用于高通量檢測瘧原蟲的方法、組合物和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測樣品中瘧原蟲的方法。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中瘧原蟲的組合物和試劑盒。
【專利說明】用于高通量檢測瘧原蟲的方法、組合物和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于高通量且靈敏地檢測痕原蟲（Genus Plasmodium)的方法。本發(fā) 明還涉及檢測瘧原蟲的組合物和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 瘧疾仍然是世界上最重要的傳染病之一?？墒?，最近幾年，在某些國家，瘧疾傳 播的下降使得有可能考慮根治該疾病（WHO. World malaria report ;2009)。隨著各國 瘧疾根治運動的展開，疾病的監(jiān)控、評價以及監(jiān)測活動都要從對發(fā)病率和死亡率的測量 轉(zhuǎn)變?yōu)閷Ω腥镜臋z測和對傳播的測量。這就需新的診斷手段，其對于檢測無癥狀感染者 具有較高的靈敏度，而對于大規(guī)模篩查和監(jiān)控具有較高的通量（A research agenda for malaria eradication:diagnoses and diagnostics. PLoS Med 2011 ;8:el000396)〇 例 如，隨著全球人口的移動和遷移，該疾病向非疫區(qū)的傳播越來越多，從而迫切需要對可 能表現(xiàn)或不表現(xiàn)臨床癥狀的高危人群進(jìn)行大規(guī)模、積極的瘧疾篩查，因為亞臨床感染的 個體可能是一個嚴(yán)重的痕疾傳播源（Harris I，Sharrock ffff, Bain LM, et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands:challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar J 2010;9:254)。引起瘧疾的寄生蟲是惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum)、間日瘧 原蟲（Plasmodium vivax)、卵形癥原蟲（Plasmodium ovale)、三日癥原蟲（Plasmodium malariae)以及諾氏癥原蟲（Plasmodium knowlesi)。惡性程度最高、甚至可能致命型的 瘧疾由惡性瘧原蟲引起，而最容易復(fù)發(fā)的瘧疾由間日瘧原蟲引起（Galinski MR, Barnwell JW. Plasmodium vivax:who cares? Malar J 2008 ;7 Suppl 1:S9)?？傮w上來看，惡性癥 原蟲和間日瘧原蟲是引發(fā)瘧疾最常見的寄生蟲。因此，鼓勵傳播性低、不穩(wěn)定的國家把重點 放在惡性癥原蟲和間日癥原蟲的消除上，從而開展癥疾根治（WHO. World malaria report; 2010)〇
[0003] 當(dāng)前的診斷技術(shù)缺乏瘧疾傳播監(jiān)控和控制所需要的靈敏度和通量。最廣泛使 用的顯微鏡鏡檢對于低于50個寄生蟲/ul的瘧原蟲感染無法檢出（Moody A. Rapid diagnostic tests for malaria parasites. Clinical Microbiology Reviews 2002 ； 15:66)。在調(diào)查流行人群時，顯微鏡鏡檢可能會漏掉大部分瘧疾感染病例，特別是在 癥疾感染傳播低的地區(qū)（Okell LC，Ghani AC，Lyons E，Drakeley CJ.Submicroscopic infection in Plasmodium falciparum-endemic populations:a systematic review and meta-analysis. J Infect Dis 2009;200:1509-17)。最近的研發(fā)的分子方法，例 如 PCR(Snounou G, Viriyakosol S, Jarra W, Thaithong S, Brown K. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Mol BiochemParasitol 1993;58:283-92)、定量 PCR(Rougemont M，Van SaanenM，Sahli R,Hinrikson HP, Bille J, Jaton K.Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rRNA gene subunit-based and species-specific real-time PCR assays. J Clin Microbiol2004;42:5636-43)、基于核酸序列的擴增（NASBA) (Mens PF,Schoone GJ, Kager PA,Schallig HD.Detection and identification of human Plasmodium species with real-time quantitative nucleic acid sequence-based amplification. Malar J 2006 ;5:80)、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增（LAMP) (Lucchi NW,Demas A,Narayanan J,et al.Real-Time Fluorescence Loop Mediated Isothermal Amplification for the Diagnosis of Malaria. PLoS One 2010 ;5)更為靈敏，而且需要較 少的瘧疾專業(yè)知識，但是這些方法對于DNA/RNA提取的依賴，嚴(yán)重影響了診斷性能。而且， 這樣的依賴妨礙了這些技術(shù)在高通量病人篩查中的應(yīng)用。基于蛋白的快速診斷實驗（RDT) 更加簡便，也同樣靈敏，可以用于瘧疾的篩查。但是其對診斷惡性瘧原蟲感染更可靠，有時 不能區(qū)分活動性感染和既往經(jīng)歷的瘧疾感染，降低了其作為顯微鏡診斷替代選擇的效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明專利提供了一種簡便、靈敏且可靠的適用于大規(guī)模檢測瘧原蟲的方法。我 們利用我們之前開發(fā)的RNA三明治雜交分析（Zheng Z, Luo Y，McMaster GK. Sensitive and quantitative measurement of gene expression directly from a small amount of whole blood. Clin Chem 2006 ;52:1294-302;and US 專利申請 US2007/016015)來檢測樣 品中存在的瘧原蟲。參考文獻(xiàn)的所有內(nèi)容均并入文中。
[0005] 具體地，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中瘧原蟲的方法，包括：
[0006] a)提供可能含有靶標(biāo)瘧原蟲的測試樣品；
[0007] b)任選地，從測試樣品a)中釋放多聚核酸；
[0008] c)用探針混合物接觸所述測試樣品或者釋放的多聚核酸，在足以使雜交發(fā)生的條 件下持續(xù)一段時間，所述探針混合物包括一個或多個捕獲延伸（CE)探針和一個或多個標(biāo) 記延伸（LE)探針；
[0009] 其中所述CE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的核苷酸，以及與共價或非 共價地粘附于固體支持物的核酸雜交的核苷酸組成；
[0010] 其中所述LE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的核苷酸，以及與可檢測分 子雜交的核苷酸組成；和
[0011] d)在所述步驟C)之后，用可檢測分子與所述測試樣品接觸，在足以使雜交發(fā)生的 條件下持續(xù)一段時間；
[0012] e)檢測步驟C)中發(fā)生的任何雜交；其中，雜交是否存在是所述測試樣品中瘧原蟲 是否存在的指征。
[0013] 本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于檢測樣品中瘧原蟲的方法，包括：
[0014] a)提供可能含有靶標(biāo)瘧原蟲的測試樣品；
[0015] b)任選地，從樣品a)中釋放多聚核酸；
[0016] c)用探針混合物接觸測試樣品或者釋放出的多聚核酸，在足以使雜交發(fā)生的條件 下持續(xù)一段時間，所述探針混合物包括一個或多個CE探針、一個或多個LE探針、和至少一 個封閉探針；
[0017] 其中所述CE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的核苷酸，以及與共價或非 共價地粘附于固體支持物的核酸雜交的核苷酸組成；
[0018] 其中所述LE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的核苷酸，以及與可檢測分 子雜交的核苷酸組成；和
[0019] 其中封閉探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA雜交的核苷酸組成，以減少或消除其他 探針對序列的非特異性雜交，且通過疊加效應(yīng)增強相鄰探針的雜交；和
[0020] d)在所述步驟c)之后，用可檢測分子與所述測試樣品接觸，在足以使雜交發(fā)生的 條件下持續(xù)一段時間；
[0021] e)檢測步驟c)中發(fā)生的任何雜交；其中，雜交是否存在是所述測試樣品中瘧原蟲 是否存在的指征。
[0022] 在一個優(yōu)選實施方案中，CE探針的含量占組合物總重量的lwt%至99wt% ;LE探 針的含量占組合物總重量的lwt%至99wt% ;封閉探針的含量占組合物總重量的lwt%至 99wt %。
[0023] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述封閉探針具有如SEQ ID N0:22所示的序列。
[0024] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述痕原蟲選自惡性痕原蟲（Plasmodium falciparum)、 間日痕原蟲（Plasmodium vivax)、三日痕原蟲（Plasmodium malariae)、卵形痕原蟲 (Plasmodium ovale)以及諾氏痕原蟲（Plasmodium knowlesi)。
[0025] 在另一個實施方案中，所述測試樣品是血液樣品，包括血漿、血清或血凝塊，培養(yǎng) 的紅細(xì)胞、或濾紙上干燥的血液樣品。
[0026] 在一個優(yōu)選實施方案中，測試樣品經(jīng)過蛋白酶K處理。優(yōu)選地，測試樣品經(jīng)過蛋白 酶K在50°C至60°C處理1小時。更優(yōu)選地，測試樣品經(jīng)過蛋白酶K在56°C處理1小時。
[0027] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述一個或多個CE探針結(jié)合于固體支持物。更優(yōu)選地， 該固體支持物可以是平板固體支持物或珠子。最優(yōu)選地，該支持物是96孔板。
[0028] 在一個優(yōu)選實施方案中，可被檢測分子由酶或者熒光標(biāo)簽標(biāo)記。
[0029] 在一個優(yōu)選實施方案中，與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的核苷酸與SEQ ID NO :23至43所示的核苷酸具有至少80 %的同一性，更優(yōu)選地，至少85%的同一性，更優(yōu)選 地，至少90 %的同一性，最優(yōu)選地，至少95 %的同一性。
[0030] 在另一個實施方案中，至少一個或多個CE探針選自SEQ ID N0 :1至7;并且至少 一個或多個LE探針選自SEQ ID N0:8至21。
[0031] 另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中瘧原蟲的方法，包括：
[0032] a)提供可能含有靶標(biāo)瘧原蟲的測試樣品；
[0033] b)任選地，從測試樣品a)中釋放多聚核酸；
[0034] c)用探針混合物接觸所述測試樣品或者釋放的多聚核酸，在足以使雜交發(fā)生的條 件下持續(xù)一段時間，探針混合物包括所有SEQ ID N0 :1至22所示的探針；和
[0035] d)在所述步驟c)之后，用可檢測分子與所述測試樣品接觸，在足以使雜交發(fā)生的 條件下持續(xù)一段時間；
[0036] e)檢測步驟c)中發(fā)生的任何雜交；其中，雜交是否存在是所述測試樣品中瘧原蟲 是否存在的指征。
[0037] 另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中瘧原蟲的組合物，包括：
[0038] a) -個或多個CE探針，其中所述CE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的 核苷酸，以及與共價或非共價地粘附于固體支持物的核酸雜交的核苷酸組成；
[0039] b) -個或多個LE探針，其中所述LE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的 核苷酸，以及與可檢測分子雜交的核苷酸組成。
[0040] 另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中瘧原蟲的組合物，包括：
[0041] a) -個或多個CE探針，其中所述CE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的 核苷酸，以及與共價或非共價地粘附于固體支持物的核酸雜交的核苷酸組成；
[0042] b) -個或多個LE探針，其中所述LE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的 核苷酸，以及與可檢測分子雜交的核苷酸組成；和
[0043] c)至少一個封閉探針；所述封閉探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA雜交的核苷酸組 成，以減少或消除其他探針對序列的非特異性雜交，且通過疊加效應(yīng)增強相鄰探針的雜交。
[0044] 在一個優(yōu)選實施方案中，與18S核糖體RNA區(qū)域雜交的核苷酸與SEQ ID N0 :23 至43所示的核苷酸具有至少80%的同一性，更優(yōu)選地，至少85%的同一性，更優(yōu)選地，至少 90 %的同一'丨生，最優(yōu)選地，至少95 %的同一'丨生。
[0045] 在一個優(yōu)選實施方案中，所述探針選自SEQ ID NO : 1至7 ;并且所述LE探針選自 SEQ ID N0 :8 至 21。
[0046] 在一個優(yōu)選實施方案中，封閉探針具有SEQ ID N0 :22所示的序列。
[0047] 另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中瘧原蟲的組合物，包括所有SEQ ID N0 :1至23所示的探針。
[0048] 另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中瘧原蟲的試劑盒，所述試劑盒包 含：
[0049] a)組合物，其包含：
[0050] i) -個或多個CE探針，其中所述CE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的 核苷酸，以及與共價或非共價地粘附于固體支持物的核酸雜交的核苷酸組成；
[0051] ii) 一個或多個LE探針，其中所述LE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的 核苷酸，以及與可檢測分子雜交的核苷酸組成；
[0052] b)固體支持物；
[0053] c)可檢測分子。
[0054] 另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測樣品中瘧原蟲的試劑盒，所述試劑盒包 含：
[0055] a)組合物，其包含：
[0056] i) -個或多個CE探針，其中所述CE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的 核苷酸，以及與共價或非共價地粘附于固體支持物的核酸雜交的核苷酸組成；
[0057] ii) -個或多個LE探針，其中所述LE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的 核苷酸，以及與可檢測分子雜交的核苷酸組成；
[0058] iii)至少一個封閉探針；所述封閉探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA雜交的核苷酸 組成，以減少或消除其他探針對序列的非特異性雜交，且通過疊加效應(yīng)增強相鄰探針的雜 交；
[0059] b)固體支持物；
[0060] c)可檢測分子。
[0061]
[0062] 除非特別限定，本專利申請中所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本專利相關(guān)領(lǐng)域從業(yè)者 通常通常理解的含義。如下定義擴展了術(shù)語在本領(lǐng)域中的定義，涉及本申請，并不歸因于其 他相關(guān)或者不相關(guān)的案例（例如：任何通常已有的專利或者專利申請）。盡管任何類似或 等效于本文描述的方法和材料都可以實際用于對本發(fā)明的驗證，本文描述了優(yōu)選的材料和 方法。因此，文中使用的術(shù)語僅用于對特定實施方案的描述，不做任何限制目的。
[0063] 如在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式的"一個"、"一種"，除非特 別聲明，包括復(fù)數(shù)指代。因而，例如，"一種分子"包括多種這樣的分子，等等。
[0064] 術(shù)語"多聚核酸"、"多聚核苷酸"、"核苷酸"、"核酸"在文中可互換使用，包括與一 串核苷酸相對應(yīng)的單體單元的任何物理字符串，包括核苷酸聚合物（如，典型的DNA或RNA 聚合物），肽核酸（PNA)，修飾的寡核苷酸（例如，含有不屬于典型生物RNA或DNA的核苷酸 的寡核苷酸，如2' -0-甲基化寡核苷酸）等。
[0065] 術(shù)語"捕獲延伸探針"或"CE探針"是一種多聚核苷酸，其能夠與瘧原蟲18S核糖 體RNA雜交，且能夠與共價或非共價地粘附于固體支持物的核酸雜交。典型地，該捕獲延伸 探針（CE探針）具有與瘧原蟲18S核糖體RNA互補的第一多聚核苷酸部分，以及與共價或 非共價粘附于固體支持物的多聚核苷酸互補的第二多聚核苷酸部分。典型地，第一和第二 多聚核苷酸部分不會彼此互補。優(yōu)選CE探針是單鏈的。
[0066] 術(shù)語"標(biāo)記延伸探針"或"LE探針"是一種多聚核苷酸。LE探針能夠與瘧原蟲18S 核糖體RNA雜交，且能夠與可檢測分子雜交。典型地，該標(biāo)記延伸探針（LE探針）具有與瘧 原蟲18S核糖體RNA互補的第一多聚核苷酸部分，以及與可檢測分子互補的第二核苷酸部 分。典型地，第一和第二多聚核苷酸部分不會彼此互補。優(yōu)選LE探針是單鏈的。
[0067] 術(shù)語"可檢測分子"包括一個或多個多聚核苷酸，其共同地包括標(biāo)簽和M-1多聚核 苷酸序列，能夠與至少一個LE探針雜交。標(biāo)簽直接或者間接地提供信號。M-1多聚核苷酸 序列通常與LE探針的第二多聚核苷酸互補。
[0068] 文中使用的術(shù)語"雜交"指互補核苷酸序列的配對，以產(chǎn)生DNA-DNA雜合體或 DNA-RNA雜合體。限定合適的雜交條件屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0069] 圖1表示了分析信號與培養(yǎng)的人紅細(xì)胞中惡性瘧原蟲的相關(guān)性。如瘧原蟲檢測方 法中描述的，確定人紅細(xì)胞培養(yǎng)物中的惡性瘧原蟲。檢測限確定為加入紅細(xì)胞中的培養(yǎng)瘧 原蟲的最小量，其給出背景紅細(xì)胞對照SD的3倍以上的信號凈值。使用培養(yǎng)基制備各稀釋 液。分析中使用一式三份的樣品，數(shù)據(jù)代表3個獨立的次數(shù)。平均檢測限是0.04個寄生蟲 /yl血液。RLU:相對光單位。
[0070]圖2表示檢測信號與保存不好的血液樣品中寄生蟲血癥的相關(guān)性。保存的樣品來 自59例病人，由于來源有限，這些樣品在采集后經(jīng)過了多次凍融，分析樣品（各20 yl)，在 采樣時，對信號凈值和認(rèn)可的顯微鏡確定的寄生蟲血癥作圖。每個樣品都是一式兩份檢測， 取平均信號。高于IX 107的信號強度被認(rèn)為接近光子檢測儀的檢測飽和值。

【具體實施方式】
[0071] 實施例
[0072] 樣品收集
[0073] 靜脈肝素血液樣品收集自緬甸克欽和中國云南的202例不明原因發(fā)熱的病人。其 中59例患者的血樣采集于2008年，143例采集于2011年。用于分析評估的對照血液樣品 (n= 13)采自中國北京的健康受試者。在使用前所有樣品凍存于一 80°C。樣品收集都有 書面知情同意。本研究經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所機構(gòu)審查委員會（IRB)的倫理 認(rèn)可。由于來源有限，59例血液樣品在檢測前經(jīng)過了多次凍融。
[0074] 檢測瘧原蟲的方法
[0075] 1、顯微鏡鏡檢
[0076] 采樣時，從每個病人收集包括厚血膜和薄血膜的2個切片，用2%吉姆薩染液處理 30分鐘。然后切片分別由兩位顯微鏡專家對瘧原蟲寄生蟲進(jìn)行查看，如果每個顯微鏡專家 最小仔細(xì)檢查了 500個視野，也沒有寄生蟲的存在，則該樣品為陰性樣品。如果切片是陽 性，則計數(shù)寄生蟲密度。
[0077] 2、RDT
[0078] 本實驗中的 RDT 檢測米用 CARESTART?(Accessbio, Monmouth Junction, NJ)，根據(jù) 廠家說明書進(jìn)行。該試劑盒選自世界衛(wèi)生組織的采購?fù)扑]RDT列表。
[0079] 3、實時 qPCR
[0080] 使用QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN)，按照廠家說明書從200 ill融化的血 液提取DNA。瘧原蟲18S篩選引物和探針序列以及實時qPCR的條件來自之前發(fā)表的文獻(xiàn)。 如果熒光信號在40個循環(huán)（Ct40)以內(nèi)不增加，則認(rèn)為樣品為陰性。每次實驗都包含至少 1個陽性對照和1個陰性對照。每個樣品都一式兩份地進(jìn)行檢測。
[0081] 4、三明治RNA核酸雜交分析
[0082] 22個寡核苷酸探針（具有SEQ ID No: 1至22所示的序列）靶向瘧原蟲18S核糖 體RNA中的幾處高度保守區(qū)域，包括惡性瘧原蟲（Genebank登錄號M19172. 1)、間日瘧原 蟲（Genebank登錄號U03079. 1)、三日瘧原蟲（Genebank登錄號AF488000. 1)、卵形瘧原蟲 (Genebank登錄號L48987. 1)以及諾氏瘧原蟲（Genebank登錄號L07560. 1)。
[0083] 探針序列如下所示：
[0084]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測樣品中瘧原蟲的方法，其包括以下步驟： a) 提供可能含有靶標(biāo)瘧原蟲的測試樣品； b) 任選地，從步驟a)的測試樣品中釋放多聚核酸； c) 用探針混合物接觸所述測試樣品或者釋放的多聚核酸，在足以使雜交發(fā)生的條件下 持續(xù)一段時間，所述探針混合物包括一個或多個CE探針和一個或多個LE探針， 其中所述CE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的核苷酸，以及與共價或非共價 地粘附于固體支持物的核酸雜交的核苷酸組成； 其中所述LE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的核苷酸，以及與可檢測分子雜 交的核苷酸組成； d) 在所述步驟c)之后，用可檢測分子與所述測試樣品接觸，在足以使雜交發(fā)生的條件 下持續(xù)一段時間；和 e) 檢測步驟c)中發(fā)生的任何雜交；其中，雜交是否存在是所述測試樣品中瘧原蟲是否 存在的指征。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括用至少一個封閉探針接觸所 述測試樣品的步驟，所述封閉探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA雜交的核苷酸組成，以減少或 消除其他探針對序列的非特異性雜交，且通過疊加效應(yīng)增強相鄰探針的雜交。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述封閉探針具有如SEQ ID N0:22所示的序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其中所述瘧原蟲選自惡性瘧原蟲 (Plasmodium falciparum)、間日痕原蟲（Plasmodium vivax)、三日痕原蟲（Plasmodium malariae)、卵形痕原蟲（Plasmodium ovale)以及諾氏痕原蟲（Plasmodium knowlesi)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其中所述測試樣品是血液樣品、培養(yǎng)的紅細(xì) 胞、或濾紙上干燥的血液樣品。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的方法，其中所述一個或多個CE探針結(jié)合于固體支 持物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述支持物是平板固體支持物或珠子。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述支持物是96孔板。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的方法，其中可檢測分子由酶或者熒光標(biāo)簽標(biāo)記。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項所述的方法，其中與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的 核苷酸選自與SEQ ID NO :23至43所示的核苷酸具有至少80%同一性的核苷酸。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項所述的方法，所述CE探針選自SEQ ID NO :1至7 ;并 且所述LE探針選自SEQ ID N0:8至21。
12. -種用于檢測樣品中瘧原蟲的方法，其包括以下步驟： a) 提供可能含有靶標(biāo)瘧原蟲的測試樣品； b) 任選地，從步驟a)的測試樣品中釋放多聚核酸； c) 用探針混合物接觸所述測試樣品或者釋放的多聚核酸，在足以使雜交發(fā)生的條件下 持續(xù)一段時間，所述探針混合物含有至少一個選自SEQ ID NO :1至21所示探針的探針； d) 在所述步驟c)之后，用可檢測分子與所述測試樣品接觸，在足以使雜交發(fā)生的條件 下持續(xù)一段時間；和 e) 檢測步驟c)中發(fā)生的任何雜交；其中，雜交是否存在是所述測試樣品中瘧原蟲是否 存在的指征。
13. -種用于檢測樣品中瘧原蟲的組合物，其包括： a) -個或多個CE探針，其中所述CE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的核苷 酸，以及與共價或非共價地粘附于固體支持物的核酸雜交的核苷酸組成；和 b) -個或多個LE探針，其中所述LE探針由與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的核苷 酸，以及與可檢測分子雜交的核苷酸組成； 其中所述所述CE探針和LE探針以足以使雜交發(fā)生的有效量存在。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其進(jìn)一步可選地包括足以與瘧原蟲18S核糖體 RNA雜交的有效量的封閉探針，以減少或消除其他探針對序列的非特異性雜交，且通過疊加 效應(yīng)增強相鄰探針的雜交。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中CE探針的含量占組合物總重量的lwt%至 99wt% ;LE探針的含量占組合物總重量的lwt%至99wt% ;封閉探針的含量占組合物總重 量的 lwt % 至 99wt %。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的組合物，其中與瘧原蟲18S核糖體RNA區(qū)域雜交的核 苷酸選自與SEQ ID NO :23至43所示的核苷酸具有至少80%同一性的核苷酸。
17. 根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項所述的組合物，其中所述CE探針選自SEQ ID NO: 1 至7;所述LE探針選自SEQIDN0:8至21。
18. 根據(jù)權(quán)利要求14至16任一項所述的組合物，其中所述封閉探針具有SEQ ID N0:22 所示的序列。
19. 一種用于檢測樣品中瘧原蟲的組合物，其包括所有SEQ ID NO :1至22所示的探針。
20. -種用于檢測樣品中瘧原蟲的試劑盒，其包含：a)根據(jù)權(quán)利要求13至18任一項所 述的組合物；b)固體支持物；c)可檢測分子和d)說明書。
【文檔編號】C12Q1/68GK104284986SQ201280072439
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月25日
【發(fā)明者】鄭直, 程志斌 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所