使用包含硫代磷酸酯基的寡核苷酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)系統(tǒng)的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及用于在試驗(yàn)系統(tǒng)中檢測(cè)核酸的方法和試劑盒。在一個(gè)方面,本發(fā)明涉及在存在缺少3’-5’核酸酶活性的聚合酶時(shí)減少引物延伸反應(yīng)中非特異性擴(kuò)增和引物二聚體形成的方法。在另一個(gè)方面,本發(fā)明涉及檢測(cè)在存在缺少3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶時(shí)產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物的方法,包括提供能夠彼此雜交以形成熒光淬滅對(duì)的具有不同Tm的第一和第二單標(biāo)記的寡核苷酸。在本發(fā)明的方法中,一條或更多條引物或寡核苷酸含有至少一個(gè)硫代磷酸酯基。【專利說(shuō)明】使用包含硫代磯酸醒基的寡核音酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)系統(tǒng)【
技術(shù)領(lǐng)域:
】[0001]本發(fā)明涉及一種在試驗(yàn)系統(tǒng)中用于檢測(cè)核酸的方法和試劑盒?!?br>背景技術(shù):
】[000引聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種快速且指數(shù)式擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的有力方法。PCR促進(jìn)了基因表征和分子克隆技術(shù)的發(fā)展,包括PCR擴(kuò)增的DNA的直接測(cè)序、等位基因變異的測(cè)定W及傳染性和遺傳性疾病病癥的檢測(cè)。通過(guò)下述重復(fù)循環(huán)進(jìn)行PCR;將含有目標(biāo)序列的DNA模板熱變性、將反向引物與互補(bǔ)DNA鏈退火和使用DNA聚合酶將退火的引物延伸。多重PCR循環(huán)導(dǎo)致由側(cè)翼擴(kuò)增引物圈定的核巧酸序列指數(shù)式擴(kuò)增。在PCR方案中加入熱穩(wěn)定的DNA聚合酶避免了重復(fù)添加酶的需要并使退火和引物延伸的溫度提高,該溫度提高了引物;模板相關(guān)的特異性。因此,TaqDNA聚合酶可用于增加PCR的特異性和簡(jiǎn)便性。[0003]在許多基于PCR的反應(yīng)中,采用信號(hào)生成系統(tǒng),如用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。在基于PCR的反應(yīng)中所使用的信號(hào)生成系統(tǒng)之一是英光能量轉(zhuǎn)移(FRET)系統(tǒng),其中核酸檢測(cè)物(detector)包括英光供體和受體基團(tuán)。FRET標(biāo)記系統(tǒng)具有許多優(yōu)于其它標(biāo)記系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì),包括進(jìn)行勻相試驗(yàn)的能力,其中并不需要結(jié)合的與未結(jié)合的標(biāo)記的核酸檢測(cè)器的分離步驟。許多現(xiàn)有技術(shù)的主要問(wèn)題與雙標(biāo)記的英光寡核巧酸的合成相關(guān)。歐洲專利申請(qǐng)EP1726664公開(kāi)了一種解決該一問(wèn)題的檢測(cè)系統(tǒng),其使用具有不同解鏈溫度(Tm)的單標(biāo)記的寡核巧酸序列,所述寡核巧酸序列在理想溶液(化eesolution)中彼此雜交W形成英光巧滅對(duì),其通過(guò)將互補(bǔ)序列引入到一個(gè)或兩個(gè)序列上來(lái)生成可測(cè)量的信號(hào),序列之一具有低于PCR過(guò)程的退火溫度(Ta)的時(shí)1。[0004]在使用標(biāo)記的核酸檢測(cè)物的檢測(cè)系統(tǒng)中,高保真擴(kuò)增是非常關(guān)鍵的。由于PCR過(guò)程和化qDNA聚合酶的性質(zhì),此類方法可能遇到所需要聚合反應(yīng)之外的其它副反應(yīng)。例如,當(dāng)在環(huán)境溫度下進(jìn)行反應(yīng)時(shí),PCR可能遇到非特異性擴(kuò)增。在亞PCR溫度下,Taq聚合酶保留部分活性,因此可W延伸非互補(bǔ)退火的引物,從而導(dǎo)致形成非預(yù)期產(chǎn)物。然后新合成的區(qū)域?qū)⒆鳛檫M(jìn)一步引物延伸和非預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物合成的模板。然而,如果在聚合起始之前將反應(yīng)加熱至約5(TC或更高的溫度,該將增加引物退火的嚴(yán)謹(jǐn)性并避免或降低非預(yù)期PCR產(chǎn)物的合成。[0005]引物二聚體也是一種常見(jiàn)的影響PCR的副反應(yīng)。發(fā)生引物二聚體的積聚是因?yàn)橐锵嗷ブg的雜交和延伸。形成引物二聚體導(dǎo)致試劑損耗并因此整體降低PCR效率。[0006]熱啟動(dòng)PCR是減少非特異性擴(kuò)增的一種方法,并因此限制了引物二聚體的形成,且已開(kāi)發(fā)了多種不同的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)該一目的,參見(jiàn)例如Moretti,T.等人,EnhancementofPC民amplificationyieldandspecificityusingAmpliTaqGoldDNApolymerase.BioTechniques25,716-22(1998)矛口HotStartPC民withheat-activatableprimers:anovelapproachforimprovedPC民performanceNucleicAcids民es(2008)36(20):el31。然而,此類技術(shù)僅部分緩解了此類問(wèn)題。由于序列中的任何錯(cuò)誤、并非基于聚合的反應(yīng)或引物錯(cuò)配(如引物二聚化)都可能導(dǎo)致產(chǎn)生弱信號(hào)或錯(cuò)誤信號(hào),尤其是在等位基因特異性PCR中,因此期望進(jìn)一步改善該些弱的或不正確的信號(hào)。[0007]硫代磯酸醋(或S-oligos)是正常DNA的變體,其中非橋鍵氧原子中的一個(gè)被硫取代。磯酸二醋和硫代磯酸醋核巧酸間鍵的實(shí)例如下所示:[0008]【權(quán)利要求】1.一種減少模板依賴的引物延伸反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增和/或引物二聚體形成的方法,其包括在缺少3'一5'核酸酶活性的聚合酶存在下進(jìn)行引物延伸反應(yīng),其中一個(gè)或多個(gè)引物包含至少一個(gè)硫代磷酸酯基團(tuán)。2.-種檢測(cè)在缺少3'一5'外切酶活性的聚合酶存在下產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物的方法,所述方法包括以下步驟:a)提供至少兩個(gè)在理想溶液中相互雜交以形成熒光猝滅對(duì)并通過(guò)引入互補(bǔ)于一個(gè)或兩個(gè)序列的互補(bǔ)序列而產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)的單標(biāo)記的寡核苷酸序列,其中寡核苷酸序列中的至少一個(gè)包含至少一個(gè)硫代磷酸酯基團(tuán);b)提供至少一個(gè)引物并起始引物延伸反應(yīng),從而產(chǎn)生互補(bǔ)于單標(biāo)記的寡核苷酸序列中的至少一個(gè)的序列;和c)測(cè)量所產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)。3.-種檢測(cè)在缺少3'一5'外切酶活性的聚合酶存在下產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物的試劑盒,其包含至少兩個(gè)在理想溶液中相互雜交以形成熒光猝滅對(duì)并通過(guò)引入互補(bǔ)于一個(gè)或兩個(gè)序列的互補(bǔ)序列而產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)的單標(biāo)記的寡核苷酸序列,其中寡核苷酸序列中的至少一個(gè)包含至少一個(gè)硫代磷酸酯基團(tuán)。4.如權(quán)利要求2或3所述的方法或試劑盒,其中第一和第二寡核苷酸序列具有不同的Tm。5.如權(quán)利要求4所述的方法或試劑盒,其中第一和第二寡核苷酸序列之一具有等于或低于引物延伸反應(yīng)的Ta的Tm。6.如權(quán)利要求4或5所述的方法或試劑盒,其中第一和第二寡核苷酸序列之一具有高于引物延伸反應(yīng)的Ta的Tm。7.-種檢測(cè)在缺少3'一5'外切酶活性的聚合酶存在下通過(guò)使用PCR產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物的方法,所述方法包括以下步驟:a)提供第一單標(biāo)記的寡核苷酸序列和至少一種第二單標(biāo)記的寡核苷酸序列和至少一種引物,第一和第二寡核苷酸序列具有不同的Tm,其中第一和第二寡核苷酸序列在理想溶液中相互雜交以形成熒光猝滅對(duì),第一和第二寡核苷酸序列之一具有等于或低于PCR過(guò)程的Ta的Tm,其中寡核苷酸序列的至少一個(gè)包含至少一個(gè)硫代磷酸酯基團(tuán),所述至少一種引物包含至少一個(gè)未標(biāo)記的加尾的引物,未標(biāo)記的加尾的引物具有尾部區(qū)域,該尾部區(qū)域包含互補(bǔ)于第二單標(biāo)記的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列,第一單標(biāo)記的寡核苷酸序列是PCR過(guò)程中一旦產(chǎn)生互補(bǔ)于第一單標(biāo)記的寡核苷酸序列的序列就可由其起始DNA合成的引物,因此第二單標(biāo)記的寡核苷酸序列不再能夠與第一單標(biāo)記的寡核苷酸序列雜交,從而產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào);b)起始引物延伸反應(yīng),從而產(chǎn)生互補(bǔ)于單標(biāo)記的寡核苷酸序列中的至少一個(gè)的互補(bǔ)序列;和c)測(cè)量所產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)。8.如權(quán)利要求2至7任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中單標(biāo)記的寡核苷酸之一比另一個(gè)短多于10個(gè)堿基。9.如權(quán)利要求2至6任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中在每個(gè)循環(huán)實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程,或者在通過(guò)降低反應(yīng)溫度以產(chǎn)生雜交而使反應(yīng)未產(chǎn)生足夠的產(chǎn)物來(lái)產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)的情況下,在多個(gè)循環(huán)后實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程。10.如權(quán)利要求7至9任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中所述其它的單標(biāo)記的寡核苷酸具有高于Ta的Tm。11.如權(quán)利要求2至10任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中所述單標(biāo)記的寡核苷酸之一具有熒光猝滅對(duì)的猝滅劑標(biāo)記。12.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中含有硫代磷酸酯基團(tuán)的引物內(nèi)的堿基中的至少一個(gè)是硫代磷酸酯。13.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中含有硫代磷酸酯基團(tuán)的引物的堿基的20-80%是硫代磷酸酯。14.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其用于基于等位基因特異性PCR的SNP基因分型。15.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其用于通過(guò)5'核酸酶試驗(yàn)監(jiān)控?cái)U(kuò)增子的產(chǎn)生。16.如權(quán)利要求15所述的方法或試劑盒,其中所述5'核酸酶試驗(yàn)用于進(jìn)行等位基因區(qū)分反應(yīng)。17.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中通過(guò)僅使用雜交來(lái)監(jiān)測(cè)引物延伸產(chǎn)物。18.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中通過(guò)僅在PCR后使用雜交來(lái)監(jiān)測(cè)引物延伸產(chǎn)物。19.如權(quán)利要求2至18任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中熒光猝滅寡核苷酸對(duì)的范圍為6bp至100bp。20.如權(quán)利要求19所述的方法或試劑盒,其中熒光猝滅寡核苷酸對(duì)的范圍為6bp至100bp,但長(zhǎng)度上不匹配。21.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中熒光團(tuán)標(biāo)記的引物的堿基中的至少一個(gè)包含至少一個(gè)硫代磷酸酯基團(tuán)。22.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中熒光猝滅寡核苷酸對(duì)被標(biāo)記,對(duì)中的一個(gè)具有熒光團(tuán),而另一個(gè)具有非熒光猝滅分子。23.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中修飾熒光猝滅寡核苷酸對(duì)以抵抗核酸酶降解。24.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法或試劑盒,其中熒光猝滅寡核苷酸對(duì)用對(duì)距離敏感的分子標(biāo)記?!疚臋n編號(hào)】C12Q1/68GK104379763SQ201280073407【公開(kāi)日】2015年2月25日申請(qǐng)日期:2012年3月22日優(yōu)先權(quán)日:2012年3月22日【發(fā)明者】菲利普·史蒂文·魯賓遜,約翰·霍爾梅,尼沙·吉恩申請(qǐng)人:Lgc基因組學(xué)有限公司