專利名稱：一種固體菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及纖維質(zhì)廢棄物利用領(lǐng)域，尤其涉及一種固體菌劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
飼料是發(fā)展畜牧業(yè)的物質(zhì)基礎(chǔ)，而大量的多纖維粗飼料又是世界上一筆取之不盡、用之不竭的飼料資源。
纖維質(zhì)粗飼料資源包括農(nóng)作物的秸桿、皮、殼、芯、廢棄木材、鋸末等，據(jù)統(tǒng)計，全世界每年的農(nóng)作物秸桿產(chǎn)量約40多億噸，我國每年約有7 8億噸。這些資源粗纖維含量高， 蛋白質(zhì)少，粗灰分多，適口性差，不適于直接作飼料，長期以來大都被燒掉或者部分還田，而作為飼料利用的尚不到五分之一，資源利用率低而污染嚴重。
玉米芯屬木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)原料之一，在自然界的纖維質(zhì)廢棄物中占有很大比例。玉米芯結(jié)構(gòu)復(fù)雜而成分單一，主要是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，含有豐富碳源，但由于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的緊密纏繞使其成為慢利用碳源。
多年來，許多國家致力于研究多種方法對纖維質(zhì)粗飼料進行加工處理，包括化學(xué)、 物理、生物學(xué)方法在內(nèi)，使其轉(zhuǎn)化成適口性良好、營養(yǎng)價值高的飼料。其中，最有前景的是微生物發(fā)酵法，該方法既不需要太復(fù)雜的設(shè)備和過多的能量消耗，又不需高溫、高壓、強酸、強堿等較為極端的條件。
微生物發(fā)酵法是通過微生物對纖維質(zhì)粗飼料進行充分發(fā)酵利用生產(chǎn)纖維素酶添加劑，用于提高飼料利用率，改善飼料的營養(yǎng)價值，降低飼料成本，提高經(jīng)濟效益，具有廣闊的開發(fā)前景。
目前國內(nèi)普遍使用的固體菌劑有兩種純化的單一菌劑和簡單混合菌劑。純化的單一菌劑是在自然環(huán)境中篩選優(yōu)良的產(chǎn)酶單菌株，再通過一定的誘變手段，獲得工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)酶菌株，再吸附到特定載體上制成的菌劑。但自然環(huán)境中對纖維素、木質(zhì)素等成分的降解是多種微生物協(xié)同完成的，微生物之間相互協(xié)調(diào)、相互制約，使產(chǎn)生的水解酶之間的比例處于一種最適降解狀態(tài)。而純化的單一菌劑中的菌種由于失去了自然條件下長期處于協(xié)同關(guān)系的其他菌的共存，其產(chǎn)酶能力大大降低，所產(chǎn)纖維素復(fù)合酶系往往不全，對發(fā)酵條件要求較高，且易受污染。
簡單混合菌劑是將兩種或兩種以上的產(chǎn)酶菌種按一定的比例混合，吸附于適宜的載體上制成。人為地簡單混合，各種菌之間是否具有協(xié)同關(guān)系，是否產(chǎn)生拮抗作用還有待證實。發(fā)明內(nèi)容·
本發(fā)明提供了一種固體菌劑的制備方法，該方法操作簡便，獲得的固體菌劑微生態(tài)穩(wěn)定。
一種固體菌劑的制備方法，包括
(I)將自然選取的玉米芯靜置培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)物A ;
(2)在所述培養(yǎng)物A中接入黑曲霉(Aspergillus niger)和麥曲；混合培養(yǎng)，獲得所述固體菌劑。
本發(fā)明利用在自然選取的玉米芯上自然生長的天然菌群對接入的產(chǎn)酶微生物進行馴化，獲得了一種微生態(tài)穩(wěn)定的固體菌劑。
為利于微生物的生長繁殖，所述玉米芯粉碎成I 2_片段后再進行靜置培養(yǎng)。如無特殊說明，本發(fā)明中的玉米芯均為被無菌粉碎成I 2_的片段。
步驟(I)中，所述靜置培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為28 32°C，培養(yǎng)時間優(yōu)選為20 30小時。合理的培養(yǎng)溫度使玉米芯上的天然菌群能自然生長，合理的培養(yǎng)時間使所述天然菌群不會因生長過盛而影響產(chǎn)酶微生物的生長。
本發(fā)明可選用黑曲霉(Aspergillus niger)ZJU-RYD1,為浙江大學(xué)食品科學(xué)與發(fā)酵工程研究所保藏。也可選用其他可發(fā)酵生產(chǎn)纖維素復(fù)合酶系中的一種或多種酶的黑曲霉 (Aspergillus niger)。
所述黑曲霉(Aspergillus niger)優(yōu)選經(jīng)活化后配制成1X108 109spores/mL 的孢子懸液再進行接種；接種量為8 12mL/100g玉米芯。
所述麥曲與玉米芯的重量比優(yōu)選為4 6 : 100。優(yōu)選地,所述麥曲為生麥曲，由安吉烏氈帽酒廠提供。與熟麥曲相比，生麥曲中微生物種類較為豐富，能夠分泌更多更豐富的酶類。
步驟(2)中，所述混合培養(yǎng)的溫度為29 31 °C，培養(yǎng)環(huán)境濕度控制在90 100 %， 培養(yǎng)時間為45 50小時。
本發(fā)明還提供了利用所述制備方法制得的固體菌劑。所述固體菌劑微生態(tài)穩(wěn)定、 能對纖維基質(zhì)進行糖化發(fā)酵產(chǎn)生纖維素復(fù)合酶系，利用這種微生態(tài)群系可以進行較為粗放的發(fā)酵，不必擔心污染問題，實現(xiàn)對纖維基質(zhì)的低成本高性價比生物轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明還提供了所述固體菌劑在生產(chǎn)纖維素復(fù)合酶系中的應(yīng)用，包括
將玉米芯、蘋果皮、麥麩、水混合，接入所述固體菌劑，攪拌均勻，靜置培養(yǎng)，獲得所述纖維素復(fù)合酶系。
將該纖維素復(fù)合酶系與適宜的載體混合，還可制成纖維素酶制劑，用作飼料添加劑，提高飼料利用率，改善飼料品質(zhì)。
玉米芯、蘋果皮、麥麩、水優(yōu)選以重量比O. 8 1. 2 O. 8 1. 2 O. 4 0.6 2. 3 2. 7混合。所述固體菌劑的添加量優(yōu)選為8 12%。
所述靜置發(fā)酵的條件優(yōu)選為發(fā)酵溫度為28 31°C，發(fā)酵環(huán)境濕度控制在86 94%,發(fā)酵時間為3 6天。發(fā)酵基質(zhì)的厚度控制在2 3cm,以增加透氣率,促進微生物生長。
發(fā)酵完成后，將發(fā)酵物與適量的緩沖液混合，進行酶液的提取。
所述緩沖液優(yōu)選為O. 5M的檸檬酸酸鈉溶液(pH 4. 8)，與發(fā)酵物以6 8 I (v/ w)的比例混合，30°C水浴55 65min后離心，上清液即為所`需酶液。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為
本發(fā)明利用自然選取的載體上的天然菌群對產(chǎn)酶微生物進行馴化，獲得的固體菌劑不僅微生態(tài)穩(wěn)定，而且能夠?qū)w維基質(zhì)進行糖化發(fā)酵生產(chǎn)纖維素復(fù)合酶系，可實現(xiàn)對纖維基質(zhì)低成本高性價比的轉(zhuǎn)化。
具體實施方式
I菌劑的制備
(I)玉米芯天然菌群的制備
將野外采集的玉米芯基質(zhì)(采自浙大紫金港)無菌粉碎成片段為l_2mm的玉米芯，取IOOg玉米芯于30°C培養(yǎng)24小時，獲得培養(yǎng)物A。
如無特殊說明，本發(fā)明中的玉米芯均指片段為l_2mm的玉米芯。
(2)黑曲霉活化
本具體實施方式
選用黑曲霉(Aspergillus niger)ZJU-RYDl，為浙江大學(xué)食品科學(xué)與發(fā)酵工程研究所保藏；生麥曲由安吉烏氈帽酒廠提供。
將黑曲霉ZJU-RYDl接種到PDA培養(yǎng)基斜面，28°C條件下培養(yǎng)3 4d進行活化。獲取活化后的黑曲霉ZJU-RYDl的孢子，用蒸餾水制成濃度為I X 108SpOreS/mL的孢子懸液， 備用。
(3)固體菌劑的制備
往步驟(I)獲得的培養(yǎng)物A中接入IOmL黑曲霉ZJU-RYDl孢子懸液、5g生麥曲，混合后于30°C培養(yǎng)48 60小時，即獲得固體菌劑。
2固態(tài)發(fā)酵
下面以玉米芯作發(fā)酵底物為例，舉例說明本發(fā)明固體菌劑在制備纖維素復(fù)合酶系中的應(yīng)用。
取玉米芯，與麥麩、蘋果皮、水以1:1 : O. 5 : 2. 5的比例混合，接種10% (w/w) 的固體菌劑。發(fā)酵基質(zhì)厚度控制在2cm左右，30°C培養(yǎng)，濕度保持在90%以上，發(fā)酵5天。
3酶液提取和酶活測定
(I)酶液提取
將發(fā)酵產(chǎn)物和O. 5M的檸檬酸酸鈉緩沖液(pH 4. 8)按比例(w/v = 1:7)混合， 放入30°C水浴60min，然后在室溫下3000rpm離心取上清液，即得所需酶液。
(2)酶活測定
I)纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶)活性測定
將一張Sigma濾紙剪成l*3cm于試管中，加O. 5M的檸檬鈉緩沖液(pH5. 8) IOmL,加酶液O. 5mL, 50°C保溫lOmin。加入3mL DNS試劑，沸水浴加熱5min，冷卻至室溫后加蒸餾水定容至25mL，測定還原糖量。
一個酶活單位(U)定義 為每分鐘水解濾紙產(chǎn)生I μ mo I葡萄糖所需的酶量。
2)木聚糖酶活性測定
底物選擇以O(shè). 2M的醋酸鈉緩沖液(pH 5. O)溶解的濃度為I %的木聚糖溶液。取酶液O. 5mL,加入ImL底物溶液，50°C保溫lOmin。然后加入3mL DNS試劑，沸水浴加熱5min， 冷卻至室溫后加蒸餾水定容至25mL，測定還原糖量。
一個酶活單位(U)定義為每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生I μ mo I木糖所需的酶量。
3)淀粉酶活的測定
底物選擇以O(shè).1M的檸檬酸鈉緩沖液(pH 5. O)溶解的濃度為I %的淀粉溶液。取酶液O. 5mL,加入ImL底物溶液，50°C保溫lOmin。然后加入3mL DNS試劑，沸水浴加熱5min，冷卻至室溫后加蒸餾水定容至25mL，測定還原糖量。
一個酶活單位(U)定義為每分鐘水解淀粉產(chǎn)生I μ mol葡萄糖所需的酶量。
4)果膠酶活的測定
底物選擇以O(shè).1M的檸檬酸鈉緩沖液(pH 5. O)溶解的濃度為I %的果膠溶液。取酶液O. 5mL,加入ImL底物溶液，50°C保溫lOmin。然后加入3mL DNS試劑，沸水浴加熱5min， 冷卻至室溫后加蒸餾水定容至25mL，測定還原糖量。
—個酶活單位(U)定義為每分鐘水解果膠產(chǎn)生I μ mol半乳糖醛酸所需的酶量。
重復(fù)三次，測定結(jié)果如表中所示，數(shù)據(jù)為每克菌劑所產(chǎn)生的酶活的平均值土標準差。
表I不同發(fā)酵時間下發(fā)酵物中四種酶的酶活力
權(quán)利要求
1.一種固體菌劑的制備方法，其特征在于，包括 (1)將自然選取的玉米芯靜置培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)物A; (2)在所述培養(yǎng)物A中接入黑曲霉(Aspergillusniger)和麥曲；混合培養(yǎng)，獲得所述固體菌劑。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述玉米芯粉碎成I 2_片段后再進行靜置培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述靜置培養(yǎng)的溫度為28 32°C，時間為20 30小時。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述黑曲霉(Aspergillusniger)經(jīng)活化后配制成IX IO8 109spores/mL的孢子懸液再進行接種；接種量為8 12mL/100g玉米芯。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述麥曲與玉米芯的重量比為4 6 100。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述混合培養(yǎng)的溫度為29 31°C，培養(yǎng)環(huán)境濕度控制在90 100%，培養(yǎng)時間為45 50小時。
7.—種如權(quán)利要求1 6任一所述制備方法制得的固體菌劑。
8.如權(quán)利要求7所述的固體菌劑在生產(chǎn)纖維素復(fù)合酶系中的應(yīng)用，包括 將玉米芯、蘋果皮、麥麩、水混合，接入所述固體菌劑，攪拌均勻，發(fā)酵培養(yǎng)，獲得所述纖維素復(fù)合酶系。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，玉米芯、蘋果皮、麥麩、水以重量比O.8 1. 2 O. 8 1. 2 O. 4 O. 6 2. 3 2. 7 混合。
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述固體菌劑的添加量為8 12%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固體菌劑及其制備方法和應(yīng)用。所述固體菌劑的制備方法包括(1)將未滅菌的玉米芯靜置培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)物A；(2)在所述培養(yǎng)物A中接入黑曲霉(Aspergillus niger)和麥曲；混合培養(yǎng)，獲得所述固體菌劑。本發(fā)明還提供了一種利用所述制備方法獲得的固體菌劑及其在生產(chǎn)纖維素復(fù)合酶系中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用未滅菌載體上的天然菌群對產(chǎn)酶微生物進行馴化，獲得的固體菌劑不僅微生態(tài)穩(wěn)定，而且能夠?qū)w維基質(zhì)進行糖化發(fā)酵生產(chǎn)纖維素復(fù)合酶系，可實現(xiàn)對纖維基質(zhì)低成本高性價比的轉(zhuǎn)化。
文檔編號C12N9/00GK103045547SQ201310009330
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者阮暉, 杜姍姍, 伍星主, 何李琳, 李青青, 徐娟, 陳功, 諸文穎, 楊璐, 劉松柏, 何國慶 申請人:浙江大學(xué)