免疫球蛋白基因多樣性的操縱及多抗體治療劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了能表達(dá)包含人可變區(qū)序列的抗體的改良的非人脊椎動物和非脊椎動物細(xì)胞。本發(fā)明涉及從非人脊椎動物和細(xì)胞中提供長HCDR3。本發(fā)明還涉及提供免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座中新的V、D和J配對。本發(fā)明提供了新的、偏向的抗體多樣性及潛在擴(kuò)展的多樣性。本發(fā)明還提供了新的和潛在擴(kuò)展的多樣性或者關(guān)于抗體共有的可變基因使用的偏向的多樣性，可用于治療和/或預(yù)防某些疾病或病癥，如感染性疾病。本發(fā)明還提供了使用這種脊椎動物產(chǎn)生抗體的方法，以及抗體本身、其治療組合物及應(yīng)用。
【專利說明】免疫球蛋白基因多樣性的操縱及多抗體治療劑
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及提供具有長HCDR3長度的抗體。本發(fā)明還涉及提供在免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座中新的V、D和J配對。本發(fā)明提供了新的、偏向的(biased)抗體多樣性和潛在擴(kuò)展的多樣性。本發(fā)明還提供了新的和潛在擴(kuò)展的多樣性或者偏向于抗體共有的可變基因使用的多樣性，可用于治療和/或預(yù)防某些疾病或病癥，如感染性疾病。偏向抗體所有成分的這種能力還提供了簡化生產(chǎn)抗體混合物如可用于治療和/或預(yù)防感染性疾病的多克隆抗體治療劑的方法，其中需要靶向多個病原體抗原的多克隆方法。為此，本發(fā)明還提供了雙特異性抗體，其能結(jié)合一個以上的抗原(例如由相同病原體表達(dá)的多個感染性抗原)，因此提供了多克隆抗體混合物不可能有的優(yōu)勢(如生產(chǎn)、用量和施用優(yōu)勢)。 [0002]本發(fā)明提供了脊椎動物和細(xì)胞，如轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠或者轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠細(xì)胞。此外，本發(fā)明涉及使用脊椎動物分離抗體或者編碼抗體的核苷酸序列的方法。本發(fā)明還提供了抗體、核苷酸序列、藥物組合物及應(yīng)用。
[0003]發(fā)明背景
[0004]現(xiàn)有技術(shù)提供了包含轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白基因座的非人脊椎動物(例如小鼠和大鼠)和細(xì)胞，這種基因座包含人可變(V)、多樣性(D)和/或連接(J)區(qū)段，及任選存在的人恒定區(qū)。或者，在轉(zhuǎn)基因基因座中提供了宿主脊椎動物的內(nèi)源性恒定區(qū)(例如小鼠或大鼠恒定區(qū))。構(gòu)建這種轉(zhuǎn)基因脊椎動物及使用其在抗原免疫之后產(chǎn)生抗體及其核酸的方法為本領(lǐng)域已知，見例如 US7501552 (Medarex)、US5939598 (Abgenix)、US6130364 (Abgenix)、W002/066630 (Regeneron)、W02011004192 (Genome Research Limited)、W02009076464、W02009143472和W02010039900 (Ablexis)所述，所述文獻(xiàn)并入本文作參考。本領(lǐng)域中的這種轉(zhuǎn)基因基因座包括不同量的人V(D)J庫集(repertoire)。
[0005]現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白基因座趨于基于單一人DNA來源。攜帶這種轉(zhuǎn)基因基因座的非人脊椎動物中人抗體可變區(qū)的潛在多樣性因此受到所用的庫集的限制。
[0006]希望在轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白基因座及攜帶其的非人脊椎動物中以及在免疫這些動物之后產(chǎn)生的抗體中提供人可變區(qū)的新的及潛在擴(kuò)展的庫集和多樣性。
[0007]發(fā)明概沭
[0008]本發(fā)明人通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因非人脊椎動物、免疫、抗體重鏈?zhǔn)占吧疃壬镄畔W(xué)分析，已經(jīng)揭示了怎樣合理設(shè)計VH結(jié)構(gòu)域、重鏈及具有長HCDR3的抗體。這些可用于針對(addressing)抗原(如感染性疾病病原體抗原,受體和酶裂縫)，其中較長的CDR更好地針對靶位。
[0009]本發(fā)明人還認(rèn)識到以新的方式提供V、D和J基因區(qū)段的組合以在免疫球蛋白基因座中提供在天然或在本領(lǐng)域現(xiàn)有基因座中未發(fā)現(xiàn)的合成的基因區(qū)段組合的可能性。本發(fā)明人認(rèn)識到在轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白基因座及攜帶其的非人脊椎動物以及在免疫這些動物之后產(chǎn)生的抗體中提供人可變區(qū)的新的和潛在擴(kuò)展的庫集和多樣性的重要性。一方面，本發(fā)明人認(rèn)識到希望偏向于新的庫集以產(chǎn)生具有改良的親和性和/或生物物理學(xué)特性的抗體，和/或其中通過這種庫集產(chǎn)生的表位特異性的范圍是新的，為抗體提供迄今為止通過現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白基因座難處理或者難以針對的表位。例如，本發(fā)明人設(shè)想了特異性應(yīng)用以偏向新的庫集產(chǎn)生可用于治療和/或預(yù)防感染性疾病的抗體。
[0010]為此，本發(fā)明的第一種配置是提供非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細(xì)胞，其基因組包含:
[0011](a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人V基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人J基因區(qū)段；任選其中重鏈基因座處于下文描述的本發(fā)明的任一配置中；及
[0012](b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含:
[0013](i)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VH基因區(qū)段和一或多個人J基因區(qū)段(任選重排的VHJLCL或VHJ λ CL，其中CL是C λ或C κ );或者
[0014](ii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VL基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人JH基因區(qū)段(任選重排的VLDJHCL或V λ DJHCL，其中CL是C λ或C κ);或者
[0015](iii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VL基因區(qū)段以及一或多個人JL基因區(qū)段，所述人VL基因區(qū)段選自如下一組中:νλ II基因家族成員、νλν?Ι4Α、νλ 112.K VAVII4A,V λ I 基因家族成員、νλ 3 基因家族成員、IGLV1S2、νλ 3_cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325、Vk I基因家族成員、κ 1-15A(KL012)、Vk II家族成員、Vk III家族成員、Vk I基因家族成員、κ 1-15A(KL012)、Vk IIA2 (任選A2a等位基因)、V κ A27 (Humkv325)及與其至少80%相同的基因區(qū)段；
[0016]其中所述重鏈 基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，所述輕鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時，小鼠能產(chǎn)生包含通過重鏈基因座的重組產(chǎn)生的重鏈和通過輕鏈基因座的重組產(chǎn)生的輕鏈的抗體。
[0017]一方面，
[0018]在(b)⑴中，所述輕鏈基因座的V基因區(qū)段庫集包含或者由一或多個VH基因區(qū)段組成，所述VH基因區(qū)段選自如下一組中=VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)、VHIV 基因家族成員、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26 (VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH Hll、VH1GRR、ha3h2、VH1-halcl、VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、Hvlfl0、VH4.11、71-4、VH251、VH1_69 及與其至少 80%相同的基因區(qū)段；或者
[0019]在(b)(iii)中，輕鏈基因座V基因區(qū)段庫集由一種VL基因區(qū)段類型(任選及一或多種其突變體)組成，其中VL基因區(qū)段選自所述一組VL基因區(qū)段。
[0020]在本發(fā)明的第二種配置中，提供了:
[0021]非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細(xì)胞，其基因組包含:
[0022](a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人V基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人J基因區(qū)段；及
[0023](b) (i)未重排的免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人VH基因區(qū)段和一或多個人J基因區(qū)段，其中每個人VH基因區(qū)段是與用于產(chǎn)生編碼來自抗體表達(dá)細(xì)胞的人抗體重鏈可變區(qū)的重排的VDJ的人VH基因區(qū)段(或其突變體)相同的人基因區(qū)段，其中所述抗體結(jié)合感染性疾病病原體抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；或者[0024](ii)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的重排的VJ區(qū)或者VDJ區(qū)，其中所述重組區(qū)的核苷酸序列與通過人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段與人VH基因區(qū)段的重組產(chǎn)生的核苷酸序列相同，所述人VH基因區(qū)段與用于產(chǎn)生編碼來自抗體表達(dá)細(xì)胞的人抗體重鏈可變區(qū)的重排的VDJ的人VH基因區(qū)段(或其突變體)相同，其中所述抗體結(jié)合感染性疾病病原體抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；
[0025](C)其中所述重鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，所述輕鏈基因座中的基因區(qū)段或VJ或VDJ與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時，小鼠能產(chǎn)生包含通過所述重鏈基因座的重組產(chǎn)生的重鏈和衍生自所述輕鏈基因座的輕鏈的抗體；
[0026](d)任選地，當(dāng)應(yīng)用(b)⑴時，所述輕鏈基因座中每個所述VH基因區(qū)段選自如下一組中=VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)、VHIV基因家族成員、VHI119.1(VH3-15)、VHIII VH26 (VH3-23),VH3-21,LSG6.ULSG12.1、DP77 (V3-21)、VH Hll、VH1GRR、ha3h2、VH1-halcl, VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71_2、HvlflO、VH4.11、71-4、VH251、VHl-69及與其至少80%相同的基因區(qū)段；
[0027](e)任選地，當(dāng)應(yīng)用(b) (ii)時，重組區(qū)的核苷酸序列與通過人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段與人VH基因區(qū)段重組產(chǎn)生的核苷酸序列相同，所述人VH基因區(qū)段選自如下一組中=VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)、VHIV基因家族成員、VHIII9.1(VH3-15), VHIII VH26 (VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77 (V3-21)、VH HlU VH1GRR、ha3h2 、VH1-halcl, VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71_2、HvlflO、VH4.ll、71-4、VH251、VHl-69及與其至少80%相同的基因區(qū)段。
[0028]一方面，所述輕鏈基因座的V基因區(qū)段庫集包含或者由一個人VH基因區(qū)段、任選種系VH及其一或多種多態(tài)性變體組成，例如每個多態(tài)性變體與種系VH核苷酸序列在1、2、
3、4、5、6、7、8、9或10個位置不同。一方面，所述輕鏈基因座的V基因區(qū)段庫集包含或者由人VH1-69基因區(qū)段、任選種系VH1-69及其一或多種多態(tài)性變體組成，例如每個多態(tài)性變體與種系VH1-69核苷酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個位置不同。下文提供了構(gòu)建包含VH1-69及多態(tài)性變體的免疫球蛋白基因座的實例。通過使用特定基因區(qū)段(例如通常在人體中對抗感染或者其它病癥產(chǎn)生的人抗體中發(fā)現(xiàn)的一個基因區(qū)段)及其一或多種多態(tài)性變體，可以提供基因的庫集且仍使抗體基因庫集偏向于與疾病(例如感染性疾病，如細(xì)菌或病毒性疾病，如流感)相關(guān)的基因區(qū)段。這提供了有用的基因庫，從中最后產(chǎn)生并分離先導(dǎo)抗體(lead antibody)以治療/預(yù)防所述研究的疾病。在一個實例中，所述多態(tài)性變體是在人類或人群中見到的天然變體。技術(shù)人員將獲知人抗體基因序列的來源，如IMGT(www.1mgt.0rg)、GenBank(www.ncb1.nlm.nih.gov/genbank)及 1000 基因組數(shù)據(jù)庫(www.1OOORenomes.0rR)。關(guān)于數(shù)據(jù)庫操作的生物信息學(xué)工具也易于獲得且為技術(shù)人員已知，例如從 1000Genomes Project/EBI (www.1000genomes.0rg)中公開獲得。
[0029]另一方面，所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于輕鏈基因座(b) (i)或(ii)是純合的，任選其中:
[0030]-所述輕鏈基因座的V基因區(qū)段庫集由一或多個人VH基因區(qū)段組成，所述VH基因區(qū)段選自如下一組中=VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)、VHIV 基因家族成員、VHIII9.1(VH3-15), VHIII VH26 (VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH Hll、VH1GRR、ha3h2、VH1-halcl, VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、HvlflO、VH4.11、71_4、VH251、VH1-69及與其至少80%相同的基因區(qū)段;或者
[0031]-所述輕鏈基因座的重組的VJ或VDJ庫集由與通過人VH基因區(qū)段與人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段重組產(chǎn)生的一或多個核苷酸序列相同的序列組成，所述人VH基因區(qū)段選自如下一組中=VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)、VHIV 基因家族成員、VHIII9.1(VH3-15), VHIII VH26 (VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH Hll、VH1GRR、ha3h2、VH1-halcl, VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、HvlflO、VH4.11、71_4、VH251、VH1-69 及與其至少 80%相同的基因區(qū)段。
[0032]另一方面，所述脊椎動物或細(xì)胞的每個免疫球蛋白輕鏈基因座是如(b) (i)所述，包含僅一個人VH基因區(qū)段，所述人VH基因區(qū)段選自如下一組中=VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)、VHIV基因家族成員、VHI119.1 (VH3-15)、VHIIIVH26 (VH3-23),VH3-21,LSG6.ULSG12.1、DP77 (V3-21)、VH Hll、VHlGRR、ha3h2、VHI_halcl、VHII1-VH2-UVH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、Hvlfl0、VH4.11、71_4、VH251、VH1-69 及與其至少80%相同的基因區(qū)段，任選其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于所述輕鏈?zhǔn)羌兒系?，由此所有輕鏈基因座均包含相同的單個人VH基因區(qū)段。
[0033]本發(fā)明提供了分離結(jié)合預(yù)定抗原的抗體的第一種方法，所述方法包括:
[0034](a)提供根據(jù)任何前述配置或方面的脊椎動物(任選小鼠或大鼠)；
[0035](b)用所述抗原免疫所述脊椎動物(任選其中所述抗原是感染性疾病病原體的抗原)； [0036](c)從所述脊椎動物中取出B淋巴細(xì)胞，選擇表達(dá)結(jié)合所述抗原的抗體的一或多個B淋巴細(xì)胞；
[0037](d)任選使所述選擇的B淋巴細(xì)胞或其后代永生化，任選通過從中產(chǎn)生雜交瘤進(jìn)行；及
[0038](e)分離由所述B淋巴細(xì)胞表達(dá)的抗體(例如，以及IgG型抗體)。
[0039]本發(fā)明提供的第二種方法包括進(jìn)行第一種方法以及從所述B淋巴細(xì)胞中分離編碼結(jié)合所述抗原的所述抗體的核酸的步驟；任選用編碼人或人源化重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列交換所述抗體的重鏈恒定區(qū)核苷酸序列及任選親和性成熟所述抗體的可變區(qū)；及任選將所述核酸插入表達(dá)載體及任選宿主中。
[0040]本發(fā)明一方面提供了產(chǎn)生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進(jìn)行第一種方法，通過用抗原分別免疫第一和第二脊椎動物(任選第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)及組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或者所述抗體的突變體或衍生物)以產(chǎn)生多克隆抗體混合物；任選其中單獨(dú)或組合(⑴和(ii);或者⑴和(iii))應(yīng)用如下步驟:
[0041](i)用相同抗原或不同抗原免疫所述脊椎動物(任選其中不同抗原由相同病原性生物體(或其家族成員)表達(dá))；
[0042](ii)在免疫之前，所述脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的VH基因庫集(任選單個VH基因)及任選存在的相同的J庫集；任選哺乳動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的；
[0043](iii)在免疫之前，所述脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的VJ或VDJ庫集(任選單個VJ或VDJ);任選所述脊椎動物輕鏈基因座在免疫之前是相同的。
[0044]本發(fā)明一方面提供了產(chǎn)生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進(jìn)行第一種方法，通過用第一和第二抗原免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)，組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或者所述抗體的突變體或衍生物)以產(chǎn)生多克隆抗體混合物；任選其中單獨(dú)或組合(⑴和(ii);或者⑴和(iii))應(yīng)用如下步驟:
[0045](i)所述抗原由相同病原性生物體(或其家族成員)表達(dá)；
[0046](ii)在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的VH基因庫集(任選單個VH基因)及任選存在的相同的J庫集；任選哺乳動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的；
[0047](iii)在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的VJ或VDJ庫集(任選單個VJ或VDJ);任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的。
[0048]本發(fā)明一方面提供了產(chǎn)生能表達(dá)多克隆抗體混合物的宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括:在第二種方法中，
[0049](a)用第一和第二抗原免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)(任選其中不同抗原由相同病原性生物體(或者其家族成員)表達(dá))；
[0050](b)從所述脊椎動物的B淋巴細(xì)胞中分離編碼第一種和第二種抗-抗原抗體的核酸；
[0051](C)確定第一種抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列；
[0052](d)確定第二種抗體的重鏈可變區(qū)及任選確定輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列；
[0053](e)將每種抗體的重鏈可變區(qū)編碼序列插入重鏈表達(dá)載體中；任選其中每個重鏈的恒定區(qū)編碼序列被交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；
[0054](f)將第一種抗體的輕鏈可變區(qū)編碼序列插入輕鏈表達(dá)載體中；任選其中第一種抗體的輕鏈恒定區(qū)編碼序列被交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；
[0055](g)任選將第二種抗體的輕鏈可變區(qū)編碼序列插入輕鏈表達(dá)載體中；任選其中第二種抗體的輕鏈恒定區(qū)編碼序列被交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；及
[0056](h)將每個表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中并在所述宿主細(xì)胞的混合物中共表達(dá)抗體鏈以產(chǎn)生抗體，每個抗體均包含所述重鏈可變區(qū)和輕鏈之一或二者；任選其中表達(dá)載體一起導(dǎo)入相同宿主細(xì)胞中(例如CHO或HEK293細(xì)胞)，由此所述細(xì)胞能表達(dá)抗體輕鏈與重鏈，由此所述細(xì)胞或多個宿主細(xì)胞表達(dá)抗體，每個抗體均包含所述重鏈可變區(qū)和輕鏈之一或二者;
[0057]⑴任選地，
[0058]在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的VH基因庫集(任選單個VH基因區(qū)段)及任選存在的相同的J庫集(任選單個J基因區(qū)段)；任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的；或者
[0059]在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的VJ或VDJ庫集(任選單個VJ或VDJ);任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的。 [0060]本發(fā)明還提供了產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體混合物的方法，任選用于醫(yī)藥學(xué)中，任選用于治療和/或預(yù)防感染性疾病，其中任選每個抗體均結(jié)合感染性疾病病原體的抗原，優(yōu)選相同抗原。本發(fā)明還提供了分離的單克隆或多克隆抗體或其突變體或衍生物抗體在生產(chǎn)治療和/或預(yù)防感染性疾病的藥物中的應(yīng)用，任選其中感染性疾病是由細(xì)菌或病毒病原體引起的疾病。
[0061]本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過本發(fā)明的方法可獲得或者獲得的分離的抗體(例如IgG型抗體)或其突變體或衍生物抗體，其中(i)所述分離的抗體包含所述第一種抗體的重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(ii)所述分離的抗體包含所述第二種抗體的重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(iii)所述分離的抗體是雙特異性抗體，其包含所述第一種抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的一個拷貝配對，及所述抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的一個拷貝配對，任選其中所述雙特異性抗體結(jié)合由相同病原性生物體(或其家族成員)表達(dá)的所述第一和第二抗原；任選用于醫(yī)藥學(xué)中，任選用于治療和/或預(yù)防感染性疾病。
[0062]一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明抗體的核苷酸序列，任選其中所述核苷酸序列是載體的一部分。
[0063]一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體及稀釋劑、賦形劑或載體。
[0064]在本發(fā)明的第三種配置中，提供了:
[0065]非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細(xì)胞，其基因組包含:
[0066](a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含:
[0067](i)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VL基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人J基因區(qū)段(任選重排的VLDJHCH或V λ DJHCH);或
[0068](ii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VH基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人JH基因區(qū)段，其中所述人VH基因區(qū)段選自如下一組中=VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)、VHIV基因家族成員、VHI119.1 (VH3-15)、VHIIIVH26 (VH3-23),VH3-21,LSG6.ULSG12.1、DP77 (V3-21)、VH Hll、VHlGRR、ha3h2、VHI_halcl、VHII1-VH2-UVH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、Hvlfl0、VH4.11、71_4、VH251、VH1-69 及與其至少80%相同的基因區(qū)段；及
[0069](b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人V基因區(qū)段及一或多個人J基因區(qū)段，任選其中輕鏈基因座如本發(fā)明第一種配置中的(b) (i)或(b) (ii)所述；
[0070]其中所述重鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，所述輕鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時小鼠能產(chǎn)生包含通過所述重鏈基因座的重組產(chǎn)生的重鏈和通過所述輕鏈基因座的重組產(chǎn)生的輕鏈的抗體。
[0071]在本發(fā)明的第四種配置中，提供了:
[0072]非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細(xì)胞，其基因組包含:
[0073](a) (i)未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人VL基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個JH基因區(qū)段，其中每個人VL基因區(qū)段是與用于產(chǎn)生編碼來自抗體表達(dá)細(xì)胞的人抗體輕鏈可變區(qū)的重排的VJ的人VL基因區(qū)段(或其突變體)相同的人基因區(qū)段，其中所述抗體結(jié)合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；或者[0074](ii)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的重排的VJ區(qū)或VDJ區(qū)，其中重組區(qū)的核苷酸序列與通過人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段與人VL基因區(qū)段重組產(chǎn)生的核苷酸序列相同，所述人VL基因區(qū)段與用于產(chǎn)生編碼來自抗體表達(dá)細(xì)胞的人抗體的輕鏈可變區(qū)的重排的VJ的人VL基因區(qū)段(或其突變體)相同，其中所述抗體結(jié)合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；
[0075](b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人V基因區(qū)段及一或多個人J基因區(qū)段；及
[0076](C)其中輕鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，及重鏈基因座中的基因區(qū)段或VJ或VDJ與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時小鼠能產(chǎn)生包含通過所述輕鏈基因座的重組產(chǎn)生的輕鏈及衍生自所述重鏈基因座的重鏈的抗體；
[0077](d)任選地，當(dāng)應(yīng)用(a)(i)時，重鏈基因座中每個所述VL基因區(qū)段選自如下一組中的VL基因區(qū)段:νλ II基因家族成員、νλν?Ι4Α、νλ 112.K VAVII4A, VA I基因家族成員、VX 3 基因家族成員、IGLV1S2、νλ 3-cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325、Vk I 基因家族成員、κ 1-15A(KL012), Vk II家族成員、Vk III家族成員、Vk I基因家族成員、κ 1-15A(KL012)、Vk II A2(任選 A2a 等位基因)、V κ A27 (Humkv325)及與其至少 80%相同的基因區(qū)段；
[0078](e)任選地，當(dāng)應(yīng)用(a) (ii)時，重組區(qū)的核苷酸序列與通過人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段與人VL基因區(qū)段重組產(chǎn)生的核苷酸序列相同，所述人VL基因區(qū)段選自如下一組中的VL基因區(qū)段:νλ II基因家族成員、νλν?Ι4Α、νλ 112.1、V λ VII4A、V λ I基因家族成員、νλ 3 基因家 族成員、IGLV1S2、VX 3-cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325、V κ I基因家族成員、κ 1-15A(KL012), Vk II家族成員、Vk III家族成員、V κ I基因家族成員、κ Ι-15Α (KL012)、Vk II A2(任選 A2a 等位基因)、V κ A27 (Humkv325)及與其至少 80% 相同的基因區(qū)段。
[0079]在本發(fā)明的第四種配置的一方面，所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于重鏈基因座(a)⑴或(ii)是純合的；任選其中:
[0080]-所述重鏈基因座的V基因區(qū)段庫集由一或多個人VL基因區(qū)段組成，所述人VL基因區(qū)段選自如下一組中的VL基因區(qū)段:νλ II基因家族成員、νλν?Ι4Α、νλ 112.1、νλ VII4A、νλ I 基因家族成員、νλ 3 基因家族成員、IGLV1S2、νλ 3-cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325, Vk I基因家族成員、κ Ι-15Α(KL012)、V κ II家族成員、Vk III家族成員、Vk I 基因家族成員、κ 1-15A(KL012)、Vk II A2 (任選 A2a 等位基因)、V κ A27 (Humkv325)及與其至少80%相同的基因區(qū)段；或者
[0081]-所述重鏈基因座的重組的VJ或VDJ庫集由與通過人VL基因區(qū)段與人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段重組產(chǎn)生的一或多個核苷酸序列相同的序列組成，所述人VL基因區(qū)段選自如下一組中的VL基因區(qū)段:νλ II基因家族成員、νλ VII4A、νλ 112.1、νλν?Ι4Α、νλ I 基因家族成員、νλ 3 基因家族成員、IGLV1S2、νλ 3-cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325, Vk I基因家族成員、κ Ι-15Α(KL012)、V κ II家族成員、Vk III家族成員、Vk I 基因家族成員、κ 1-15A(KL012)、Vk II A2 (任選 A2a 等位基因)、V κ A27 (Humkv325)及與其至少80%相同的基因區(qū)段。
[0082]本發(fā)明提供了一種單克隆或多克隆抗體組合物，通過用抗原免疫前述任何配置或方面所述的至少一種脊椎動物(例如小鼠或大鼠)而制備，任選其中所述抗原是感染性疾病病原體抗原，任選其中相同抗原用于免疫所有脊椎動物；任選其中所述抗體是IgG型。
[0083]本發(fā)明還提供了分離的嵌合抗體以治療和/或預(yù)防感染性疾病或病癥，所述抗體包含非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)重鏈恒定區(qū)及結(jié)合感染性疾病病原體抗原的人可變區(qū)，其中所述抗體在包括用所述抗原免疫本發(fā)明的非人脊椎動物的方法中可獲得或獲得。
[0084]本發(fā)明還提供了分離的人抗體以治療和/或預(yù)防感染性疾病或病癥，所述抗體包含人重鏈恒定區(qū)及結(jié)合感染性疾病病原體抗原的人可變區(qū)，其中所述抗體在包括在轉(zhuǎn)基因非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)中在體內(nèi)親和性成熟抗體可變區(qū)的方法中可獲得或獲得，當(dāng)所述可變區(qū)與所述脊椎動物重鏈恒定區(qū)(例如小鼠或大鼠重鏈恒定區(qū))可操縱地連接時，通過(a)用所述抗原免疫本發(fā)明的脊椎動物，(b)分離編碼本發(fā)明的嵌合抗體的核酸，(C)用編碼人重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列置換編碼非人脊椎動物重鏈恒定區(qū)的核酸的核苷酸序列，產(chǎn)生編碼人抗體的核酸，(d)在體外表達(dá)人抗體(任選從攜帶所述人核酸的CHO或HEK293細(xì)胞中表達(dá))及(e)分離所述人抗體(任選進(jìn)一步親和性成熟所述抗體和/或產(chǎn)生其衍生物)。
[0085]本發(fā)明一方面提供了第一種和第二種人抗體的混合物，每個抗體均能結(jié)合感染性疾病病原體抗原(任選其中第一種抗體結(jié)合第一抗原，第二種抗體結(jié)合第二抗原，所述抗原來自相同病原體；或者其中所述抗原是相同的)。在一個實施方案中，使用共同輕鏈，其能簡化抗體混合物的生產(chǎn) 。因此在混合物中提供了第一種抗體的輕鏈氨基酸序列，其與第二種抗體的輕鏈氨基酸序列相同，或者具有直至15個氨基酸改變。
[0086]本發(fā)明進(jìn)一步提供了宿主細(xì)胞，其包含編碼3或更多個第一種和第二種抗體重鏈和輕鏈的一或多個表達(dá)載體。
[0087]在本發(fā)明的第五種配置中，提供了:
[0088]合成的免疫球蛋白基因座，其包含一或多個可變和J基因區(qū)段(及任選存在的一或多個D基因區(qū)段)，與恒定區(qū)5’端可操縱地連接，其中所述基因座包含5’至3’ V(D) J排列，選自可以用如下一或多種排列(5’至3’ )構(gòu)建的免疫球蛋白基因座:
[0089](a) [V(重鏈,λ 或 κ)]-[兩轉(zhuǎn)角(two-turn)RSS]-[ 一轉(zhuǎn)角(one-turn)RSS]-[D]-[JH]，其中所述RSS是相反方向；
[0090](b) [VH]_[D]_ [兩轉(zhuǎn)角RSS]-[—轉(zhuǎn)角RSS]-[J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0091](c) [VH]_[D]_ [—轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[J κ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0092](d) [VH或Vk ]_[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[—轉(zhuǎn)角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0093](e) [Vk ]-[—轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[JH或JX ]，其中所述RSS是相反方向；
[0094](f)[V(重鏈，λ 或 κ)]-[一轉(zhuǎn)角 RSS]-[兩轉(zhuǎn)角 RSS] _[D] _[JH]，其中所述 RSS 是相反方向；
[0095](g) [VH]_[D]_ [—轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0096](h) [VH]_[D]_ [兩轉(zhuǎn)角RSS]-[—轉(zhuǎn)角RSS]-[J κ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0097]⑴[VH或Vk ]_[—轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0098](j) [Vk ]_[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[—轉(zhuǎn)角RSS] - [JH或J λ ]，其中所述RSS是相反方向。[0099]在本發(fā)明的第六種配置中還提供了產(chǎn)生VH結(jié)構(gòu)域、重鏈和具有長HCDR3長度的抗體的方式。在此，本發(fā)明提供了:
[0100]非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎動物細(xì)胞(例如小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞)，其基因組包含人免疫球蛋白D基因區(qū)段庫集，其偏向于人D2和/或D3家族或者偏向于一、多個或所有人D基因區(qū)段，所述人D基因區(qū)段選自Dl-26、D2-2、D3_9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19。
[0101]非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎動物細(xì)胞(例如小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞)，任選根據(jù)前述權(quán)利要求所述，其基因組包含人免疫球蛋白VH基因區(qū)段庫集，其偏向于選自如下一組中的一個、多個或所有基因區(qū)段:VHl-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和VH7-4-1。
[0102]非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎動物細(xì)胞(例如小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞)，其基因組包含人免疫球蛋白JH基因區(qū)段庫集，其偏向于人JH6。
[0103]單克隆或多克隆抗體組合物或者產(chǎn)生這種組合物的抗體生產(chǎn)細(xì)胞群，其中所述組合物或細(xì)胞群是通過用抗原免疫前述任何權(quán)利要求所述至少一種脊椎動物而制備的，其中所述抗體具有人重鏈可變區(qū)，當(dāng)與相應(yīng)人種系V、D和J序列相比時其包含非人脊椎動物AID-模式體細(xì)胞超變(例如小鼠或大鼠AID-模式突變)和/或當(dāng)與相應(yīng)人種系V、D和J序列相比時其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)-模式連接突變(junctional mutation);其中所述組合物包含至少一種抗原特異性抗體,其具有長度為至少20個氨基酸的HCDR3 (根據(jù)MGT )。
[0104]包含一或多個重鏈的抗體重鏈庫集(例如由抗體提供)，其可變結(jié)構(gòu)域HCDR3的長度為至少20個氨基酸(根據(jù)MGT)，衍生自人VH、D和JH的重組，其中所述VH選自:
[0105]VHl-2*02、VH1_3*01、VH1_8*01、VH1_18*01、VH2_5*10、VH3_7*01、VH3_9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01 和 VH7-4_1*01，以及
[0106]所述D選自:
[0107]D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01 和 D3_22*01，或者
[0108]D2-2*02、D3-9*01 和 D3_10*01，或者
[0109]D3_9*01 和 D3_10*01，或者
[0110]D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19，或者
[0111]Dl-26*01、 D2-2*02、 D3_9*01、 D3_10*01、 D3_22*01、 D4_17*01、 D6_13*01 和D6-19*01，或者
[0112]D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19，或者 D2_2*02、D3_9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01 和 D6_19*01，或者
[0113]Dl-26、D2-2、D3-10 和 D6-19，或者
[0114]D2-2、D3_9 和 D3-10 ;并且
[0115]任選JH 是 JH6 (例如 JH6*02)；
[0116]其中
[0117](a)所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域已經(jīng)在非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)中在體內(nèi)產(chǎn)生；和/或[0118](b)所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域當(dāng)與相應(yīng)人種系V、D和J序列相比時包含非人脊椎動物AID-模式體細(xì)胞超變(例如小鼠或大鼠AID-模式突變)和/或當(dāng)與相應(yīng)人種系V、D和J序列相比時包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)-模式連接突變。
[0119]附圖簡沭
[0120]圖1-3:例證了產(chǎn)生重組工程BAC載體以將V基因區(qū)段加入小鼠基因組中的方案示意圖；
[0121]圖4:例證了使用相繼重組酶介導(dǎo)的盒交換(sRMCE)將V基因區(qū)段加入小鼠基因組中的方案示意圖；
[0122]圖5(4部分):僅示出可變(V)編碼區(qū)的13個IGHV1-69等位基因的比對。與VH1-69等位基因*01不同的核苷酸在適當(dāng)位置標(biāo)示，而相同的核苷酸用破折號標(biāo)示。在核苷酸改變導(dǎo)致氨基酸不同的情況中，編碼的氨基酸在相應(yīng)三聯(lián)體上示出。方框區(qū)相應(yīng)于CDR1、CDR2 和 CDR3；
[0123]圖6 =RSS結(jié)構(gòu)及重組示意圖。
[0124]發(fā)明詳沭
[0125]人V、D和J基因區(qū)段的來源是細(xì)菌人工染色體(RPC1-11BAC)，得自Roswell ParkCancer Institute (RPCI) /Invitrogen0 見 http: //bacpac.chor1.0rg/hmalell.htm,其描述了如下的BAC:
[0126]RPC1-1l 人男件 BACf 庫
[0127]RPC1-11 人男性 BAC 文庫(Osoegawa et al.，2001)使用由 Kazutoyo Osoegawa 開發(fā)的改良的克隆技術(shù)構(gòu)建(Osoegawa et al.，1998)。所述文庫由Kazutoyo Osoegawa產(chǎn)生。構(gòu)建由 National Human Genome Research Institute (NHGRI, NIH) (#1R01RG01165-03)提供資金。這個文庫根據(jù)新的 NHGRI/D0E〃Guidance on Human Subjects in Large-ScaleDNA Sequencing 產(chǎn)生。
[0128]“男性血液通過雙盲選擇方案獲得。男性血液DNA分離自一個隨機(jī)選擇的供體(在10個男性供體中)”。
[0129].0soegawa K, Mammoser AG, Wu C, Frengen E, Zeng C，Catanese JJ, de Jong PJ ；Genome Res.200IMar ;11 (3):483-96 ;〃A bacterial artificial chromosome library forsequencing the complete human genome〃 ；
[0130].0soegawa, K., ffoon, P.Y., Zhao, B., Frengen, E., Tateno, M., Catanese, J.J, and de Jong, P.J.(1998) ;〃An Improved Approach for Construction of BacterialArtificial Chromosome Libraries" ；Genomics52, 1-8.[0131]作為抗體基因區(qū)段序列的來源，技術(shù)人員也意識到如下可利用的數(shù)據(jù)庫和資源(包括其更新材料):
[0132]1.1.Kabat 數(shù)據(jù)庫(G.Johnson and T.T.ffu, 2002:http: //www.kabatdatabase.com)。由E.A.Kabat和T.Τ.Wu在1966年產(chǎn)生，Kabat數(shù)據(jù)庫公開了抗體、T-細(xì)胞受體、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類和II類分子及其它免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的排列對比的序列?？伤阉鞯慕缑嬗蒘eqhuntII工具提供，可獲得關(guān)于序列排列對比、序列子群分類及產(chǎn)生變異性作圖(variability plot)的效用范圍。也見Kabat, E.A.，Wu, T.T., Perry,H., Gottesman, K., and Foeller, C.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th ed., NIH Publication N0.91-3242, Bethesda, MD 所述，該文獻(xiàn)并入本文作參考，特別是參考人基因區(qū)段用于本發(fā)明。
[0133]1.2.KabatMan (A.C.R.Martin, 2002:http: //www.bioinf.0rg.uk/abs/simkab.html)。這是產(chǎn)生簡單查詢Kabat序列數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)頁。
[0134]1.3.1MGT, the International ImMunoGeneTics Information , System?; Μ.-P.Lefranc, 2002:http: //imgt.cines.fr)。IMGT是一個整合的信息系統(tǒng),其專攻所有脊椎動物物種的抗體、T細(xì)胞受體和MHC分子。其提供了標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)的一個公共端口，包括核苷酸和蛋白質(zhì)序列、寡核苷酸引物、基因作圖、遺傳多態(tài)性、特異性及二維(2D)和三維(3D)結(jié)構(gòu)。MGT 包括三個序列數(shù)據(jù)庫(MGT/LIGM-DB、IMGT/MHC-DB, MGT/PRMERDB)，一個基因組數(shù)據(jù)庫(MGT/GENE-DB)，一個3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(MGT/3D結(jié)構(gòu)-DB)，及一系列網(wǎng)站資源("IMGT Marie-Paule page〃)和交互工具。
[0135]1.4V-BASE (1.M.Toml in son, 2002 ；http: //www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)。V-BASE是從1000個以上的公開序列中匯編的所有人抗體種系可變區(qū)序列的綜合目錄。其包括排列軟件DNAPL0T (由Hans-Helmar Althaus和Werner Muller開發(fā)),其使得可以將重排的抗體V基因分配給其最接近種系基因區(qū)段。
[0136]1.5.Antibodies—Structure and Sequence (A.C.R.Martin, 2002:http: //www.bioinf.0rR.uk/abs)。這個網(wǎng)頁概括了關(guān)于抗體結(jié)構(gòu)和序列的有用信息。其提供了 Kabat抗體序列數(shù)據(jù)的查詢界面，關(guān)于抗體的一般信息，、晶體結(jié)構(gòu)及與其它抗體相關(guān)信息的鏈接。其還指示Protein Databank(PDB)中保藏的所有抗體結(jié)構(gòu)的自動化摘要。特別感興趣的是其全面描述和對比了抗體可變區(qū)的各種編號方案。
[0137]1.6.AAAAA—AHo，s Amazing Atlas of Antibody Anatomy (A.Honegger, 2001 ；http://www.unizh.ch/~antibody)。這個資源包括結(jié)構(gòu)分析、建模及工程化的工具。其采用一致的方案綜合抗體和T細(xì)胞受體序列的結(jié)構(gòu)排列，包括抗體分析和圖示的Excelmacros。
[0138]1.7.WAM—Web Antibody Modeling (N.Whitelegg and A.R.Rees, 2001:http: //antibody, bath, ac.uk)。 由 the Centre for Protein Analysis and Design at theUniversity of Bath, United Kingdom 主持?；?AbM 程序包(先前由 Oxford Molecular銷售)構(gòu)建抗體Fv序列的3D模型，組合使用確立的理論方法，這個網(wǎng)站還包括最新的抗體結(jié)構(gòu)信息。
[0139]1.8.Mike，s Immunoglobulin Structure/Function Page (M.R.Clark, 2001 ；http: //www.path, cam, ac.uk/ ~mrc7/mikeimages, html)。這些網(wǎng)頁提供了關(guān)于免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和功能的教育材料，通過許多彩色圖片、模型和動畫例證?？色@得關(guān)于抗體人源化和Mike Clark’s Therapeutic Antibody Human Homology Project 的另外信息,其關(guān)注于使臨床效力和抗免疫球蛋白應(yīng)答與治療性抗體的可變區(qū)序列相關(guān)聯(lián)。
[0140]1.9.The Antibody Resource Page(The Antibody Resource Page, 2000:http://WWW, antibodyresourc e.com)。這個網(wǎng)站描述了其自身作為“抗體研究和供應(yīng)的完全指導(dǎo)”。與氨基酸測序工具、核苷酸抗體測序工具鏈接，提供了雜交瘤/細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)庫。
[0141]1.9.Humanization bY Design (J.Saldanha, 2000:http: //people, cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07S)。這個資源提供了關(guān)于抗體人源化技術(shù)的綜述。最有用的特征是超過40個公開的人源化抗體的可搜索數(shù)據(jù)庫(通過序列和文本)，包括關(guān)于人源化構(gòu)建體的設(shè)計問題、構(gòu)架選擇、構(gòu)架回復(fù)突變及結(jié)合親和性的信息。
[0142]也見AntibodyEngineering Methods and Protocols, Ed.Benny K C Lo, Methodsin Molecular Biology?, Human Press 所述。見 http: / / www.blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-engineering-methods-and-protocols.pdf o
[0143]在本說明書中的一個實施方案中，“種系”是指規(guī)范的種系基因區(qū)段序列。
[0144]本發(fā)明涉及提供在免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座中的新的V、D和J配對。提供了新的、偏向的抗體多樣性及潛在擴(kuò)展的多樣性。本發(fā)明的一方面在體內(nèi)在抗體V(D)J重組期間利用相容的重組信號序列(RSS)的天然配對，本發(fā)明的這個方面提供了使用RSS相容性觀測結(jié)果的V、D和J基因區(qū)段的新的合成組合。
[0145]本發(fā)明另一方面基于在針對感染性疾病病原體產(chǎn)生的天然發(fā)生的人抗體中V、D和J的使用偏向的觀測。本發(fā)明可用于在轉(zhuǎn)基因非人動物中操縱抗體基因多樣性，由此提供新的及潛在擴(kuò)展的多樣性或者偏向于抗體共同的可變基因使用的多樣性，可用于治療和/或預(yù)防某些疾病或病癥，如感染性疾病。這個偏向抗體庫集的能力還提供了簡化抗體混合物生產(chǎn)的方法，如在希望靶向多個病原體抗原的多克隆方法中可用于治療和/或預(yù)防感染性疾病的多克隆抗體治療劑。為此，本發(fā)明還提供了雙特異性抗體，其能結(jié)合一種以上的抗原(例如由相同病原體表達(dá)的多個感染性抗原)，因此提供了使用多克隆抗體混合物不可能的優(yōu)勢(如生產(chǎn) 、給藥劑量和施用優(yōu)勢)。
[0146]本發(fā)明提供了脊椎動物和細(xì)胞，如轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠或者轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠細(xì)胞。此外，本發(fā)明涉及使用所述脊椎動物分離抗體或編碼抗體的核苷酸序列的方法。本發(fā)明還提供了抗體、核苷酸序列、藥物組合物及應(yīng)用。
[0147]為此，本發(fā)明在第一種配置中提供了:
[0148]非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細(xì)胞，其基因組包含:
[0149](a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人V基因區(qū)段(任選多個VH)、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人J基因區(qū)段；任選其中重鏈基因座如下述第二種配置中的(a)所述；及
[0150](b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含:
[0151](i)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VH基因區(qū)段和一或多個人J基因區(qū)段(任選重排的VhJlCl或VhJa Cl，其中(^是(^或(^);或者
[0152](ii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VL基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人Jh基因區(qū)段(任選重排的'01(^或￥；^1(^，其中(^是(^或1);或者
[0153](iii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VL基因區(qū)段及一或多個人叉基因區(qū)段，所述VL基因區(qū)段選自如下一組中:VA II基因家族成員、VaVII4A、Va 112.1、VaVII4A、Va I基因家族成員、νλ3 基因家族成員、IGLV1S2、Vx3-cML70、lalh2、lalvl、Ia3h3、Kv325、Vk I基因家族成員、κ 1-15A(KL012)、VkII家族成員、VkIII家族成員、VkI基因家族成員、κ 1-15A(KL012)、VKIIA2(任選 A2a 等位基因)、VKA27(Humkv325)及與其至少 80%相同的基因區(qū)段；任選一或多個VL基因區(qū)段選自下文的列表A1、A2、A1.UAL 2、A2.1、A2.2、A2.3或 Α2.4。[0154]其中所述重鏈基因座中基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，所述輕鏈基因座中基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時小鼠能產(chǎn)生包含通過所述重鏈基因座的重組產(chǎn)生的重鏈及通過所述輕鏈基因座的重組產(chǎn)生的輕鏈的抗體。
[0155]本發(fā)明的這個配置因此在轉(zhuǎn)基因非人脊椎動物如小鼠或大鼠中提供了新的、合成的抗體和基因庫集的可能性。這種新的庫集是需要的，因為其提供了新抗體庫的可能性，從中在用預(yù)定抗原免疫脊椎動物之后可以選擇先導(dǎo)抗體。這因此提供了可以從中分離具有希望特性的抗體的庫，例如對于特異性靶抗原結(jié)合具有相對高親和性的抗體。希望的是可以從免疫的脊椎動物中直接分離高親和性抗體，因為這樣可以提供可潛在用作治療和/或預(yù)防性藥物的抗體前導(dǎo)，而不需要進(jìn)一步大量的親和性成熟(例如通過體外抗體展示如核糖體展示或者噬菌體展示)?？梢愿鶕?jù)需要對抗體的效應(yīng)子部分進(jìn)行修飾(例如恒定區(qū)的人源化)，而不需要操縱可變區(qū)的序列?；蛘?，或此外，抗體的庫可以允許選擇具有希望的生物物理學(xué)特性和/或表位特異性的先導(dǎo)抗體。后者對于發(fā)現(xiàn)針對如下表位的先導(dǎo)抗體是重要的，所述表位是先前未產(chǎn)生治療性 和/或預(yù)防性抗體的表位或者難以由攜帶轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白基因座的先前非人脊椎動物產(chǎn)生的抗體基因多樣性產(chǎn)生的抗體達(dá)到的，例如基于由RPC1-1IBAC所示的單個人基因座的那些。
[0156]本發(fā)明的細(xì)胞(根據(jù)本發(fā)明任何方面或配置)是例如B細(xì)胞、雜交瘤或干細(xì)胞，任選胚胎干細(xì)胞或者造血干細(xì)胞。一方面，所述ES細(xì)胞衍生自小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv品系。一方面，所述非人脊椎動物是嚙齒類動物，優(yōu)選小鼠，及本發(fā)明的細(xì)胞是嚙齒類動物細(xì)胞或ES細(xì)胞，適當(dāng)?shù)氖切∈驟S細(xì)胞。本發(fā)明的ES細(xì)胞可用于產(chǎn)生動物，使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行，包括將ES細(xì)胞注射進(jìn)胚泡中，隨后將嵌合的胚泡植入雌性動物中以產(chǎn)生可以繁殖的后代，針對具有需要插入的純合重組體進(jìn)行選擇。一方面，本發(fā)明涉及包含ES細(xì)胞衍生的組織及宿主胚胎衍生的組織的轉(zhuǎn)基因動物。一方面，本發(fā)明涉及遺傳改變的后代動物，包括具有對于VDJ和/或VJ區(qū)是純合重組體的動物。
[0157]攜帶如(b) (i)和(ii)所述一或多個輕鏈基因座的脊椎動物提供了新的及潛在擴(kuò)展的抗體和基因庫集，通過采用合成的非天然發(fā)生的免疫球蛋白基因區(qū)段(V、D、J、C)組合而成。在這方面，本發(fā)明人意識到提供混合重鏈基因區(qū)段與輕鏈基因座那些基因區(qū)段的抗體和基因庫集的需求和可能性。這基于本發(fā)明人的觀測結(jié)果:首先，自然提示具有VH-VH或VL-VL配對(與更經(jīng)典的VH-VL配對相反)的功能性抗體的可能性。例如，參見駱駝科(Camelidae)的重鏈抗體，其產(chǎn)生具有配對的VH結(jié)構(gòu)域及缺乏輕鏈VL結(jié)構(gòu)域的抗體(例如見 Nature.1993Jun3 ;363 (6428): 446-8 ;NaturalIy occurring antibodies devoid oflight chains ;Hamers_Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，HamersC, Songa EB, Bendahman N, Hamers R)。這些抗體發(fā)揮特異性結(jié)合抗原的功能,這種抗體在這種駱駝科動物(例如美洲駱駝，駱駝，羊駝)的血液中發(fā)現(xiàn)。具有VH配對的這種抗體也可以是合成產(chǎn)生的，以提供治療性和預(yù)防性藥物(見例如W01994004678、W02004041862、W02004041863所述)。轉(zhuǎn)基因小鼠也可以產(chǎn)生這種重鏈抗體，以及所述抗體的體內(nèi)產(chǎn)生使得小鼠的免疫系統(tǒng)可以選擇VH-VH配對，有時選擇其中已經(jīng)在體內(nèi)由小鼠導(dǎo)入突變的這種配對以適應(yīng)配對(W02010109165A2)。因此，本發(fā)明人認(rèn)識到采用體內(nèi)抗體產(chǎn)生系統(tǒng)(而不是體外系統(tǒng)如抗體的噬菌體或核糖體展示)可以適應(yīng)于本發(fā)明設(shè)想的合成的免疫球蛋白基因區(qū)段組合。[0158]本發(fā)明人的第二個觀測結(jié)果在于天然發(fā)生的免疫球蛋白基因座的結(jié)構(gòu)，特別是介導(dǎo)體內(nèi)V(D) J重組的重組信號序列(RSS)的排列(見例如Cell.2002Apr ；109Supp1:S45-55.The mechanism and regulation of chromosomal V (D) Jrecombination ；Bassing CH, Swat ff, Alt FW,所述文獻(xiàn)并入本文作參考)。如圖6所例證，已經(jīng)鑒別了兩種類型的RSS元件:一轉(zhuǎn)角RSS(12-RSS)和兩轉(zhuǎn)角RSS(23_RSS)。自然地，λ輕鏈基因座中的VJ重組，如果在位于V λ的3’端的兩轉(zhuǎn)角RSS與位于JA的5’端的一轉(zhuǎn)角RSS之間發(fā)生重組，RSS是相反方向。自然地，在κ輕鏈基因座中的VJ重組，如果在位于Vk的3’端的一轉(zhuǎn)角RSS與位于J κ的5’端的兩轉(zhuǎn)角RSS之間發(fā)生重組，RSS是相反方向。自然地，在重鏈基因座中的VD重組，如果在位于VH的3’端的兩轉(zhuǎn)角RSS與位于D的5 ’端的一轉(zhuǎn)角RSS之間發(fā)生重組，RSS是相反方向。自然地，在重鏈基因座中的DJ重組，如果在位于D的3’端的一轉(zhuǎn)角RSS與位于JH的5’端的兩轉(zhuǎn)角RSS之間發(fā)生重組，RSS是相反方向。因此，通常兩轉(zhuǎn)角RSS與相反方向的一轉(zhuǎn)角RSS相容。本發(fā)明人認(rèn)識到可以使用這個觀測結(jié)果構(gòu)建轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白基因座，由此當(dāng)以相反方向提供兩轉(zhuǎn)角RSS與一轉(zhuǎn)角RSS時，5’基因區(qū)段可以與3’基因區(qū)段重組(例如V與J ;或者V與D)，每個RSS鄰近各自的一個基因區(qū)段。因此，本發(fā)明人認(rèn)識到，在一個實施方案中，免疫球蛋白基因座可以用一或多個如下排列方式構(gòu)建(5，至3’):
[0159](k)[V(重鏈，λ 或 κ)]-[兩轉(zhuǎn)角 RSS]-[—轉(zhuǎn)角 RSS] _[D]-[JH]，其中所述 RSS 是相反方向；
[0160](I) [VH]_[D]_ [兩轉(zhuǎn)角RSS]-[—轉(zhuǎn)角RSS]-[J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0161](m) [VH]_[D]_ [—轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[J κ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0162](n) [VH或Vk ]_[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[—轉(zhuǎn)角RSS]-[J λ ]，其中所述RSS是相反方向； [0163](ο) [Vk ]_[—轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS] - [JH或J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0164](P) [V (重鏈，λ 或 κ)]-[一轉(zhuǎn)角 RSS]-[兩轉(zhuǎn)角 RSS] _[D]-[JH]，其中所述 RSS 是相反方向；
[0165](q) [VH]_[D]_ [—轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS] _ [J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0166](r) [VH]_[D]_ [兩轉(zhuǎn)角RSS]-[—轉(zhuǎn)角RSS]-[J κ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0167](s) [VH或Vk ]_[—轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向；
[0168](t) [Vk ]_[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[—轉(zhuǎn)角RSS] - [JH或J λ ]，其中所述RSS是相反方向。
[0169]技術(shù)人員將認(rèn)識到可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)提供包含RSS與V、D或J的合成組合的載體用于本發(fā)明的這個方面中，由此所述載體可用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白基因座(例如使用本領(lǐng)域已知的同源重組和/或重組酶介導(dǎo)的盒交換，例如見 US7501552 (Medarex)、US5939598 (Abgenix)、US6130364 (Abgenix)、W002/066630 (Regeneron)、W02011004192 (Genome Research Limited)、W02009076464、W02009143472和W02010039900 (Ablexis)所述，所述文獻(xiàn)在此并入本文作參考。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組工程技術(shù)在大腸桿菌中產(chǎn)生RSS與基因區(qū)段的這種合成組合以構(gòu)建攜帶所述合成組合的BAC載體,之后使用同源重組或RMCE (例如使用cre/lox位點(diǎn)特異性重組)插入胚胎干細(xì)胞中。關(guān)于重組工程的詳細(xì)描述可見于www.genebridges.com及在EP1034260和EP1204740中所述，所述文獻(xiàn)在此并入本文作參考。
[0170]在(b) (i)的一個實施方案中，所有輕鏈基因座V基因區(qū)段均是人VH基因區(qū)段(任選具有一或多個人V λ基因區(qū)段)。
[0171]在(b)⑴的一個實施方案中，所述恒定區(qū)是小鼠、大鼠或者人CL，如CX。在一個實施方案中，J和恒定區(qū)均由一或多個人JX CA提供。
[0172]盡管通常對任何抗原和疾病均有效，但是攜帶(b) (iii)的一或多個輕鏈基因座的脊椎動物是有益的，特別用于產(chǎn)生針對感染性疾病病原體的抗體前導(dǎo)。在這方面，本發(fā)明人認(rèn)識到提供抗體和基因庫集的需要性和可能性，其偏向于通常見于人對感染性疾病病原體的天然抗體反應(yīng)中的免疫球蛋白基因區(qū)段。本發(fā)明人認(rèn)識到希望的是提供脊椎動物、細(xì)胞、方法等用于基于對抗原如感染性疾病病原體的抗原的天然人免疫應(yīng)答產(chǎn)生治療性和/或預(yù)防性抗體。在這個方面，所述文獻(xiàn)觀測通常使用免疫球蛋白基因區(qū)段在人體中產(chǎn)生抗感染性應(yīng)答(表1)。
[0173]表1:在針對感染性疾病病原體的人抗體應(yīng)答中免疫球蛋白基因使用
[0174]
【權(quán)利要求】
1. 非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎動物細(xì)胞(例如小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞)，其基因組包含人免疫球蛋白D基因區(qū)段庫集，所述人免疫球蛋白D基因區(qū)段庫集偏向于人 D2 和 / 或 D3 家族或者偏向于選自 D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和D6-19的一個、多個或者所有人D基因區(qū)段。
2.權(quán)利要求1的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述D基因區(qū)段庫集由或者基本由選自D1-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19 的 I 個、2 個或者 3 個人基因區(qū)段組成。
3.權(quán)利要求1或2的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，所述未重排的免疫球蛋白重鏈基因座包含(5’至3’方向)人VH、D和JH基因區(qū)段，并且權(quán)利要求1中所述的人D基因與所述VH基因區(qū)段由不超過4個其它D基因區(qū)段(例如無D基因區(qū)段)間隔開。
4.前述任何權(quán)利要求的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，所述未重排的免疫球蛋白重鏈基因座包含所述人D基因區(qū)段，并且在所述基因座中在所述人D基因區(qū)段之間無其它D基因區(qū)段。
5.前述任何權(quán)利要求的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含選自Dl-26、D2-2、D2-15、D3-3、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19 的人 D 基因區(qū)段的三個或更多個拷貝。
6.權(quán)利要求5的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含選自Dl-26、D2-2、D2-15、D3-3、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13和D6-19的第一個和第二個人D基因區(qū)段，其中所述第一個D基因區(qū)段以三或更多個拷貝存在及其中第二個D基因區(qū)段以三或更多個拷貝存在。
7.前述任何權(quán)利要求的脊椎動物或細(xì)胞，其中D基因區(qū)段選自D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01 和 D3-22*01，或者選自 Dl_26*01、D2_2*02、D3_9*01、D3_10*01、D3_22*01、D4-17*01、D6-13*01 和 D6_19*01。
8.非人脊椎動物(如小鼠或大鼠)或者非人脊椎動物細(xì)胞(如小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞)，任選根據(jù)前述任何權(quán)利要求的非人脊椎動物(如小鼠或大鼠)或者非人脊椎動物細(xì)胞(如小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞)，其基因組包含人免疫球蛋白VH基因區(qū)段庫集，其偏向于選自如下一組中的一個、多個或所有基因區(qū)段:VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2_5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和 VH7-4-1。
9.權(quán)利要求8的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述VH基因區(qū)段庫集基本上由或基本上由選自如下一組中的I個、2個或3個人基因區(qū)段組成:VHl-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和VH7-4-1。
10.權(quán)利要求8或9的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，所述未重排的免疫球蛋白重鏈基因座包含(5’至3’方向)人VH、D和JH基因區(qū)段，所述人VH基因區(qū)段與所述D基因區(qū)段由不超過4個其它VH基因區(qū)段(例如無VH基因區(qū)段)間隔開。
11.權(quán)利要求8-10任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，所述未重排的免疫球蛋白重鏈基因座包含所述人VH基因區(qū)段，并且在所述基因座中在所述人VH基因區(qū)段之間無其它VH基因區(qū)段。
12.權(quán)利要求8-11任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含選自如下一組中的人 VH 基因區(qū)段的 3 個或更多個拷貝:VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2_5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和 VH7-4-1。
13.權(quán)利要求12的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含選自如下一組中的第一個和第二個人 VH 基因區(qū)段:VHl-2、VHl-3、VHl-8、VHl-18、VH5-51、VHl-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和 VH7-4-1，其中第一個 VH 基因區(qū)段以3或更多個拷貝存在及其中第二個VH基因區(qū)段以3或更多個拷貝存在。
14.權(quán)利要求8-13任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述VH基因區(qū)段選自如下一組中:VHl-2*02, VH1-3*0U VH1-8*0U VH1-18*0U VH2-5*10, VH3_7*01、VH3-腫01、VH3_11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3_23*04、VH4_4*02、VH6_1*01 和 VH7-4_1*01。
15.權(quán)利要求8-16任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其包含具有選自所述組的VH基因區(qū)段的2或更多個拷貝的免疫球蛋白重鏈基因座。
16.任何權(quán)利要求的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含由一或多個人JH6基因區(qū)段組成的人JH基因區(qū)段庫集。
17.前述任何權(quán)利要求的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含偏向于JH6、任選JH6*02的人免疫球蛋白JH基因區(qū)段庫集。
18.權(quán)利要求17的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述JH基因區(qū)段庫集由或者基本上由3或更多個人JH6基因區(qū)段組成。
19.前述任何權(quán)利要求的脊椎動物或細(xì)胞，其中每個所述人基因區(qū)段的序列是人種系基因區(qū)段序列。
20.前述任何權(quán)利要求的脊椎動物或細(xì)胞，其中一個、多個或所有選擇的基因區(qū)段以2或更多個拷貝存在于基因組中，所述拷貝是彼此的變體。
21.前述任何權(quán)利要求的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述人基因區(qū)段由純合免疫球蛋白重鏈基因座提供。
22.非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎動物細(xì)胞(例如小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞)，其基因組包含人免疫球蛋白VH基因區(qū)段庫集、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人JH基因區(qū)段，其中所述VH庫集不包含選自如下一組中的一個、多個或所有VH基因區(qū)段:VHl-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH5-51、VH1-69、VH2-5、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH4-4、VH6-1 和 VH7-4-1。
23.非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎動物細(xì)胞(例如小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞)，其基因組包含人免疫球蛋白D基因區(qū)段庫集、一或多個人VH基因區(qū)段及一或多個人JH基因區(qū)段，其中所述D庫集不包含選自如下一組中的一個、多個或所有D基因區(qū)段:Dl-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19。
24.權(quán)利要求22或23的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含人JH基因區(qū)段庫集，所述人JH基因區(qū)段庫集不包含JH6。
25.非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或者非人脊椎動物細(xì)胞(例如小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞)，其基因組包含偏向于人JH6的人免疫球蛋白JH基因區(qū)段庫集。
26.權(quán)利要求25的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因組包含未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，所述未重排的免疫球蛋白重鏈基因座包含多個人JH6基因區(qū)段，任選其中所述基因組對于所述基因座是純合的。
27.權(quán)利要求26的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述重鏈基因座包含(5’至3’方向)人VH、D和JH基因區(qū)段，所述JH6基因區(qū)段與所述D基因區(qū)段由不超過兩個其它JH基因區(qū)段間隔開。
28.權(quán)利要求25、26或27的脊椎動物或細(xì)胞，其中在所述基因座中在所述人JH6基因區(qū)段之間中無其它JH基因區(qū)段。
29.非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或 者非人脊椎動物細(xì)胞(例如小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞)，其基因組包含人免疫球蛋白JH基因區(qū)段庫集，所述人免疫球蛋白JH基因區(qū)段庫集由一或多個人JH6基因區(qū)段組成。
30.權(quán)利要求25-29任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中所有所述基因區(qū)段均是人種系基因區(qū)段。
31.權(quán)利要求25-30任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其包含不同的變體JH6基因區(qū)段。
32.權(quán)利要求25-31任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述基因區(qū)段由純合的免疫球蛋白重鏈基因座提供。
33.單克隆或多克隆抗體組合物或者用于產(chǎn)生這種組合物的抗體生產(chǎn)細(xì)胞群，其中所述組合物或細(xì)胞群是通過用抗原免疫任何前述權(quán)利要求的至少一種脊椎動物而制備的，其中所述抗體具有人重鏈可變區(qū)，當(dāng)與相應(yīng)人種系V、D和J序列相比時其包含非人脊椎動物AID-模式體細(xì)胞超變(例如小鼠或大鼠AID-模式突變)和/或當(dāng)與相應(yīng)人種系V、D和J序列相比時其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)-模式連接突變；其中所述組合物包含至少一種具有長度為至少20個氨基酸的HCDR3 (根據(jù)MGT)的抗原特異性抗體。
34.特異性結(jié)合抗原的分離的抗體，所述抗體包含人重鏈可變區(qū)和非人恒定區(qū)，其中所述可變區(qū)衍生自(i)選自權(quán)利要求8中列舉的一組中的人VH基因區(qū)段與(ii)選自權(quán)利要求I中列舉的一組中的人D基因區(qū)段及與人JH基因區(qū)段(任選JH6)在非人脊椎動物中的重組；其中所述抗體具有長度為至少20個氨基酸的HCDR3(根據(jù)MGT);當(dāng)與相應(yīng)人種系V、D和J序列相比時其包含非人脊椎動物AID-模式體細(xì)胞超變(例如小鼠或大鼠AID-模式突變)和/或當(dāng)與相應(yīng)人種系V、D和J序列相比時其包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)-模式連接突變。
35.權(quán)利要求34的抗體，其中所述抗體得自或可得自權(quán)利要求1-32任一項的脊椎動物。
36.分離結(jié)合預(yù)定抗原的抗體的方法，所述方法包括: (a)提供權(quán)利要求1-32任一項的脊椎動物(任選小鼠或大鼠)； (b)用所述抗原免疫所述脊椎動物； (c)從所述脊椎動物取出B淋巴細(xì)胞，選擇表達(dá)結(jié)合所述抗原的抗體的一或多個B淋巴細(xì)胞； (d)任選使所述選擇的B淋巴細(xì)胞或者其后代永生化，任選通過從中產(chǎn)生雜交瘤而永生化；及 (e)分離由所述B淋巴細(xì)胞表達(dá)的抗體(例如，以及IgG型抗體)。
37.權(quán)利要求36的方法，其中在步驟(e)中，所述抗體具有長度為至少20個氨基酸的HCDR3 (根據(jù) MGT)。
38.權(quán)利要求36或37的方法，包括從所述B淋巴細(xì)胞中分離編碼結(jié)合所述抗原的所述抗體的核酸的步驟；任選地用編碼人或人源化重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列交換所述抗體的重鏈恒定區(qū)核苷酸序列及任選親和性成熟所述抗體的可變區(qū)；以及任選將所述核酸插入表達(dá)載體及任選宿主中。
39.權(quán)利要求36、37或38的方法，進(jìn)一步包括產(chǎn)生通過所述方法產(chǎn)生的抗體的拷貝、突變體或衍生物(例如人源化形式)。
40.權(quán)利要求33-39任一項的抗體組合物、細(xì)胞群、抗體或方法，其中所述抗原是感染性疾病病原體的抗原，任選其 中所述病原體是病毒或細(xì)菌。
41.權(quán)利要求40的抗體組合物、細(xì)胞群、抗體或方法，其中病原體選自流感嗜血桿菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、皰疹病毒科病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、HIV和流感病毒。
42.權(quán)利要求33-41任一項的抗體組合物、細(xì)胞群、抗體或方法，其中所述抗原是HIVgpl20抗原或者HIV gp41抗原。
43.權(quán)利要求33-40任一項的抗體組合物、細(xì)胞群、抗體或方法，其中所述抗原包含活性位點(diǎn)或裂縫，其中所述具有長度為至少20個氨基酸的HCDR3的抗體特異性結(jié)合所述抗原的活性位點(diǎn)或裂縫。
44.包含權(quán)利要求33-35及40-43任一項的抗體或抗體組合物或者由權(quán)利要求36-38任一項的方法產(chǎn)生的抗體的藥物組合物，用以治療和/或預(yù)防人感染性疾病(例如其中所述感染性疾病是由選自如下的病原體所致:流感嗜血桿菌，大腸桿菌，腦膜炎奈瑟氏菌，皰疹病毒科病毒，巨細(xì)胞病毒(CMV)，HIV和流感病毒)。
45.抗體重鏈的庫集(例如由抗體提供)，其包含一或多個衍生自人VH、D和JH的重組的重鏈，所述重鏈的可變結(jié)構(gòu)域HCDR3的長度為至少20個氨基酸(根據(jù)MGT)，其中 VH選自如下一組:
VHl-2*02, VH1-3*01, VH1-8*01, VH1-18*01, VH2-5*10, VH3-7*01, VH3_9*01、VH3-11*01、VH3-13*01、VH3-21*03、VH3-23*04、VH4-4*02、VH6-1*01 和 VH7-4_1*01，及D選自如下一組: D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01 和 D3_22*01，或者 D2-2*02、D3-9*01 和 D3_10*01，或者 D3-9*01 和 D3-10*01，或者 Dl-26、D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19，或者 D1-26*01、D2-2*02、D3-9*01、D3-10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01 和 D6_19*01，或者
D2-2、D3-9、D3-10、D3-22、D4-17、D6-13 和 D6-19，或者 D2_2*02、D3_9*01、D3_10*01、D3-22*01、D4-17*01、D6-13*01 和 D6_19*01，或者Dl-26、D2-2、D3-10 和 D6-19，或者D2-2、D3-9 和 D3-10 ； 任選地，JH是JH6 (例如JH6*02)； 其中 (a)所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域已經(jīng)在非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)中在體內(nèi)產(chǎn)生；和/或(b) 所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域當(dāng)與相應(yīng)人種系V、D和J序列相比時包含非人脊椎動物AID-模式體細(xì)胞超變(例如小鼠或大鼠AID-模式突變)和/或當(dāng)與相應(yīng)人種系V、D和J序列相比時包含非人(例如小鼠或大鼠)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)-模式連接突變。
46.編碼權(quán)利要求45的重鏈庫集的核酸集合。
47.獲得抗原特異性重鏈(例如由抗體提供)的方法，所述方法包括將權(quán)利要求45的庫集暴露于預(yù)定抗原并選擇特異性結(jié)合所述抗原的一或多個重鏈，其中一或多個重鏈?zhǔn)欠蛛x的，具有長度為至少20個氨基酸的HCDR3。
48.非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細(xì)胞，其基因組包含: (a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人V基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人J基因區(qū)段，任選其中所述重鏈基因座如權(quán)利要求81的(a)所述；及 (b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含: (i)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VH基因區(qū)段及一或多個人J基因區(qū)段(任選重排的VhJA或VhJaQ，其中Q是Ca或CO ;或者 (ii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VL基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人Jh基因區(qū)段(任選重排的VlDJhCl或VxDJhCl,其中Cl是Ca或C K);或者 (iii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VL基因區(qū)段及一或多個人叉基因區(qū)段，所述一或多個人VL基因區(qū)段選自如下一組中:VAII基因家族成員，VaVII4A, νλΙΙ2.1，VaVII4A,VaI 基因家族成員，νλ3 基因家族成員，IGLV1S2, VA3-cML70, lalh2, lalvl, Ia3h3, Kv325,Vk I基因家族成員，κ 1-15A(KL012), Vk II家族成員，VkIII家族成員，Vk I基因家族成員，K 1-15A(KL012)，VKII A2 (任選 A2a 等位基因)，VkA27 (Humkv325)及與其至少 80%相同的基因區(qū)段； 其中重鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，輕鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時，小鼠能產(chǎn)生包含由重鏈基因座重組產(chǎn)生的重鏈和由輕鏈基因座重組產(chǎn)生的輕鏈的抗體。
49.權(quán)利要求48的脊椎動物或細(xì)胞，其中在(b)(i)中，輕鏈基因座的J基因區(qū)段是夂基因區(qū)段，及任選輕鏈基因座的恒定區(qū)是λ恒定區(qū)；或者在(b) (ii)中，，及任選輕鏈基因座的恒定區(qū)是λ恒定區(qū)。
50.權(quán)利要求48或49的脊椎動物或細(xì)胞，其中 在(b) (i)中，輕鏈基因座的V基因區(qū)段庫集包含或由一或多個VH基因區(qū)段組成，所述VH基因區(qū)段選自如下一組中:VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)，VhIV 基因家族成員，VhI 119.1 (VH3-15)，VhIII VH26 (VH3-23), VH3_21，LSG6.1，LSG12.1，DP77(V3-21), Vh Hll, VH1GRR, ha3h2, VHI_halcl，VhII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3,Hvl051, 71-2，Hvlf 10，VH4.11，71-4，VH251，VH1-69 及與其至少 80%相同的基因區(qū)段;或者 在(b) (iii)中，輕鏈基因座V基因區(qū)段庫集由VL基因區(qū)段類型(任選及其一或多個突變體)組成，其中所述VL基因區(qū)段選自所述一組VL基因區(qū)段。
51.權(quán)利要求48-50任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中在(a)中，所述恒定區(qū)是重鏈內(nèi)源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)和/或在(b)中，所述恒定區(qū)是輕鏈內(nèi)源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。
52.權(quán)利要求48-51任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中內(nèi)源性重鏈和輕鏈表達(dá)已經(jīng)被失活。
53.非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細(xì)胞，其基因組包含: (a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人V基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人J基因區(qū)段 '及 (b)(i)未重排的免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人VH基因區(qū)段和一或多個人J基因區(qū)段，其中每個人VH基因區(qū)段是與用于產(chǎn)生重排的VDJ的人VH基因區(qū)段(或其突變體)相同的人基因區(qū)段，所述重排的VDJ編碼來自抗體表達(dá)細(xì)胞的人抗體的重鏈可變區(qū)，其中所述抗體結(jié)合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；或者 (ii)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的重排的VJ區(qū)或VDJ區(qū)，其中重組區(qū)的核苷酸序列與通過人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段與人VH基因區(qū)段重組產(chǎn)生的核苷酸序列相同，所述人VH基因區(qū)段與用于產(chǎn)生重排的VDJ的人VH基因區(qū)段(或其突變體)相同，所述重排的VDJ編碼來自抗體表達(dá)細(xì)胞的人抗體的重鏈可變區(qū)，其中所述抗體結(jié)合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)； (C)其中重鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，輕鏈基因座中的基因區(qū)段或VJ或VDJ與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時，小鼠能產(chǎn)生包含通過重鏈基因座重組產(chǎn)生的重鏈和衍生自輕鏈基因座的輕鏈的抗體； (d)任選地，當(dāng)應(yīng)用(b)(i)時，輕鏈基因座中每個所述VH基因區(qū)段選自如下一組中=VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)，VHIV基因家族成員，VHI119.1(VH3-15),VHIII VH26(VH3-23), VH3-21,LSG6.1,LSG12.1,DP77(V3-21),VH Hll,VH1GRR, ha3h2, VH1-halcl, VHII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3, Hvl051,71-2, Hvlf10, VH4.11，71-4，VH251，VH1-69及與其至少80%相同的基因區(qū)段； (e)任選地，當(dāng)應(yīng)用(b)(ii)時，重組區(qū)的核苷酸序列與通過人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段與人VH基因區(qū)段重組產(chǎn)生的核苷酸序列相同，所述人VH基因區(qū)段選自如下一組中=VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)，VHIV基因家族成員，VHIII9.1(VH3-15),VHIII VH26(VH3-23), VH3-21, LSG6.1,LSG12.1,DP77(V3-21),VH Hll,VH1GRR, ha3h2, VH1-halcl, VHII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3, Hvl051，71_2，HvlflO, VH4.11，71-4，VH251，VH1-69及與其至少80%相同的基因區(qū)段。
54.權(quán)利要求53的脊椎動物或細(xì)胞，其中輕鏈基因座的J基因區(qū)段是Ja基因區(qū)段，任選輕鏈基因座的恒定區(qū)是λ恒定區(qū)。
55.權(quán)利要求53或54的脊椎動物或細(xì)胞，其中輕鏈基因座的V基因區(qū)段庫集包含或者由人VH1-69基因區(qū)段組成。
56.權(quán)利要求53、54或55的脊椎動物或細(xì)胞，其中在(a)中，所述恒定區(qū)是重鏈內(nèi)源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。
57.權(quán)利要求53、54、55或56的脊椎動物或細(xì)胞，其中在(b)中，所述恒定區(qū)是輕鏈內(nèi)源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。
58.權(quán)利要求53-57任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于輕鏈基因座(b) (i)或(ii)是純合的，任選其中: -輕鏈基因座的V基因區(qū)段庫集由選自如下一組中的一或多個人VH基因區(qū)段組成:VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)，VHIV基因家族成員，VHI119.1(VH3-15),VHIII VH26(VH3-23), VH3-21,LSG6.1,LSG12.1,DP77(V3-21),VH Hll,VH1GRR, ha3h2, VH1-halcl, VHII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3, Hvl051, 71-2, HvlflO, VH4.11，71-4，VH251，VH1-69及與其至少80%相同的基因區(qū)段；或者 -輕鏈基因座的重組VJ或VDJ庫集由與通過人VH基因區(qū)段與人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段重組產(chǎn)生的一或多個核苷酸序列相同的序列組成，所述人VH基因區(qū)段選自如下一組中=VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)，VHIV基因家族成員，VHI119.1 (VH3-15), VHIII VH26 (VH3-23), VH3-21, LSG6.1，LSG12.1，DP77(V3_21)，VH Hll, VH1GRR, ha3h2, VH1-halcl, VHII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3, Hvl051，71_2，HvlflO,VH4.11，71-4，VH251，VH1-69及與其至少80%相同的基因區(qū)段。
59.權(quán)利要求53-58任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中內(nèi)源性重鏈和輕鏈表達(dá)已經(jīng)被失活，及其中權(quán)利要求53-58任一項的輕鏈基因座是在所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組中唯一的功能性輕鏈基因座。
60.權(quán)利要求53-59任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述脊椎動物或細(xì)胞的每個免疫球蛋白輕鏈基因座如權(quán)利要求53中(b) (i)所述，并且包含僅一個人VH基因區(qū)段，所述人VH基因區(qū)段選自如下一組中=VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb家族成員)，VHIV 基因家族成員，VHI1 19.1 (VH3-15), VHIII VH26 (VH3-23), VH3-21, LSG6.1，LSG12.1，DP77(V3-21), VH Hll, VH1GRR, ha3h2, VH1-halcl, VHII1-VH2-1, VH4.18，ha4h3, Hvl051,71-2，HvlflO, VH4.11,71-4, VH251，VH1-69及與其至少80%相同的基因區(qū)段，任選其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于所述輕鏈?zhǔn)羌兒系?，由此所有輕鏈基因座均包含相同的單個人VH基因區(qū)段。
61.權(quán)利要求53-59任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述脊椎動物或細(xì)胞的每個免疫球蛋白輕鏈基因座如權(quán)利要求53中(b) (ii)所述，包含僅一個重排的VJ或VDJ區(qū)，任選其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于所述輕鏈?zhǔn)羌兒系?，由此所有輕鏈基因座均包含相同的單個重排的VJ或VDJ區(qū)。
62.權(quán)利要求60或61的脊椎動物或細(xì)胞，其中每個免疫球蛋白輕鏈基因座進(jìn)一步包含VH基因區(qū)段或重排的區(qū)域，其分別是所述選擇的人VH基因區(qū)段或重排的區(qū)域的突變體，任選其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于所述輕鏈突變體VH基因區(qū)段或者重排的區(qū)域是純合的。
63.權(quán)利要求60的脊椎動物或細(xì)胞，其中每個免疫球蛋白輕鏈基因座包含選自所述一組中的僅兩個人VH基因區(qū)段，任選其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于所述兩個輕鏈人VH基因區(qū)段是純合的。
64.權(quán)利要求61的脊椎動物或細(xì)胞，其中每個免疫球蛋白輕鏈基因座包含僅兩個所述重排的VJ或VDJ區(qū)，任選其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于所述兩個輕鏈重排的VJ或VDJ區(qū)是純合的。
65.單克隆或多克隆抗體組合物，通過用抗原免疫權(quán)利要求48-64任一項的至少一種脊椎動物(例如小鼠或大鼠)而制備，任選其中所述抗原是感染性疾病病原體抗原，任選其中相同抗原用于免疫所有脊椎動物，任選其中所述抗體是IgG型。
66.分離結(jié)合預(yù)定抗原的抗體的方法，所述方法包括: (a)提供權(quán)利要求48-64任一項的脊椎動物(任選小鼠或大鼠)； (b)用所述抗原免疫所述脊椎動物(任選其中所述抗原是感染性疾病病原體的抗原)； (c)從脊椎動物取出B淋巴細(xì)胞并選擇表達(dá)結(jié)合所述抗原的抗體的一或多個B淋巴細(xì)胞； (d)任選使所述選擇的B淋巴細(xì)胞或其后代永生化，任選通過從中產(chǎn)生雜交瘤而進(jìn)行永生化；及 (e)分離由所述B淋巴細(xì)胞表達(dá)的抗體(例如，以及IgG型抗體)。
67.權(quán)利要求66的方法，包括從所述B淋巴細(xì)胞中分離編碼結(jié)合所述抗原的所述抗體的核酸的步驟；任選用編碼人或人源化重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列交換所述抗體的重鏈恒定區(qū)核苷酸序列及任選親和性成熟所述抗體的可變區(qū)；以及任選將所述核酸插入表達(dá)載體及任選宿主中。
68.權(quán)利要求66或67的方法,進(jìn)一步包括產(chǎn)生通過權(quán)利要求66或67的方法產(chǎn)生的抗體的突變體或衍生物。
69.產(chǎn)生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求66-68任一項的方法，通過用抗原分別免疫第一和第二脊椎動物(任選第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)并組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或者所述抗體的突變體或衍生物)以產(chǎn)生多克隆抗體混合物；任選其中單獨(dú)或組合(⑴和(ii);或者⑴和(iii))應(yīng)用如下步驟: (i)用相同抗原或不同抗原免疫脊椎動物(任選其中所述不同抗原是由相同病原性生物體(或其家族成員)表達(dá)的)); (ii)在免疫之前，所述脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的VH基因庫集(任選單個VH基因)及任選存在的相同的J庫集；任選所述哺乳動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的； (iii)在免疫之前，所述脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的VJ或VDJ庫集(任選單個VJ或VDJ);任選所述脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的。
70.產(chǎn)生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求66-68任一項的方法，通過用第一和第二抗原免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)并組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或者所述抗體的突變體或衍生物)以產(chǎn)生多克隆抗體混合物；任選其中單獨(dú)或組合(（i）和(ii);或者（i）和(iii))應(yīng)用如下步驟: (i)所述抗原由相同病原性生物體(或其家族成員)表達(dá)； (ii)在免疫之前，所述脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的VH基因庫集(任選單個VH基因)及任選存在的相同的J庫集；任選所述哺乳動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的； (iii)在免疫之前，所述脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的VJ或VDJ庫集(任選單個VJ或VDJ);任選所述脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的。
71.產(chǎn)生能表達(dá)多克隆抗體混合物的宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括，在權(quán)利要求67的方法中: (a)用第一和第二抗原(任選其中不同抗原由相同病原體生物體(或其家族成員)表達(dá))免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)； (b)從所述脊椎動物B淋巴細(xì)胞中分離編碼第一種和第二種抗-抗原抗體的核酸； (c)確定第一種抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列； (d)確定第二種抗體的重鏈可變區(qū)及任選確定輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列； (e)將每個抗體的重鏈 可變區(qū)編碼序列插入重鏈表達(dá)載體中；任選其中每個重鏈的恒定區(qū)編碼序列交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列； (f)將第一種抗體的輕鏈可變區(qū)編碼序列插入輕鏈表達(dá)載體中；任選其中第一種抗體的輕鏈的恒定區(qū)編碼序列交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列； (g)任選將第二種抗體的輕鏈可變區(qū)編碼序列插入輕鏈表達(dá)載體中；任選其中第二種抗體的輕鏈的恒定區(qū)編碼序列交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；及 (h)將每個表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中并在所述宿主細(xì)胞的混合物中共表達(dá)抗體鏈以產(chǎn)生抗體，每個抗體均包含所述重鏈可變區(qū)和輕鏈之一或二者；任選其中所述表達(dá)載體一起導(dǎo)入相同宿主細(xì)胞(例如CHO或HEK293細(xì)胞)中，以便細(xì)胞能表達(dá)抗體輕鏈和重鏈，由此所述細(xì)胞或多個宿主細(xì)胞表達(dá)抗體，每個抗體均包含所述重鏈可變區(qū)和輕鏈之一或二者； (i)任選地: 在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的VH基因庫集(任選單個VH基因區(qū)段)及任選存在的相同的J庫集(任選單個J基因區(qū)段)；任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的；或者 在免疫之前，脊椎動物的輕鏈基因座含有相同的重排的VJ或VDJ庫集(任選單個VJ或VDJ);任選脊椎動物的輕鏈基因座在免疫之前是相同的。
72.產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求71的方法及表達(dá)單克隆抗體或所述抗體的多克隆混合物；任選隨后分離包含第一種和/或第二種抗體的重鏈可變區(qū)的抗體。
73.權(quán)利要求66-72任一項的方法，其中用于免疫的每個脊椎動物如下所述提供: (a)從人血液或組織(例如B淋巴細(xì)胞、PBMC、骨髓、脾、扁桃體或淋巴結(jié))樣品中分離B淋巴細(xì)胞，其表達(dá)結(jié)合預(yù)定抗原的抗體(例如由感染性疾病病原體表達(dá)的抗原；任選其中所述血清或組織來自患有、易感于或者恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體，或者來自攜帶所述生物體的人類個體)； (b)確定何種人種系VH基因區(qū)段在人體中重組以產(chǎn)生編碼所述抗體重鏈可變區(qū)的所述B淋巴細(xì)胞的核苷酸序列； (c)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因脊椎動物，其中所述人種系VH基因區(qū)段提供于權(quán)利要求48-63任一項的其輕鏈基因座中 '及 (d)提供所述轉(zhuǎn)基因脊椎動物以在權(quán)利要求66-72任一項的方法中免疫。
74.權(quán)利要求66-72任一項的方法，其中用于免疫的每個脊椎動物如下所述提供: (a)從人血液或組織(例如B淋巴細(xì)胞、PBMC、骨髓、脾、扁桃體或淋巴結(jié))樣品中分離B淋巴細(xì)胞，其表達(dá)結(jié)合預(yù)定抗原的抗體(例如由感染性疾病病原體表達(dá)的抗原；任選其中所述血清或組織來自患有、易感于或者恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體，或者來自攜帶所述生物體的人類個體)； (b)確定編碼所述抗體的重排的VDJ或VJ區(qū)的所述B淋巴細(xì)胞的核苷酸序列； (c)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因脊椎動物，其中所述重排的VDJ或VJ區(qū)提供在權(quán)利要求48-64任一項的其輕鏈基因座中 '及 (d)提供所述轉(zhuǎn)基因脊椎動物以在權(quán)利要求66-72任一項的方法中進(jìn)行免疫。
75.通過權(quán)利要求72的方法或者從屬于權(quán)利要求72時的權(quán)利要求73或74的方法可獲得的或獲得的分離的抗體(例如IgG型抗體)或其突變體或衍生物抗體，其中(i)所述分離的抗體包含所述第一種抗體重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(ii)所述分離的抗體包含所述第二種抗體重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(iii)所述分離的抗體是雙特異性抗體，包含所述第一種抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的一個拷貝配對，及包含所述抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝，與第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的一個拷貝配對，任選其中所述雙特異性抗體結(jié)合權(quán)利要求71所述第一和第二抗原；所述分離的抗體或其突變體或衍生物抗體任選用于醫(yī)學(xué)中，任選用于治療和/或預(yù)防感染性疾病。
76.單克隆或多克隆抗體混合物(例如一或多種IgG型抗體)，其中所述單克隆抗體或者混合物包含或由通過權(quán)利要求65-71和72-74任一項的方法產(chǎn)生的抗體或者其突變體或衍生物抗體組成，任選用于醫(yī)學(xué)中，任選用于治療和/或預(yù)防感染性疾病，其中任選其中每個抗體均結(jié)合感染性疾病病原體的抗原，優(yōu)選相同抗原。
77.權(quán)利要求65、75或76的分離的單克隆或多克隆抗體或者其突變體或衍生物抗體在生產(chǎn)治療和/或預(yù)防感染性疾病的藥物中的應(yīng)用，任選其中所述感染性疾病是由細(xì)菌或病毒病原體引起的疾病。
78.權(quán)利要求75、76或77的抗體、混合物或應(yīng)用，其中所述感染性疾病選自由選自如下的病原體引起的疾病:流感嗜血桿菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、皰疹病毒科病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、HIV和流感病毒。
79.編碼權(quán)利要求65、75或76的抗體的核苷酸序列,任選其中所述核苷酸序列是載體的一部分。
80.包含權(quán)利要求65、75或76的抗體及稀釋劑、賦形劑或載體的藥物組合物。
81.非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細(xì)胞，其基因組包含: (a)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含: (i)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VL基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人J基因區(qū)段(任選重排的VJXJhCh或VaDJhCh);或者 (ii)位于恒定區(qū)上游的一或多個人VH基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段及一或多個人Jh基因區(qū)段，所述一或多個人VH基因區(qū)段選自VHIII基因家族成員(任選VHIIIa或VHIIIb 家族成員)、VHIV 基因家族成員、VHIII9.1 (VH3-15)、VHIII VH26 (VH3-23)、VH3_21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH Hll、VHlGRR、ha3h2、VH1-halcl、VHII1-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hvl051、71-2、Hvlfl0、VH4.11、71-4、VH251、VH1_69 及至少 80%相同的基因區(qū)段;及 (b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人V基因區(qū)段和一或多個人J基因區(qū)段，任選其中所述輕鏈基因座如權(quán)利要求48的(b) (i)或(b) (ii)所述，其 中所述重鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，所述輕鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時，小鼠能產(chǎn)生包含由所述重鏈基因座重組產(chǎn)生的重鏈及由所述輕鏈基因座重組產(chǎn)生的輕鏈的抗體。
82.權(quán)利要求81的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述輕鏈基因座的V基因區(qū)段庫集包含或由一或多個VL基因區(qū)段組成，所述VL基因區(qū)段選自VaII基因家族成員、VaVII4A、VaII2.1、￥^114六、￥入1基因家族成員、￥入3基因家族成員、161^152、￥;^3-。]^70、1&1112、1&1￥1、1&3113、Kv325、Vk I基因家族成員、κ Ι-15Α(KL012)、Vk II家族成員、VkIII家族成員、Vk I基因家族成員、κ 1-15A(KL012)、VKII A2 (任選A2a等位基因)、VkA27 (Humkv325)及與其至少80%相同的基因區(qū)段；和/或其中或在(a) (ii)中，所述重鏈基因座V基因區(qū)段庫集由一種VH基因區(qū)段類型(任選及一或其突變體)組成，其中所述VH基因選自所述一組VH基因區(qū)段。
83.權(quán)利要求81-82任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中在(a)中，所述恒定區(qū)是重鏈內(nèi)源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)和/或在(b)中，所述恒定區(qū)是輕鏈內(nèi)源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。
84.權(quán)利要求81-83任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中內(nèi)源性重鏈和輕鏈表達(dá)已經(jīng)被失活。
85.非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)或者脊椎動物細(xì)胞，其基因組包含: (a)(i)未重排的免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人VL基因區(qū)段、一或多個人D基因區(qū)段和一或多個Jh基因區(qū)段，其中每個人VL基因區(qū)段是與用于產(chǎn)生重排VJ的人VL基因區(qū)段(或其突變體)相同的人基因區(qū)段，所述重排的VJ編碼來自表達(dá)抗體細(xì)胞的人抗體輕鏈可變區(qū)，其中所述抗體結(jié)合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)；或者 (ii)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的重排的VJ區(qū)或者VDJ區(qū)，其中重組區(qū)域的核苷酸序列與由人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段與人VL基因區(qū)段重組產(chǎn)生的核苷酸序列相同，所述人VL基因區(qū)段與用于產(chǎn)生重排的VJ的人VL基因區(qū)段(或其突變體)相同，所述重排的VJ編碼來自抗體表達(dá)細(xì)胞的人抗體輕鏈可變區(qū)，其中所述抗體結(jié)合感染性疾病病原體的抗原(任選所述抗體的可變區(qū)與來自患有、易感于或者恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體的抗體相同)； (b)免疫球蛋白輕鏈基因座，其包含位于恒定區(qū)上游的一或多個人V基因區(qū)段及一或多個人J基因區(qū)段；及 (c)其中所述輕鏈基因座中的基因區(qū)段與其恒定區(qū)可操縱地連接，所述重鏈基因座中的基因區(qū)段或VJ或VDJ與其恒定區(qū)可操縱地連接，由此在免疫時，小鼠能產(chǎn)生包含通過所述輕鏈基因座重組產(chǎn)生的輕鏈和衍生自所述重鏈基因座的重鏈的抗體； (d)任選地，當(dāng)應(yīng)用(a)(i)時，所述重鏈基因座中每個所述VL基因區(qū)段選自如下一組中:V λ II基因家族成員，νλν?Ι4Α，VA 112.1, VAVII4A, νλ I基因家族成員，νλ3基因家族成員，IGLV1S2, VA 3-cML70, lalh2, lalvl, Ia3h3，Kv325，V κ I 基因家族成員，κ 1-15A(KL012)，Vk II 家族成員，Vk III 家族成員，Vk I 基因家族成員，κ Ι-15Α(KL012)，Vk II A2(任選A2a等位基因)，VKA27(Humkv325)及與其至少80%相同的基因區(qū)段； (e)任選地，當(dāng)應(yīng)用(a) (ii)時，重組區(qū)的核苷酸序列與通過人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段與人VL基因區(qū)段重組而產(chǎn)生的核苷酸序列相同，所述人VL基因區(qū)段選自如下一組中的VL基因區(qū)段:νλ II基因家族成員，νλν?Ι4Α，νλ 112.1, V λ VII4A, V λ I基因家族成員，νλ 3 基因家族成員，IGLV1S2, VA 3-cML70, lalh2, lalvl, Ia3h3, Kv325, Vk I基因家族成員，κ 1-15A(KL012), Vk II家族成員，Vk III家族成員，Vk I基因家族成員，κ 1-15A (KL012) ,Vk II A2 (任選 A2a 等位基因)，V κ A27 (Humkv325)及與其至少 80%相同的基因區(qū)段。
86.權(quán)利要求85的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述重鏈基因座的VL基因區(qū)段是Va基因區(qū)段。
87.權(quán)利要求85 或86的脊椎動物或細(xì)胞，其中在(a)中，所述恒定區(qū)是重鏈內(nèi)源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。
88.權(quán)利要求85、86或87的脊椎動物或細(xì)胞，其中在(b)中，所述恒定區(qū)是輕鏈內(nèi)源性非人脊椎動物(任選宿主小鼠或大鼠)恒定區(qū)。
89.權(quán)利要求85-88任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于重鏈基因座(a) (i)或(ii)是純合的，任選其中: -所述重鏈基因座的V基因區(qū)段庫集由一或多個人VL基因區(qū)段組成，所述人VL基因區(qū)段選自如下一組中II基因家族成員、VaVII4A、Va 112.1、VaVII4A、Va I基因家族成員、V人3 基因家族成員、IGLVlS2、Vx3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VK I 基因家族成員、κ 1-15A(KL012)、VkII 家族成員、VkIII 家族成員、Vk I 基因家族成員、κ Ι-15Α(KL012)、VkII Α2(任選A2a等位基因)、VKA27(Humkv325)及與其至少80%相同的基因區(qū)段；或者 -所述重鏈基因座的重組VJ或VDJ庫集由與通過人VL基因區(qū)段與人J基因區(qū)段及任選存在的人D基因區(qū)段重組產(chǎn)生的一或多個核苷酸序列相同的序列組成，所述人VL基因區(qū)段選自如下一組中的VL基因區(qū)段:νλ II基因家族成員，νλν?Ι4Α，νλ 112.1, V λ VII4A, V λ I基因家族成員，νλ 3 基因家族成員，IGLV1S2，VX 3-cML70，lalh2, lalvl, la3h3,Kv325, V κ I基因家族成員，κ 1-15A(KL012), Vk II家族成員，Vk III家族成員，Vk I基因家族成員，κ 1-15A(KL012)，Vk II A2 (任選 A2a 等位基因)，V κ A27 (Humkv325)以及與其至少 80%相同的基因區(qū)段。
90.權(quán)利要求85-89任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中內(nèi)源性重鏈和輕鏈表達(dá)已經(jīng)被失活，及其中權(quán)利要求85-89任一項的重鏈基因座是脊椎動物或細(xì)胞基因組中的唯一功能性重鏈基因座。
91.權(quán)利要求85-90任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述脊椎動物或細(xì)胞的每個免疫球蛋白重鏈基因座是如權(quán)利要求85中(a) (i)所述，包含僅一個人VL基因區(qū)段，所述人VL基因區(qū)段選自如下一組中的VL基因區(qū)段:νλ II基因家族成員，VAVII4A, VA 112.1，νλν?Ι4Α，V λ I 基因家族成員，νλ 3 基因家族成員，IGLV1S2, VA 3-cML70, lalh2, lalvl,Ia3h3，Kv325，Vk I基因家族成員，κ Ι-15Α(KL012)，Vk II家族成員，Vk III家族成員，Vk I 基因家族成員，κ 1-15A(KL012)，Vk II A2 (任選 A2a 等位基因)，V κ A27 (Humkv325)及與其至少80%相同的基因區(qū)段，任選其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于所述重鏈?zhǔn)羌兒系模纱怂兄劓溁蜃嗤膯蝹€人VL基因區(qū)段。
92. 權(quán)利要求85-90任一項的脊椎動物或細(xì)胞，其中所述脊椎動物或細(xì)胞的每個免疫球蛋白重鏈基因座是如權(quán)利要求85中(a) (ii)所述，包含僅一個的重排的VJ或VDJ區(qū)，任選其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于所述重鏈?zhǔn)羌兒系?，由此所有重鏈基因座均包含相同的單個重排的VJ或VDJ區(qū)。
93.權(quán)利要求91或92的脊椎動物或細(xì)胞，其中每個免疫球蛋白重鏈基因座進(jìn)一步包含VL基因區(qū)段或重排區(qū)域，其分別是所述選擇的人VL基因區(qū)段或者重排區(qū)域的突變體，任選其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于所述輕鏈突變體VL基因區(qū)段或重排區(qū)域是純合的。
94.權(quán)利要求91的脊椎動物或細(xì)胞，其中每個免疫球蛋白重鏈基因座包含僅兩個選自所述組中的人VL基因區(qū)段，任選其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于所述兩個重鏈人VL基因區(qū)段是純合的。
95.權(quán)利要求92的脊椎動物或細(xì)胞，其中每個免疫球蛋白重鏈基因座包含僅兩個所述重排的VJ或VDJ區(qū)，任選其中所述脊椎動物或細(xì)胞的基因組對于所述兩個重鏈重排的VJ或VDJ區(qū)是純合的。
96.通過用抗原免疫權(quán)利要求81-95任一項的至少一個脊椎動物(例如小鼠或大鼠)制備的單克隆或多克隆抗體組合物，任選其中所述抗原是感染性疾病病原體的抗原，任選其中用相同抗原免疫所有脊椎動物；任選其中所述抗體是IgG型。
97.分離結(jié)合預(yù)定抗原的抗體的方法，所述方法包括: (a)提供權(quán)利要求81-95任一項的脊椎動物(任選小鼠或大鼠)； (b)用所述抗原免疫所述脊椎動物(任選其中所述抗原是感染性疾病病原體的抗原)； (c)從所述脊椎動物中取出B淋巴細(xì)胞并選擇表達(dá)結(jié)合所述抗原的抗體的一或多個B淋巴細(xì)胞； (d)任選使所述選擇的B淋巴細(xì)胞或其后代永生化，任選通過從中產(chǎn)生雜交瘤進(jìn)行永生化；及 (e)分離由所述B淋巴細(xì)胞表達(dá)的抗體(例如，以及IgG型抗體)。
98.權(quán)利要求97的方法，包括從所述B淋巴細(xì)胞中分離編碼結(jié)合所述抗原的所述抗體的核酸的步驟；任選用編碼人或人源化重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列交換所述抗體的重鏈恒定區(qū)核苷酸序列及任選親和性成熟所述抗體的可變區(qū)；及任選將所述核酸插入表達(dá)載體及任選宿主中。
99.權(quán)利要求97或98的方法，進(jìn)一步包括產(chǎn)生通過權(quán)利要求97或98的方法產(chǎn)生的抗體的突變體或衍生物。
100.產(chǎn)生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求97-99任一項的方法，用抗原分別免疫第一和第二脊椎動物(任選第一和第二小鼠或者第一和第二大鼠)及組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或所述抗體的突變體或衍生物)以產(chǎn)生多克隆抗體混合物；任選其中單獨(dú)或組合(⑴和(ii);或者⑴和(iii))應(yīng)用如下步驟: (i)將脊椎動物用相同抗原或不同抗原免疫(任選其中不同抗原是由相同病原性生物體(或其家族成員)表達(dá)的)； (ii)在免疫之前，所述脊椎動物的重鏈基因座含有相同的VL基因庫集(任選單個VL基因)及任選存在的相同的D和/或J庫集；任選哺乳動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的； (iii)在免疫之前，所述脊椎動物的重鏈基因座含有相同的重排的VJ或VDJ庫集(任選單個VJ或VDJ);任選所述脊椎動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的。
101.產(chǎn)生多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求97-99任一項的方法，用第一和第二抗原免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)并組合分離自每個脊椎動物的抗-抗原抗體(或者所述抗體的突變體或衍生物)以產(chǎn)生多克隆抗體混合物；任選其中單獨(dú)或組合(⑴和(ii);或者⑴和(iii))應(yīng)用如下步驟: (i)所述抗原由相同病原性生物體(或其家族成員)表達(dá)； (ii)在免疫之前，所述脊椎動物的重鏈基因座含有相同的VL基因庫集(任選單個VL基因)及任選存在的相同的D和/或J庫集；任選哺乳動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的； (iii)在免疫之前，所述脊椎動物的重鏈基因座含有相同的重排的VJ或VDJ庫集(任選單個VJ或VDJ);任選所述脊椎動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的。
102.產(chǎn)生能表達(dá)多克隆抗體混合物的宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括:在權(quán)利要求98的方法中， (a)用第一和第二抗原(任選其中不同抗原由相同病原性生物體(或其家族成員)表達(dá))免疫一或多個脊椎動物(任選小鼠或大鼠)； (b)從所述脊椎動物的B淋巴細(xì)胞中分離編碼第一種和第二種抗-抗原抗體的核酸； (C)確定第一種抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列； (d)確定第二種抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列及任選確定第二種抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列； (e)將每個抗體的輕鏈可變區(qū)編碼序列插入輕鏈表達(dá)載體中；任選其中每個輕鏈的恒定區(qū)編碼序列交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列； (f)將第一種抗體的重鏈可變區(qū)編碼序列插入重鏈表達(dá)載體中；任選其中第一種抗體的重鏈的恒定區(qū)編碼序列交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列； (g)任選將第二種抗體的重鏈可變區(qū)編碼序列插入重鏈表達(dá)載體中；任選其中第二種抗體的重鏈恒定區(qū)編碼序列交換為編碼人或人源化恒定區(qū)的核苷酸序列；及 (h)將每個表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中并在所述宿主細(xì)胞混合物中共表達(dá)抗體鏈以產(chǎn)生抗體，每個抗體均包含所述輕鏈可變區(qū)和重鏈之一或二者；任選其中將表達(dá)載體一起導(dǎo)入相同宿主細(xì)胞中(例如CHO或HEK293細(xì)胞)由此所述細(xì)胞能表達(dá)抗體輕鏈和重鏈，由此所述細(xì)胞或多個宿主細(xì)胞表達(dá)抗體，每個抗體均包含所述輕鏈可變區(qū)和重鏈之一或二者； (i)任選地: 在免疫之前，所述脊椎動物的重鏈基因座含有相同的VL基因庫集(任選單個VL基因區(qū)段)及任選存在的相同的D和/或J庫集(任選單個D和J基因區(qū)段)；任選脊椎動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的；或者 在免疫之前，所述脊椎動物的重鏈基因座含有相同的重排的VJ或VDJ庫集(任選單個VJ或VDJ);任選脊椎動物的重鏈基因座在免疫之前是相同的。
103.產(chǎn)生單克隆抗體或多克隆抗體混合物的方法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求102的方法及表達(dá)單克隆抗體或所述抗體的多克隆混合物；任選隨后分離包含第一種和/或第二種抗體的輕鏈可變區(qū)的抗體。
104.權(quán)利要求97-103任一項的方法，其中用于免疫的每個脊椎動物如下所述提供: (a)從人血液或組織(例如B淋巴細(xì)胞、PBMC、骨髓、脾、扁桃體或淋巴結(jié))樣品中分離表達(dá)結(jié)合預(yù)定抗原的抗體的B淋巴細(xì)胞(例如由感染性疾病病原體表達(dá)的抗原；任選其中所述血清或組織來自患有、易感于或者恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體)； (b)確定何種人種系VL基因區(qū)段在人體內(nèi)重組，以產(chǎn)生編碼所述抗體輕鏈可變區(qū)的所述B淋巴細(xì)胞的核苷酸序列； (c)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因脊椎動物，其中所述人種系VL基因區(qū)段提供在權(quán)利要求81-95任一項的其重鏈基因座中；及 (d)提供所述轉(zhuǎn)基因脊椎動物以在權(quán)利要求97-103任一項的方法中進(jìn)行免疫。
105.權(quán)利要求97-103任一項的方法，其中用于免疫的每個脊椎動物如下所述提供: (a)從人血液或組織(例如B淋巴細(xì)胞、PBMC、骨髓、脾、扁桃體或淋巴結(jié))樣品中分離表達(dá)結(jié)合預(yù)定抗原的抗體的B淋巴細(xì)胞(例如由感染性疾病病原體表達(dá)的抗原；任選其中所述血清或組織來自患有、易感于或者恢復(fù)自由攜帶或分泌所述抗原的生物體引起或介導(dǎo)的疾病或病癥的人類個體或者來自攜帶所述生物體的人類個體)； (b)確定編碼所述抗體的重排的VDJ或VJ區(qū)的所述B淋巴細(xì)胞的核苷酸序列； (c)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因脊椎動物，其中所述重排的VDJ或VJ區(qū)提供在權(quán)利要求81-95任一項的其重鏈基因座中；及 (d)提供所述轉(zhuǎn)基因脊椎動物以在權(quán)利要求97-103任一項的方法中進(jìn)行免疫。
106.通過權(quán)利要求103或者當(dāng)從屬于權(quán)利要求103時的權(quán)利要求104或105的方法可獲得的或者獲得的分離的抗體(例如IgG型抗體)或者其突變體或衍生物抗體，其中(i)所述分離的抗體包含所述第一種抗體的重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(ii)所述分離的抗體包含所述第二種抗體的重鏈可變區(qū)的兩個拷貝，與所述第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的兩個拷貝配對；或者(iii)所述分離的抗體是雙特異性抗體，其包含所述第一種抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝，與第一種抗體輕鏈可變區(qū)的一個拷貝配對，及包含所述抗體的重鏈可變區(qū)的一個拷貝，與第一種抗體的輕鏈可變區(qū)的一個拷貝配對，任選其中所述雙特異性抗體結(jié)合權(quán)利要求102所述第一和第二抗原；所述分離的抗體或者其突變體或衍生物抗體任選用于醫(yī)藥學(xué)中，任選用于治療和/或預(yù)防感染性疾病。
107.單克隆或多克隆抗體混合物(例如IgG型抗體)，其中所述單克隆抗體或混合物包含或者由通過權(quán)利要求97-101和103-105任一項的方法產(chǎn)生的抗體或者其突變體或衍生物抗體組成，任選用于醫(yī)藥學(xué)中，任選用于治療和/或預(yù)防感染性疾病，其中任選其中每種抗體均結(jié)合感染性疾病病原體的抗原，優(yōu)選相同抗原。
108.用以治療和/或預(yù)防感染性疾病或病癥的分離的嵌合抗體，所述抗體包含非人脊椎動物(任選小鼠或大鼠)重鏈恒定區(qū)和人可變區(qū)，其結(jié)合感染性疾病病原體的抗原，其中所述抗體在包括用所述抗原免疫權(quán)利要求48-64和81-95任一項的脊椎動物的方法中可獲得或獲得。
109.用于治療和/或預(yù)防感染性疾病或病癥的分離的人抗體，所述抗體包含人重鏈恒定區(qū)和人可變區(qū)，其結(jié)合感染性疾病病原體的抗原，其中所述抗體在包括當(dāng)可變區(qū)與脊椎動物(例如小鼠或大鼠重鏈恒定區(qū))的重鏈恒定區(qū)可操縱地連接時在轉(zhuǎn)基因非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)中在體內(nèi)親和性成熟抗體可變區(qū)的方法中如下可獲得或獲得，(a)用所述抗原免疫權(quán)利要求48-64和81-95任一項的脊椎動物；(b)分離編碼權(quán)利要求108的嵌合抗體的核酸；(c)用編碼人重鏈恒定區(qū)的核苷酸序列置換編碼非人脊椎動物重鏈恒定區(qū)的核酸的核苷酸序列以產(chǎn)生編碼人抗體的核酸；(d)在體外表達(dá)所述人抗體(任選從攜帶所述人核酸的CHO或HEK293細(xì)胞表達(dá))及(e)分離所述人抗體(任選進(jìn)一步親和性成熟所述抗體和/或產(chǎn)生其衍生物)。
110.包含結(jié)合預(yù)定抗原(例如由細(xì)菌或病毒病原體表達(dá)的抗原)的人可變結(jié)構(gòu)域的抗體，其中所述可變結(jié)構(gòu)域序列由重排的VDJ和VJ區(qū)編碼，每個VDJ和/或VJ均是通過在體內(nèi)重排人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因區(qū)段(V和J及任選存在的D區(qū)段)產(chǎn)生的雜交區(qū)；任選其中所述抗體包含人恒定區(qū)。
111.第一種和第二種人抗體的混合物，每個抗體均如權(quán)利要求109或110所述，其能結(jié)合感染性疾病病原體的抗原(任選其中第一種抗體結(jié)合第一種抗原，第二種抗體結(jié)合第二種抗原，所述抗原來自相同病原體；或者其中所述抗原是相同的)。
112.權(quán)利要求111的混合物，其中第一種抗體的輕鏈氨基酸序列與第二種抗體的輕鏈氨基酸序列相同，或者具有至多15個氨基酸改變。
113.權(quán)利要求96及106-112任一項的分離的單克隆或多克隆抗體或混合物在生產(chǎn)治療和/或預(yù)防感染性疾病的藥物中的應(yīng)用，任選其中所述感染性疾病是由細(xì)菌或病毒病原體引起的疾病。
114.權(quán)利要求96及106-112任一項的抗體、混合物或應(yīng)用，其中所述感染性疾病選自由選自流感嗜血桿菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、皰疹病毒科病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、HIV和流感病毒的病原體引起的疾病。
115.編碼權(quán)利要求96及106-112任一項的抗體的重鏈和輕鏈或者至少其可變區(qū)的第一個和第二個核苷酸序列，任選其中每個核苷酸序列均是載體的一部分。
116.宿主細(xì)胞，其包含一或多個編碼權(quán)利要求110或112所述第一種和第二種抗體的重鏈及權(quán)利要求110或112所述第一種抗體的輕鏈(及任選權(quán)利要求110或112所述第二種抗體的輕鏈)的表達(dá)載體。
117.藥物組合物，其包含權(quán)利要求96及106-112任一項的抗體及稀釋劑、賦形劑或載體；任選其中所述組合物提供在與IV針頭或注射器連接的容器中或者在IV包中。
118.合成的免疫球蛋白基因座，其包含與恒定區(qū)5’端可操縱地連接的一或多個可變區(qū)和J基因區(qū)段(及任選存在的一或多個D基因區(qū)段)，其中所述基因座包含選自由如下免疫球蛋白基因座組成的組中的5’至3’ V(D)J排列，其可以根據(jù)如下一或多種排列(5，至3’ )構(gòu)建: (a)[V(重鏈，λ或κ)]-[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[—轉(zhuǎn)角RSS]-[D]_[JH]，其中所述RSS是相反方向； (b)[VH]-[D]_ [兩轉(zhuǎn)角RSS]-[—轉(zhuǎn)角RSS] - [J λ]，其中所述RSS是相反方向； (c) [VH] - [D]-[ —轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS] _ [J κ ]，其中所述RSS是相反方向；(d)[VH或V κ ]-[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[ 一轉(zhuǎn)角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向； (e)[Vk ]-[ 一轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS] _ [JH或J λ ]，其中所述RSS是相反方向； (f)[V(重鏈，λ或κ)]-[一轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[D]-[JH]，其中所述RSS是相反方向； (g)[VH] - [D]-[ —轉(zhuǎn)角RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向； (h)[VH] - [D]-[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[ 一轉(zhuǎn)角RSS] _ [J κ ]，其中所述RSS是相反方向； (i)[VH或V κ ]-[ —轉(zhuǎn)角 RSS]-[兩轉(zhuǎn)角RSS] - [J λ ]，其中所述RSS是相反方向； (j) [Vk ]-[兩轉(zhuǎn)角RSS]-[ 一轉(zhuǎn)角RSS] _ [JH或J λ ]，其中所述RSS是相反方向。
119.包含權(quán)利要求118的基因座的非人脊椎動物(例如小鼠或大鼠)或者細(xì)胞。
【文檔編號】C12N15/85GK103945689SQ201280056528
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月19日
【發(fā)明者】G·弗里德里克, E-C·李, J·克拉貝, N·英格蘭 申請人:科馬布有限公司