用于降低非特異性擴(kuò)增的方法和試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于核酸擴(kuò)增的方法和試劑。與使用未經(jīng)修飾的寡核苷酸進(jìn)行的擴(kuò)增相比較，使用含有N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸進(jìn)行的擴(kuò)增和檢測(cè)可以導(dǎo)致更少的涉及探針的非特異性擴(kuò)增，可能這是由于在模板中大量N2-芐基-dG小溝結(jié)合劑的存在防止通過(guò)DNA聚合酶的互補(bǔ)鏈的延伸。
【專利說(shuō)明】用于降低非特異性擴(kuò)增的方法和試劑
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和核酸化學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，它涉及用于改進(jìn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的可靠性的方法和試劑。
[0002]發(fā)明背景
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的發(fā)明使得核酸序列的體外擴(kuò)增成為可能。PCR在美國(guó)專利號(hào) 4，683，195 ;4，683，202 ；和 4，965，188 ；Saiki 等人，1985，Science 230:1350-1354 ；Mullis 等人，1986, Cold Springs Harbor Symp.Quant.Biol.51:263-273 ;以及 Mullis 和Faloona, 1987，Methods Enzymo1.155:335-350中描述。PCR的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用在文獻(xiàn)中廣泛描述。例如，一系列 PCR相關(guān)主題在 PCR Technology - principles and applications for DNAamplification, 1989, (H.A.Erlich編輯)Stockton Press, New York ；PCR Protocols: A guideto methods and applications, 1990, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego ；和 PCR Strategies, 1995, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego 中討論。商業(yè)供應(yīng)商例如Applied Biosystems (Foster City, CA)銷(xiāo)售PCR試劑和公開(kāi)PCR方案。 [0003]自從核酸擴(kuò)增的原始出版物以后，多種基于引物的核酸擴(kuò)增方法已得到描述，包括但不限于鏈置換測(cè)定(Walker 等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:392-396，Walker 等人，1992，Nucleic Acids Res.20:1691-1696 和美國(guó)專利號(hào) 5，455，166)和基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)，包括美國(guó)專利號(hào)5，437，990 ;5，409，818 ;和5，399,491中所述的方法；轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS ) (Kwoh 等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:1173-1177);和自主序列復(fù)制(3SR) (Guatelli 等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 87:1874-1878和 WO 92/08800)。擴(kuò)增系統(tǒng)的調(diào)查在 Abramson 和 Myers, 1993, Current Opinion inBiotechnology 4:41-47 中提供。
[0004]基于引物的擴(kuò)增反應(yīng)的特異性在很大程度上依賴引物雜交和延伸的特異性。在典型擴(kuò)增中使用的高溫下，引物僅與預(yù)期靶序列雜交。然而，擴(kuò)增反應(yīng)混合物通常在室溫下組合，遠(yuǎn)低于確保引物雜交特異性所需的溫度。在此類較不嚴(yán)格的條件下，引物可以與其他僅部分互補(bǔ)的核酸序列或與其他引物非特異性結(jié)合，并且起始不希望的延伸產(chǎn)物的合成，其可以沿靶序列擴(kuò)增。非特異性引物延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增可以與所需靶序列的擴(kuò)增競(jìng)爭(zhēng)，并且可以顯著降低所需序列的擴(kuò)增效率。
[0005]一種經(jīng)常觀察到的類型的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物是被稱為“引物二聚體”的模板不依賴性擴(kuò)增反應(yīng)假象(artifact)。引物二聚體是這樣的雙鏈片段，其長(zhǎng)度通常接近于兩條引物長(zhǎng)度總和，并且看起來(lái)當(dāng)一條引物在另一條引物上延伸時(shí)發(fā)生。所得到的延伸產(chǎn)物形成不希望的模板，因?yàn)槠涠涕L(zhǎng)度，所以所述不希望的模板被有效擴(kuò)增。
[0006]非特異性擴(kuò)增可以通過(guò)在反應(yīng)開(kāi)始前降低引物延伸產(chǎn)物形成而降低。在被稱為“熱啟動(dòng)”方案的一種方法中，一種或多種關(guān)鍵試劑從反應(yīng)混合物中扣留，直至溫度足夠升高以提供所需雜交特異性時(shí)。其中反應(yīng)管在初始高溫溫育步驟后打開(kāi)并加入缺少的試劑的手動(dòng)熱啟動(dòng)方法是費(fèi)力的，并且增加反應(yīng)混合物污染的風(fēng)險(xiǎn)。或者，熱敏感材料例如蠟可以用于分開(kāi)或隔離反應(yīng)組分，如美國(guó)專利號(hào)5，411，876和Chou等人，1992，Nucl.Acids Res.20 (7):1717-1723中所述。在這些方法中，高溫反應(yīng)前溫育熔化熱敏感材料，由此允許試劑混合。
[0007]在反應(yīng)開(kāi)始前降低引物延伸產(chǎn)物形成的另一種方法依賴DNA聚合酶的熱可逆失活。美國(guó)專利號(hào)5，773，258和5，677，152描述了通過(guò)改性劑基團(tuán)(modifier group)的共價(jià)連接可逆修飾的DNA聚合酶。失活的DNA聚合酶在高溫下溫育導(dǎo)致改性劑(modifier)-酶鍵的斷裂，由此使酶再活化。
[0008]DNA聚合酶通過(guò)DNA聚合酶特異性抗體的非共價(jià)可逆抑制在美國(guó)專利號(hào)5，338，671 中描述。
[0009]非特異性擴(kuò)增還可以使 用美國(guó)專利號(hào)5，418，149中描述的方法，通過(guò)在反應(yīng)開(kāi)始前酶促降解形成的延伸產(chǎn)物而降低。新近合成的延伸產(chǎn)物的降解通過(guò)下述實(shí)現(xiàn):將dUTP和UNG摻入反應(yīng)混合物內(nèi)，并且在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)前，使反應(yīng)混合物在45-60°C下溫育。引物延伸導(dǎo)致形成含尿嘧啶DNA，其在擴(kuò)增前條件下由UNG降解。該方法的缺點(diǎn)是延伸產(chǎn)物的降解與延伸產(chǎn)物的形成競(jìng)爭(zhēng)，并且非特異性引物延伸產(chǎn)物的消除可能是較不完全的。該方法的優(yōu)點(diǎn)是作為來(lái)自先前反應(yīng)的污染引入反應(yīng)混合物內(nèi)的含尿嘧啶DNA也被降解，并且因此該方法還降低PCR由來(lái)自先前反應(yīng)的擴(kuò)增核酸污染的問(wèn)題。
[0010]在反應(yīng)開(kāi)始前降低引物延伸產(chǎn)物形成的另一種方法依賴于使用在3’端處或附近通過(guò)將基團(tuán)加入環(huán)外胺(exocyclic amine)而修飾的引物,如美國(guó)專利號(hào)6，001，611中所述。
[0011]在本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的分子生物學(xué)和核酸化學(xué)的常規(guī)技術(shù)在文獻(xiàn)中充分說(shuō)明。參見(jiàn)例如，Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York ；01igonucleotide Synthesis (M.J.Gait,編輯，1984) ；Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames 和 S.J.Higgins.編輯，1984) ；PCRTechnology - principles and applications for DNA amplification, 1989, (H.A.Erlich編輯)Stockton Press, New York ；PCR Protocols: A guide to methods and applications,1990, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego ;和 PCR Strategies, 1995, (M.A.1nnis 等人編輯)Academic Press, San Diego。
[0012]發(fā)明概述
本發(fā)明基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn):在某些擴(kuò)增反應(yīng)中，特別是在含有多條引物和探針用于擴(kuò)增和檢測(cè)多種靶核酸的反應(yīng)(例如多重PCR反應(yīng))中，一條或多條探針可能充當(dāng)可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的模板，所述非特異性擴(kuò)增依次又產(chǎn)生假陽(yáng)性的信號(hào)。為了降低PCR中基于探針的非特異性擴(kuò)增，可以使用干擾DNA聚合酶活性但仍能夠與互補(bǔ)核苷酸堿基配對(duì)的小溝改性劑。一個(gè)小溝改性劑的此類實(shí)例是脫氧鳥(niǎo)苷類似物，N2-芐基鳥(niǎo)苷(N2-芐基-dG)，其是如本文描述的本發(fā)明的主題。
[0013]因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及在采用以模板依賴性方式的引物延伸的測(cè)定中，防止與模板核苷酸序列雜交的引物寡核苷酸通過(guò)DNA聚合酶延伸的方法，其包括將小溝結(jié)合劑摻入模板核苷酸序列上，其中所述引物寡核苷酸不能被延伸超出小溝結(jié)合劑位置多于2個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，小溝結(jié)合劑是經(jīng)修飾的核苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的核苷是N2-芐基-脫氧鳥(niǎo)苷(N2-芐基-dG)。
[0014]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及降低或防止在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中核酸的非特異性擴(kuò)增的方法，其包括提供能夠擴(kuò)增靶核酸序列的至少一對(duì)引物寡核苷酸；提供摻入小溝結(jié)合劑的探針寡核苷酸，當(dāng)引物寡核苷酸與探針寡核苷酸雜交時(shí)，所述小溝結(jié)合劑阻斷引物寡核苷酸通過(guò)DNA聚合酶延伸超出小溝結(jié)合劑位置多于2個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，小溝結(jié)合劑是經(jīng)修飾的核苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的核苷是N2-芐基-脫氧鳥(niǎo)苷(N2-芐基-dG)。
[0015]本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng)混合物，其包含至少一對(duì)引物寡核苷酸和至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸。
[0016]本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及用于核酸擴(kuò)增的試劑盒，其包含至少一對(duì)引物寡核苷酸、至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸、至少一種核苷酸摻入生物催化劑、核苷三磷酸、適合于通過(guò)所述核苷酸摻入生物催化劑的核酸擴(kuò)增的緩沖液、和用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增的一套說(shuō)明書(shū)。
[0017]附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示(A) N2-芐基脫氧鳥(niǎo)苷(N2-芐基-dG)的結(jié)構(gòu)和(B) N2-芐基脫氧鳥(niǎo)苷(N2-芐基-dG)和脫氧胞嘧唳(deoxycytosine) (dC)之間的堿基配對(duì)。
[0018]是使用含有N2-芐基-dG的模板核酸的引物延伸阻斷的圖示:(A)顯示不含修飾的模板，(B)和(C)顯示具有修飾的模板，其中X是N2-芐基-dG。
[0019]圖3顯示在O分鐘(A)和5分鐘(B)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)施例1的引物延伸反應(yīng)的結(jié)果。
[0020]Si顯示針對(duì)三種測(cè)試寡核苷酸，一種未經(jīng)修飾的對(duì)照寡核苷酸和具有與對(duì)照寡核苷酸相同的序列但在N-4或N-9位置處具有N2-芐基-dG修飾的兩種寡核苷酸的互補(bǔ)寡核苷酸的熔解溫度。
[0021]S5顯示與具有相同序列的對(duì)照TaqMan?探針相比較，含有N2-芐基-dG殘基的TaqMane探針的切割效率。
[0022]發(fā)明詳述 定義
除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。在描述和請(qǐng)求保護(hù)本發(fā)明中，將使用下述定義。
[0023]術(shù)語(yǔ)“核酸”指核苷酸(例如核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核苷酸類似物等)聚合物，并且包含脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA-RNA雜交物、寡核苷酸、多核苷酸、適體、肽核酸(PNA)、PNA-DNA綴合物、PNA-RNA綴合物等，其包含以線性(linear)或分支(branched)方式共價(jià)連接在一起的核苷酸。核酸一般是單鏈或雙鏈的，并且一般含有磷酸二酯鍵，盡管在一些情況下，包括可以具有替代骨架的核酸類似物，包括例如磷酰胺(Beaucage 等人 (1993) Tetrahedron 49 (10): 1925)；硫代憐酸酯(Mag 等人(1991)Nucleic Acids Res.19:1437 ;和美國(guó)專利號(hào) 5，644，048)、二硫代磷酸酯(Briu 等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111:2321 )、O-甲基亞憐酸胺(0-methyIphophoroamidite)連接(參見(jiàn)Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford UniversityPress (1992))、和肽核酸骨架和連接(參見(jiàn) Egholm (1992) J.Am.Chem.Soc.114:1895)。其他類似物核酸包括具有帶正電荷骨架的類似物核酸(Denpcy等人(1995) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 92: 6097);非離子骨架的類似物核酸(美國(guó)專利號(hào)5，386，023，5，637，684，5，602，240，5，216，141和4，469,863)和非核糖骨架的類似物核酸，包括在美國(guó)專利號(hào)5，235，033和5，034，506中描述的類似物核酸。含有一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義內(nèi)(參見(jiàn)Jenkins等人(1995)Chem.Soc.Rev.第169-176頁(yè)),并且類似物還在例如Rawls，C & E News 1997年6月2日，第35頁(yè)中描述。可以完成磷酸核糖骨架的這些修飾，以促進(jìn)另外部分例如標(biāo)記的添加，或以改變此類分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。
[0024]除了一般在核酸中發(fā)現(xiàn)的天然存在的雜環(huán)堿基(例如腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)外，核苷酸類似物也可以包括非天然存在的雜環(huán)堿基，例如在如Seela等人(1999)Helv.Chim.Acta 82:1640中所述的那些。在核苷酸類似物中使用的某些堿基充當(dāng)熔解溫度(Tm)改性劑。例如，這些中的一些包括7-脫氮嘌呤(例如7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮腺嘌呤等)、吡唑并[3，4-d]嘧啶、丙炔基-dN(例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等，參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5，990，303。其他代表性雜環(huán)堿基包括例如次黃嘌呤、肌苷、黃嘌呤；以下堿基的8-氮雜衍生物:2_氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤；以下堿基的7-脫氮-8-氮雜衍生物:腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤；6_氮雜胞苷；5_氟胞苷；5_氯胞苷；5-碘胞苷；5_溴胞苷；5-甲基胞苷；5_丙炔基胞苷；5_溴乙烯基尿嘧啶；5_氟尿嘧啶；5_氯尿嘧啶；5_碘尿嘧啶；5_溴尿嘧啶；5_三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。
[0025]“核苷”指包含與糖部分(核糖或脫氧核糖)、糖部分的衍生物、或糖部分的功能等同物(例如碳環(huán))共價(jià)連接的堿基或堿性基團(tuán)(包含至少一個(gè)同素環(huán)、至少一個(gè)雜環(huán)、至少一個(gè)芳基，等等(and/or the like))的核酸組分。例如，當(dāng)核苷包括糖部分時(shí)，堿基一般連接至該糖部分的I’-位置。如上所述，堿基可以是天然存在的堿基或非天然存在的堿基。示例性核苷包括核糖核苷、脫氧核糖核苷、雙脫氧核糖核苷和碳環(huán)核苷。 [0026]“核苷酸”指核苷的酯，例如核苷的磷酸酯，其具有共價(jià)連接至核苷糖部分的5’位置的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)磷酸基。
[0027]“嘌呤核苷酸”指包含嘌呤堿基的核苷酸，而“嘧啶核苷酸”指包含嘧啶堿基的核苷酸。
[0028]“經(jīng)修飾的核苷酸”指罕見(jiàn)或較少的核酸堿基、核苷酸和常規(guī)堿基或核苷酸的修飾、衍生或類似物，并且包括具有經(jīng)修飾的堿基部分和/或經(jīng)修飾的糖部分的合成核苷酸(參見(jiàn) Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology,第 26卷(Suhier AgrawaI,編輯，Humana Press, Totowa,N.J., (1994));和 Oligonucleotides andAnalogues, A Practical Approach (Fritz Eckstein,編輯，IRL Press, Oxford UniversityPress, Oxford)。
[0029]“寡核苷酸”指包括至少兩個(gè)，但一般為5-50個(gè)核苷酸且更一般為15-35個(gè)核苷酸的核酸聚合物。寡核苷酸的確切大小通常取決于多種因素，包括寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適方法進(jìn)行制備，包括例如合適序列的克隆和限制性消化，或通過(guò)諸如下述方法的直接化學(xué)合成:Narang等人(1979) Meth.Enzymol.68:90-99 的憐酸三酯法；Brown 等人(1979) Meth.Enzymol.68:109-151 的憐酸二酯法；Beaucage 等人(1981) Tetrahedron Lett.22:1859-1862 的二乙基亞憐酸胺法；Matteucci等人(1981 )J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191的三酯法；自動(dòng)合成法；美國(guó)專利號(hào)4，458，066的固體載體法或本領(lǐng)域已知的任何其他化學(xué)方法。[0030]“Watson-Crick堿基配對(duì)”或簡(jiǎn)寫(xiě)的“堿基配對(duì)”指在雙鏈核酸分子內(nèi)的“常規(guī)的”氫鍵成鍵。Watson-Crick堿基配對(duì)是腺嘌呤和胸腺嘧啶之間、鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶之間、腺嘌呤和尿嘧啶之間、以及這些堿基的類似物之間的氫鍵成鍵。
[0031 ] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“雜交”和“退火”等等可互換使用，并且指一種多核苷酸與另一種多核苷酸(通常為反向平行的多核苷酸)的堿基配對(duì)相互作用，其導(dǎo)致通常稱為雜交復(fù)合物的雙鏈體或其他更高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。反向平行的多核苷酸分子之間的一級(jí)相互作用通常為堿基特異性的，例如A/T和G/C，通過(guò)Watson/Crick和/或Hoogsteen型氫鍵成鍵。不需要兩種多核苷酸在其全長(zhǎng)上具有100%互補(bǔ)性以實(shí)現(xiàn)雜交。在一些方面，雜交復(fù)合物可以由分子間相互作用形成，或者，可以由分子內(nèi)相互作用形成。
[0032]如本文使用的,術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增(amplification)”、“擴(kuò)增(amplifying)”等等一般指導(dǎo)致分子或相關(guān)分子組的拷貝數(shù)中的增 加的任何過(guò)程。當(dāng)它應(yīng)用于多核苷酸分子時(shí)，擴(kuò)增意指通常從少量多核苷酸(例如病毒基因組)開(kāi)始產(chǎn)生多核苷酸分子或多核苷酸分子的部分的多個(gè)拷貝，其中擴(kuò)增材料(例如病毒PCR擴(kuò)增子)通常是可檢測(cè)的。多核苷酸的擴(kuò)增包含多個(gè)化學(xué)和酶促過(guò)程。在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)反應(yīng)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)反應(yīng)或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)過(guò)程中，由一個(gè)或少數(shù)拷貝的模板DNA分子生成多個(gè)DNA拷貝是擴(kuò)增形式。擴(kuò)增并不限于起始分子的嚴(yán)格復(fù)制。例如，使用RT-PCR由樣品中有限量的病毒RNA生成多重cDNA分子是擴(kuò)增形式。此外，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程期間由單一 DNA分子生成多重RNA分子也是擴(kuò)增形式。
[0033]在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增任選隨后為另外的步驟，例如但不限于標(biāo)記、測(cè)序、純化、分離、雜交、大小分辨、表達(dá)、檢測(cè)和/或克隆。
[0034]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“聚合酶鏈反應(yīng)”(PCR)指本領(lǐng)域眾所周知的用于增加樣品中的靶多核苷酸區(qū)段的濃度的擴(kuò)增方法，其中該樣品可以是單一多核苷酸種類，或多種多核苷酸。一般地，PCR過(guò)程由下述組成:將摩爾過(guò)量的兩種或更多種可延伸的寡核苷酸引物引入包含一種或多種所需靶序列的反應(yīng)混合物內(nèi)，其中該引物與雙鏈靶序列的相反鏈互補(bǔ)。對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施在DNA聚合酶的存在下的熱循環(huán)程序，導(dǎo)致側(cè)翼為DNA引物的所需靶序列的擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄酶PCR (RT-PCR)是使用RNA模板和逆轉(zhuǎn)錄酶、或具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶的PCR反應(yīng)，以首先在DNA依賴性DNA聚合酶引物延長(zhǎng)的多個(gè)循環(huán)之前生成單鏈DNA分子。多重PCR指通常通過(guò)在單一反應(yīng)中包括多于兩條引物，在單一反應(yīng)中產(chǎn)生多于一種擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR反應(yīng)。廣泛多樣的PCR應(yīng)用的方法是本領(lǐng)域廣泛已知的，并且在許多來(lái)源例如 AusubeI等人(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology, Section 15, John Wiley& Sons, Inc., New York (1994)中描述。
[0035]“引物核酸”或“引物”是可以與模板核酸雜交且允許使用核苷酸摻入生物催化劑的鏈延伸或延長(zhǎng)的寡核苷酸。盡管有時(shí)利用其他引物長(zhǎng)度，但引物一般范圍為15-35個(gè)核苷酸。短引物核酸一般利用更冷的溫度，以與模板核酸形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。與模板核酸的子序列至少部分互補(bǔ)的引物核酸一般足以與模板核酸雜交以發(fā)生延伸。然而，延伸的成功通常需要在引物的3’端處更大的互補(bǔ)性(即與模板的更少錯(cuò)配)。需要時(shí)，引物核酸可以通過(guò)摻入標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，所述標(biāo)記可通過(guò)放射學(xué)、光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)技術(shù)檢測(cè)。
[0036]“延伸的引物”指一個(gè)或多個(gè)另外的核苷酸已加入其中的引物?！耙镅由臁笔橇硗獾暮塑账嵬ㄟ^(guò)其加入引物中的酶的作用。
[0037]“模板核酸”、“模板”或“靶”指引物核酸在合適條件下可以與之雜交且延伸的核酸。在核酸擴(kuò)增的背景下，“靶”優(yōu)選是雙鏈核酸的區(qū)域，由與至少兩條引物序列至少部分互補(bǔ)的序列及間插序列組成。靶還可以是單鏈核酸，由與一條引物至少部分互補(bǔ)的序列和與第二條引物部分相同的序列組成。模板核酸可以作為分離的核酸片段存在或可以是大核酸片段的部分。靶核酸可以衍生自或分離自基本上任何來(lái)源，例如培養(yǎng)的微生物、未培養(yǎng)的微生物、復(fù)雜的生物混合物、組織、血清、古老的或保存的組織或樣品、環(huán)境分離物等。進(jìn)一步地，模板核酸任選包括或來(lái)源于cDNA、RNA、基因組DNA、克隆的基因組DNA、基因組DNA文庫(kù)、酶促斷裂的DNA或RNA、化學(xué)斷裂的DNA或RNA、物理斷裂的DNA或RNA等。模板核酸還可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)化學(xué)合成。
[0038]如本文使用的，術(shù) 語(yǔ)“探針”通常指能夠與目的靶核酸雜交的多核苷酸。通常但非唯一地，探針與合適標(biāo)記或報(bào)道分子部分結(jié)合，使得探針(和因此其靶)可以得到檢測(cè)、顯現(xiàn)、測(cè)量和/或定量。標(biāo)記探針的檢測(cè)系統(tǒng)包括但不限于熒光檢測(cè)、熒光猝滅(例如當(dāng)使用FRET對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)時(shí))、酶促活性、吸光度、分子質(zhì)量、放射性、發(fā)光或允許報(bào)道分子(例如當(dāng)報(bào)道分子是抗體時(shí))的特異性結(jié)合的結(jié)合特性。在一些實(shí)施方案中，探針可以是抗體而不是多核苷酸，其對(duì)于目的核酸核苷酸序列具有結(jié)合特異性。不旨在本發(fā)明限制于任何具體標(biāo)記探針或探針檢測(cè)系統(tǒng)。在探針中使用的多核苷酸來(lái)源不受限制，并且可以在非酶促系統(tǒng)中合成產(chǎn)生，或可以是使用生物(例如酶促)系統(tǒng)(例如在細(xì)菌細(xì)胞中)產(chǎn)生的多核苷酸(或多核苷酸的部分)。
[0039]通常，探針與核酸中含有的特定靶序列充分互補(bǔ)，以在所選雜交條件例如但不限于嚴(yán)格雜交條件下與靶序列形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。在充分嚴(yán)格的雜交條件下使用探針進(jìn)行的雜交測(cè)定允許選擇性檢測(cè)特定靶序列。
[0040]如本文使用的，如果在引物序列和靶序列之間存在的錯(cuò)配數(shù)目小于引物序列和樣品中可能存在的非靶序列之間存在的錯(cuò)配數(shù)目，則引物對(duì)于模板序列是“特異性的”。雜交條件可以選擇為僅在存在的錯(cuò)配數(shù)目不多于引物序列和靶序列之間存在的錯(cuò)配數(shù)目時(shí)，在其下形成穩(wěn)定雙鏈體的條件。在此類條件下，引物可以僅與靶序列形成穩(wěn)定雙鏈體。因此，在含有靶弓丨物結(jié)合位點(diǎn)的那些靶序列的適當(dāng)嚴(yán)格擴(kuò)增下使用靶特異性引物。序列特異性擴(kuò)增條件的使用使得能夠特異性擴(kuò)增含有確切互補(bǔ)的引物結(jié)合位點(diǎn)的那些靶序列。
[0041]術(shù)語(yǔ)“非特異性擴(kuò)增”指除靶序列外的核酸序列的擴(kuò)增，其產(chǎn)生于引物與除靶序列外的序列雜交并且隨后充當(dāng)引物延伸的底物。引物與非靶序列的雜交被稱為“非特異性雜交”，并且可以在較低溫度、降低的嚴(yán)格性、預(yù)擴(kuò)增條件過(guò)程中發(fā)生。
[0042]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增子”指在特定靶核酸擴(kuò)增后產(chǎn)生的多核苷酸分子(或共同地多種分子)。用于生成擴(kuò)增子的擴(kuò)增方法可以是任何合適方法，最通常地，例如通過(guò)使用PCR方法。擴(kuò)增子通常但非唯一地是DNA擴(kuò)增子。擴(kuò)增子可以是單鏈或雙鏈的，或在其以任何濃度比的混合物中。
[0043]如本文使用的，表達(dá)“擴(kuò)增子累積的實(shí)時(shí)檢測(cè)”指當(dāng)一種或多種擴(kuò)增子產(chǎn)生(通常通過(guò)PCR)時(shí)，一種或多種特定擴(kuò)增子的檢測(cè)和通常的其定量，而無(wú)需在擴(kuò)增完成后的檢測(cè)或定量步驟。術(shù)語(yǔ)“實(shí)時(shí)PCR”或“動(dòng)態(tài)PCR”指在PCR中生成的擴(kuò)增子的實(shí)時(shí)檢測(cè)和/或定量。[0044]擴(kuò)增子累積的實(shí)時(shí)檢測(cè)的常見(jiàn)方法是通過(guò)5’ -核酸酶測(cè)定，也稱為熒光5’ -核酸酶測(cè)定，例如 TaqMan 分析；參見(jiàn)，Holland 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88:7276-7280(1991);和 Heid 等人，Genome Research 6:986-994 (1996)。在 TaqMan PCR 程序中，兩種寡核苷酸引物用于生成對(duì)PCR反應(yīng)特異性的擴(kuò)增子。設(shè)計(jì)第三寡核苷酸(TaqMan探針)與位于兩種PCR引物之間的擴(kuò)增子中的核苷酸序列雜交。該探針可以具有無(wú)法通過(guò)PCR反應(yīng)中使用的DNA聚合酶延伸的結(jié)構(gòu)，并且通常(但不一定)由彼此緊密接近的熒光報(bào)道染料和猝滅劑部分共標(biāo)記。當(dāng)熒光劑和猝滅劑緊密接近時(shí)，如它們?cè)谔结樕蠒r(shí)，來(lái)自報(bào)道染料的發(fā)射由猝滅部分猝滅。在一些情況下，該探針可以僅由熒光報(bào)道染料或另一種可檢測(cè)部分標(biāo)記。
[0045]TaqMan PCR反應(yīng)使用熱穩(wěn)定的DNA依賴性DNA聚合酶，其具有5’ _3’核酸酶活性。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中，DNA聚合酶的5’-3’核酸酶活性切割以模板依賴性方式與擴(kuò)增子雜交的標(biāo)記探針。所得的探針片段從引物/模板復(fù)合物中解離，并且報(bào)道染料隨后免于猝滅劑部分的猝滅效應(yīng)。對(duì)于合成的每個(gè)新擴(kuò)增子分子釋放大約一分子的報(bào)道染料，并且未猝滅的報(bào)道染料的檢測(cè)提供數(shù)據(jù)定量解釋的基礎(chǔ)，使得釋放的熒光報(bào)道染料的量與擴(kuò)增子模板的量直接成比例。
[0046]TaqMan測(cè)定數(shù)據(jù)的一個(gè)量度通常表示為閾值循環(huán)(CT )。熒光水平在每個(gè)PCR循環(huán)過(guò)程中進(jìn)行記錄，并且與擴(kuò)增反應(yīng)中的那個(gè)點(diǎn)擴(kuò)增的產(chǎn)物量成比例。當(dāng)熒光信號(hào)首先記錄為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的時(shí)，或其中熒光信號(hào)超過(guò)一些其他任意水平(例如任意熒光水平，或AFL)的PCR循環(huán)是閾值循環(huán)(CT )。
[0047]5’ -核酸酶測(cè)定的方案和試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且在多個(gè)來(lái)源中描述。例如，5’-核酸酶反應(yīng)和探針在下述中描述:于2001年4月10日授予Gelfand等人,名稱為“HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM”的美國(guó)專利號(hào)6，214，979 ;于1998年9月8日授予 Gelfand 等人，名稱為 “REACTION MIXTURES FOR DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACIDS”的美國(guó)專利號(hào)5,804，375 ;于1996年I月30日授予Gelfand等人，名稱為“NUCLEIC ACIDDETECTION BY THE 5’ -3’ EXONUCLEASE ACTIVITY OF POLYMERASES ACTING ON ADJACENTLYHYBRIDIZED OLIGONUCLEOTIDES” 的美國(guó)專利號(hào) 5，487，972 ;和于 1993 年 5 月 11 日授予Gelfand 等人，名稱為 “HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM USING THE NUCLEASE ACTIVITY OF ANUCLEIC ACID POLYMERASE” 的美國(guó)專利號(hào) 5，210, 015。
[0048]實(shí)時(shí)擴(kuò)增子檢測(cè)的方法中的變化也是已知的，并且特別地，當(dāng)5’ -核酸酶探針替換為雙鏈DNA嵌入染料時(shí)，導(dǎo)致依賴擴(kuò)增反應(yīng)中存在的雙鏈擴(kuò)增子量的熒光，參見(jiàn)例如于2001 年 I 月 9 日授予 Hi guchi，名稱為 “METHODS AND DEVICES FOR HEM0GENE0US NUCLEICACID AMPLIFICATION AND DETECTOR”的美國(guó)專利號(hào) 6，171,785 ;和于 1999 年 11 月 30 日授予Higuchi，名稱為 “HOMOGENEOUS METHODS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTION”的美國(guó)專利號(hào)5，994，056。
[0049]TaqMan? PCR可以使用商購(gòu)可得的試劑盒和設(shè)備進(jìn)行，所述設(shè)備例如ABI PRISMs7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, Calif.)、 或LightCycIer? (Roche Applied Sciences, Mannheim,德國(guó))。在優(yōu)選實(shí)施方案中，5’ 核酸酶測(cè)定程序在實(shí)時(shí)定量PCR裝置例如ABI PRISMs 7700 Sequence Detection System上運(yùn)行。該系統(tǒng)由熱循環(huán)儀、激光器、電荷耦合器件(CCD)、照相機(jī)和計(jì)算機(jī)組成。該系統(tǒng)擴(kuò)增在熱循環(huán)儀上的96孔微量滴定板形式中的樣品。在擴(kuò)增過(guò)程中，激光誘導(dǎo)的熒光信號(hào)對(duì)于所有96孔通過(guò)光纖電纜實(shí)時(shí)收集，并且在CCD照相機(jī)上檢測(cè)。該系統(tǒng)包括用于運(yùn)行儀器和分析數(shù)據(jù)的軟件。
[0050]如本文使用的，“基因”指與生物功能相關(guān)的DNA的任何區(qū)段。因此，基因包括編碼序列并任選包括編碼序列表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列。
[0051]當(dāng)另外的核苷酸例如通過(guò)核苷酸摻入生物催化劑在核酸的3’端處摻入核酸內(nèi)時(shí)，核酸被“延伸”或“延長(zhǎng)”。
[0052]“部分(moiety) ”或“基團(tuán)(group) ”指某些事物例如分子分裂成的部分之一(例如官能團(tuán)、取代基等)。例如，核苷酸一般包含堿基基團(tuán)(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶或類似物)、糖部分、和一個(gè)或多個(gè)磷酸基。
[0053]“芐基”指具有式C6H5CH2-的單價(jià)芳香族基團(tuán)，并且可與術(shù)語(yǔ)“苯基甲基”互換使用。
[0054]“基因型”指細(xì)胞或個(gè)體或者細(xì)胞或個(gè)體的組的全部或部分遺傳組成。例如，基因型包括存在于給定基因座上或分布在基因組中的特定突變和/或等位基因(例如多態(tài)性，例如單核苷酸多態(tài)性(SNP)等)?！盎蚍中汀敝笢y(cè)定細(xì)胞或個(gè)體的基因型的測(cè)定。
[0055]“核苷酸摻入生物催化劑”或“核苷酸摻入酶”指催化核苷酸摻入核酸內(nèi)的催化劑(或酶)。示例性核苷酸摻入酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒末端轉(zhuǎn)移酶等。
[0056]“熱穩(wěn)定酶”指 當(dāng)將其置于高溫下所選的時(shí)間段時(shí)是穩(wěn)定的(即抵抗斷裂或變性)且保留足夠催化活性的酶。例如，當(dāng)將其置于高溫下雙鏈核酸變性所需的時(shí)間時(shí)，熱穩(wěn)定聚合酶保留實(shí)現(xiàn)隨后的引物延伸反應(yīng)的足夠活性。核酸變性所需的加熱條件是本領(lǐng)域眾所周知的且在美國(guó)專利號(hào)4，683，202和4，683，195中例示。如本文使用的，熱穩(wěn)定聚合酶一般適合于在溫度循環(huán)反應(yīng)例如聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)中使用。熱穩(wěn)定核酸聚合酶的實(shí)例包括水生棲熱菌(Thermus aquaticus)Taq DNA聚合酶、棲熱菌屬物種(Thermus sp.)Z05聚合酶、黃棲熱菌(Thermus fIavus)聚合酶、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶例如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
[0057]“經(jīng)修飾的”酶指包含氨基酸聚合物的酶，其中至少一個(gè)單體不同于參考序列，例如酶的天然或野生型形式或酶的另一種修飾形式。示例性修飾包括單體插入、缺失和取代。經(jīng)修飾的酶還包括具有來(lái)源于兩個(gè)或更多個(gè)親本的可鑒定組分序列(例如結(jié)構(gòu)或功能結(jié)構(gòu)域等)的嵌合酶。在經(jīng)修飾的酶的定義內(nèi)還包括的是包含參考序列的化學(xué)修飾的那些。經(jīng)修飾的聚合酶的實(shí)例包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA 聚合酶、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA 聚合酶、G46E E678G CS6 DNA 聚合酶、ΛΖ05 聚合酶、Λ Z05_Gold 聚合酶、Λ Z05R 聚合酶、E615G TaqDNA聚合酶、E678G ΤΜΑ-25聚合酶、E678G ΤΜΑ-30聚合酶等。
[0058]術(shù)語(yǔ)“5’至3’核酸酶活性”或“5’-3’核酸酶活性”指一般與核酸鏈合成相關(guān)的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸從核酸鏈的5’端去除，例如大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I具有這種活性，而Klenow片段則沒(méi)有。
[0059]“基本上缺乏5’ -3’核酸酶活性”的聚合酶指具有Taq DNA聚合酶的50%或更低的(例如〈25%、〈20%、〈15%、〈10%) 5’-3’核酸酶活性的聚合酶。測(cè)量5’-3’核酸酶活性的方法和用于測(cè)量的條件是本領(lǐng)域眾所周知的，參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5，466，591。基本上缺乏5’到3’核酸酶活性的DNA聚合酶的實(shí)例包括大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段；缺乏N末端235個(gè)氨基酸的水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq)(例如如美國(guó)專利號(hào)5，616，494中描述的且在本領(lǐng)域中通常被稱為“Stoffel片段”)。其他實(shí)例包括具有足夠缺失(例如N末端缺失)、突變或修飾，以消除或失活負(fù)責(zé)5’ -3’核酸酶活性的結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5，795，762。
[0060]“標(biāo)記”指(共價(jià)或非共價(jià))連接至分子且能夠提供關(guān)于分子的信息的部分。示例性標(biāo)記包括突光標(biāo)記、比色法標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、質(zhì)量修飾基團(tuán)、抗體、抗原、生物素、半抗原和酶(包括過(guò)氧化物酶、磷酸酶等)。
[0061]在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的背景下，“熱啟動(dòng)”指其中至少一種關(guān)鍵試劑從反應(yīng)混合物中被扣留(或如果存在于反應(yīng)混合物中，則試劑保持無(wú)活性)，直至溫度足夠升高以提供一條或多條引物的必需雜交特異性的方案?！盁釂?dòng)酶”是能夠在熱啟動(dòng)方案中充當(dāng)“扣留”或無(wú)活性試劑的酶，一般為核酸聚合酶。
[0062]術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)混合物”指含有進(jìn)行給定反應(yīng)所需的試劑的溶液?！皵U(kuò)增反應(yīng)混合物”指含有進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑的溶液，通常含有在合適緩沖液中的寡核苷酸引物和DNA聚合酶或連接酶?！癙CR反應(yīng)混合物”通常含有在合適緩沖液中的寡核苷酸引物、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、dNTP’ s和二價(jià)金屬陽(yáng)離子。如果反應(yīng)混合物含有實(shí)現(xiàn)反應(yīng)所需的所有試劑，則它被稱為完全的，并且如果反應(yīng)混合物僅含有必需試劑子集，則它被稱為不完全的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解反應(yīng)組分照常規(guī)作為各自含有全部組分的子集的分離的溶液貯存，為了方便、貯存、穩(wěn)定性、或以允許組分濃度的應(yīng)用依賴性調(diào)整的原因，并且反應(yīng)組分在反應(yīng)前組合以產(chǎn)生完全反應(yīng)混合物。
[0063]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“試劑盒”用于提及物品組合，所述物品組合促進(jìn)樣品的處理、方法、測(cè)定、分析或操作。試劑盒可以含有描述如何使用試劑盒的書(shū)面說(shuō)明書(shū)(例如描述本發(fā)明的方法的說(shuō)明書(shū))、 法所需的化學(xué)試劑或酶、引物和探針、以及任何其他組分。
[0064]本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn):當(dāng)存在于模板核酸上時(shí)，某些經(jīng)修飾的核苷酸能夠防止或抑制引物寡核苷酸通過(guò)DNA聚合酶的延伸，但仍可以維持與其在引物上的互補(bǔ)堿基的Watson-Crick堿基配對(duì)。一種此類經(jīng)修飾的核苷酸是脫氧鳥(niǎo)苷類似物，N2-芐基-脫氧鳥(niǎo)苷(N2-芐基-dG)，其如圖1A中所示，含有在環(huán)外氨基的C-2氮上的芐基。具有環(huán)外氨基的共價(jià)修飾的核苷酸已在美國(guó)專利號(hào)6，001，611中描述。此類核苷酸的合成和摻入此類核苷酸的寡核苷酸也在‘611專利中描述。
[0065]雖然不受理論束縛，但認(rèn)為N2-芐基-dG能夠通過(guò)占據(jù)雙鏈DNA的小溝而防止引物延伸，由此表現(xiàn)為“小溝結(jié)合劑”，并且干擾DNA聚合酶的活性位點(diǎn)。然而，與互補(bǔ)脫氧胞嘧啶(dC)核苷酸的堿基配對(duì)仍可以發(fā)生，因?yàn)槿齻€(gè)氫鍵不受芐基部分存在的影響(圖1B)。
[0066]因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及防止與模板核苷酸序列雜交的引物寡核苷酸通過(guò)DNA聚合酶延伸的方法，其包括將小溝結(jié)合劑摻入模板核苷酸序列上，其中小溝結(jié)合劑是經(jīng)修飾的核苷酸，并且經(jīng)修飾的核苷酸是N2-芐基-dG，并且其中引物不能延伸超出N2-芐基-dG核苷酸位置多于2個(gè)核苷酸。該方法可應(yīng)用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增、核酸測(cè)序、基因分型和采用以模板依賴性方式的引物延伸的其他應(yīng)用。
[0067]N2-芐基-dG的獨(dú)特特性也允許其用于降低或防止基于引物的擴(kuò)增反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增。認(rèn)為當(dāng)不穩(wěn)定的、瞬時(shí)雜交雙鏈體在引物和非靶分子之間形成時(shí)，發(fā)生非特異性擴(kuò)增，其中引物的3’端與其他分子中的互補(bǔ)堿基暫時(shí)配對(duì)。初始引物延伸導(dǎo)致形成互補(bǔ)序列，其穩(wěn)定雙鏈體且允許進(jìn)一步延伸。美國(guó)專利號(hào)6，001，611公開(kāi)了含有經(jīng)修飾的核苷酸的引物用于防止非特異性擴(kuò)增的用途，所述非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生于引物二聚體的形成，在所述引物二聚體中在引物和另一條引物之間形成瞬時(shí)雜交雙鏈體。N2-芐基-dG將不用于引物中以防止非特異性擴(kuò)增，因?yàn)樗谝镅由飚a(chǎn)物中的存在將引起引物延伸的終止，所述引物延伸產(chǎn)物用作后續(xù)擴(kuò)增循環(huán)中的模板。然而，在利用探針(例如Taqman PCR測(cè)定中的5’核酸酶探針)的擴(kuò)增反應(yīng)中，N2-芐基-dG的摻入已導(dǎo)致降低或防止產(chǎn)生于在引物和探針之間發(fā)生的雜交的非特異性擴(kuò)增。
[0068]因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及降低或防止在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中核酸的非特異性擴(kuò)增的方法，其包括提供能夠擴(kuò)增靶核酸序列的至少一對(duì)引物寡核苷酸；提供摻入小溝結(jié)合劑的探針寡核苷酸，當(dāng)引物與探針寡核苷酸雜交時(shí)，所述小溝結(jié)合劑阻斷引物通過(guò)DNA聚合酶延伸超出小溝結(jié)合劑位置多于2個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，小溝結(jié)合劑是經(jīng)修飾的核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的核苷酸是N2-芐基-dG。
[0069]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng)混合物，其包含至少一對(duì)引物寡核苷酸和至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物進(jìn)一步包含核酸擴(kuò)增一般所需的試劑和溶液，包括核苷酸摻入生物催化劑、核酸前體即核苷三磷酸、以及適合于支持核苷酸摻入生物催化劑活性的有機(jī)和無(wú)機(jī)離子。
[0070]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒。試劑盒一般包括測(cè)定特異性組分以及進(jìn)行DNA擴(kuò)增測(cè)定一般所需的組分。作為測(cè)定特異性組分，本發(fā)明的擴(kuò)增試劑盒通常包括至少一對(duì)引物寡核苷酸、至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸、和用于進(jìn)行本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)的一套說(shuō)明書(shū)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括兩對(duì)或更多對(duì)引物 寡核苷酸和兩條或更多條探針寡核苷酸，其中每條探針寡核苷酸摻入N2-芐基-dG核苷酸。作為核酸擴(kuò)增一般所需的組分，本發(fā)明的試劑盒通常包括下述中的一種或多種:核苷酸摻入生物催化劑、核酸前體例如核苷三磷酸(脫氧核糖核苷三磷酸或核糖核苷三磷酸)、任選的用于使核酸的焦磷酸解降到最低的焦磷酸酶、用于保護(hù)不受擴(kuò)增反應(yīng)的攜帶污染(carry-over contamination)的尿嘧唳N-糖基化酶(UNG)、以及擴(kuò)增反應(yīng)和檢測(cè)所需的預(yù)制試劑和緩沖液。
[0071]提供下述實(shí)施例和附圖以幫助本發(fā)明的理解，本發(fā)明的真實(shí)范圍在附加的權(quán)利要求中闡述。
實(shí)施例
[0072]年施例I引物延伸
為了證實(shí)如圖2中圖解描述的，含有N2-芐基-dG的模板核酸能夠阻斷通過(guò)DNA聚合酶的引物延伸，使用FAM標(biāo)記的引物寡核苷酸和三種互補(bǔ)模板寡核苷酸設(shè)置引物延伸實(shí)驗(yàn)，其序列顯示于下文:
【權(quán)利要求】
1.在采用以模板依賴性方式的引物延伸的測(cè)定中，防止與模板核苷酸序列雜交的引物寡核苷酸通過(guò)DNA聚合酶延伸的方法，其包括將小溝結(jié)合劑摻入所述模板核苷酸序列上，并且其中所述引物寡核苷酸不能被延伸超出N2-芐基-dG核苷酸位置多于2個(gè)核苷酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述小溝結(jié)合劑是經(jīng)修飾的核苷酸。
3.權(quán)利要求3的方法，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸是N2-芐基-脫氧鳥(niǎo)苷(N2-芐基-dG)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述測(cè)定選自PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序和基因分型。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述測(cè)定是PCR擴(kuò)增。
6.降低或防止在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中核酸的非特異性擴(kuò)增的方法，其包括提供能夠擴(kuò)增靶核酸序列的至少一對(duì)引物寡核苷酸；和提供摻入小溝結(jié)合劑的探針寡核苷酸，當(dāng)所述引物寡核苷酸與所述探針寡核苷酸雜交時(shí)，所述小溝結(jié)合劑阻斷所述引物寡核苷酸通過(guò)DNA聚合酶延伸超出經(jīng)修飾的核苷酸位置多于2個(gè)核苷酸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述小溝結(jié)合劑是經(jīng)修飾的核苷酸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸是N2-芐基-dG。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)是TaqmanPCR測(cè)定，并且所述探針寡核苷酸是5’核酸酶探針。
10.用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng)混合物，其包含至少一對(duì)引物寡核苷酸和至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷 酸。
11.權(quán)利要求10的反應(yīng)混合物，其進(jìn)一步包含核苷酸摻入生物催化劑、核苷三磷酸、和適合于通過(guò)所述核苷酸摻入生物催化劑的核酸擴(kuò)增的緩沖液。
12.用于核酸擴(kuò)增的試劑盒，其包含至少一對(duì)引物寡核苷酸、至少一條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸、至少一種核苷酸摻入生物催化劑、核苷三磷酸、適合于通過(guò)所述至少一種核苷酸摻入生物催化劑的核酸擴(kuò)增的緩沖液、和用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增的一套說(shuō)明書(shū)。
13.權(quán)利要求12的試劑盒,其進(jìn)一步包含一對(duì)或多對(duì)引物寡核苷酸和一條或多條摻入N2-芐基-dG核苷酸的探針寡核苷酸。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104011224SQ201280062833
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月22日
【發(fā)明者】V.博德普迪, N.J.舍恩布倫納, S.威爾 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司