專利名稱：一種秸稈低溫降解復(fù)合菌系的篩選和馴化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)(微生物)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作物秸桿低溫降解復(fù)合菌系的篩選和馴化技術(shù)。
背景技術(shù)：
作物秸桿是豐富的自然資源，我國是農(nóng)業(yè)大國，每年產(chǎn)秸桿6億噸以上，其中只有一小部分被利用。秸桿原位還田是提升土壤有機(jī)質(zhì)、合理利用資源、解決環(huán)境污染的有效手段，但秸桿進(jìn)入土壤后，腐解緩慢，對耕作與農(nóng)藝操作產(chǎn)生諸多不利影響，限制了其推廣。特別是在我國北方，由于冬季時間長，氣溫偏低，作物秸桿降解慢、腐解效果差已成為限制秸桿還田利用的瓶頸。利用微生物技術(shù)處理秸桿是提高秸桿利用率的有效途徑，前人有大量的研究，并篩選馴化出在28-50°C下降解秸桿的單菌株，而在低溫(20 15°C)條件下具有高效降解能力的菌系還未見報道。通過建立規(guī)范而有效的篩選和馴化秸桿低溫降解菌系的方法，為篩選出低溫條件下具有較高降解效率的作物秸桿降解菌系提供技術(shù)支撐，促進(jìn)秸桿的快速腐解，對于促進(jìn)我國北方地區(qū)秸桿資源充分利用、農(nóng)田地力培肥和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種作物秸桿低溫降解復(fù)合菌系的篩選和馴化方法，特別是針對我國北方地區(qū)播種面積最大的作物——玉米，篩選其秸桿降解菌系對促進(jìn)北方地區(qū)秸桿資源的還田利用意義重大。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:一種秸桿低溫降解復(fù)合菌系的篩選和馴化方法，包括以下步驟:I)富集培養(yǎng):采集年平均氣溫在-0.6°C 8°C的高寒地區(qū)的富含纖維素的自然物樣品，對樣品進(jìn)行纖維素降解菌系的富集培養(yǎng)，獲得富集培養(yǎng)物；2)初篩:將富集培養(yǎng)物接種到濾紙條培養(yǎng)基中，以28°C為初始培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)多代后選擇濾紙崩潰時間短、潰爛程度高，PH接近中性(pH6.5 7.5)的培養(yǎng)物，按每轉(zhuǎn)接一次培養(yǎng)溫度降低1-2°C的梯度進(jìn)行繼代培養(yǎng),至培養(yǎng)溫度降低至15°C 20°C的某一溫度時，在該溫度下連續(xù)繼代培養(yǎng)，至每代濾紙條斷裂時間一致時停止繼代培養(yǎng)，挑選出纖維素降解能力保持較好的菌系；3)復(fù)篩:對初篩菌系進(jìn)行CMC酶相對活性和纖維素酶活的檢測，選出酶活性高的復(fù)合菌系；4)馴化:將復(fù)篩得到的復(fù)合菌系在15°C 20°C的某一溫度下，以秸桿和濾紙分別為唯一碳源進(jìn)行交替繼代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)到多代次以后，選擇秸桿分解能力強(qiáng)，培養(yǎng)物PH近中性(pH6.5 7.5)的菌系，為低溫降解菌系。上述方法中，步驟1)可采用濾紙平鋪法、濾紙崩解法、天然作物秸桿粉搖床培養(yǎng)等方法富集培養(yǎng)，選擇濾紙潰爛程度高、濾紙斷裂時間短、降解秸桿效果好的樣品。
步驟1)中所述富含纖維素的自然物樣品包括但不限于:年平均氣溫在-0.6°c 8°C的高寒地區(qū)的腐爛秸桿、腐爛落葉、朽木、爛草、動物糞便、堆肥、鋸末、食用菌栽培下腳料、麥田土、樹林土、多年秸桿還田土壤、菜園土、草原土等材料。優(yōu)選的，上述步驟2)從初始培養(yǎng)溫度28°C開始，培養(yǎng)4代，選擇濾紙崩潰時間短、潰爛程度高、PH接近中性(pH6.5 7.5)的培養(yǎng)物繼續(xù)傳代，每傳一代降低1_2°C的梯度進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)溫度降低至15 20°C的某一溫度，在該溫度條件下連續(xù)培養(yǎng)，直至每代濾紙條斷裂時間一致時停止繼代培養(yǎng)。上述步驟3)將初篩的菌系接到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，在15 20°C的某一溫度下培養(yǎng)，通過剛果紅水解圈和菌落大小計(jì)算CMC酶相對活性，同時在該溫度下將初篩菌系于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)后并檢測過濾液的纖維素酶活，選出酶活性高的復(fù)合菌系。其中所述纖維素酶活包括Cx酶活、FPA酶活和Cl酶活，綜合CMC酶相對活性、Cx酶活、FPA酶活和Cl酶活四項(xiàng)指標(biāo)。上述步驟4)是進(jìn)行多代限制性碳源繼代培養(yǎng)馴化，將復(fù)篩得到的菌系以秸桿和濾紙分別為唯一碳源進(jìn)行交替培養(yǎng)馴化，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為15°C，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)到4 6代以后，選擇分解能力強(qiáng)，PH近中性(pH6.5 7.5)的菌系。本發(fā)明中所述作物秸桿尤其指玉米秸桿，培養(yǎng)基中作為碳源的玉米秸桿通過下述方法得到:將成熟收獲后的玉米秸桿晾干后剪成小塊，再烘干，滅菌備用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是:本發(fā)明針對北方地區(qū)冬季時間長，氣溫偏低，作物秸桿降解慢、腐解效果差這些限制因素，從年平均氣溫-0.6°C -8°c的高寒地區(qū)富含纖維素的鋸末、爛草、羊糞、草原土等作為菌源采集菌種，通過限制性繼代培養(yǎng)和低溫梯度誘導(dǎo)馴化方法，高效構(gòu)建低溫玉米秸桿降解復(fù)合菌系。篩選出的低溫秸桿降解菌系能夠在低溫(15°C )條件下高效降解玉米秸桿。需要說明的是，本發(fā)明方法并不是針對某種特定微生物的篩選方法，而是篩選和馴化能夠在低溫下降解秸桿的復(fù)合菌系。在高寒地區(qū)富含纖維素的自然物中普遍存在纖維素降解菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本發(fā)明的方法能夠篩選和馴化出合適的復(fù)合菌系，以用于天然作物秸桿的微生物降解處理。


圖1顯示了實(shí)施例1的馴化系在液體發(fā)酵情況下的玉米秸桿降解率。圖2A顯示了將實(shí)施例1得到的菌系接種到秸桿上，15°C條件下培養(yǎng)3-4d的各菌系生長情況。圖2B顯示了將實(shí)施例1得到的菌系接種到秸桿上，15°C培養(yǎng)15d后各菌系降解秸桿的效果。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳述，但實(shí)施例所敘述的技術(shù)內(nèi)容是說明性的，而不是限定性的，不應(yīng)依此來局限本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1低溫降解玉米秸桿的復(fù)合菌系篩選試驗(yàn)于2011-2012年在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)薩拉齊試驗(yàn)基地微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.材料及菌種來源
采集年平均氣溫-0.6_8°C的高寒地區(qū)的富含纖維素的鋸末、爛草、腐爛秸桿、牛羊雞鴨鴿兔糞、草甸土、森林土、木菇、多年秸桿還田土壤等100份材料。2.富集培養(yǎng)本試驗(yàn)采用濾紙平鋪法、濾紙崩解法、天然玉米秸桿粉搖床富集培養(yǎng)。濾紙平鋪法:將采集的材料混合富集靜止培養(yǎng)，腐爛玉米秸桿、腐爛麥桿、腐爛水稻桿、腐爛落葉、朽木、牛羊兔雞鴨鴿子糞、堆肥、腐爛紙盒、鋸末、食用菌栽培下腳料、腐爛柳樹木質(zhì)部等16種材料各50g與5種土壤(麥田土、樹林土、多年玉米秸桿還田土壤、菜園土、草原土)各500g分別混合均勻，得到16X5共80個混合樣品，每個樣品加入10% g/mL的硫酸銨IOOml ;取適量混合樣品在滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)平鋪成約0.5_厚薄層，上面覆蓋一層滅菌濾紙，置入28+l°C培養(yǎng)15d，富集培養(yǎng)4代。每天觀察平皿內(nèi)濾紙變化情況，傳代時從濾紙潰爛處吸取具有明顯濾紙崩解效果的培養(yǎng)液部分轉(zhuǎn)接到相同成分新鮮培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)。根據(jù)濾紙的潰爛程度，定性判定樣品的纖維素降解能力。篩選出濾紙潰爛程度高的10份樣品。濾紙崩解法:采集的樣品單獨(dú)富集靜止培養(yǎng)，采集的100份材料分別取5.0g接種至IJ盛有150mL濾紙條培養(yǎng)基(或滅菌蒸餾水)的500mL三角瓶中，28°C恒溫震蕩培養(yǎng)30min混勻，并將上清液做KT1-KT9稀釋，各取ImL稀釋液接種在濾紙為唯一碳源的濾紙條培養(yǎng)基(奧梅梁斯基培養(yǎng)基)里，28°C靜止富集培養(yǎng)4代。篩選出濾紙斷裂時間短、潰爛程度高的33份材料。天然玉米秸桿粉搖床培養(yǎng):稱取菌種來源樣品5g加入以天然玉米秸桿粉為唯一碳源的IOOmL玉米秸桿粉培養(yǎng)基(將奧梅梁斯基培養(yǎng)基中濾紙用玉米秸桿粉替代中，28°C恒溫震蕩培養(yǎng)15d吸取5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新的玉米秸桿粉富集培養(yǎng)基，富集培養(yǎng)4代。篩選出玉米秸桿粉降解程度高的9份材料。經(jīng)過上述的富集培養(yǎng)后，從100份材料中共篩選出了 45份材料。3.低溫降解纖維素復(fù)合菌系的初篩及馴化采用濾紙崩解法，上述富集培養(yǎng)物接種到濾紙條培養(yǎng)基中馴化低溫纖維素分解菌系。初始培養(yǎng)溫度為28°C，在該溫度下繼代培養(yǎng)4代，選擇濾紙潰爛程度高的、斷裂時間短，PH接近中性的培養(yǎng)物繼續(xù)傳代。每繼代培養(yǎng)一次培養(yǎng)溫度降低2°C，直至培養(yǎng)溫度降低至15°C,目測生長情況，通過濾紙的斷裂情況判斷培養(yǎng)物的纖維素分解能力，邊傳代邊挑選出降解能力保持較好的培養(yǎng)物，在馴化過程中，在15°C溫度條件下連續(xù)培養(yǎng)6代，濾紙條斷裂時間一致時停止低溫馴化。經(jīng)過初步的低溫馴化，結(jié)果在15°C條件下，編號為1、4、6、8、11、12、15、16、17、20
的菌系生長良好，說明其能夠在低溫條件正常生長。因此選擇以上10個低溫降解菌系進(jìn)行復(fù)篩。實(shí)驗(yàn)結(jié)果例于表I。

表115°C培養(yǎng)條件下纖維素分解菌生長情況
權(quán)利要求
1.一種秸桿低溫降解復(fù)合菌系的篩選和馴化方法，包括以下步驟: 1)采集年平均氣溫在-0.6V 8°C的高寒地區(qū)富含纖維素的自然物樣品進(jìn)行纖維素降解菌系的富集培養(yǎng)，獲得富集培養(yǎng)物； 2)將富集培養(yǎng)物接種到濾紙條培養(yǎng)基中，以28°C為初始培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)多代后選擇濾紙崩潰時間短、潰爛程度高，PH6.5 7.5的培養(yǎng)物，按每轉(zhuǎn)接一次培養(yǎng)溫度降低1_2°C的梯度進(jìn)行繼代培養(yǎng)，至培養(yǎng)溫度降低至15°C 20°C的某一溫度時，在該溫度下連續(xù)繼代培養(yǎng)，直至每代濾紙條斷裂時間一致時停止繼代培養(yǎng)，初篩出纖維素降解能力保持好的菌系; 3)對初篩菌系進(jìn)行CMC酶相對活性和纖維素酶活的檢測，選出酶活性高的復(fù)合菌系； 4)將復(fù)合菌系在15°C 20°C的某一溫度下，以秸桿和濾紙分別為唯一碳源進(jìn)行交替繼代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)到多代次以后，選擇秸桿分解能力強(qiáng)、培養(yǎng)物PH6.5 7.5的菌系為秸桿低溫降解復(fù)合菌系。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟I)采用濾紙平鋪法、濾紙崩解法、天然作物秸桿粉搖床培養(yǎng)法中的一種或多種進(jìn)行富集培養(yǎng)，在濾紙平鋪法和濾紙崩解法中選擇濾紙潰爛程度高、濾紙斷裂時間短的樣品，在天然作物秸桿粉搖床培養(yǎng)法中選擇降解秸桿效果好的樣品。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述樣品選自下列材料中的多種:腐爛秸桿、腐爛落葉、朽木、爛草、動物糞便、堆肥、鋸末、食用菌栽培下腳料、麥田土、樹林土、多年秸桿還田土壤、菜園土、草原土。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)在初始培養(yǎng)溫度28°C培養(yǎng)4代，然后再梯度降低溫度進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中CMC酶相對活性的檢測方法是:將初篩菌系接到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，在15 20°C的某一溫度下培養(yǎng)，通過剛果紅水解圈直徑/菌落直徑計(jì)算CMC酶相對活性。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述纖維素酶活包括Cx酶活、FPA酶活和Cl酶活。
7.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)在15 20°C的某一溫度下，以秸桿和濾紙分別為唯一碳源對復(fù)合菌系進(jìn)行交替繼代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4 6代以后選擇秸桿分解能力強(qiáng)、培養(yǎng)物ρΗ6.5 7.5的菌系。
8.按權(quán)利要求1 7任一所述的方法，其特征在于，所述秸桿為玉米秸桿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種秸稈低溫降解復(fù)合菌系的篩選和馴化方法。采集年平均氣溫在-0.6～8℃的高寒地區(qū)的富含纖維素的自然物樣品，先進(jìn)行纖維素降解菌系的富集培養(yǎng)，然后經(jīng)過限制性繼代培養(yǎng)初篩、低溫梯度誘導(dǎo)馴化和纖維素酶活復(fù)篩，再進(jìn)行低溫多代限制性碳源繼代培養(yǎng)馴化，得到秸稈低溫降解復(fù)合菌系。通過本發(fā)明方法篩選和馴化出低溫下高效降解玉米秸稈的復(fù)合菌系，對促進(jìn)北方地區(qū)秸稈資源的還田利用意義重大。
文檔編號C12N1/02GK103087973SQ20131004006
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者高聚林, 薩如拉, 于曉芳, 胡樹平, 孫繼穎, 王志剛, 蘇治軍, 謝岷, 鬧干朝魯, 青格爾 申請人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)