誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題在于提供在癌治療研究和癌治療的藥物開發(fā)研究中有用的、能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞、它們的制造方法、由這些細(xì)胞所誘導(dǎo)的癌細(xì)胞、以及這些細(xì)胞的應(yīng)用。本發(fā)明提供能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于，滿足下述(1)和(2)的條件：(1)具有選自(a)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因或癌相關(guān)基因區(qū)域的甲基化異常(高甲基化或低甲基化)、(b)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因的體細(xì)胞突變或內(nèi)源性癌相關(guān)基因的體細(xì)胞突變、(c)內(nèi)源性癌基因或內(nèi)源性抑癌基因的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(d)內(nèi)源性的癌相關(guān)微小RNA這樣的非編碼RNA的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(e)內(nèi)源性的癌相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(f)內(nèi)源性的癌相關(guān)代謝異常(代謝亢進(jìn)或代謝降低)、或(g)內(nèi)源性的癌相關(guān)糖鏈的異常中的至少1種異常；(2)表達(dá)POU5F1基因、NANOG基因、SOX2基因、ZFP42基因。
【專利說明】誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，涉及具有與癌相關(guān)的基因組的異?；虮碛^遺傳的異常、并且表達(dá)P0U5F1基因(也稱為0CT3/4基因)、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因這4種基因的、能夠在體外(in vitro)增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞、它們的制造方法、從這些細(xì)胞誘導(dǎo)得到的癌細(xì)胞以及這些細(xì)胞的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來，通過以克隆動(dòng)物的創(chuàng)建和胚胎干細(xì)胞(也稱為“ES細(xì)胞”。在本說明書中，以下，記作“胚胎干細(xì)胞”)為代表的干細(xì)胞的研究，開始認(rèn)為能夠?qū)⒈碛^遺傳(DNA甲基化和組蛋白的修飾)重編程(也稱為“初期化”。在本說明書中，以下記作“重編程”。)。實(shí)際上，報(bào)道了如下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在去核的卵細(xì)胞中移植作為癌細(xì)胞的小鼠黑色素瘤細(xì)胞的核，貝U該卵細(xì)胞開始胚胎發(fā)育，從該胚胎所得到的胚胎干細(xì)胞(也稱為“ES細(xì)胞”。)分化成黑素細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)I)。
[0003]最近，有如下報(bào)道:通過0CT3/4基因(有時(shí)也標(biāo)記為“0CT3基因”、“0CT4基因”、或“P0U5F1基因”)、 S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因(專利文獻(xiàn)I)的導(dǎo)入、或者在堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)存在下的0CT3/4基因、S0X2基因和KLF4基因(非專利文獻(xiàn)2)的導(dǎo)入，能夠從人的體細(xì)胞重編程制作稱為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞這樣的與胚胎干細(xì)胞同樣的未分化細(xì)胞(專利文獻(xiàn)2)。已知人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced Pluripotent Stem Cells ；以下也稱為“iPS細(xì)胞”。)具有如下兩個(gè)特征:(1)向能夠成為形成身體的所有細(xì)胞的三胚層的分化多能性，和(2)在人胚胎干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)條件下，維持其未分化性的狀態(tài)，能夠在培養(yǎng)皿中無限傳代培養(yǎng)的增殖能力(自我復(fù)制能力)。并且，該人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞在形態(tài)、基因表達(dá)、細(xì)胞表面抗原、長期增殖能力(自我復(fù)制能力)、畸胎瘤(在體內(nèi)(in vivo)向三胚層的分化)形成能力上，與人胚胎干細(xì)胞非常類似(非專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)4)，此外，還報(bào)道了 HLA的基因型與作為來源細(xì)胞的體細(xì)胞完全相同(非專利文獻(xiàn)4)。可以認(rèn)為，這些細(xì)胞的制作方法，僅通過導(dǎo)入上述基因(即，0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c-MYC基因、或者bFGF存在下的0CT3/4基因、S0X2基因和KLF4基因)，可以使分化后的體細(xì)胞向誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)“重編程”。
[0004]一般而言，基于與癌相關(guān)的基因組的異常和/或表觀遺傳的異常，發(fā)生基因表達(dá)上升?低下或消失這樣的異常，由此，細(xì)胞癌化。因此，可以認(rèn)為，如果使用如上所述的重編程的技術(shù)，將癌細(xì)胞中發(fā)生的各種異常重編程，恢復(fù)為正常的細(xì)胞，消除癌細(xì)胞的性質(zhì)。
[0005]實(shí)際上，最近，在國際干細(xì)胞學(xué)會(huì)(ISSCR)中，發(fā)表了:“在培養(yǎng)皿中對(duì)源自人肝癌細(xì)胞株的癌干細(xì)胞(源自HuH7的CD133陽性細(xì)胞)添加抗癌劑等2種化學(xué)物質(zhì)(非環(huán)式維甲酸和托瑞司他(Tolrestat))，則在2天后，85~90%的癌細(xì)胞變?yōu)檎５母闻K細(xì)胞。此外，如果添加2個(gè)基因(S0X2基因和KLF4基因)和2種化學(xué)物質(zhì)(5-AZAC和TSA)，則變成iPS細(xì)胞，通過向肝細(xì)胞的分化操作程序(Protocol)，成功使所得到的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞(AFP或ALB陽性細(xì)胞)”(非專利文獻(xiàn)5)。另外，報(bào)道了使作為癌細(xì)胞的小鼠黑色素瘤細(xì)胞向誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞重編程的論文(非專利文獻(xiàn)6)、和通過0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c-MYC基因的導(dǎo)入而被重編程的結(jié)果，從具有作為致癌的原因的BCR-ABL酪氨酸激酶活性的慢性髓性白血病(CML)的細(xì)胞株，制作BCR-ABL酪氨酸激酶依賴性消失的iPS細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)7)。此外，還報(bào)道了:在癌細(xì)胞株中導(dǎo)入0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c-MYC基因，通過重編程，耐藥性和腫瘤形成能力消失，但是長期培養(yǎng)后，伴隨導(dǎo)入細(xì)胞的基因組中的外來性c-MYC基因的活性化而發(fā)生癌化(非專利文獻(xiàn)8)。
[0006]然而，自我復(fù)制相關(guān)基因(0CT3/4、S0X2、NANOG、ZFP42等)的表達(dá)未被充分誘導(dǎo)，而將作為致癌原因的c-MYC基因?qū)肓思?xì)胞的基因組(非專利文獻(xiàn)8)中。這樣，賦予基因、化學(xué)物質(zhì)使細(xì)胞恢復(fù)正常的重編程療法被期待參與癌的治療，正在進(jìn)行研究(非專利文獻(xiàn)9)。
[0007]然而，即使癌細(xì)胞被重編程為正常細(xì)胞，為了實(shí)際上實(shí)現(xiàn)癌治療，不僅需要培養(yǎng)皿中、而且需要生物體中的癌細(xì)胞以100%的效率重編程為正常細(xì)胞。而且，一般認(rèn)為即使是由圖像檢查發(fā)現(xiàn)的早期癌也有I億個(gè)癌細(xì)胞，假設(shè)實(shí)現(xiàn)了以99.9%的效率將癌細(xì)胞重編程為正常細(xì)胞，也會(huì)殘留10萬個(gè)癌細(xì)胞，因此如果上述重編程的效率不為100%,則不能說是有效的癌治療方法。
[0008]在以往的癌研究中，使用如下得到的癌細(xì)胞株:將外來性的SV40、HPV的E6基因、E7基因、TERT基因?qū)爰?xì)胞的基因組，通過由強(qiáng)制表達(dá)的細(xì)胞的永生化培養(yǎng)、或者通過將c-MYC基因、RAS基因等癌基因?qū)爰?xì)胞的基因組中進(jìn)行永生化或癌化等構(gòu)建癌細(xì)胞株后，進(jìn)一步用通常的現(xiàn)有培養(yǎng)基培養(yǎng)得到癌細(xì)胞株。
[0009]然而，在不進(jìn)行這樣的基因的導(dǎo)入的情況下，用通常的現(xiàn)有通用培養(yǎng)基構(gòu)建的癌細(xì)胞株中，在長時(shí)間培養(yǎng)中，顯著發(fā)生培養(yǎng)后的人工的(In vitro Artifact)染色體異常(轉(zhuǎn)座、缺失等)、基因組異常(基因突變)或成為基因表達(dá)異常的原因的表觀遺傳的異常(非專利文獻(xiàn)10)。因此，存在如下問題:難以將In vitro Artifact的異常抑制到最小限度，難以將原本在生物體內(nèi)成為致癌或惡性化的原因的癌細(xì)胞中所發(fā)生的突變等的異常原樣保持在細(xì)胞中。這些細(xì)胞株都不是通過在體外使其自我復(fù)制的培養(yǎng)而構(gòu)建、維持的細(xì)胞株。
[0010]在癌治療的研究和癌相關(guān)藥物開發(fā)的研究中，即使分析由這樣的現(xiàn)有的通用培養(yǎng)基長時(shí)間培養(yǎng)的癌細(xì)胞株的基因組異常和表觀遺傳的異常，判別這些異常是在哺乳動(dòng)物的原本生物體內(nèi)作為致癌或惡性化的原因在癌細(xì)胞中發(fā)生的異常，還是在培養(yǎng)中發(fā)生的Invitro Artifact的異常，這特別困難或者不可能，因此，難以根據(jù)這些分析結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹掳┗驉盒曰脑蚪饷?。使用這樣的細(xì)胞進(jìn)行癌治療藥物開發(fā)靶點(diǎn)的探索、癌治療藥候選物的篩選等并不適合。
[0011]另外，盡管作為藥物開發(fā)的靶點(diǎn)，癌干細(xì)胞的存在受到重視，但是新鮮的癌組織所含的癌細(xì)胞為層次性的、且為異質(zhì)的細(xì)胞團(tuán)，因此存在鑒定哪個(gè)癌細(xì)胞為癌干細(xì)胞并不容易的問題。近年來，報(bào)道了用于從癌細(xì)胞株或初代培養(yǎng)癌細(xì)胞鑒定癌干細(xì)胞的研究(非專利文獻(xiàn)11)，但是不僅沒有使單克隆癌干細(xì)胞在體外增殖、實(shí)現(xiàn)長期培養(yǎng)的報(bào)道，而且還沒有關(guān)于使其增殖到在體外應(yīng)用于藥物開發(fā)、或者用于癌研究所必要的數(shù)量的擴(kuò)增培養(yǎng)的技術(shù)的報(bào)道。
[0012]如上所述，作為臨床檢體的癌組織所含的細(xì)胞為異質(zhì)的細(xì)胞團(tuán)，與多種正常細(xì)胞、非癌細(xì)胞和癌細(xì)胞混合存在。同樣地，癌組織所含的癌細(xì)胞為層次性的，還不是克隆性的細(xì)胞團(tuán)(非專利文獻(xiàn)12)。近年來，以新一代的測序儀為代表的能夠提供龐大的分析結(jié)果的大規(guī)模的多層組學(xué)分析風(fēng)靡一時(shí)。然而，在分析對(duì)象為層次性的且不是克隆性的異質(zhì)的癌組織的分析中，作為結(jié)果顯示的是癌細(xì)胞團(tuán)的平均的基因組、或占最多數(shù)的癌細(xì)胞團(tuán)的基因組的數(shù)據(jù)，其結(jié)果，存在無法解明是否來自在癌組織中存在的作為惡性化(發(fā)展、轉(zhuǎn)移)的原因的癌細(xì)胞的問題。
[0013]最近，能夠進(jìn)行單一細(xì)胞的基因組分析、僅少數(shù)存在的癌細(xì)胞的指紋分析(Profiling)也成為可能(非專利文獻(xiàn)13)。如果能夠從同一癌組織分析多個(gè)單一細(xì)胞,則即使癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和顯示耐藥性的克隆為少數(shù)的亞群，也能夠進(jìn)行監(jiān)測或檢出(非專利文獻(xiàn)14)。即，對(duì)于癌細(xì)胞在積累體細(xì)胞突變中不是乘客突變(二次突變)而是驅(qū)動(dòng)突變(致癌、惡性化中，決定性的體細(xì)胞性突變)的解明有用。
[0014]然而，目前為止，對(duì)應(yīng)分析結(jié)果的能夠擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞尚未構(gòu)建，不可能用于功能分析、XENOGRAFT模型、藥物開發(fā)中的靶點(diǎn)/化合物篩選。
[0015]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0016]專利文獻(xiàn)
[0017]專利文獻(xiàn)1:日本特開2008-283972
[0018]專利文獻(xiàn)2:日本特開2008-307007
[0019]非專利文獻(xiàn)
[0020]非專利文獻(xiàn)1:Hochedl inger K, Jaenisch R et al.，GenesDev.，18:1875-85，2004.
[0021]非專利文獻(xiàn)2:Nakagawa M, Yamanaka S et al., Nat B1technol.2008，26:101-6.
[0022]非專利文獻(xiàn)3:Takahashi K, Yamanaka S et al., Cell 2007，131，861-872.
[0023]非專利文獻(xiàn)4:Masaki H, Ishikawa T et al., Stem Cell Res.2008, I, 105-115.
[0024]非專利文獻(xiàn)5:國際干細(xì)胞研究學(xué)會(huì)，2009年，抄錄號(hào)1739(285頁)
[0025]非專利文獻(xiàn)6:Utikal J, et al., J Cell Sc1.2009122 (Pt 19):3502-3510.
[0026]非專利文獻(xiàn)7:Carette JE et al., Blood 2010 Mar 16.
[0027]非專利文獻(xiàn)8:Nagai KI et al., B1chem B1phys Res Commun.201OApr 7.
[0028]非專利文獻(xiàn)9:Miyoshi et al., Proc Natl Acad Sci USA.2010，107:40-5.
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[0030]非專利文獻(xiàn)11:Visvader JE, Lindeman GJ, Nat Rev Cancer.2008, 8:755-68.
[0031]非專利文獻(xiàn)12 Stephens P.J.，et al.，Cell 2011，144:27-40
[0032]非專利文獻(xiàn)13:Navin N.and Hicks J., Genome Med 2011, 3:31
[0033]非專利文獻(xiàn)14:Navin N.，Nature 2011，472:90-94


【發(fā)明內(nèi)容】

[0034]發(fā)明所要解決的課題
[0035]本發(fā)明的目的在于，開發(fā)不用特定分子標(biāo)記捕捉也不經(jīng)由向免疫不全小鼠的移植就能夠擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)、以及構(gòu)建具有醫(yī)學(xué)信息的源自人的癌組織或非癌組織(臨床檢體)的克隆性的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞。
[0036]如果可以獲得這樣的從同一癌組織中得到的多個(gè)克隆性的癌細(xì)胞團(tuán)，則能夠作為由于量的限制而以單一細(xì)胞無法實(shí)施的利用新一代測序儀進(jìn)行的基因組分析(全基因組、外顯子組、激酶組等的靶點(diǎn)序列)、基因組范圍的DNA甲基化分析、表達(dá)窮舉分析(mRNA和miRNA)、蛋白質(zhì)的表達(dá)窮舉分析、糖鏈窮舉分析、代謝組分析等多層組學(xué)分析、利用陣列比較基因組雜交(Array based comparative genomic hybridizat1n,陣列 CGH)的拷貝數(shù)突變(CNV)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定試驗(yàn)等多種分析的對(duì)象。
[0037]而且，通過對(duì)多個(gè)克隆性的癌細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行分析，有望實(shí)現(xiàn)作為其來源的層次性且多克隆性的異質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的癌的原因、發(fā)展的機(jī)理、驅(qū)動(dòng)突變的解明。從這樣的源自同一癌組織中得到的多個(gè)單一細(xì)胞的單克隆性的癌細(xì)胞團(tuán)能夠用于進(jìn)一步的細(xì)胞功能分析、XENOGRAFT模型、藥物開發(fā)中的靶點(diǎn)/化合物篩選。將來如果從人種、性、年齡、腫瘤不同的供體組織構(gòu)建這樣的克隆性的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞并建庫，則通過與供體的診療信息、病理學(xué)信息、免疫學(xué)的數(shù)據(jù)整合，就能夠構(gòu)建具有醫(yī)學(xué)信息和多層組學(xué)分析的信息的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的生物樣本庫，有望在革新的癌治療藥的開發(fā)中應(yīng)用。
[0038]因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在提供一種具有與癌相關(guān)的基因組的異?；虮碛^遺傳的異常、能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其能夠在癌治療藥物開發(fā)靶點(diǎn)、癌治療藥候選物、癌診斷藥物等的篩選、癌疫苗的制作、癌動(dòng)物模型的制作等中使用。
[0039]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供制造具有與癌相關(guān)的基因組的異?；虮碛^遺傳的異常的、能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的方法。
[0040]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供使用本發(fā)明的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的癌治療藥物開發(fā)靶點(diǎn)的篩選、癌治療藥候選物的篩選、癌診斷藥物的篩選等的篩選方法。
[0041]本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供使用本發(fā)明的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的癌疫苗的制作方法。
[0042]本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供將本發(fā)明的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞移植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的癌動(dòng)物模型的制作方法。
[0043]用于解決課題的方法
[0044]即，在本發(fā)明的第一方式中，提供一種能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于，滿足下述⑴和⑵的條件:
[0045](I)具有選自(a)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因或癌相關(guān)基因區(qū)域的甲基化異常(高甲基化或低甲基化)、(b)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因的體細(xì)胞突變或內(nèi)源性癌相關(guān)基因的體細(xì)胞突變、(c)內(nèi)源性癌基因或內(nèi)源性抑癌基因的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(d)內(nèi)源性的癌相關(guān)微小RNA這樣的非編碼RNA的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(e)內(nèi)源性的癌相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)異常、(f)內(nèi)源性的癌相關(guān)代謝異常(代謝亢進(jìn)或代謝降低)、(g)內(nèi)源性的癌相關(guān)糖鏈的異常、(h)內(nèi)源性基因組DNA基因拷貝數(shù)多態(tài)性異常、或者(i)誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的內(nèi)源性基因組DNA微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性中的至少I種的異常；
[0046](2)表達(dá)I個(gè)或多個(gè)自我復(fù)制相關(guān)基因。
[0047]在本發(fā)明的第二方式中，提供由采集自具有與癌相關(guān)的基因組異?；虮碛^遺傳異常的哺乳動(dòng)物的癌組織的非胚胎性的原料體細(xì)胞制造能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞方法。提供能夠在體外增殖的本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的制造方法，該方法的特征在于，進(jìn)行對(duì)由采集自發(fā)生癌的哺乳動(dòng)物的新鮮癌組織或非癌組織制備的原料體細(xì)胞導(dǎo)入選自P0U5F1基因、S0X2基因、c-Myc基因、KLF4基因、LIN28基因和NANOG基因中的I~6種基因、選自 P0U5F1 RNA、S0X2 RNA、c-Myc RNA、KLF4 RNA、LIN28 RNA 和 NANOG RNA 中的 I ~6種RNA、或選自P0U5F1蛋白質(zhì)、S0X2蛋白質(zhì)、c_Myc蛋白質(zhì)、KLF4蛋白質(zhì)、LIN28蛋白質(zhì)和NANOG蛋白質(zhì)中的I~6種蛋白質(zhì)的任一種的工序。其中，細(xì)胞為“非胚胎性”的情況，是指不是胚胎干細(xì)胞、胚胎、生殖細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞的細(xì)胞。
[0048]在該方法中，特征在于，新鮮癌組織為實(shí)體癌的新鮮癌組織或腫瘤的新鮮癌組織，而且原料體細(xì)胞為從選自胃癌、大腸癌、乳腺癌、腎癌、肺癌、肝癌中的新鮮癌組織制備得到的。
[0049]在本發(fā)明的第三方式中，提供一種篩選方法，其是選自癌治療藥物開發(fā)靶點(diǎn)的篩選方法、癌治療藥(候選物)的篩選方法和癌診斷藥物(候選物)的篩選方法中的I種篩選方法，該篩選方法的特征在于，使用本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞。
[0050]在本發(fā)明的第四方式中，提供以使用本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞為特征的癌疫苗的制作方法，在本發(fā)明第五方式中，提供以將本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞移植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中為特征的癌動(dòng)物模型的制作方法。
[0051]發(fā)明的效果
[0052]根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)嵤┱T導(dǎo)惡性干細(xì)胞、誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的制造方法、以及它們的細(xì)胞的應(yīng)用，該誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的特征在于，(I)具有(a)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因或癌相關(guān)基因區(qū)域的甲基化異常(高甲基化或低甲基化)、(b)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因的體細(xì)胞突變或內(nèi)源性癌相關(guān)基因的體細(xì)胞突變、(c)內(nèi)源性癌基因或內(nèi)源性抑癌基因的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(d)內(nèi)源性的癌相關(guān)微小RNA這樣的非編碼RNA的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(e)內(nèi)源性的癌相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)異常、(f)內(nèi)源性的癌相關(guān)代謝異常(代謝亢進(jìn)或代謝降低)、(g)內(nèi)源性的癌相關(guān)糖鏈的異常、(h)內(nèi)源性基因組DNA基因拷貝數(shù)多態(tài)性異常、或者(i)誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的內(nèi)源性基因組DNA微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性等的與癌相關(guān)基因組的異?；虮碛^遺傳的異常，并且表達(dá)P0U5F1 (也稱為0CT3/4。)基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因等自我復(fù)制相關(guān)基因。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053]圖1是表示發(fā)生誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的內(nèi)源性基因組DNA微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性的圖。
[0054]圖2是表示進(jìn)行了誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的代謝產(chǎn)物的主成分分析的結(jié)果的圖。
[0055]圖3是表示進(jìn)行了誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的癌相關(guān)糖鏈的分析的結(jié)果的圖。
[0056]圖4是表示誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞以與誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞相同程度地表達(dá)ES細(xì)胞特異性基因的圖。
[0057]本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞不僅原樣維持原料體細(xì)胞具有的⑴(a)~⑴⑴等的異常，而且一并具有作為干細(xì)胞的特征之一的能夠增殖的特征。因此，本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞能夠長期傳代培養(yǎng)，容易誘導(dǎo)成具有分化細(xì)胞的性質(zhì)的癌細(xì)胞，因此，在醫(yī)學(xué)研究、例如多層組學(xué)分析(表觀基因組、基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、糖組、代謝組等的分析)、分子細(xì)胞生物學(xué)的分析、藥物開發(fā)篩選(化合物篩選、靶點(diǎn)篩選(siRNA、反義DNA/RNA或cDNA篩選))以及癌診斷藥物的篩選方法等的篩選方法、癌疫苗的制作方法、癌動(dòng)物模型的制作等癌治療的研究和癌相關(guān)藥物開發(fā)的研究中非常有用。

【具體實(shí)施方式】
[0058]現(xiàn)在，確立了與體細(xì)胞被重編程為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞同樣，通過對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行重編程，能夠?qū)┘?xì)胞恢復(fù)成正常的細(xì)胞的概念。
[0059]對(duì)此，本發(fā)明的
【發(fā)明者】建立了如下假說:通常，新鮮癌組織和初代培養(yǎng)癌細(xì)胞團(tuán)都不均一，從新鮮癌組織或初代培養(yǎng)癌細(xì)胞團(tuán)得到的細(xì)胞中，混合存在有具有與正常細(xì)胞相同或近似的基因組或表觀遺傳的正常細(xì)胞或非癌細(xì)胞，因此，不是癌細(xì)胞被重編程為正常細(xì)胞，而是新鮮癌組織和初代培養(yǎng)癌細(xì)胞團(tuán)中混合存在的正常細(xì)胞被誘導(dǎo)成正常的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，而另一方面從在新鮮癌組織和初代培養(yǎng)癌細(xì)胞團(tuán)中存在的具有與癌相關(guān)的基因組異常或表觀遺傳的異常等的癌細(xì)胞誘導(dǎo)為具有與癌相關(guān)的基因組異?；虮碛^遺傳的異常等的惡性干細(xì)胞。
[0060]基于該假說，可以認(rèn)為，應(yīng)用P0U5FI基因、S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因的導(dǎo)入、或者P0U5F1基因、S0X2基因和KLF4基因的導(dǎo)入等的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞制作技術(shù)，能夠制作能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，另外，如果使所得到的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞在體外增殖，則能夠使基因組地或表觀遺傳地維持了原料體細(xì)胞所具有的作為癌的惡性性質(zhì)的、能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞在培養(yǎng)條件下無限增殖。
[0061]因此，本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)這樣的假設(shè)深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為原料體細(xì)胞，使用具有與癌相關(guān)的基因組的異?；虮碛^遺傳的異常等的體細(xì)胞，使P0U5F1基因、KLF4基因、S0X2基因、c-MYC基因、LIN28基因、NANOG基因等的至少一種自我復(fù)制相關(guān)基因或其翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)存在于原料體細(xì)胞內(nèi)，由此能夠得到能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞。
[0062]這樣，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了維持在生物體內(nèi)原料體細(xì)胞具有的作為癌的惡性的性質(zhì)、即、原料體細(xì)胞具有的與癌相關(guān)的基因組的異?；虮碛^遺傳的異常，并且能夠增殖能夠長期傳代培養(yǎng)的本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)了能夠?qū)⑦@些細(xì)胞在體外應(yīng)用于藥物開發(fā)或癌研究，從而完成了本發(fā)明。
[0063]下面，對(duì)本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞、它們的制造方法、從這些細(xì)胞所誘導(dǎo)的癌細(xì)胞、以及這些細(xì)胞的應(yīng)用詳細(xì)地進(jìn)行說明。
[0064]誘導(dǎo)惡件干細(xì)朐
[0065]本發(fā)明的第一方式中提供的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞為能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于，滿足下述⑴和⑵的條件:
[0066](I)具有選自(a)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因或癌相關(guān)基因區(qū)域的甲基化異常(高甲基化或低甲基化)、(b)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因的體細(xì)胞突變或內(nèi)源性癌相關(guān)基因的體細(xì)胞突變、(c)內(nèi)源性癌基因或內(nèi)源性抑癌基因的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(d)內(nèi)源性的癌相關(guān)微小RNA這樣的非編碼RNA的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(e)內(nèi)源性的癌相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)異常、(f)內(nèi)源性的癌相關(guān)代謝異常(代謝亢進(jìn)或代謝降低)、(g)內(nèi)源性的癌相關(guān)糖鏈的異常、(h)內(nèi)源性基因組DNA基因拷貝數(shù)多態(tài)性異常、或者(i)誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的內(nèi)源性基因組DNA微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性中的至少I種的異常；并且
[0067](2)表達(dá)I個(gè)或多個(gè)自我復(fù)制相關(guān)基因。
[0068]其中，本發(fā)明的“誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞”是指為癌細(xì)胞且具有作為干細(xì)胞的功能(實(shí)質(zhì)上至少具有增殖能力或自我復(fù)制能力)的細(xì)胞。該【技術(shù)領(lǐng)域】中一般稱為“干細(xì)胞”的情況是指具有能夠分化成特定細(xì)胞的能力(分化能力)和即使經(jīng)過細(xì)胞分裂也能夠維持與原始的細(xì)胞相同性質(zhì)(分化能力)的能力(自我復(fù)制能力)的細(xì)胞。其中，稱為自我復(fù)制能力的情況是指能夠分裂制作出相同細(xì)胞的能力，本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的情況是指能夠增殖培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)至少3天。
[0069]誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的與癌相關(guān)的基因組的異?；虮碛^遺傳的異常
[0070]本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的特征在于具有與癌相關(guān)的基因組的異?；虮碛^遺傳的異常。具體而言，本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的特征在于:(I)具有選自(a)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因或癌相關(guān)基因區(qū)域的甲基化異常(高甲基化或低甲基化)、(b)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因的體細(xì)胞突變或內(nèi)源性癌相關(guān)基因的體細(xì)胞突變、(c)內(nèi)源性癌基因或內(nèi)源性抑癌基因的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(d)內(nèi)源性的癌相關(guān)微小RNA這樣的非編碼RNA的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(e)內(nèi)源性的癌相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)異常、(f)內(nèi)源性的癌相關(guān)代謝異常(代謝亢進(jìn)或代謝降低)、(g)內(nèi)源性的癌相關(guān)糖鏈的異常、(h)內(nèi)源性基因組DNA基因拷貝數(shù)多態(tài)性異常、或者(i)誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的內(nèi)源性基因組DNA微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性中的至少I種異常。除此以外，本發(fā)明的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞還可以具有與誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞相比的代謝組的異常(例如，與誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞相比顯示糖酵解系統(tǒng)的亢進(jìn))、與誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞相比的糖酵解系統(tǒng)的亢進(jìn)、或核型的異常或染色體異常。這些異常為直接繼承了作為本發(fā)明的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞來源的原料體細(xì)胞本來所具有的異常。
[0071]在本發(fā)明中，能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞可以具有(I) (a)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因或癌相關(guān)基因區(qū)域的甲基化異常。作為發(fā)生這樣的甲基化異常的內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因或癌相關(guān)基因區(qū)域以及具有甲基化發(fā)生可能性的部位，作為例子，能夠列舉以下的表1所不的基因組DNA (GeneSymbol_N0.)的存在于基因組起始點(diǎn)的位直到基因組終止點(diǎn)的位置的CpG的胞嘧啶堿基(C)的5位的甲基化異常。
[0072][表1]
[0073]表1:發(fā)生條件(I) (a)甲基化異常的抑癌基因或癌相關(guān)基因區(qū)域
[0074]

【權(quán)利要求】
1.一種能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于，滿足下述(I)和(2)的條件: (1)具有選自(a)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因或癌相關(guān)基因區(qū)域的甲基化異常(高甲基化或低甲基化)、(b)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因的體細(xì)胞突變或內(nèi)源性癌相關(guān)基因的體細(xì)胞突變、(c)內(nèi)源性癌基因或內(nèi)源性抑癌基因的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(d)內(nèi)源性的癌相關(guān)微小RNA這樣的非編碼RNA的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(e)內(nèi)源性的癌相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)、(f)內(nèi)源性的癌相關(guān)代謝異常(代謝亢進(jìn)或代謝降低)、(g)內(nèi)源性的癌相關(guān)糖鏈的異常、(h)內(nèi)源性基因組DNA基因拷貝數(shù)多態(tài)性異常、或者(i)誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的內(nèi)源性基因組DNA微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性中的至少I種異常；并且 (2)表達(dá)P0U5F1基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因這4種基因。
2.如權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述(I) (a)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因或癌相關(guān)基因區(qū)域的甲基化異常為以下的表1所示的基因組DNA(基因符號(hào)_N0.)的存在于從基因組起始點(diǎn)的位置到基因組終止點(diǎn)的位置的CpG的胞嘧啶堿基(C)的5位的甲基化異常。 [表1] 表1:發(fā)生條件(I) (a)甲基化異常的抑癌基因或癌相關(guān)基因區(qū)域













3.如權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述(I) (b)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因的體細(xì)胞突變或內(nèi)源性癌相關(guān)基因的體細(xì)胞突變包括乘客突變。
4.如權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述(I) (b)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因的體細(xì)胞突變或內(nèi)源性癌相關(guān)基因的體細(xì)胞突變?yōu)轵?qū)動(dòng)突變。
5.如權(quán)利要求1、3或4所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述(I) (b)內(nèi)源性基因組DNA的抑癌基因的體細(xì)胞突變或內(nèi)源性癌相關(guān)基因的體細(xì)胞突變在以下的表2所記載的基因中的至少一個(gè)中發(fā)生，或者在以下的表3所記載的基因的氨基酸突變(突變ID)中的至少一個(gè)中顯示， [表2] 表2:發(fā)生條件⑴(b)體細(xì)胞突變的抑癌基因或內(nèi)源性癌相關(guān)基因







[表3] 表3:發(fā)生條件(I) (b)體細(xì)胞突變的抑癌基因或內(nèi)源性癌相關(guān)基因




6.如權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述(I) (c)內(nèi)源性癌基因或內(nèi)源性抑癌基因的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)是在(I) (b)中所記載的基因的至少一個(gè)中發(fā)生的。
7.如權(quán)利要求6所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 內(nèi)源性癌基因或內(nèi)源性抑癌基因的表達(dá)異常為內(nèi)源性癌基因的表達(dá)上升或內(nèi)源性抑癌基因的表達(dá)降低/消失。
8.如權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述⑴⑷內(nèi)源性的癌相關(guān)微小RNA這樣的非編碼RNA的表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)是在以下的微小RNA中所列舉的微小RNA中的至少一個(gè)微小RNA中發(fā)生的。[表4] 表4:發(fā)生條件⑴(d)表達(dá)異常的癌相關(guān)微小RNA
9.如權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述(I) (e)內(nèi)源性的癌相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)異常是與誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞相比，顯示蛋白質(zhì)的表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失，或者通過表達(dá)癌特異抗原而發(fā)生的。
10.如權(quán)利要求9所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 顯示表達(dá)異常(表達(dá)上升或表達(dá)降低/消失)的蛋白質(zhì)或癌特異抗原為Muc-1、VEGF-C,HnRNP A2/B1、E2F3、MAGE A4、MMP_9、細(xì)胞角蛋白-19、E2Fl、c-kit、Muc_4、細(xì)胞角蛋白-20、c-met、L-myc、MDRUhCG β、COX-2、CA125、MAGE A12、NSE、c_myc、CD44、Her2/Neu、RCASU bcl-2、FGFR2、HIF-1 a、GPC3、細(xì)胞周期蛋白 Dl、mdm2、細(xì)胞角蛋白-7、MMP-2、生存素、hTERT、Gli1、甲狀腺球蛋白、VEGF-A、AFP、CEA、CGA、EGFR、MAGE Al、MAGE A3/A6、Muc-7、ProGRP, PSA、SCC, IGF2、DLK-1 或 WT-1 中的任一種。
11.如權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述(I) (f)內(nèi)源性的癌相關(guān)代謝異常(代謝亢進(jìn)或代謝降低)與誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞相比，顯示代謝組的異常，或者與誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞相比，顯示糖酵解系統(tǒng)的亢進(jìn)。
12.如權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述(I) (g)內(nèi)源性的癌相關(guān)糖鏈的異常是與誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞相比，顯示糖鏈的表達(dá)異常，或者通過表達(dá)癌特異性的糖鏈而發(fā)生的。
13.如權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述(I) (h)內(nèi)源性基因組DNA基因拷貝數(shù)多態(tài)性異常是與基準(zhǔn)細(xì)胞的基因組DNA相比較，被檢細(xì)胞中顯示基因拷貝數(shù)增加或減少。
14.如權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述(I) (i)誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的內(nèi)源性基因組DNA微衛(wèi)星中的不穩(wěn)定性是作為錯(cuò)配修復(fù)基因的MLHl、MSH2、MSH6、PMS2中的微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù)的突變。
15.如權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 所述(2)的基因的表達(dá)量與作為對(duì)照的未分化的胚胎干細(xì)胞的基因的表達(dá)量相比較，為1/8到8倍。
16.如權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞，其特征在于: 細(xì)胞為人的細(xì)胞。
17.—種能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的制造方法，其特征在于:進(jìn)行誘導(dǎo)工序，使由采集自發(fā)生癌的哺乳動(dòng)物的新鮮癌組織或非癌組織制備的原料體細(xì)胞處于選自P0U5F1基因、S0X2基因、c-Myc基因、KLF4基因、LIN28基因和NANOG基因中的I~6種基因的基因產(chǎn)物在所述原料體細(xì)胞內(nèi)存在的狀態(tài)。
18.如權(quán)利要求17所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的制造方法，其特征在于: 基因產(chǎn)物為基因、RNA或蛋白質(zhì)中的任一種。
19.如權(quán)利要求17或18所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的制造方法，其特征在于: 新鮮癌組織為實(shí)體癌的新鮮癌組織或腫瘤的新鮮癌組織。
20.如權(quán)利要求17~19中任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的制造方法，其特征在于: 原料體細(xì)胞為從選自胃癌、大腸癌、乳腺癌、腎癌、肺癌、肝癌中的新鮮癌組織制備得到的。
21.—種癌細(xì)胞，其特征在于: 其是從權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞中誘導(dǎo)而成的。
22.—種篩選方法，其是選自癌治療藥物開發(fā)靶點(diǎn)的篩選方法、癌治療藥候選物的篩選方法和癌診斷藥物的篩選方法中的I種，該篩選方法的特征在于: 使用權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞或者權(quán)利要求21所述的癌細(xì)胞。
23.如權(quán)利要求22所述的篩選方法，其特征在于: 利用siRNA、cDNA、微小RNA、反義RNA/DNA等核酸、低分子化合物、肽、抗體中的任一種或者它們的組合來進(jìn)行。
24.一種癌疫苗的制作方法，其特征在于: 使用權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞或者權(quán)利要求21所述的癌細(xì)胞。
25.一種癌動(dòng)物模型的制作方法，其特征在于: 將權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞或者權(quán)利要求21所述的癌細(xì)胞移植到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中。
26.—種通過使用權(quán)利要求1所述的能夠在體外增殖的誘導(dǎo)惡性干細(xì)胞的組學(xué)分析進(jìn)行的、癌的特征性的甲基化表型、突變表型、驅(qū)動(dòng)突變或藥物開發(fā)靶點(diǎn)的鑒定方法。
27.如權(quán)利要求26所述的鑒定方法，其特征在于: 組學(xué)分析選自表觀基因組分析、基因組分析、轉(zhuǎn)錄組分析、蛋白質(zhì)組分析、糖組分析或代謝組分析。
28.由權(quán)利要求26或27所述的鑒定方法鑒定的、癌的特征性的甲基化表型、突變表型、驅(qū)動(dòng)突變或藥物開發(fā)靶點(diǎn)。
29.針對(duì)權(quán)利要求28所述的癌的特征性的甲基化表型、突變表型、驅(qū)動(dòng)突變或藥物開發(fā)靶點(diǎn)的醫(yī)藥品候選物。
30.如權(quán)利要求29所述的醫(yī)藥品候選物，其特征在于: 其為siRNA 、cDNA、微小RNA、反義RNA/DNA等核酸、低分子化合物、肽、抗體。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK104080907SQ201280067113
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月30日
【發(fā)明者】石川哲也 申請人:日本國立癌癥研究中心, Lsip基金運(yùn)營聯(lián)合公司