化為纖維素乙醇。
文檔編號C12R1/865GK103146741SQ20131004134
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月1日 優(yōu)先權日2013年2月1日
發(fā)明者蕭偉, 曹利民, 湯興良, 田雪蕾 申請人:首都師范大學