酶方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新的表征目標多核苷酸的方法。所述方法使用孔和RecD解旋酶。所述解旋酶控制目標多核苷酸穿過所述孔的移動。
【專利說明】酶方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新的表征目標多核苷酸的方法。所述方法使用孔和RecD解旋酶。 所述解旋酶控制目標多核苷酸穿過所述孔的移動。

【背景技術(shù)】
[0002] 當前，需要可以廣泛應(yīng)用的快速且便宜的多核苷酸（例如DNA或RNA)測序和鑒定 技術(shù)?，F(xiàn)有技術(shù)緩慢且昂貴，主要是由于它們依賴于擴增技術(shù)產(chǎn)生大量的多核苷酸并需要 大量的專業(yè)熒光化學品進行信號檢測。
[0003] 跨膜孔（納米孔）具有極大潛力作為聚合物和許多小分子的直接的，電生物傳感 器。特別是最近的關(guān)注點是將納米孔作為潛在的DNA測序技術(shù)。
[0004] 穿過納米孔施加電勢時，當分析物諸如核苷酸短暫停留在桶內(nèi)一段時間將會有 電流的變化。核苷酸的納米孔檢測給出已知標記和時間的電流變化。在"鏈測序（Strand Sequencing) "方法中，使單個多核苷酸鏈穿過所述孔并獲得對各核苷酸的鑒定。鏈測序可 涉及使用核苷酸調(diào)控蛋白來控制所述多核苷酸穿過所述孔的移動。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明人已經(jīng)證明RecD解旋酶能夠控制多核苷酸穿過孔的移動，尤其當在施加 電勢諸如電壓時。所述解旋酶能使目標多核苷酸以可控和逐步的方式逆著或順著由所施加 的電壓引起的電場進行運動。令人驚奇地，所述解旋酶能在高的鹽濃度下起作用，這對于表 征多核苷酸，尤其是使用鏈測序的方法確定多核苷酸的序列，是有利的。這將在下文進一步 詳細描述。
[0006] 相應(yīng)的，本發(fā)明提供一種表征目標多核苷酸的方法，包括：
[0007] (a)將目標多核苷酸與跨膜孔和RecD解旋酶接觸，使得所述目標多核苷酸移動穿 過所述孔，并且使所述RecD解旋酶控制所述目標多核苷酸穿過所述孔的移動；以及
[0008] (b)隨著所述多核苷酸相對所述孔移動獲取一個或多個測量值，其中所述測量值 代表所述目標多核苷酸的一個或多個特征，并由此表征所述目標多核苷酸。
[0009] 本發(fā)明還提供了：
[0010] - 一種用于表征目標多核苷酸的傳感器的形成方法，包括在孔和RecD解旋酶之間 形成復(fù)合體并由此形成用于表征目標多核苷酸的傳感器；
[0011] -RecD解旋酶在控制目標多核苷酸穿過孔的移動中的應(yīng)用；
[0012] -一種用于表征目標多核苷酸的試劑盒，包括（a)孔和（b)RecD解旋酶；以及
[0013] --種用于表征樣本中目標多核苷酸的分析設(shè)備，包括多個孔和多個RecD解旋 酶；
[0014] --種表征目標多核苷酸的方法，包括：
[0015] (a)將目標多核苷酸與RecD解旋酶接觸，使得所述RecD解旋酶控制所述目標多核 苷酸的運動；以及
[0016] (b)隨著RecD解旋酶控制所述多核苷酸的運動，獲取一個或多個測量值，其中所 述測量值代表所述目標多核苷酸的一個或多個特征并由此表征所述目標多核苷酸；
[0017] -RecD解旋酶在表征目標多核苷酸的過程中控制目標多核苷酸的運動中的應(yīng)用；
[0018] -RecD解旋酶在對目標多核苷酸的部分或全部進行測序的過程中控制目標多核苷 酸的運動中的應(yīng)用；
[0019] - 一種用于表征樣本中的目標多核苷酸的分析裝置，其特征在于包括RecD解旋 酶；以及
[0020] --種用于表征目標多核苷酸的試劑盒，包括（a)用于表征目標多核苷酸的分析 裝置和（b) RecD解旋酶。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1. A)使用解旋酶控制DNA穿過納米孔的運動的例示圖。將ssDNA底物與含有 膽固醇標簽的退火引物添加到雙分子層的順側(cè)。膽固醇標簽結(jié)合到所述雙分子層上，在雙 分子層表面處富集所述底物。添加到順側(cè)隔間（compartment)的解旋酶連接到DNA上。在 二價金屬離子和NTP底物的存在下，所述解旋酶沿著所述DNA運動。在施加的電壓下，納米 孔捕獲所述DNA底物。在施加的電勢的力的作用下，所述DNA被牽拉穿過所述孔直到連接 在DNA上的解旋酶與所述孔的頂部接觸，防止進一步的不受控的DNA移位。之后所述解旋 酶繼續(xù)移動所述DNA使其以受控制的方式穿過所述納米孔。
[0022] 所述例示圖顯示了將DNA引入納米孔的兩種可能的方法：一種模式（上部分圖） 所述解旋酶順著所施加的電場的方向，將被捕獲的DNA移進所述納米孔，以及另一種模式 (下部分圖）所述解旋酶逆著所施加的電場的方向，將被捕獲的DNA牽拉出所述納米孔。當 順著所施加的電場移動時，DNA將被移動到所述膜的反側(cè)。在上部分圖和下部分圖中，反側(cè) 的箭頭表示DNA的運動方向，順側(cè)的箭頭表示解旋酶相對于與DNA的運動方向。當逆著所 施加的電場移動時，DNA被移動回所述膜的順側(cè)，并且如果所述解旋酶不解離，DNA可完全 移位到所述順側(cè)。通過底物設(shè)計，諸如使用合適的前導(dǎo)區(qū)，上述方法的一個或兩個可以同時 使用。解旋酶的RecD家族沿著DNA的5' -3'方向運動。因此，順著所述電場移動所述DNA 需要捕獲DNA的5 '端下游，并且逆著所述電場移動所述DNA需要捕獲DNA的3 '端下游。B) 實施例中使用的DNA底物的設(shè)計。
[0023] 圖2是解旋酶能以可控方式移動DNA穿過納米孔，隨著DNA移動穿過納米孔 (MspA-(B2)8)，產(chǎn)生逐步變化的電流。解旋酶-DNA事件的例子（140mV，400mM NaCl，10mM H印es，pH8·0,0·60nM 400merDNA(SEQIDN0:172，173和174)，100nMTralEco(SEQID N0:61), ImM DTT, ImM ATP, ImM MgCl2)。上部），獲得 Tral400mer DNA 事件的電流 vs.時間 的分圖。所述開孔（open-pore)電流為?100pA。DNA在施加的電勢（+140mV)的力的作用 下被所述納米孔捕獲。具有酶連接的DNA產(chǎn)生長的模塊（block)(在該條件下，在?25pA)， 隨著酶移動DNA穿過所述孔，該模塊顯示出逐步變化的電流。中部）是解旋酶控制的DNA 事件中的一個的放大圖，顯示DNA-酶的捕獲，以及隨著DNA被牽拉穿過所述孔時電流的逐 步變化。下部），隨著DNA移動穿過所述納米孔電流逐步變化的另一個放大圖。
[0024] 圖 3 是 Tral Eco(SEQ ID 61)解旋酶控制的 400merDNA(400merDNASEQ ID NO: 172, 173和174)移動穿過MspA-B2 (8)納米孔事件的另一個實例。下部），顯示DNA鏈 的不同部分移動穿過所述納米孔引起的電流逐步變化的事件的放大分圖。
[0025] 圖4是檢測酶活性的熒光分析。A)使用常規(guī)的熒光底物檢測解旋酶（a)用于 置換雜交的雙鏈DNA的能力。1)所述熒光底物鏈（終濃度50nM)具有5' ssDNA突出部 分（overhang),以及雜交的雙鏈DNA的40個堿基部分。主鏈上部（The major upper strand)在3'末端具有羧基熒光素堿基，并且所述雜交的互補鏈在5'末端具有黑洞淬滅 劑（black-hole quencher (BHQ-1))堿基。當雜交時，來自突光素的突光被局部的BHQ-1淬 滅，所述底物基本上是無熒光的。所述分析中還包括，與熒光底物的較短鏈互補的1 μ Μ的 捕獲鏈。2)，在ATP(lmM)和MgCl2(10mM)存在下，添加到所述底物中的解旋酶（ΙΟΟηΜ)連 接到所述熒光底物的5'尾部，沿著所述主鏈移動，并如圖所示置換所述互補鏈。3)，一旦具 有BHQ-1的互補鏈被完全取代，則主鏈上的熒光素發(fā)熒光。4)，過量的捕獲鏈優(yōu)先與互補鏈 DNA退火以防止初始底物重新退火與丟失熒光。B)在含有100mM到1M不同濃度的KC1的緩 沖液（（RecD Nth 和 Dth SEQ 序號 28 和 35, lOOmM Η印es ρΗ8· 0, ImM ATP, 10mMMgCl2, 50nM 熒光底物DNA, 1 μ M捕獲DNA)中RecD解旋酶活性的初始速率的圖。
[0026] 圖5是解旋酶控制的DNA事件的實例，使用了不同的Tral解旋酶，TrwC Cba(+140mV, 10mM Η印es, ρΗ8· 0, 0· 6nM, 400merDNASEQ ID NO:172, 172 和 173, ΙΟΟηΜ TrwC Cba SEQ ID 65, ImM DTT, ImM ATP, ImM MgCl2)。上部），獲得 TrwC Cba 400mer DNA 事件的 電流vs.時間的分圖。所述開孔電流為?100pA。DNA在施加的電勢（+140mV)的力的作用 下被所述納米孔捕獲。具有酶連接的DNA產(chǎn)生長的模塊（在該條件下，在?25pA)，隨著酶 移動DNA穿過所述孔，該模塊顯示出逐步變化的電流。下部），底部的線條顯示DNA事件的 放大的分圖，表明了隨著DNA被牽拉穿過所述孔時序列依賴性電流的逐步變化。
[0027] 圖6顯示了使用TrwC (Atr) (SEQ ID N0:144)解旋酶時解旋酶控制的DNA運動的 電流線條的實例。
[0028] 圖7顯示了使用TrwC (Sal) (SEQ ID N0:140)解旋酶時解旋酶控制的DNA運動的 電流線條的實例。
[0029] 圖8顯示了使用TrwC (Ccr) (SEQ ID N0:136)解旋酶時解旋酶控制的DNA運動的 電流線條的實例。
[0030] 圖9顯示了使用TrwC (Eco) (SEQ ID N0:74)解旋酶時解旋酶控制的DNA運動的電 流線條的實例。
[0031] 圖10顯示了使用TrwC (Oma) (SEQ ID N0:106)解旋酶時解旋酶控制的DNA運動的 電流線條的實例。
[0032] 圖11顯示了使用TrwC (Afe) (SEQ ID N0:86)解旋酶時解旋酶控制的DNA運動的 電流線條的實例。底部的線條顯示了解旋酶控制的DNA運動的放大區(qū)域。
[0033] 圖12顯示了使用TrwC (Mph) (SEQ ID N0:94)解旋酶時解旋酶控制的DNA運動的 電流線條的實例。底部的線條顯示了解旋酶控制的DNA運動的放大區(qū)域。
[0034] 序列表的說明
[0035] SEQ ID N0:1顯示了密碼子優(yōu)化的、編碼MS-B1突變MspA單體的多核苷酸序列。 該突變?nèi)鄙傩盘栃蛄胁⒑邢铝型蛔儯篋90N, D91N, D93N, D118R, D134R和E139K。
[0036] SEQ ID N0:2顯示了 MspA單體的MS-B1突變的成熟形式的氨基酸序列。該突變?nèi)?少信號序列并含有下列突變：D90N, D91N, D93N, D118R, D134R和E139K。
[0037] SEQ ID N0:3 顯示 了編碼 α -溶血素-Ε111Ν/Κ147Ν( α -HL-NN ;Stoddart 等 人，PNAS, 2009 ; 106 (19) : 7702-7707)的一個亞基的多核苷酸序列。
[0038] SEQ ID N0:4顯示了 a-HL-NN的一個亞基的氨基酸序列。
[0039] SEQ ID Ν0:5 到 SEQ ID Ν0:7 顯示了 MspB, C 和 D 的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID N0:8 顯不了類 RecD 模序（RecD-like motif) I 的序列。
[0041] SEQ ID N0:9,10和11顯示了延長的類RecD模序I的序列。
[0042] SEQ ID N0:12 顯示了 RecD 模序 I 的序列。
[0043] SEQ ID N0:13,14和15顯示了延長的RecD模序I的序列。
[0044] SEQ ID N0:16顯示了類RecD模序V的序列。
[0045] SEQ ID N0:17 顯示了 RecD 模序 V 的序列。
[0046] SEQ ID N0:18-45顯示了表5中RecD解旋酶的氨基酸序列。
[0047] SEQ ID NO:46-53 顯示了 MobF 模序 III 的序列。
[0048] SEQ ID NO:54-60 顯示了 MobQ 模序 III 的序列。
[0049] SEQ ID N0:61-171顯不了圖7中所不Tral解旋酶和Tral亞族（subgroup)解旋 酶的氨基酸序列。
[0050] SEQ ID N0:172-182顯示了實例中使用的序列。

【具體實施方式】
[0051] 可以理解公開的產(chǎn)品和方法的不同應(yīng)用可以根據(jù)本領(lǐng)域的具體需求進行調(diào)整。也 可以理解本文中使用的術(shù)語僅僅是為了描述本發(fā)明的【具體實施方式】，不意為對本發(fā)明的限 制。
[0052] 另外，如在說明書和隨附的權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式的"一個"，"該"，"所 述"包括復(fù)數(shù)，除非本文另有明確說明。因此，例如，涉及"一個孔"時包括兩個或多個這樣 的孔，涉及"一個解旋酶"時包括包括兩個或多個這樣的解旋酶，涉及"一個多核苷酸"時包 括兩個或多個多這樣的核苷酸，等。
[0053] 所有在本文--無論前文或后文--中引用的出版物，專利和專利申請，均以全 文參考的方式納入本文中。
[0054] 本發(fā)明的方法
[0055] 本發(fā)明提供了一種表征目標多核苷酸的方法。所述方法包括將所述目標多核苷 酸與跨膜孔和RecD解旋酶接觸，使得所述目標多核苷酸移動穿過所述孔并且所述RecD解 旋酶控制目標多核苷酸穿過所述孔的移動。然后隨著所述多核苷酸相對于所述孔移動，使 用現(xiàn)有技術(shù)已知的標準方法測定目標多核苷酸的一個或多個特征。優(yōu)選隨著所述多核苷 酸相對于所述孔移動測定目標多核苷酸的一個或多個特征。步驟（a)和（b)優(yōu)選在對該 孔施加電勢時實施。如下面進一步詳細描述的，施加的電勢典型地導(dǎo)致在所述孔和解旋 酶之間形成復(fù)合體。施加的電勢可以是電壓電勢。替換的，施加的電勢可以是化學電勢。 其一個例子是橫跨兩性分子層使用鹽梯度。Holden等人，J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27) :8650-5中公開了鹽梯度。
[0056] 在一些情況下，隨著所述多核苷酸相對于所述孔移動，穿過所述孔的電流用于確 定目標多核苷酸的序列。這就是鏈測序。
[0057] 所述方法具有多個優(yōu)勢。首先，本發(fā)明人出乎意料的發(fā)現(xiàn)RecD解旋酶具有出乎意 料的高的鹽耐受性，因此本發(fā)明方法能夠在高的鹽濃度下實施。在鏈測序中，電荷載體，諸 如鹽，是產(chǎn)生導(dǎo)電溶液必須的，所述導(dǎo)電溶液用于施加補償電壓以捕獲和移位目標多核苷 酸并且隨著所述多核苷酸相對于所述孔的移動測定產(chǎn)生的序列依賴性電流變化。因為測量 信號依賴于鹽濃度，因此有利的是使用高的鹽濃度以提高獲得信號的強度。高的鹽濃度提 供了高信噪比，并使得在正常電流波動的背景下，代表核苷酸存在的電流能被識別。對于鏈 測序，超過l〇〇mM的鹽濃度是理想的，例如超過400mM，600mM或800mM的鹽濃度。本發(fā)明人 出乎意料的發(fā)現(xiàn)RecD解旋酶能在非常高的鹽濃度例如1M下有效發(fā)揮作用。本發(fā)明包括能 在超過1M的鹽濃度下例如2M下有效發(fā)揮作用的解旋酶。
[0058] 第二，當施加電壓時，RecD解旋酶能出乎意料的朝兩個方向，即逆著或順著由施加 的電壓產(chǎn)生的電場，移動目標多核苷酸。因此，本發(fā)明的方法可以兩種優(yōu)選方式之一實施。 根據(jù)目標多核苷酸相對于所述孔的運動方向，即逆著或順著所述電場，獲得不同的信號。下 面將對這進行更詳細描述。
[0059] 第三，RecD解旋酶通常一次移動所述目標多核苷酸中的一個核苷酸穿過所述孔。 RecD解旋酶由此可作為單堿基棘齒（ratchet)。當然，這對測序目標多核苷酸是有利的，因 為使用所述孔可以鑒定目標多核苷酸中的基本上全部的核苷酸--如果不是全部的話。
[0060] 第四，RecD解旋酶能控制單鏈多核苷酸和雙鏈多核苷酸的運動。這意味著根據(jù)本 發(fā)明可以表征多種不同的目標多核苷酸。
[0061] 第五，RecD解旋酶表現(xiàn)出非常耐受由施加的電壓產(chǎn)生的電場。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在"解 鏈"狀態(tài)下多核苷酸幾乎不發(fā)生運動。解鏈狀態(tài)通常是在缺乏核苷酸例如缺乏ATP的時候 出現(xiàn)。當解旋酶在解鏈模式下操作時，其作用類似閘（brake)，防止目標序列在施加的電壓 的影響下太快穿過所述孔。這是非常重要的，因為這意味著，當逆著所施加電壓產(chǎn)生的電場 移動多核苷酸時，不會發(fā)生不希望的"向后"運動問題。
[0062] 第六，RecD解旋酶非常容易制備和操控。因此它們非常適合用于直接且便宜的測 序方法。
[0063] 本發(fā)明方法是用于表征目標多核苷酸。多核苷酸，諸如核酸，是一種含有兩個或多 個核苷酸的大分子。所述多核苷酸或核酸可以包含任何核苷酸的任何組合。所述核苷酸可 以是天然存在的或人工合成的。所述目標多核苷酸中的一個或多個核苷酸可以被氧化或甲 基化。所述目標多核苷酸中的一個或多個核苷酸可以被破壞。所述目標多核苷酸中的一個 或多個核苷酸可以被修飾，例如使用標記或標簽。所述目標核苷酸可以包括一個或多個間 隔物。
[0064] 核苷酸通常含有堿基，糖和至少一個磷酸基團。核苷堿基通常是雜環(huán)的。核苷堿 基包括但不局限于，嘌呤和嘧啶，更具體地，腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶和胞嘧啶。 所述糖通常為戊糖。核苷酸糖包括但不局限于，核糖和脫氧核糖。所述核苷酸通常為核糖 核苷酸或脫氧核糖核苷酸。所述核苷酸通常含有單磷酸，二磷酸或三磷酸。磷酸可以連接 在核苷酸的5'或3'端。
[0065] 核苷酸包括但不局限于，腺苷單磷酸（AMP)，鳥苷單磷酸（GMP)，胸苷單磷酸 (TMP)，尿苷單磷酸（UMP)，胞苷單磷酸（CMP)，環(huán)狀腺苷單磷酸（cAMP)，環(huán)狀鳥苷單磷酸 (cGMP)，脫氧腺苷單磷酸（dAMP)，脫氧鳥苷單磷酸（dGMP)，脫氧胸苷單磷酸（dTMP)，脫氧 尿苷單磷酸（dUMP)和脫氧胞苷單磷酸（dCMP)。所述核苷酸優(yōu)選選自AMP，TMP，GMP，CMP，UM P, dAMP，dTMP, dGMP 或 dCMP。
[0066] 核苷酸可以是脫堿基的（即缺少核苷堿基）。
[0067] 所述多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的。至少多核苷酸的一部分優(yōu)選是雙鏈的。
[0068] 所述多核苷酸可以是核酸，諸如脫氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA)。所述目標 多核苷酸可包括與一條DNA鏈雜交的一條RNA鏈。所述多核苷酸可以是本領(lǐng)域已知的任何 人造核酸，諸如肽核酸（PNA)，甘油核酸（GNA)，蘇糖核酸（TNA)，鎖定核酸（LNA)，或其他具 有核苷側(cè)鏈的合成聚合物。
[0069]目標多核苷酸的整體或僅部分可以通過所述方法表征，所述目標多核苷酸可具有 任何長度。例如，所述多核苷酸可以為至少10,至少50,至少100,至少150,至少200,至 少250,至少300,至少400或至少500個核苷酸對的長度。所述核苷酸可以是1000或更 多個核苷酸對，5000或更多個核苷酸對的長度，或者100000或更多個核苷酸對的長度。
[0070] 目標多核苷酸存在于任何合適的樣本中。本發(fā)明通常針對已知含有或懷疑含有目 標多核苷酸的樣本實施。替換的，可以對樣本實施本發(fā)明，以確認所識別的一個或多個目標 多核苷酸，所述目標多核苷酸已知或預(yù)期存在于所述樣本中。
[0071] 所述樣本可以是生物樣本。本發(fā)明可以針對由任何生物體或微生物體獲得或提取 的樣本在體外實施。所述生物體或微生物體通常是古核的（archaean)，原核的或真核的并 通常屬于以下五界中的一個：植物界，動物界，真菌界，無核原生物界和原生生物界。本 發(fā)明可以針對由任何生病毒獲得或提取的樣本在體外實施。所述樣本優(yōu)選為液體樣本。所 述樣本通常包括患者的體液。所述樣本可以是尿液，淋巴液，唾液，粘液或羊水，優(yōu)選血液， 血漿或血清。通常，所述樣本是來自人的，但替換的，其可以是來自其他哺乳動物的，諸如商 購可獲得的家畜諸如馬，牛，羊或豬，或可替換的，為寵物，如貓或狗?？商鎿Q的，源自植物的 樣本通常獲得自經(jīng)濟作物，諸如谷類，豆類，水果或蔬菜，例如小麥，大賣，燕麥，油菜，玉米， 大豆，稻米，香蕉，蘋果，西紅柿，土豆，葡萄，煙草，黃豆，扁豆，甘蔗，可可豆，棉花。
[0072] 所述樣本可以是非生物樣本。所述非生物樣本優(yōu)選為液體樣本。所述非生物樣本 的實例包括外科手術(shù)液體，水諸如飲用水，海水或河水，以及用于實驗室測試的試劑。
[0073] 通常在分析前對所述樣本進行處理，例如，通過離心或通過膜過濾掉不需要的分 子或細胞，諸如紅血細胞。可以在獲取所述樣本后立即進行檢測。通常也可以在分析前儲 存所述樣本，優(yōu)選在低于-70°C儲存。
[0074] 跨膜孔是一種在一定程度上穿過膜的結(jié)構(gòu)，其允許離子諸如水合離子在施加的電 勢的驅(qū)動下穿過所述膜流動或在所述膜內(nèi)流動。所述跨膜孔通常穿過整個膜使得離子可以 從膜的一側(cè)流向膜的另一側(cè)。然而，所述跨膜孔不一定必須穿過所述膜。其可以在一端封 閉。例如，所述孔可以是在所述膜內(nèi)的井（well)，離子可以沿著所述井流動或流進所述井。
[0075] 根據(jù)本發(fā)明可使用任何膜。合適的膜是本領(lǐng)域已知的。所述膜優(yōu)選為兩性分子 層。兩性分子層是一種由具有至少一個親水性部分和至少一個親脂性或疏水性部分的兩性 分子諸如磷脂質(zhì)形成的層。所述兩性分子層可以是單層或雙層。所述兩性分子層通常是一 種平面脂雙層或支撐雙層。
[0076] 所述兩性分子層通常是脂質(zhì)雙分子層。脂質(zhì)雙分子層是細胞膜的模型并被用作多 種實驗研究的優(yōu)良平臺。例如，脂質(zhì)雙分子層能被通過單通道記錄用于對膜蛋白進行體外 研究。替換的，脂質(zhì)雙分子層可以用作生物傳感器以檢測多種物質(zhì)的存在。所述脂質(zhì)雙分 子層可以是任何的脂質(zhì)雙分子層。合適的脂質(zhì)雙分子層包括但不局限于，平面脂質(zhì)雙分子 層，支撐雙分子層或脂質(zhì)體。所述脂質(zhì)雙分子層優(yōu)選為平面脂質(zhì)雙分子層。合適的脂質(zhì)雙 分子層公開在國際申請No. PCT/GB08/000563(公布號TO 2008/102121)，國際申請No. PCT/ GB08/004127(公布號 TO 2009/077734)和國際申請 No. PCT/GB2006/001057(公布號 TO 2006/100484)中。
[0077] 形成脂質(zhì)雙分子層的方法為本領(lǐng)域已知的。合適的方法公開在實施例中。脂質(zhì)雙 分子層通常通過Montal 和 Mueller (Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，1972 ;69:3561-3566)的方 法形成，其中脂質(zhì)單分子層穿過孔的任一側(cè)負載在水溶液/空氣界面上，所述孔垂直于所 述界面。
[0078] 所述Montal&Mueller的方法非常受歡迎，因為其成本經(jīng)濟并是一種相對迅速 的形成具有良好質(zhì)量的適合蛋白質(zhì)孔嵌入的脂質(zhì)雙分子層的方法。其他常規(guī)的用于形 成脂質(zhì)雙分子層的方法包括脂質(zhì)體雙分子層的尖端浸漬（tip-dipping)，涂覆雙分子層 (painting bilayers)和膜片謝（patch-clamping)方法。
[0079] 在一個優(yōu)選實施方式中，所述脂質(zhì)雙分子層如國際申請N〇.PCT/GB08/004127(公 布號W0 2009/077734)所述形成。
[0080] 在另一個優(yōu)選實施方式中，所述膜為固態(tài)層。固態(tài)層不來源于生物體。換句話， 固態(tài)層不是由生物環(huán)境獲得或分離出的，所述生物環(huán)境諸如生物體或細胞或是生物上可 獲得的結(jié)構(gòu)合成制得的變體結(jié)構(gòu)（synthetically manufactured version)。固態(tài)層可 以由有機和無機材料形成，所述有機和無機材料包括但不局限于微電子材料，絕緣材料諸 如Si 3N4，Ai2o3，和Si〇,有機和無機聚合物諸如聚酰胺，塑料諸如Teflon?或彈性體諸如 雙組分加成固化硅橡膠，和玻璃。所述固態(tài)層可以由單原子層諸如石墨烯形成，或者只有 幾個原子厚的層形成。適合的石墨烯層在國際申請No. PCT/US2008/010637 (公布號TO 2009/035647)中公開。
[0081] 所述方法通常使用以下的物質(zhì)進行實施：（i)含有孔的人工兩性分子層，（ii)分 離出的，天然存在的含有孔的脂質(zhì)雙分子層，或（iii)含有孔嵌入其中的細胞。所述方法通 常使用人工兩性分子層諸如人工脂質(zhì)雙分子層實施。所述分子層除孔之外還可以含有其他 跨膜和/或膜內(nèi)蛋白以及其他分子。適合的設(shè)備和條件如下所述。本發(fā)明的方法通常在體 外實施。
[0082] 所述多核苷酸可以偶聯(lián)到所述膜。這可使用任何已知方法完成。如果所述膜是兩 性分子層，諸如脂質(zhì)雙分子層（如上文詳細所述的），所述多核苷酸優(yōu)選可以通過存在于所 述膜中的多肽或存在于所述膜中的疏水錨（anchor)偶聯(lián)到所述膜。所述疏水錨優(yōu)選為脂 質(zhì)，脂肪酸，固醇，碳納米管或氨基酸。
[0083] 所述多核苷酸可以直接偶聯(lián)到所述膜。所述多核苷酸優(yōu)選通過連接體（linker) 偶聯(lián)到膜。優(yōu)選的連接體包括但不局限于，聚合物諸如多核苷酸，聚乙二醇（PEG)和多肽。 如果多核苷酸直接偶聯(lián)到所述膜上，則由于所述膜與所述解旋酶之間的距離，表征不能進 行到所述多核苷酸的末端，將丟失一些數(shù)據(jù)。如果使用連接體，則所述多核苷酸能夠被表征 完全。如果使用連接體，連接體可以在任何位置連接到所述多核苷酸。所述連接體優(yōu)選在 尾部聚合物連接到所述多核苷酸。
[0084] 所述偶聯(lián)可以是穩(wěn)定的或暫時的。對于某些應(yīng)用，暫時性的偶聯(lián)是優(yōu)選的。如果 一個穩(wěn)定的偶聯(lián)分子直接連接在多核苷酸的5'或3'端，則由于所述雙分子層與所述解旋 酶的活性位點之間的距離，表征不能進行到所述多核苷酸的末端，將丟失一些數(shù)據(jù)。如果所 述偶聯(lián)是暫時性的，則當偶聯(lián)的末端隨機的變?yōu)橄鄬τ陔p分子層是自由的狀態(tài)時，所述多 核苷酸能被表征完全。與膜形成穩(wěn)定或暫時性的連接的化學基團在下面更詳細的描述。所 述多核苷酸可以使用所述膽固醇或脂肪酰基鏈暫時性地與兩性分子層諸如脂質(zhì)雙分子層 偶聯(lián)。可以使用任何具有6-30個碳原子長度的脂肪?；?，諸如十六烷酸。
[0085] 在優(yōu)選實施方式中，將所述多核苷酸偶聯(lián)到兩性分子層上。多核苷酸與合成的脂 質(zhì)雙分子層的偶聯(lián)可以預(yù)先用多種不同的栓系策略（tethering strategies)實施。這些 策略綜合在下面的表1中。
[0086] 表 1
[0087]

【權(quán)利要求】
1. 一種表征目標多核苷酸的方法，包括： (a) 將目標多核苷酸與跨膜孔和RecD解旋酶接觸，使得所述目標多核苷酸移動穿過所 述孔并且使所述RecD解旋酶控制所述目標多核苷酸穿過所述孔的移動；以及 (b) 隨著所述多核苷酸相對所述孔移動獲取一個或多個測量值，其中所述測量值代表 所述目標多核苷酸的一個或多個特征并由此表征所述目標多核苷酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一個或多個特征選自（i)所述目標多核苷酸 的長度，（ii)所述目標多核苷酸的相似性，（iii)所述目標多核苷酸的序列，（iv)所述目標 多核苷酸的二級結(jié)構(gòu)以及（v)所述目標多核苷酸是否被修飾。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述目標多核苷酸經(jīng)甲基化，氧化，損傷，用一個 或多個蛋白質(zhì)，或用一個或多個標記物，標簽或間隔物進行修飾。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中所述目標多核苷酸的一個或多個特征通 過電測量和/或光學測量進行測量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述電測量為電流測量，阻抗測量，隧道測量或場 效應(yīng)晶體管（FET)測量。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包括： (a) 將目標多核苷酸與跨膜孔和RecD解旋酶接觸，使得所述目標多核苷酸移動穿過所 述孔并且使所述RecD解旋酶控制所述目標多核苷酸穿過所述孔的移動；和 (b) 隨著所述多核苷酸相對所述孔移動測量穿過所述孔的電流，其中所述電流代表所 述目標多核苷酸的一個或多個特征并由此表征所述目標多核苷酸。
7. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟（b)包括隨著所述多核苷酸移動穿過 所述孔，獲取一個或多個測量值。
8. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述方法進一步包括跨所述孔施加電壓到 以在所述孔和解旋酶之間形成復(fù)合體的步驟。
9. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中至少所述多核苷酸的一部分為雙鏈。
10. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述孔為跨膜蛋白孔或固態(tài)孔。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述跨膜蛋白孔選自溶血素，殺白細胞素，恥 垢分枝桿菌孔蛋白A(MspA),外膜孔蛋白F(OmpF),外膜孔蛋白G(OmpG),外膜磷酯酶A,奈 瑟氏菌自轉(zhuǎn)運脂蛋白（NalP)和WZA。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述跨膜蛋白由下述物質(zhì)形成（a)SEQ ID N0:2 所示的8個相同亞基，或（b) (a)所述亞基的變體，基于氨基酸相似性，該變體中7個亞基中 的一個或多個相比于SEQ ID N0:2的整個序列具有至少50%的同源性并保留有孔活性。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述跨膜蛋白為（a)SEQ ID N0:4所示的7個相 同亞基形成的α-溶血素，或（b)所述亞基的變體，基于氨基酸相似性，該變體中7個亞基 中的一個或多個相比于SEQ ID N0:4的整個序列具有至少50%的同源性并保留有孔活性。
14. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述RecD解旋酶包括： -氨基酸模序 X1-X2_X3-G-X4-X5-X6-X7(SEQ ID 勵:8)，其中乂1為6,3或4，乂2為任意 氨基酸，X3為P，A, S或G，X4為T，A，V，S或C，X5為G或A, X6為K或R且X7為T或S ;和/ 或 -氨基酸模序X1-X2-X3-X4-X5-(X6)3-Q-X7(SEQIDN0:9，SEQIDN0:10和SEQID NO: 11)，其中XI為Y，W或F，X2為A，T，S，M，C或V，X3為任意氨基酸，X4為T或N，X5為 A，T，G，S，V或I，X6為任意氨基酸且X7為G或S。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述RecD解旋酶包括以下模序： (a) GGPGTGKT(SEQ ID N0:19)和 / 或WAVTIHKSQG(SEQ ID N0:20); (b) GGPGTGKS(SEQ ID N0:22)和 / 或YALTVHRAQG(SEQ ID N0:23); (c) GGPGVGKT(SEQ ID N0:26)和 / 或YAISVHKSQG(SEQ ID N0:27); (d) GGPGTGKT(SEQ ID N0:19)和 / 或YCISVHKSQG SEQ ID N0:(29); (e) GGPGVGKT(SEQ ID N0:26)和 / 或YAATIHKSQG(SEQ ID N0:31); (f) GGPGCGKS(SEQ ID N0:33)和 / 或YAMTIHRSQG(SEQ ID N0:34); (g) GGPGTGKS(SEQ ID N0:22)和 / 或YAVSIHKSQG(SEQ ID N0:36); (h) GGPGVGKT(SEQ ID N0:26)和 / 或YATSVHKSQG(SEQ ID N0:38); (i) GGPGTGKT(SEQ ID N0:19)和 / 或YAVSVHKSQG(SEQ ID N0:40); (j) GGPGVGKT(SEQ ID N0:26)和 / 或 YATSIHKSQG(SEQ ID N0:43);或 (k) GGPGTGKS(SEQ ID N0:22)和 / 或YALTVHRGQG(SEQ ID N0:45)。
16. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述RecD解旋酶為表4或5所示的解旋 酶之一或其變體。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述RecD解旋酶包括（a) SEQ ID NO: 18, 21，24 ，25, 28, 30, 32, 35, 37, 39, 41，42和44中任一個所示的序列，或（b) (a)中序列的變體，基于 氨基酸相似性，該變體相比于整個長度的（a)中序列具有至少25%的同源性并保留解旋酶 活性。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項所述的方法，其中所述RecD解旋酶為Tral解旋酶或 Tral亞族解旋酶。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述Tral解旋酶或Tral亞族解旋酶進一步包 括： -氨基酸模序H-(X1)2-X2-R-(X3)5_12-H-X4-H(SEQIDN0 :46到53)，其中X1和X3為任 意氨基酸并且X2和X4相互獨立的選自除了 D，E，K和R以外的任意氨基酸；或者 -氨基酸模序 G-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-H-(X8)6_12-H-X9(SEQ ID N0:54 到 60)，其中 XI，X2, X3, X5, X6, X7和X9相互獨立的選自除了 D，E，K和R以外的任意氨基酸，X4為D或E 且X8為任意氨基酸。
20. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述Tral解旋酶或Tral亞族解旋酶包括以下 的豐吳序： (a) GYAGVGKT(SEQIDN0:62)，YAITAHGAQG(SEQIDN0:63)和HDTSRDQEPQLHTH(SEQID NO:64)； (b) GIAGAGKS(SEQIDN0:66)，YALNVHMAQG(SEQIDN0:67)和HDTNRNQEPNLHFH(SEQID NO:68)； (c) GMGAGKT(SEQ ID N0:70)，YCITIHRSQG(SEQ ID N0:71)和HEDARTVDDIADPQLHTH(SEQ ID NO :72)； (d) GFAGTGKS(SEQIDN0:75)，YATTVHSSQG(SEQIDN0:76)和HETSRERDPQLHTH(SEQID NO :77)； (e) GRAGAGKT(SEQ ID N0:79)，YATTIHKSQG(SEQ ID N0:80)和GMVADWVYHDNPGNPHIH(SEQ ID N0:81)； (f) GAAGTGKT(SEQIDN0:83)，YASTAHKSQG(SEQIDN0:84)和HSTSRAQDPHLHSH(SEQID NO :85)； (g) GHAGAGKT(SEQIDNO:87)，YAGTTHRNQG(SEQIDNO:88)和HASSREQDPQIHSH(SEQID NO :89)； (h) GLAGTGKT(SEQ ID NO:91)，YAVTSHSSQG(SEQ ID NO:92)和HDTARPVNGYMPQLHTH(SEQ ID NO :93)； (i) GPAGAGKT(SEQIDNO:95)，YAITAHRAQG(SEQIDNO:96)和HYDSRAGDPQLHTH(SEQID NO :97)； (j) GWAGVGKT(SEQIDN0:99)，YAVTADHMQG(SEQIDN0:100)和HLCGRLDPQIHNH(SEQID NO:101)； (k) GVAGAGKT(SEQ ID N0:103)，YALTIDSAQG(SEQ ID N0:104)和 HMTS⑶GSPHLHVH(SEQ ID NO:105)； (l) GYAGTGKS(SEQ ID NO :107), YAATIHKAQG(SEQ ID NO : 108)和 GMIADLVNVHWDIGEDGKAKPHAH(SEQ ID NO:109)； (m) GIAGAGKS(SEQIDN0:66)，YALNAHMAQG(SEQIDN0:67)和HDTNRNQEPNLHFH(SEQID N0:111)； (n) GVAGAGKS(SEQIDN0:115)，YALNAHMAQG(SEQIDN0:67)和HDTNRNQEPNAHFH(SEQID NO:116)； (o) GGAGVGKS(SEQ ID N0:118)，YAINVHIAQG(SEQ ID N0:119)和 HDVSRNNDPQLHVH(SEQ ID NO:120)； (p) GIAGAGKS(SEQ ID NO:66)，YALNMHMAQG(SEQ ID NO:122)和HDTSRALDPQGHIH(SEQ ID NO:123)； (q) GVAGAGKS(SEQIDN0:115)，YALNAHMAQG(SEQIDN0:67)和HDTSRALDPQGHIH(SEQID NO:123)； (r) GRAGTGKT(SEQ ID N0:126)，F(xiàn)ASTAHGAQG(SEQ ID N0:127)和HEASRNLDPQLHSH(SEQ ID NO:128)； (s) GYAGTGKT(SEQ ID N0:130)，YAMTSHAAQG(SEQ ID N0:131)和 HDISRDKDPQLHTH(SEQ ID NO:132)； (t) GLAGTGKT(SEQIDN0:91)，YAQTVHASQG(SEQIDN0:134)和HNTSRDLDPQTHTH(SEQID NO:135)； (u) GFAGTAKT(SEQ ID N0:137)，YVQTAFAAQG(SEQ ID N0:138)和HETSRAQDPQLHTH(SEQ ID NO:139)； (v) GYAGTAKT(SEQ ID N0:141)，YVDTAFAAQG(SEQ ID N0:142)和 HGTSRAQDPQLHTH(SEQ ID NO:143)； (w) GYAGTAKT(SEQ ID N0:141)，YASTAFAAQG(SEQ ID N0:145)和 HGTSRALDPQLHSH(SEQ ID NO:146)； (x) GSAGSGKT(SEQ ID NO :148), YAVTSYSAQG(SEQ ID NO : 149)和 HDTARPVGGYAAPQLHTH(SEQ ID NO:150)； (y) GEAGTGKT(SEQ ID N0:153)，YAHTSYKEQG(SEQ ID N0:154)和 HETNRENEPQLHNH(SEQ ID NO:155)； (z) GYAGVAKT(SEQ ID N0:157)，YVLTNYKVQG(SEQ ID N0:158)和 QPSSR 和 PALHTH(SEQ ID NO:159)； (aa)GSAGTGKT(SEQ ID N0:161)，YSLTANRAQG(SEQ ID N0:162)和HSMSRAGDPEMHNH(SEQ ID NO:163)； (bb)AGAGTGKT(SEQ ID N0:165)，YAGTVYAAQG(SEQ ID N0:166)和HYTTRE⑶PNIHTH(SEQ ID NO:167);或 (cc)APAGAGKT(SEQ ID N0:169)，YAVTVHAAQG(SEQ ID N0:170)和HETSRAGDPHLHTH(SEQ ID NO:171)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求18-20任一項所述的方法，其中所述Tral解旋酶或Tral亞族解旋酶 為表6或7所示的解旋酶之一或其變體。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述Tral解旋酶或Tral亞族解旋酶包括（a) SEQ ID N0:61，65, 69, 73, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 112, 113, 114, 117, 121，12 4, 125, 129, 133, 136, 140, 144, 147, 151，152, 156, 160, 164 和 168 中任一個所示的序列，或 (b) (a)中序列的變體，基于氨基酸相似性，該變體相比于整個長度的（a)中序列具有至少 10%的同源性并保留解旋酶活性。
23. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述方法使用至少0. 3M的鹽濃度進行實 施，所述鹽可選的為KC1。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述鹽濃度為至少1.0M。
25. -種形成用于表征目標多核苷酸的傳感器的方法，包括在孔和RecD解旋酶之間形 成復(fù)合體并由此形成用于表征目標多核苷酸的傳感器。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述復(fù)合體通過（a)使所述孔和所述解旋酶在 所述目標多核苷酸的存在下接觸以及（a)跨所述孔施加電勢而形成。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述電勢是電壓電勢或化學電勢。
28. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述復(fù)合體通過將所述孔共價連接到所述解旋 酶而形成。 29. RecD解旋酶在控制目標多核苷酸穿過孔的移動中的應(yīng)用。
30. -種用于表征目標多核苷酸的試劑盒，包括（a)孔和（b)RecD解旋酶。
31. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包括含有兩親分子層的芯 片。
32. -種用于表征樣本中的目標多核苷酸的分析裝置，包括多個孔和多個RecD解旋 酶。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的分析裝置，其中所述分析裝置包括： 傳感器設(shè)備，能支撐多個孔，并能可操作的使用所述孔和解旋酶進行多核苷酸的表 征； 至少一個存儲器，存儲用于進行表征的材料； 流體系統(tǒng)，配置為從至少一個存儲器可控地向所述傳感器設(shè)備提供材料；以及 多個容器，用于接收各樣本，所述流體系統(tǒng)被配置為選擇性地從所述容器向所述傳感 器設(shè)備提供樣本。
34. -種用于表征目標多核苷酸的方法，包括： (a) 將目標多核苷酸與RecD解旋酶接觸使得所述RecD解旋酶控制所述目標多核苷酸 穿過所述孔的移動，以及 (b) )隨著所述RecD解旋酶控制所述目標多核苷酸的運動，獲取一個或多個測量值，其 中所述測量值代表所述目標多核苷酸的一個或多個特征并由此表征所述目標多核苷酸。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中： (a) 所述一個或多個特征如權(quán)利要求2所定義； (b) 所述目標多核苷酸如權(quán)利要求3或9所定義； (c) 所述一個或多個特征如權(quán)利要求4或5所定義的進行測量； (d) 所述RecD為權(quán)利要求14-22任一項所定義；或者 (e) 所述方法如權(quán)利要求23或24所定義的進行實施。 36. RecD解旋酶在表征目標多核苷酸的過程中控制目標多核苷酸的運動中的應(yīng)用。 37. RecD解旋酶在對目標多核苷酸的部分或全部進行測序的過程中控制目標多核苷酸 的運動中的應(yīng)用。
38. -種用于表征樣本中的目標多核苷酸的分析裝置，其特征在于所述分析裝置包括 RecD解旋酶。
39. -種用于表征目標多核苷酸的試劑盒，包括（a)用于表征目標多核苷酸的分析裝 置和（b) RecD解旋酶。
【文檔編號】C12Q1/68GK104126018SQ201280069777
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月29日
【發(fā)明者】露絲·莫伊西, 安德魯·約翰·赫倫, 紹博爾奇·蘇羅爾斯 申請人:牛津納米孔技術(shù)公司