核酸轉(zhuǎn)錄方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及產(chǎn)生模板核酸的擴(kuò)增的核酸部分的方法，所述方法包括：獲得所述模板核酸，使至少一種寡核苷酸引物與所述模板核酸退火，使至少一種寡核苷酸終止物與所述模板核酸退火，以模板特異性方式延伸所述至少一種寡核苷酸引物，直至延伸的產(chǎn)物核酸到達(dá)退火的寡核苷酸終止物的位置，從而延伸反應(yīng)被終止，其中在所述延伸反應(yīng)中所述寡核苷酸終止物不被延伸，以及其中延伸的產(chǎn)物核酸被連接到所述寡核苷酸終止物的3’末端，所述終止物本身也可以是引物。本發(fā)明還涉及其應(yīng)用以及進(jìn)行所述方法的試劑盒。
【專利說明】核酸轉(zhuǎn)錄方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及通過擴(kuò)增指定的序列部分?jǐn)U增或分析核酸樣品的領(lǐng)域。
[0002]發(fā)明背景
[0003]本領(lǐng)域熟知并確立了許多基于擴(kuò)增的方法以擴(kuò)增和檢測靶核酸。通常被稱作PCR的聚合酶鏈反應(yīng)使用變性、引物對與相反鏈的退火及引物延伸的多次循環(huán)，以指數(shù)增加靶序列的拷貝數(shù)(US4, 683，195，US4, 683，202，US4, 800，159，US5, 804，375)。在稱作 RT-PCR的變化方式中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA中產(chǎn)生互補(bǔ)DNA(cDNA)，然后通過PCR擴(kuò)增cDNA以產(chǎn)生DNA 的多個拷貝(US5, 322，770，US5, 310，652)。
[0004]PCR反應(yīng)通常包括進(jìn)行如下多次循環(huán):
[0005](A)第一引物與核酸鏈中在靶核酸序列的一端的位點(diǎn)雜交(退火)，第二引物與互補(bǔ)核酸鏈中相應(yīng)于靶序列的相反端的位點(diǎn)雜交；
[0006](B)從各引物合成(延伸)核酸序列 '及
[0007](C)使在步 驟(B)中產(chǎn)生的雙鏈核酸變性，以形成單鏈核酸。
[0008]變性通常在80-10(TC進(jìn)行，雜交(退火)通常在40-80°C進(jìn)行，延伸通常在50-80°C進(jìn)行。一個典型的循環(huán)是:變性，大約94°C進(jìn)行I分鐘；雜交，大約58°C進(jìn)行大約2分鐘；延伸，大約72°C進(jìn)行大約I分鐘。實(shí)際的方案依賴于例如引物和靶序列的長度和序列以及使用的酶。
[0009]PCR可以根據(jù)各種不同的應(yīng)用進(jìn)行修改。例如，GB2293238描述了降低非特異性引發(fā)和擴(kuò)增核酸序列的方法。公開了阻斷“引物”(或者寡核苷酸)以產(chǎn)生錯配及通過產(chǎn)生與擴(kuò)增引物的競爭性引物退火反應(yīng)而降低非特異性引發(fā)。例如，使用包含在3’位置的ddNTP的隨機(jī)阻斷引物的混合物，以防止延伸反應(yīng)的起始。只有正確的擴(kuò)增引物取代其阻斷引物并可以起始擴(kuò)增反應(yīng)。
[0010]已經(jīng)確立了使用特異性結(jié)合樣品中不希望的靶寡核苷酸分子的阻斷引物以防止其在未阻斷的寡核苷酸分子的PCR反應(yīng)中擴(kuò)增的方法。未阻斷的寡核苷酸可以被擴(kuò)增而無需進(jìn)一步的保證靶特異性的措施-在不存在可擴(kuò)增的不希望被擴(kuò)增的競爭性寡核苷酸分子的條件下(US2002/0076767A1 和 US6, 391，592B1 ；W099/61661)。
[0011]W002/086155中揭示了一種類似的方法，其中阻斷寡核苷酸與不希望的模板結(jié)合導(dǎo)致延伸反應(yīng)的提前終止。所述阻斷寡核苷酸特異性結(jié)合混合物中的一種模板，而其它模板自由擴(kuò)增。
[0012]US5, 849，497描述了在PCR期間使用阻斷寡核苷酸及缺少5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。這種DNA聚合酶不能消化阻止擴(kuò)增的阻斷寡核苷酸。已經(jīng)選擇這種系統(tǒng)以避免使用PNA(肽核酸)作為阻斷寡核苷酸。W02009/019008中描述了一種類似的系統(tǒng)，然而，考慮使用PNA和LNA等作為阻斷寡核苷酸。
[0013]所有這些方法的共同點(diǎn)是不希望的模板的擴(kuò)增通過特異性阻斷寡核苷酸的雜交而被特異性阻抑。
[0014]在專利申請W098/02449A1 (US6, 090，552)中，描述了 “三元擴(kuò)增(triamplification) ’DNA擴(kuò)增方法。其基于使用被延伸的及與阻斷物連接的發(fā)夾引物。引物與阻斷物均結(jié)合至一模板DNA鏈。第二種引物結(jié)合互補(bǔ)DNA鏈。所述阻斷物和一種引物與含有供體的引物和含有FRET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的受體部分的阻斷物部分互補(bǔ)。引物的延伸及延伸產(chǎn)物與阻斷物的連接導(dǎo)致熒光降低，因?yàn)樵谧钄辔镆镫s交體中其不再緊密相鄰。這種三元擴(kuò)增方法限于使用模板DNA并且不涉及RNA方法。
[0015]W094/17210A1涉及使用靶DNA的反義和有義鏈的多個引物的PCT方法。
[0016]Seyfang et al.[I]描述了使用多個磷酸化寡核苷酸以在DNA鏈中導(dǎo)入突變。使用缺少任何可檢測的鏈置換活性或者5’-3’核酸外切酶活性的T4DNA聚合酶，其不適于RNA模板。
[0017]Hogrefe et al.[2]描述了使用QuikChange多位點(diǎn)定向誘變試劑盒產(chǎn)生隨機(jī)化氨基酸文庫。使用在與已知單鏈靶DNA互補(bǔ)的中心含有3個簡并核苷酸的特異性引物。所述試劑盒使用PfuTurbo DNA聚合酶,其不適于RNA模板。
[0018]RNA的分析通常是從RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA開始，因?yàn)镈NA比RNA更穩(wěn)定，現(xiàn)存分析DNA的許多方法。無論使用什么方案分析cDNA，重要的是在逆轉(zhuǎn)錄(RT)期間產(chǎn)生的cDNA在序列和濃度方面盡可能密切代表需要分析的RNA。
[0019]逆轉(zhuǎn)錄通常使用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行。這些酶需要寡核苷酸引物，引物與RNA雜交以起始(引發(fā))cDNA的模板依賴性聚合。兩個最常使用的引發(fā)策略是寡聚dT引發(fā)和隨機(jī)引發(fā)。
[0020]寡聚dT引發(fā)用于3’末端具有多聚A尾的mRNA的RT。所述寡聚dT在3’末端引發(fā)RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶拷貝mRNA直至其5’末端。這種方法的一個缺點(diǎn)是需要高品質(zhì)的mRNA，因?yàn)槿魏蝝RNA降解均將導(dǎo)致mRNA的3’末端的強(qiáng)過度表現(xiàn)(overrepresentation)。
[0021]即使使用未降解的mRNA，cDNA分子由于提前的聚合終止事件而仍可以被截短。常見的原因是在高結(jié)構(gòu)化的RNA區(qū)域中二級和三級結(jié)構(gòu)形成。特別是當(dāng)GC含量較高時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄酶也許不閱讀通過這些區(qū)域，因此cDNA被截短。mRNA需要被拷貝的長度較長則發(fā)生這種事件的可能性增加。因此，寡聚dT引發(fā)的cDNA可以示出朝向過度表現(xiàn)RNA的3’末端的強(qiáng)偏差(bias)。因此，3’末端引發(fā)具有濃度偏差，導(dǎo)致在3’末端或其附近的序列增加及5’末端方向序列表現(xiàn)逐漸降低(見圖15三角形所示，qPCR偏差測量)。這在定量方法中存在問題，例如在確定特定基因的表達(dá)程度中，在差異分析或者在細(xì)胞的完全表達(dá)譜分析中。
[0022]已經(jīng)揭示了克服RNA二級結(jié)構(gòu)終止的方法，特別是當(dāng)長mRNA需要被逆轉(zhuǎn)錄為全長cDNA時(shí)。一種這樣的方法例如包括混合兩種逆轉(zhuǎn)錄酶,一種是高度進(jìn)行性(processive)的如MMLV或AMV及其突變體，首先將反應(yīng)混合物在正常溫度范圍保溫以合成第一鏈，加上使用具有逆轉(zhuǎn)錄活性的耐熱酶組合物，然后將反應(yīng)混合物在抑制二級mRNA結(jié)構(gòu)存在的溫度下保溫以產(chǎn)生第一鏈(美國專利US6，406，891)。然而，逆轉(zhuǎn)錄酶的緩沖液含有高濃度的MgCl2 (3-10mM)或者M(jìn)n2+(例如針對Tth DNA聚合酶)，并且RNA是高度不穩(wěn)定的及易于在較高溫度下破壞和/或降解，特別是在存在二價(jià)陽離子的條件下。在兩種溫度之間循環(huán)以避開二級結(jié)構(gòu)的方法也可以導(dǎo)致在高溫期間產(chǎn)生的短RNA片段隨機(jī)引發(fā)。這種短RNA片段由MMLV-H或者其它病毒逆轉(zhuǎn)錄酶作為引物使用[3]。再次，這將導(dǎo)致在合成cDNA中的偏差。
[0023] 另一方法是隨機(jī)引發(fā)，其具有在沿著RNA的多個部位雜交的優(yōu)勢，并因此也阻斷這些序列參與二級結(jié)構(gòu)形成。在隨機(jī)引發(fā)隨機(jī)序列的寡核苷酸群中，使用隨機(jī)六聚體模板在核酸鏈內(nèi)任何部位引發(fā)RT。逆轉(zhuǎn)錄或者使用DNA作為模板的規(guī)則轉(zhuǎn)錄均使用隨機(jī)引發(fā)。當(dāng)分析產(chǎn)物DNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨機(jī)引發(fā)沒有對于樣品中的所有靶產(chǎn)生相等的逆轉(zhuǎn)錄效力[4，5]。此外，當(dāng)測量特異性靶時(shí)，在模板核酸輸入與產(chǎn)物DNA輸出之間無線性關(guān)系[4，5]。事實(shí)上，已經(jīng)示出使用隨機(jī)引物可導(dǎo)致過高估計(jì)一些模板拷貝數(shù)，與序列特異性引發(fā)的模板相比高直至19倍[6]。盡管對這些現(xiàn)象的導(dǎo)致原因進(jìn)行了許多思考，但是還未提出確鑿的合理說明。
[0024]發(fā)明目的
[0025]本發(fā)明人觀測到在這種隨機(jī)引發(fā)的cDNA文庫中存在普遍偏差，形式是在RNA分子5’末端的序列部分當(dāng)與3’末端序列部分相比時(shí)是過度表現(xiàn)的。這種現(xiàn)象的原因有待在隨機(jī)引發(fā)與逆轉(zhuǎn)錄酶的強(qiáng)鏈置換活性的組合中發(fā)現(xiàn)。由于RNA具有高度二級結(jié)構(gòu)，因此逆轉(zhuǎn)錄酶不得不發(fā)揮強(qiáng)鏈置換活性以克服這種二級結(jié)構(gòu)并有效地產(chǎn)生cDNA。鑒于逆轉(zhuǎn)錄酶的強(qiáng)鏈置換活性，當(dāng)使用隨機(jī)寡核苷酸引發(fā)時(shí)，任何RNA的5’側(cè)在cDNA文庫中將以幾倍表現(xiàn)。在具有與模板RNA上更3’位置退火的引物的(如隨機(jī))引物組合的延伸期間發(fā)生相似作用(延伸引物方向中的上游引物)，其中逆轉(zhuǎn)錄酶將置換與模板RNA上更5’位置雜交的所有引物的延伸產(chǎn)物(延伸產(chǎn)物方向中的下游引物)。因此，隨機(jī)引發(fā)是一種DNA合成方法，其具有過度表現(xiàn)指定模板核酸的5’末端的較強(qiáng)偏差(也見圖1的問題示意圖及圖15的qPCR偏差測量)。除了使用隨機(jī)物(例如隨機(jī)六聚體)進(jìn)行cDNA文庫制備及放射標(biāo)記DNA探針[7，8]，其也用于檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及小規(guī)模染色體事件，主要是插入或缺失[5，6]。已經(jīng)揭示了比較基因組雜交(CGH)以解釋不同基因組之間全基因組序列拷貝數(shù)變化(CNV)，如腫瘤DNA與來自附近未受影響的組織的正常DNA之間遺傳區(qū)域的不同擴(kuò)增或缺失[9，10]。
[0026]目前DNA文庫的最全面的分析方法是第二代測序(NGS)[參見11的綜述]。NGS是以高通量方式通過聚合平行測序的上位術(shù)語。NGS基于從小片段中獲取測序讀段(read)。在cDNA文庫的產(chǎn)生中，mRNA在cDNA合成之前被片段化，或者單鏈或雙鏈cDNA被片段化。然而，模板核酸的任何片段化(化學(xué)或者物理方式)導(dǎo)致非指定的及不可預(yù)見的偏差，并且會耗盡模板。在NGS中，完整的序列是通過比對這些讀段而獲得的，這由于為了裝配為完整序列的小讀段的絕對數(shù)而是一個挑戰(zhàn)性工作。迄今為止，許多讀段僅提供了有限的信息。例如，許多讀段不能唯一地指定，并因此被棄去。序列產(chǎn)生由于序列片段的表現(xiàn)偏差而被進(jìn)一步阻礙。
[0027]因此，需要改良的方法以擴(kuò)增模板核酸，產(chǎn)生較小的擴(kuò)增量偏差，例如用于NGS或者用于DNA文庫的產(chǎn)生，以改良原始模板的序列濃度的表現(xiàn)。
[0028]發(fā)明概述
[0029]因此，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生模板核酸的擴(kuò)增的核酸部分的方法，所述方法包括:
[0030]獲得所述模板核酸，
[0031]使至少一種寡核苷酸引物與所述模板核酸退火，
[0032]使至少一種寡核苷酸終止物與所述模板核酸退火，
[0033]以模板特異性方式延伸所述至少一種寡核苷酸引物，直至延伸產(chǎn)物核酸到達(dá)退火的寡核苷酸終止物的位置，從而延伸反應(yīng)被終止，其中在所述延伸反應(yīng)中，所述寡核苷酸終止物不被延伸，及[0034]其中延伸的產(chǎn)物核酸在3’末端鄰近所述寡核苷酸終止物的位置被標(biāo)記，和/或其中被延伸的產(chǎn)物核酸與所述寡核苷酸終止物的5’末端連接；因此獲得擴(kuò)增的核酸部分。
[0035]另一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生模板核酸的擴(kuò)增的核酸的方法，所述方法包括:
[0036]獲得所述模板核酸，，
[0037]使第一寡核苷酸引物與所述模板核酸退火，
[0038]使至少一種另外的寡核苷酸引物與所述模板核酸退火，
[0039]以模板特異性方式延伸第一寡核苷酸引物，直至延伸產(chǎn)物核酸到達(dá)所述另外的寡核苷酸引物中的一種的位置，從而延伸反應(yīng)被終止，及以模板特異性方式延伸至少一種另外的寡核苷酸引物，其中延伸的產(chǎn)物核酸在3’末端鄰近所述另外的寡核苷酸引物的位置被標(biāo)記，和/或其中被終止的延伸的產(chǎn)物核酸連接到所述另外的寡核苷酸引物的5’末端；因此獲得擴(kuò)增的核酸部分。在這種方法中，所述另外的寡核苷酸引物作為終止物，阻止到達(dá)退火的終止物位置的擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)一步延伸，并且自身作為引物，即作為延伸的起始物。
[0040]所述模板核酸可包含或者基本上由RNA或DNA組成，在優(yōu)選的實(shí)施方案中所述模板是RNA。
[0041]在一優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生模板核酸的擴(kuò)增的核酸的方法，所述模板核酸是RNA,所述方法包括:
[0042]獲得所述模板RNA，
[0043]使第一寡核苷酸引物與所述模板RNA退火，
[0044]使至少一種另外的寡核苷酸引物與所述模板RNA和/或至少一種寡核苷酸終止物退火，
[0045]以模板特異性方式延伸所述第一寡核苷酸引物，直至延伸產(chǎn)物核酸到達(dá)所述另外的寡核苷酸引物或所述寡核苷酸終止物中的一種的位置，從而延伸反應(yīng)被終止，其中在所述延伸反應(yīng)中，所述任選的寡核苷酸終止物不被延伸，和/或所述至少一種另外的寡核苷酸引物以模板特異性方式被延伸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，延伸的產(chǎn)物核酸連接到所述寡核苷酸終止物或者另外的引物的5’末端。
[0046]另一方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生一或多種模板核酸的序列文庫，其包含所述模板核酸的優(yōu)選重疊的、擴(kuò)增的核酸部分的混合物。序列文庫是DNA片段的集合，其可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法貯存和拷貝。例如，序列文庫可以通過分子克隆方法獲得。序列文庫也可以使用DNA片段末端上的通用序列通過例如PCR擴(kuò)增。
[0047] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生模板核酸的擴(kuò)增的核酸部分或者產(chǎn)生上述序列文庫的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包含逆轉(zhuǎn)錄酶、包含增加Tm(解鏈溫度)的修飾的隨機(jī)寡核苷酸引物以及不適于核苷酸延伸并且包含增加Tm的修飾的隨機(jī)寡核苷酸終止物，任選進(jìn)一步包含一或多種反應(yīng)緩沖液，所述緩沖液包含Mn2+或Mg2+，連接酶，優(yōu)選具有DNA連接活性的DNA連接酶或者RNA連接酶，PEG。
[0048]如下詳細(xì)公開解釋了本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方案。
[0049]發(fā)明詳述
[0050]本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生擴(kuò)增的核酸或者擴(kuò)增核酸的方法。這種產(chǎn)生也可涉及單一擴(kuò)增反應(yīng)，例如一個轉(zhuǎn)錄循環(huán)，或者更多個。其包括通過RNA或DNA依賴性聚合產(chǎn)生RNA或DNA。因此，擴(kuò)增核酸包括基于RNA或DNA模板核酸的RNA核苷酸聚合或者基于RNA或DNA模板核酸的DNA核苷酸聚合。優(yōu)選地，所述方法包括一個逆轉(zhuǎn)錄、RNA依賴性DNA聚合的步驟或循環(huán)。
[0051]本發(fā)明的方法包括使用與模板核酸雜交的至少兩種短寡核苷酸。至少一種寡核苷酸具有引物功能，即其可以作為核苷酸聚合起始物以進(jìn)行聚合酶依賴性擴(kuò)增，即轉(zhuǎn)錄。通過加入核苷酸以模板依賴性方式的引物延伸在本文稱作延伸(elongation)或延長(extension) 0這種反應(yīng)的產(chǎn)物被稱作延伸產(chǎn)物或者延長產(chǎn)物。RNA或DNA聚合酶將核苷酸加入其堿基與模板鏈的核堿基配對的給定寡核苷酸鏈。雜交和退火被理解為是互補(bǔ)核苷酸的堿基配對?；パa(bǔ)核苷酸或堿基是能堿基配對的那些核苷酸或堿基，如A與T (或U)，G與C，G 與 U。
[0052]至少一種另外的寡核苷酸具有終止物功能。這意味著在上游引物(以延伸產(chǎn)物方向)起始的延伸(延長)反應(yīng)達(dá)到具有終止物功能的下游(以延伸產(chǎn)物方向)寡核苷酸，所述延伸反應(yīng)被阻止進(jìn)一步延伸。相對于模板核酸上的核苷酸位置，這意味著一旦從與相對于具有終止物功能的寡核苷酸的模板核酸的3’末端退火的引物開始的延伸反應(yīng)達(dá)到所述寡核苷酸(終止物)，則所述延伸反應(yīng)被阻止進(jìn)一步延伸。延伸反應(yīng)可以通過具有終止物功能的寡核苷酸與模板核酸的強(qiáng)力雜交而被終止，由此其不被聚合酶置換。
[0053]具有終止物功能的寡核苷酸也可以是引物。其可以在第一引物下游(延伸反應(yīng)方向，模板方向上游)雜交，并終止所述第一引物的延伸反應(yīng)。隨之(或者同時(shí))，其自身可以作為延伸起始物，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-隨之也可以在再下游(相對于延伸反應(yīng)方向)具有終止物功能的寡核苷酸的位置 被終止。
[0054]“上游”是朝向指定核酸或寡核苷酸的5’末端(3’ -5’ )方向?！跋掠巍笔浅蛑付ê怂峄蚬押塑账岬?’末端(5’ -3’ )方向。由于寡核苷酸以反向方式雜交，因此引物的下游涉及雜交的模板核酸的上游方向。這是指下游寡核苷酸(或者寡聚物，或者引物或者終止物或者阻斷物)是這樣的寡聚物，其與模板核酸的相對于已經(jīng)與模板核酸的更下游部分雜交的上游寡核苷酸(或者寡聚物，或者引物或者終止物或者阻斷子)更上游部位雜交。因此，當(dāng)使用術(shù)語“下游寡核苷酸”或者“上游寡核苷酸”時(shí)，除非特別指出，所述方向性總是指延伸產(chǎn)物的方向。本發(fā)明的聚合酶依賴性延伸反應(yīng)是5’ -3’方向，下游。
[0055]如本文所用，“包含”應(yīng)理解為是指一個開放的定義，允許另外的具有相似或其它特征的成員?！坝伞M成”應(yīng)理解為是關(guān)于限定特征范圍的一個封閉的定義。
[0056]如本文所用，“引物”也可以是指寡核苷酸引物?！敖K止物(stopper) ”也是指寡核苷酸終止物。“寡聚物”用于描述寡核苷酸引物及寡核苷酸終止物。
[0057]寡核苷酸終止物是這樣的一種寡核苷酸，其可以終止上文所述延伸反應(yīng)，并且不起始進(jìn)一步的延伸反應(yīng)，例如寡核苷酸在其3’位置不能接受(共價(jià)結(jié)合)進(jìn)一步的核苷酸。這種核苷酸為本領(lǐng)域已知，通常缺少3’ 0H，例如在ddNTS(雙脫氧核苷酸)中。
[0058]因此，本發(fā)明實(shí)質(zhì)上提供了兩種方法，一種方法利用寡核苷酸終止物，一種方法利用另外的寡核苷酸引物。除了這個不同之外，所述方法包含發(fā)明相似性，以提供限定的及充分定義的擴(kuò)增產(chǎn)物，其可以以良好控制的方式被擴(kuò)增，最重要的是在模板核酸全長具有單一的濃度分布。本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)一步鑒定和使用。它們是獲得的不被棄去的希望產(chǎn)物，就像在模板抑制方法中一樣。本發(fā)明產(chǎn)生了更好地表現(xiàn)需要被分析的模板分子的擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物，制備了那些分子以與隨后的分析方法如第二代測序方法無縫整合或者作為序列文庫。如果終止物同時(shí)是引物，可以基于僅一個模板分子提供一個連續(xù)序列。當(dāng)各個產(chǎn)物序列共價(jià)結(jié)合如連接時(shí)，擴(kuò)增的產(chǎn)物的這個連續(xù)序列可以提供為單一分子?？梢赃M(jìn)行這種結(jié)合或連接反應(yīng)，同時(shí)與模板鏈雜交，以保證所述產(chǎn)物以與模板鏈(當(dāng)然是反向互補(bǔ)鏈)相同的順序結(jié)合。
[0059]本發(fā)明的優(yōu)勢在使用根據(jù)本發(fā)明被擴(kuò)增的長模板核酸時(shí)是最突出的。這種模板的長度可以是至少100個堿基,至少1000個堿基(Ikb),至少2kb,至少4kb,至少6kb,至少IOkb,至少 20kb,至少 30kb,至少 40kb,至少 50kb。
[0060]在逆轉(zhuǎn)錄的情況中，本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及逆轉(zhuǎn)錄RNA分子的方法，包括使至少兩種引物與模板RNA分子雜交，利用RNA依賴性DNA聚合酶延伸引物，其中上游引物的延伸產(chǎn)物(在模板方向下游)不置換下游引物的延伸產(chǎn)物(在模板方向上游)。這個實(shí)施方案通?；旧习ㄒ镅由旆磻?yīng)，其使用第一引物，所述引物被延伸但在也被延伸的第二引物處終止(不置換)。
[0061]然而，對于通過延伸產(chǎn)物完全表現(xiàn)指定模板，延伸的核苷酸的直接連接不是必須要求的。模板核酸的樣品通常含有具有相同序列的許多模板分子。通過使用多于一種的引物和終止物組合，可以由許多延伸產(chǎn)物完全表現(xiàn)這種序列。許多短的延伸產(chǎn)物通常是完全表現(xiàn)模板的核酸文庫需要的。因此本發(fā)明提供了通過提供延伸的產(chǎn)物制備核酸文庫的方法。所述文庫可含有在混合物中的延伸產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述延伸產(chǎn)物，特別是相同序列的模板，含有重疊的序列部分。重疊的序列部分易于完全序列裝配，如在NGS方法中是需要的，并且是提供可用于克隆任何特異性序列(其中在達(dá)到單個延伸的核酸的大小限制時(shí)沒有被中斷或者中斷有限)的文庫所希望的。
[0062]在逆轉(zhuǎn)錄情況中，本發(fā)明的這種實(shí)施方案涉及逆轉(zhuǎn)錄RNA分子的方法，包括使至少兩種寡核苷酸(一種是引物，一種是終止物)與模板RNA分子雜交，并利用RNA依賴性DNA聚合酶延伸該引物，其中上游引物的延伸產(chǎn)物(在模板方向下游)終止在(不置換)下游終止物的位置(在模板方向上游)。所述終止物不被延伸。這個實(shí)施方案通?；旧习褂玫谝灰镞M(jìn)行引物延伸反應(yīng)，第一引物被延伸但是終止于(不置換)不被延伸的寡核苷酸終止物。
[0063]可以組合本發(fā)明的實(shí)施方案，例如通過使用至少兩種引物和一種終止物，第一上游引物在下游延伸，延伸反應(yīng)終止在也在下游延伸的第二下游引物的位置，該延伸反應(yīng)隨之終止于寡核苷酸終止物的位置。
[0064]在特定的實(shí)施方案中，不使用不可被延伸的寡核苷酸終止物。在這種實(shí)施方案中，僅可延伸的引物在擴(kuò)增/轉(zhuǎn)錄期間可使用。
[0065]在其它的實(shí)施方案中，希望獲得已經(jīng)終止于寡核苷酸終止物的擴(kuò)增產(chǎn)物。為此，技術(shù)人員可例如通過熟知的方法選擇這種延伸的核酸，如通過標(biāo)記，包括固定在固相(如珠或固體表面)或者通過附上條碼序列或序列標(biāo)簽。延伸的產(chǎn)物也可以與寡核苷酸終止物連接-和與具有終止物功能的引物連接相似，以提供如上述一長產(chǎn)物分子。可以組合與寡核苷酸終止物的標(biāo)記及連接，例如通過標(biāo)記所述寡核苷酸終止物及將延伸產(chǎn)物與標(biāo)記的寡核苷酸終止物連接。當(dāng)然，寡核苷酸終止物的標(biāo)記可以在與延伸產(chǎn)物連接后進(jìn)行。這種標(biāo)記使得可以簡便操作、選擇和/或擴(kuò)增延伸的產(chǎn)物。例如，序列標(biāo)簽可用于所述延伸的及如此標(biāo)記的延伸產(chǎn)物的進(jìn)一步選擇擴(kuò)增，通過使用與這種標(biāo)簽雜交及可起始所述(前述)延伸的核酸產(chǎn)物的擴(kuò)增反應(yīng)(例如PCR)的引物。如果獲得大量不同的延伸產(chǎn)物及許多產(chǎn)物用相同序列標(biāo)簽標(biāo)記，這是特別有利的。在序列文庫的情況中，這種方法使得可以簡便擴(kuò)增整個文庫-所有序列的量在原始模板的整個長度的表現(xiàn)一致。
[0066]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用多于一種的寡核苷酸引物，其功能與第一引物相似，但是具有不同的引物序列，所述序列與靶模板退火。特別地，本發(fā)明的方法的這個實(shí)施方案進(jìn)一步包括一種另外的寡核苷酸引物與所述模板核酸的退火，及延伸所述另外的寡核苷酸引物直至延伸產(chǎn)物核酸達(dá)到另一寡核苷酸引物或寡核苷酸終止物的位置。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用至少I種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少30種、至少40種、至少50種或者更多種不同的寡核苷酸引物?！安煌墓押塑账嵋铩睉?yīng)理解為其引物序列不同，但是當(dāng)然可共有其它相似序列部分，如序列標(biāo)簽。這種序列標(biāo)簽優(yōu)選用于延伸產(chǎn)物的進(jìn)一步的擴(kuò)增反應(yīng)中，使用與序列標(biāo)簽退火的引物進(jìn)行。因此，使用一種引物，可以擴(kuò)增所有潛在不同的產(chǎn)物。在一個特別的實(shí)施方案中，寡核苷酸引物是隨機(jī)引物?！半S機(jī)引物”應(yīng)理解為是具有不同引物序列部分的不同引物的混合物，由于至少一部分引物序列的隨機(jī)合成而具有高度可變性。隨機(jī)引物潛在地覆蓋所述序列的整個組合區(qū)域。隨機(jī)引物的隨機(jī)序列引物部分可覆蓋1、2、3、4、5、6、7、8或更多個核苷酸，其隨機(jī)選自A、G、C或T(U)。關(guān)于引物序列的雜交序列，T和U在本文可互換使用。隨機(jī)序列部分的完全組合的可能區(qū)域是mn，其中m是使用的核苷酸類型的數(shù)目，優(yōu)選所有四種A、G、C、T (U)，η是隨機(jī)核苷酸的數(shù)目。因此，其中表現(xiàn)每種可能的序列的隨機(jī)六聚體由46 = 40 96個不同序列組成。
[0067]同樣，在本發(fā) 明的任一方法中也可以使用一種以上的寡核苷酸終止物。所述另外的終止物與第一終止物作用相似，但是與模板對齊的序列不同。對于另外的終止物，與上文關(guān)于另外的引物的描述相同，當(dāng)然也具有差別，所述終止物不適于延伸反應(yīng)。因此，為了前后一致，與模板雜交的寡核苷酸終止物區(qū)域也被稱作“引物序列”。所述引物序列的長度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 或更多個核苷酸。本發(fā)明因此提供了如上述的一種方法，進(jìn)一步包括一種另外的寡核苷酸終止物與所述模板核酸退火，及在所述延伸反應(yīng)中所述寡核苷酸終止物不被延伸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用至少I種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、至少15種、至少20種、至少30種、至少40種、至少50種或者更多種不同的寡核苷酸終止物。所述寡核苷酸終止物可以是隨機(jī)寡核苷酸終止物，包含與模板退火的隨機(jī)引物序列。如上文關(guān)于寡核苷酸引物所述，寡核苷酸終止物也可以共有相似的序列部分，如可用于擴(kuò)增或鑒別產(chǎn)物的標(biāo)簽或條碼。這種標(biāo)記使得可以在包含本發(fā)明擴(kuò)增產(chǎn)物的序列文庫中簡便地鑒別。
[0068]如在導(dǎo)言中所述，無延伸反應(yīng)(及其終止)控制的(隨機(jī))引發(fā)的cDNA文庫扭曲了序列部分的真實(shí)RNA表現(xiàn)。甚至在例如短mRNA模板(200_1000nt)上，可以發(fā)生多個引發(fā)事件及具有鏈置換，RNA分子的5’側(cè)比3’側(cè)存在于更多拷貝中(見圖1)。因此，當(dāng)測量某一基因轉(zhuǎn)錄物的濃度時(shí)，當(dāng)探查在5’或3’末端的序列部分時(shí)將獲得不同數(shù)值。短的隨機(jī)探針通常用于微陣列和定量PCR分析。這樣導(dǎo)致測量的濃度嚴(yán)重扭曲。此外，這種扭曲當(dāng)對比長與短轉(zhuǎn)錄物時(shí)更明顯，因?yàn)楦哓S度的長轉(zhuǎn)錄物的5’末端比較短轉(zhuǎn)錄物的5’末端表現(xiàn)更高。當(dāng)整體分析轉(zhuǎn)錄物的濃度時(shí)，如在高通量測序(例如下一代測序)中，除了扭曲濃度之外，檢測罕見的短轉(zhuǎn)錄物變得比檢測罕見的長轉(zhuǎn)錄物甚至更不容易。由于基因轉(zhuǎn)錄物及其剪接變體的不同表達(dá)是表型分析的重要部分，因此重要的是轉(zhuǎn)錄物的每個序列部分以正確的豐度表現(xiàn)在產(chǎn)生的cDNA文庫中。
[0069]這些問題由本發(fā)明解決。應(yīng)用本發(fā)明的方法提供了充分限定的轉(zhuǎn)錄物，在從大量RNA分子中產(chǎn)生cDNA期間終止在引物或者終止物位置(優(yōu)選具有逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制的鏈置換)，例如在產(chǎn)生mRNA分子的cDNA文庫中，使得相等地表現(xiàn)RNA分子的每個部分。例如，mRNA可以用隨機(jī)引物引發(fā)，如被修飾以保證隨機(jī)引物不被逆轉(zhuǎn)錄酶置換的隨機(jī)六聚體?？梢詮哪０錜NA分子多個位點(diǎn)起始逆轉(zhuǎn)錄的任何隨機(jī)引物均可使用。
[0070]本發(fā)明還提供使得獲得的延伸產(chǎn)物共價(jià)結(jié)合(例如通過連接)的方法，所述延伸產(chǎn)物以與模板雜交形式提供(見圖2c)。這樣可以產(chǎn)生全長的擴(kuò)增的核酸分子。
[0071]使用具有5’磷酸的引物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)“短的”延伸的核酸-其基本是模板鏈的互補(bǔ)鏈的片段-可以連接而仍與模板雜交。這樣將產(chǎn)生長的及在大多數(shù)情況中全長的擴(kuò)增核酸分子，其是模板的直接表現(xiàn)。能保存模板全長序列的信息是重要的，例如當(dāng)需要分析基因的剪接變體時(shí)?；旧袭?dāng)多個外顯子基因的剪接是復(fù)雜的時(shí)，單一剪接接合的分析自己不產(chǎn)生關(guān)于包含的轉(zhuǎn)錄變體的全長序列的明確信息。然而，在mRNA的情況中的僅寡聚dT引發(fā)或者從來自任何核酸模板的3’連接的一般接頭中的引發(fā)將導(dǎo)致模板5’側(cè)的低表現(xiàn)。換句話說，模板越長，則分子越不可能被逆轉(zhuǎn)錄為全長分子。從圖15中可以看出，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)寡聚dT引發(fā)的RT時(shí)，平均6kb以后的僅~10%的RNA分子被逆轉(zhuǎn)錄為全長分子。正如本發(fā)明所提供的方法，在一個實(shí)施方案中，從模板分子的兩或多個位置開始聚合，延伸反應(yīng)終止在下游引物位置，上游 引物的延伸產(chǎn)物可以連接到下游引物的5’末端。通過共價(jià)結(jié)合這兩個延伸產(chǎn)物，當(dāng)與模板雜交時(shí)，產(chǎn)生較長的序列。接著，當(dāng)使用許多不同的引物時(shí)，樣品中存在的所有模板均可以被轉(zhuǎn)錄，及通過連接短的延伸產(chǎn)物，可以產(chǎn)生模板的全長的擴(kuò)增拷貝(見圖 2c，d)。
[0072]同樣，根據(jù)本發(fā)明的利用寡核苷酸終止物的實(shí)施方案，可以進(jìn)行與延伸的產(chǎn)物的連接，以獲得在引物與終止物之間的序列擴(kuò)增充分定義的擴(kuò)增的核酸。
[0073]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸引物和/或寡核苷酸終止物在5’末端是磷酸化或者腺苷酸化的。這種措施有助于簡便地使寡核苷酸引物或終止物與另一核酸如延伸產(chǎn)物在一或幾個步驟中使用連接酶連接。在一些實(shí)施方案中，特別是當(dāng)使用許多種引物和終止物的混合物時(shí)，可以僅給終止物提供這種修飾以保證延伸的核酸與終止物連接并防止與其它引物連接。
[0074]可以使用本領(lǐng)域已知的任何連接酶，如T4RNA連接酶、T4DNA連接酶、T4RNA連接酶
2、Taq DNA連接酶和大腸桿菌連接酶。
[0075]為了防止任何非雜交的引物或者終止物連接，本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案使用雙鏈特異性連接酶如T4RNA連接酶2或者T4DNA連接酶。雙鏈DNA是T4DNA連接酶的天然底物，DNA-RNA雜交體是不良底物[29]。為了克服這種無效性，可以用Mn2+代替Mg2+作為酶的二價(jià)離子[30]。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，示出在連接反應(yīng)中加入PEG增加RNA雜交體中DNA分子的連接效力，甚至在含有Mg2+的連接酶緩沖液中。
[0076]任選地，腺苷酸化缺陷的(例如截短的)T4RNA連接酶可用于連接，其依賴于與RNA的雜交體中存在腺苷酸化DNA片段(用T4DNA連接酶腺苷酸化只發(fā)生在雙鏈核酸中)。其可以另外加入連接反應(yīng)中以進(jìn)一步增加效力。所述連接只發(fā)生在雜交體中，先前認(rèn)為是非常低效的連接形式[31]。在US6，368，801中，描述了 RNA雜交體中2個DNA分子(在其3’和5’末端具有核糖核苷酸)由T4RNA連接酶的連接。然而，T4RNA連接酶不是特異于雜交體的，因?yàn)槠溥B接5’或3’末端含有脫氧核糖核苷酸的所有單鏈核酸(RNA與DNA，RNA與RNA7DNA與DNA，條件是在3’和5’末端存在脫氧核糖核苷酸)。本發(fā)明包括在連接反應(yīng)中加入PEG，其使得可以在RNA雜交體中發(fā)生連接反應(yīng)。PEG已經(jīng)用于單鏈連接反應(yīng)，作為分子擁擠劑，通過降低有效反應(yīng)體積而增加供體寡核苷酸連接酶復(fù)合物與受體(3’ OH)相互作用的可能性[32]。在此相比之下，供體寡核苷酸連接酶復(fù)合物已經(jīng)緊鄰受體，以及PEG通過將雙螺旋縮合成更接近DNA = DNA螺旋的構(gòu)象而改變RNA = DNA雜交體的構(gòu)象，由此通常特異地連接具有DNA鏈的雜交體中的兩個DNA分子的T4DNA連接酶可以連接具有RNA分子的雜交體中的兩個DNA分子?；蛘?，可以使用T4RNA連接酶2，其是雙鏈特異性連接酶。
[0077]其它添加劑如Tween-20、NP_40可以另外加入，或者代替PEG以在RNA雜交體中有效連接。在本發(fā)明范圍內(nèi)，連接反應(yīng)需要12%-25%的最終PEG-8000(V/V)?？梢允褂枚喾NPEG分子量和化合物，技術(shù)人員將意識到所述添加劑的身份和濃度可以變化以優(yōu)化結(jié)果。在本發(fā)明中，PEG的有效量是足以在RNA雜交體中發(fā)揮連接活性的量。在20 μ I RT反應(yīng)中，發(fā)現(xiàn)在RNA雜交體中連接的最佳PEG濃度是20%。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知任選可以增加或者減少所述反應(yīng)體積和PEG濃度(例如減少體積，增加PEG量或濃度)，以潛在地進(jìn)一步優(yōu)化在RNA雜交體中由T4DNA連接酶或者T4RNA連接酶2對2個DNA分子的連接效力。其它添加劑如ImM HCC和/或焦磷酸酶可進(jìn)一步增加在RNA雜交體中的連接效力。
[0078]預(yù)腺苷酸化的寡核苷酸可以插入在所述反應(yīng)中并和截短的T4RNA連接酶一起使用，條件是在連接反應(yīng)之前已經(jīng)除去任何未雜交的寡核苷酸。如之前在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中所提及，除了 T4DNA連接酶之外可以加入截短的T4RNA連接酶2，以在RNA雜交體中進(jìn)一步加強(qiáng)DNA片段的連接。
[0079]因此，優(yōu)選所述連接酶是雙鏈特異性連接酶，如T4DNA連接酶或者T4RNA連接酶2，及其中優(yōu)選使用濃度在12% -25%之間的聚乙二醇。
[0080]除了代表性模板擴(kuò)增合成之外，本發(fā)明的另一益處是改良的產(chǎn)生長產(chǎn)物核酸的效力，特別是cDNA合成，獲得較高的檢測敏感性及較長的產(chǎn)物(見實(shí)施例5和6)。
[0081]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，任一寡核苷酸引物均可包含序列標(biāo)簽。這種序列標(biāo)簽是獨(dú)特的預(yù)選的核酸序列形式的標(biāo)記，可用于檢測、識別或者擴(kuò)增用所述標(biāo)簽標(biāo)記的序列。優(yōu)選地，同樣的序列標(biāo)簽連接至多于一種的寡核苷酸引物，特別優(yōu)選連接至所有寡核苷酸引物。這種序列標(biāo)簽優(yōu)選不能與模板退火，例如與互補(bǔ)核酸雜交。序列標(biāo)簽可以連接至寡核苷酸終止物的5’末端，以免防止引物在其3’末端的延伸反應(yīng)。
[0082]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，任一寡核苷酸終止物均可包含序列標(biāo)簽。這種序列標(biāo)簽是獨(dú)特的預(yù)選的核酸序列形式的標(biāo)記，可用于檢測、識別或者擴(kuò)增用所述標(biāo)簽標(biāo)記的序列。優(yōu)選地，同樣的序列標(biāo)簽連接至多于一種的寡核苷酸終止物，特別優(yōu)選連接至所有寡核苷酸終止物。這種序列標(biāo)簽優(yōu)選不能與模板退火，例如與互補(bǔ)核酸雜交。序列標(biāo)簽可以連接至寡核苷酸終止物的3’末端。在該位置，所述標(biāo)簽不阻礙延伸產(chǎn)物核酸與終止物的5’末端的接觸，獲得充分限定的產(chǎn)物。其也使得延伸的產(chǎn)物可以與寡核苷酸終止物連接?；蛘?，所述標(biāo)簽可以在所述終止物的5’末端上，然而，無法與模板雜交，以便所述延伸反應(yīng)仍達(dá)到所述終止物的引物區(qū)域的5’末端。所述標(biāo)簽優(yōu)選包含游離的5’末端，由此延伸的產(chǎn)物可以與所述標(biāo)簽連接，以由所述標(biāo)簽標(biāo)記延伸的產(chǎn)物?？梢匀菀椎嘏c產(chǎn)物連接的所述標(biāo)簽的游離5’末端優(yōu)選提供在延伸的產(chǎn)物的3’末端附近。這可以通過例如提供該標(biāo)簽與寡核苷酸終止物的互補(bǔ)區(qū)雜交而實(shí)現(xiàn)，所述互補(bǔ)區(qū)與所述標(biāo)簽雜交，并附著于寡核苷酸終止物的引物區(qū)的5’末端(實(shí)例參見圖4)。
[0083]延伸的產(chǎn)物當(dāng)其達(dá)到寡核苷酸終止物(或者另一引物)、優(yōu)選終止物的位置時(shí)的創(chuàng)造性標(biāo)記步驟可以使用本領(lǐng)域易于獲得的任何已知方式實(shí)現(xiàn)。這種方式包括附著生色團(tuán)、熒光團(tuán)或者簡單相分離，通過與固相結(jié)合而并洗滌所述固相以除去所有未結(jié)合的核酸，從而分離標(biāo)記的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述標(biāo)記步驟包括與序列標(biāo)簽連接。序列標(biāo)簽可以附著于所述寡核苷酸引物或者寡核苷酸終止物。標(biāo)記也可以包括與包含序列標(biāo)簽的所述寡核苷酸引物或者寡核苷酸終止物連接。
[0084]對于許多下游分析而言，優(yōu)選寡核苷酸如引物、終止物、阻斷劑或者接頭被去除。特別地，當(dāng)必需或需要利用通用接頭序列擴(kuò)增文庫時(shí)，可優(yōu)選去除未連接的接頭。
[0085]這可以通過例如尺寸排阻實(shí)現(xiàn)，在合適的床中保留寡核苷酸(較短)，并回收文庫(較長)。另一可能性是使較長的文庫與基于硅石的載體結(jié)合，而不保留較短的寡聚物。也可以進(jìn)行這種辨別，當(dāng)仍在具有模板的雜交體中時(shí)，在寡聚體的單鏈型(singlestrandedness)與文庫的雙鏈型(double strandedness)之間進(jìn)行區(qū)分?；陂L度的純化的另一可能性是基于PEG沉淀的方法。PEG濃度越高，可以沉淀的核酸越短。例如，發(fā)現(xiàn)使用12.5% PEG沉淀，所有小片段(低于60個核苷酸)將留在溶液中，僅cDNA和接頭連接的文庫沉淀。
[0086]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用基于珠的清除方法。分離生物素標(biāo)記的寡聚dT引物的寡聚dT偶聯(lián)的珠或者鏈霉親和素珠可商購?；谥榈那宄哂锌梢栽谒鲋樯线M(jìn)行RT和連接這兩個反應(yīng)的額外優(yōu)勢。在mRNA與寡聚dT (生物素標(biāo)簽的或者在珠上)及與起始物和終止物雜交之后，可以洗去任何過量的未雜交的起始物和終止物，之后開始RT反應(yīng)。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述模板核酸固定在固相或者固體支持物上，優(yōu)選固定在珠上。然后可以洗滌與所述模板核酸雜交的擴(kuò)增的核酸。
[0087]本發(fā)明的另一實(shí)施方案是可以在一個反應(yīng)步驟中進(jìn)行RT和連接反應(yīng)，簡便地通過在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中在常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液中加入連接酶(如T4DNA連接酶或者T4RNA連接酶2)、10% PEG和0.4 μ M ATP而進(jìn)行。盡管可以使用30分鐘保溫，但是在37°C保溫2小時(shí)獲得更好的產(chǎn)量。在另一洗滌步驟(4次洗滌)之后，可以將RNA水解以獲得雙標(biāo)簽(d1-tagged)的cDNA文庫，然后可插入PCR反應(yīng)中。RT和連接反應(yīng)也可以在兩個連續(xù)反應(yīng)步驟中進(jìn)行，通過洗滌所述珠簡便地再緩沖所述反應(yīng)。然而，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，同時(shí)進(jìn)行RT/連接反應(yīng)，因?yàn)檫@樣獲得與兩個步驟方案相似的產(chǎn)量，但是具有減少轉(zhuǎn)送和保溫時(shí)間的優(yōu)勢。同時(shí)的RT和連接反應(yīng)可以通過在具有模板核酸的一個反應(yīng)混合物中加入DNA聚合酶和連接酶而進(jìn)行。
[0088] 在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述延伸的產(chǎn)物被擴(kuò)增。擴(kuò)增可包括使用標(biāo)簽特異性引物以擴(kuò)增包含5’和/或3’標(biāo)簽的延伸的產(chǎn)物，分別來自于標(biāo)簽標(biāo)記的寡核苷酸引物和/或終止物。優(yōu)選通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。在隨后的擴(kuò)增循環(huán)中適于引物雜交的序列標(biāo)簽在本文也稱作“接頭”。
[0089]目前針對高通量測序如NGS的小cDNA片段的任何制備均包括RNA的片段化，在大多數(shù)情況中包括多步驟程序以導(dǎo)入5’和3’接頭標(biāo)簽以進(jìn)行擴(kuò)增和條碼編碼。例如，Epicentre’ s ScriptSeq?mRNA-Seq文庫制備試劑盒使用末端標(biāo)簽技術(shù)(US2009/0227009A1)及化學(xué)片段化的RNA的隨機(jī)引發(fā)(去除核糖體RNA)。然而，mRNA的任何片段化(化學(xué)或物理)引出不確定的和不可預(yù)見的偏差。另外，在片段化方案期間，一部分RNA被降解或者失去。因此，本發(fā)明完美地適于產(chǎn)生充分限定較短大小的cDNA文庫而不需要RNA片段化。
[0090]此外，當(dāng)RNA被片段化時(shí)，產(chǎn)生許多額外的5’末端。逆轉(zhuǎn)錄酶具有當(dāng)其達(dá)到模板RNA的5’末端時(shí)加入幾個非模板核苷酸及使用這些核苷酸引發(fā)第二鏈合成的傾向。因此，當(dāng)RNA被片段化時(shí)，產(chǎn)生更多的5’末端，并因此起始更多的第二鏈合成。在RNA測序期間的一個重要問題是RNA從哪個DNA鏈被轉(zhuǎn)錄。特別是在有義和反義轉(zhuǎn)錄分析中，需要測序的文庫的高鏈型(strandedness)(鏈信息保守性)。因此，由于在本發(fā)明中不需要RNA消化，因此與包括RNA片段化的文庫制備方法相比在產(chǎn)生的cDNA文庫中可以實(shí)現(xiàn)更高程度的鏈型(見實(shí)施例9)。
[0091]當(dāng)然這種方法可以用于產(chǎn)生任何種類模板核酸的片段，不限于RNA。這種片段由本發(fā)明的延伸的產(chǎn)物或者擴(kuò)增的核酸部分提供。模板核苷酸序列也可以是DNA。因此，使用本發(fā)明所述技術(shù)制備文庫也可以從基因組DNA或PCR產(chǎn)物開始。由于逆轉(zhuǎn)錄酶也接受DNA模板[33]，因此所有步驟可基本如這個發(fā)明所述進(jìn)行。任選地，如果DNA用作模板，也可以使用DNA依賴性聚 合酶。
[0092]對于許多分析方法如NGS，優(yōu)選在cDNA的3’和/或5’末端上存在明確的通用接頭序列。這種接頭序列可例如作為PCR擴(kuò)增的引發(fā)位點(diǎn)以富集文庫，或者作為在固體表面上橋接擴(kuò)增的引發(fā)位點(diǎn)，或者引發(fā)測序反應(yīng)。因此，在本發(fā)明范圍內(nèi)，接頭序列與擴(kuò)增的核酸部分連接。然而，優(yōu)選5’接頭序列用引物直接導(dǎo)入(見圖3(L1))。在此，5’接頭序列是用于引發(fā)聚合酶的序列的5’延伸。
[0093]或者或此外，接頭序列可以導(dǎo)入在延伸的核酸產(chǎn)物的3’末端，例如通過使用終止物寡聚物進(jìn)行(圖3.(Sl，Sm))，所述終止物寡聚物3’末端上添加有接頭序列(圖3.(L2))。終止物寡聚物的5’末端可以與延伸產(chǎn)物的3’末端連接(圖3b)。特異性裂解反應(yīng)保證了終止物寡聚物的5’末端不被鏈置換。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入終止物寡核苷酸，及其中所述終止物寡核苷酸具有3’接頭序列延伸。
[0094]在另一種形式中，如圖5和8所示，起始物和終止物寡核苷酸彼此至少部分雜交。5’磷酸化的終止物寡核苷酸可以仍與模板鏈雜交(如圖8a-d，f_h所示)，或者與模板鏈不雜交(見圖Se)。在這種情況中，稱作起始物的延伸的寡聚物必須是終止鏈置換的實(shí)際寡聚物并因此優(yōu)選含有終止鏈置換的修飾。從更上游的起始物延伸的鏈將終止在下一個起始物，先前被稱作終止物的與起始物雜交的磷酸化的寡聚物與延伸的cDNA鏈連接。
[0095]在8e中，示出更詳盡描述的起始物/終止物組合。關(guān)于接頭序列LI和L2的詳細(xì)描述可見于圖9的描述。
[0096]最后，起始物和終止物寡聚物的序列標(biāo)簽(接頭)可以接合(見圖8h)，以將序列標(biāo)簽導(dǎo)入cDNA中，但是保持各個延伸產(chǎn)物序列順序，因?yàn)槠洮F(xiàn)在通過其起始物終止物序列標(biāo)簽彼此共價(jià)連接。
[0097]優(yōu)選在延伸反應(yīng)期間使用具有較低或沒有末端轉(zhuǎn)移酶活性的聚合酶，在到達(dá)終止物寡聚物的5’末端位置時(shí)在延伸產(chǎn)物的3’末端不加入非模板化的核苷酸，因?yàn)?’突出端降低連接反應(yīng)的特異性和效力。具有低末端轉(zhuǎn)移酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶例如是SuperscriptIII (Invitrogen)，無末端轉(zhuǎn)移酶活性的RT是例如AMV-RT。
[0098]或者或此外，末端轉(zhuǎn)移酶活性及因此的第二鏈合成可以通過加入放線菌素D而被抑制。放線菌素D可以這樣的量加入聚合反應(yīng)中，所述量與未加入放線菌素相比避免第二鏈合成和/或降低聚合酶的鏈置換。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將放線菌素D加入RT反應(yīng)中，終濃度為大約50μ g/ml，也可以使用較高或較低濃度，如5μ g/ml-200l.! g/ml。
[0099]此外或另外，突出端可以由單鏈特異性核酸酶消化，優(yōu)選3’ -5’核酸外切酶，例如但不限于核酸外切酶I (3，-5’ ssDNA消化)、Exo T5 (3，-5’ ss或者dsDNA消化)。
[0100]本發(fā)明的目標(biāo)之一是控制通過擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物獲得的序列文庫中導(dǎo)入任何偏差，這在大多數(shù)情況中意味著使偏差最小化。作為隨機(jī)或半隨機(jī)引發(fā)序列的延伸導(dǎo)入的接頭序列也可以參與與模板雜交。這樣在產(chǎn)生的文庫中將加入偏差。因此優(yōu)選至少位于引物或終止物序列鄰近的接頭的核苷酸與模板的雜交被抑制。這可以通過不同方式實(shí)現(xiàn)。例如，可以在反應(yīng)中加入具有接頭序列的反向互補(bǔ)序列的寡核苷酸(見圖5C-f，圖6c_f)。在那種情況中，反向互補(bǔ)物將與模板競爭與接頭序列雜交，通過使用過量的反向互補(bǔ)物，接頭序列在引發(fā)RT或雜交終止物寡聚物中的參與可以被有效終止。
[0101]優(yōu)選提供具有核苷酸修飾的反向互補(bǔ)，通過使用例如LNA，增強(qiáng)接頭:反向互補(bǔ)物雜交體的穩(wěn)定性。然 而，可以使用增強(qiáng)結(jié)合能力的任何其它修飾(見圖6e，圖7e)。
[0102]此外，優(yōu)選加入引物和/或終止物作為逆轉(zhuǎn)錄的預(yù)制連接物。這意味著基本上所有接頭序列與其反向互補(bǔ)鏈雜交，由此接頭序列參與雜交反應(yīng)被抑制。
[0103]因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將寡核苷酸的接頭序列部分的反向互補(bǔ)序列加入反應(yīng)中，優(yōu)選已經(jīng)與寡核苷酸引物雜交，及進(jìn)一步優(yōu)選所述反向互補(bǔ)寡聚物的Tm通過例如導(dǎo)入修飾如LNA、2’氟代核苷酸或者PNA而升高。
[0104]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反向互補(bǔ)序列與接頭序列共價(jià)連接(見圖6g，7g)。這可以是與接頭序列直接連續(xù)或者通過核苷酸發(fā)夾或間隔物如C3、C6、C12或者任何其它部分連接。此外，這個部分可以是增強(qiáng)連接物形成的修飾。如前文所述，優(yōu)選反向互補(bǔ)的核苷酸被修飾為增強(qiáng)與接頭序列的雜交。因此，優(yōu)選接頭序列的反向互補(bǔ)與接頭序列直接連接或者通過核苷酸發(fā)夾或間隔物如C3、C6、C12或者任何其它部分連接。
[0105]在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，引物上的序列標(biāo)簽(LI)和終止物上的序列標(biāo)簽(L2)包含至少部分互補(bǔ)序列，其使得起始物與終止物可以形成雜交體(見圖5和8)。以此方式，所述序列標(biāo)簽(接頭)序列不與模板鏈雜交，及作為額外的益處，終止物-連接將在下一起始事件緊鄰發(fā)生，使起始與終止事件之間的任何缺口最小化。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一或多種或者所有寡核苷酸終止物與至少一種另外的寡核苷酸引物雜交。在另一實(shí)施方案或者另外的組合實(shí)施方案中，至少一或多種、優(yōu)選所有寡核苷酸引物與寡核苷酸終止物雜交。特別優(yōu)選寡核苷酸終止物任一種和寡核苷酸引物任一種各自包含序列標(biāo)簽，且優(yōu)選其中寡核苷酸引物的序列標(biāo)簽與寡核苷酸終止物的序列標(biāo)簽至少部分互補(bǔ)，從而使得所述寡核苷酸終止物與寡核苷酸引物彼此至少在各自的序列標(biāo)簽部分雜交。[0106]由于任何游離的3’ OH在聚合或連接期間均可作為接受體，因此優(yōu)選任何游離3’ OH(除了在寡核苷酸引物上的之外)均被阻斷(見圖6f，圖7f)。本領(lǐng)域已知許多阻斷基團(tuán)?？晒﹨⒖嫉幌抻诙撗鹾颂呛塑账?、C-間隔物和磷酸基團(tuán)。此外，引發(fā)連接物中反向互補(bǔ)的3’末端也可以提供為具有突出端(見圖6d)。相應(yīng)地，終止連接物的接頭序列可以提供為具有3’突出端(見圖7d)。因此，優(yōu)選不參與引物延伸反應(yīng)的寡核苷酸的3’0H被阻斷和/或在提供在雜交體中的情況中，所述3’末端具有跨過5’末端的突出端。
[0107]當(dāng)接頭序列與引物和/或終止物寡核苷酸一起導(dǎo)入時(shí)，接頭序列之間的序列反映模板RNA序列。由于在聚合期間引物或終止物與模板的錯誤雜交比摻入錯誤核苷酸更加可能，因此引物序列和/或終止物序列比聚合的序列更可能含有錯誤。因此，當(dāng)例如在NGS實(shí)驗(yàn)中測序文庫中，可優(yōu)選含有測序引物的接頭序列與引物延伸產(chǎn)物緊鄰。這個問題的一個解決方案在圖4中示出。在此，L2序列與已經(jīng)導(dǎo)入在終止物寡核苷酸5’側(cè)的其反向互補(bǔ)序列雜交。以此方式，一旦聚合酶到達(dá)并終止在終止寡聚物，則L2序列可以與引物延伸產(chǎn)物連接。然而，所述寡聚物的終止序列的序列不包括在所述文庫中。因此，從L2序列起始任何測序反應(yīng)將不包括潛在的錯誤雜交的終止物序列。因此，優(yōu)選接頭序列在所述終止寡核苷酸的5’末端上，且接頭序列的反向互補(bǔ)序列的5’末端與鏈置換終止的延伸產(chǎn)物的3’末端連接作為序列標(biāo)簽。相同原理用于圖Se所示起始物-“終止物”組合，唯一不同是負(fù)責(zé)終止的寡聚物實(shí)際上是下一文庫片段的起始物。
[0108]因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸引物或者寡核苷酸終止物與作為寡核苷酸標(biāo)記的序列標(biāo)簽雜交。特別優(yōu)選的所述序列標(biāo)簽優(yōu)選與在所述寡核苷酸引物或寡核苷酸終止物的5’末端上的部分雜交。所述引物或終止物3’方向緊鄰所述引物或終止物與所述序列標(biāo)簽雜交的核苷酸的接 下去例如1、2、3、4、5、6或更多個核苷酸與模板雜交。這樣使得所述標(biāo)簽的5’末端位于另一引物的延伸產(chǎn)物的3’末端附近，其位于具有雜交的序列標(biāo)簽的寡核苷酸引物或寡核苷酸終止物的上游，由此所述另外的引物的3’末端可以與所述序列標(biāo)簽的5’末端連接。這種標(biāo)簽也可用于隨后的連接的產(chǎn)物的擴(kuò)增反應(yīng)，及在本文也被稱作“接頭”。
[0109]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸引物和/或寡核苷酸終止物包含核苷酸修飾，其增加Tm或者強(qiáng)化所述寡核苷酸的糖磷酸酯主鏈。增加Tm的這些修飾是為了增強(qiáng)與模板的雜交，以保證延伸反應(yīng)的終止及防止引物或終止物的置換。這種修飾從本領(lǐng)域寡核苷酸阻斷劑中已知，如在 GB2293238、US2002/0076767A1、US6, 391，592B1、W099/6166UW002/086155、US5, 849，497、W02009/019008中所述。合適的修飾包括選自2，氟代核苷、LNA(鎖核酸)、ZNA(拉鏈核酸)、PNA(肽核酸)的一或多種修飾。進(jìn)一步地，Tm可以通過使用特異性結(jié)合核酸的嵌入劑或者添加劑提高，如溴化乙錠(Ethidiumbromid)、Sybr Green。優(yōu)選的嵌入劑特異于RNA = DNA雜交體。修飾的核苷酸的數(shù)目可以變化，根據(jù)采取的增加Tm的其它措施而定。優(yōu)選修飾1、2、3、4、5或6個核苷酸。優(yōu)選地，修飾的核酸在引物序列部分的5’側(cè)，寡核苷酸引物或終止物的可以雜交或與模板退火的部分。優(yōu)選地，修飾1、2或3個5’核苷酸。DNA聚合酶可具有內(nèi)部鏈置換活性，特別是逆轉(zhuǎn)錄酶使二級RNA結(jié)構(gòu)變性。具有核苷酸鏈置換活性的聚合酶可用于延伸反應(yīng)。
[0110]由于DNA聚合酶、特別是逆轉(zhuǎn)錄酶可從RNA的模板鏈置換DNA寡核苷酸，至少與溶解二級或三級結(jié)構(gòu)一樣好，因此寡核苷酸的雜交需要被增強(qiáng)以終止逆轉(zhuǎn)錄酶的鏈置換。這可以通過使用對寡核苷酸自身的修飾或者通過使用穩(wěn)定寡核苷酸雜交或終止逆轉(zhuǎn)錄的添加劑而實(shí)現(xiàn)。降低或抑制逆轉(zhuǎn)錄酶鏈置換活性的寡核苷酸的修飾是例如2’氟代核苷[15]、PNA[16，見圖 2，17]、ZNA[18，19]、G-Clamps (US6，335，439，能鎖住結(jié)合鳥嘌呤(Clamp Binding to Guanine)的胞嘧啶類似物)或者 LNA (US2003/0092905 ；US7, 084, 125)[20，21]。這些修飾通常提高寡核苷酸的解鏈溫度，通過增加寡核苷酸與模板RNA鏈的局部雜交能量而實(shí)現(xiàn)。一些修飾也使得糖磷酸酯主鏈強(qiáng)化(stiffen),進(jìn)一步抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的鏈置換活性。
[0111]或者或此外，寡聚物與RNA模板的雜交可以通過使用結(jié)合或嵌入核酸的不同添加劑改變。例如，可以使用溴化乙錠、SybrGreen (US5, 436，134 ；US5, 658，751 ；US6, 569，627)或者吖啶(acricidine)?？山Y(jié)合dsNA的其它化合物是放線菌素D及類似物[22]。然而，其潛在地也穩(wěn)定RNA 二級結(jié)構(gòu)。
[0112]因此，優(yōu)選這種嵌入劑或添加劑特異性結(jié)合RNA = DNA雜交體。例如是新霉素家族的氨基糖苷(新霉素、核糖霉素、巴龍霉素和弗拉霉素[23])。改變寡核苷酸雜交性質(zhì)的添加劑也可以共價(jià)包含在寡核苷酸結(jié)構(gòu)中[23]。
[0113]可以改變雜交能量和動力學(xué)以抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的鏈置換活性，通過加入核酸結(jié)合蛋白如單鏈結(jié)合蛋白如TtH SSB[24]或Tth RecA[25]實(shí)現(xiàn)。
[0114]本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到這些添加劑只是舉例，可以使用使寡核苷酸與RNA的雜交增加的任何其它化合物、堿基修飾或者酶，以增加Tm及因此抑制鏈置換。
[0115]Tm的增加應(yīng)足夠高以防止與模板退火的引物區(qū)的任一 5’末端核苷酸被延伸聚合酶置換。特別地，本發(fā)明的Tm提高防止引物區(qū)5’末端下游的第3、第2和/或第I核苷酸置換。
[0116]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，鏈置換需要剛好在下游引物的第一個5’核苷酸被終止，特別是當(dāng)cDNA片段彼此連接或者與接頭連接時(shí)，如下文描述。寡核苷酸的鏈置換被降低或抑制，通過使用增加Tm或使寡核苷酸的糖磷酸酯主鏈變硬的核苷酸修飾，通過例如包括2’氟代核苷LNA、PNA、ZNA或PNA或者通過使用特異性結(jié)合核酸的嵌入劑或添加劑如溴化乙錠、Sybr gold、SybrGreen,優(yōu)選嵌入劑特異于RNA:DNA雜交體。
[0117]因此，優(yōu)選寡核苷酸引物的結(jié)合是在其5’末端特異性Tm增強(qiáng)的，以防止延伸中聚合酶置換它們。這種修飾包括但不限于LNA、PNA、ZNA、吖啶或者熒光團(tuán)。
[0118]在其5’末端具有提高的Tm的寡核苷酸如LNA修飾的寡核苷酸使得可以剛好在下一引物的起始處終止。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以組合鏈置換終止措施，通過使用LNA修飾的寡聚物以及置換合成缺陷突變體如Y64AM-MLV或F61W HIV或者具有削弱的置換合成活性的任何其它逆轉(zhuǎn)錄酶，以及降低反應(yīng)溫度和使用增強(qiáng)寡核苷酸與RNA結(jié)合的不同添加劑。
[0119]優(yōu)選地，修飾C和/或G核苷酸。甚至未修飾的這些核苷酸由于當(dāng)互補(bǔ)退火時(shí)增加的氫鍵形成而與A或T相比具有較高的Tm。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸引物和/或寡核苷酸終止物包含至少1、2、3、4、5、6個選自G或C的修飾的核苷酸。這些修飾的核苷酸優(yōu)選如上述在引物序列的5’末端。
[0120] 最有效的鏈置換終止是通過G或C堿基實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)槠湓黾右锘蚪K止物的局部Tm。因此，半隨機(jī)引物或終止物(六聚體、七聚體、八聚體、九聚體等)含有至少2個、更優(yōu)選3或更多個G或C或者G與C的組合。最優(yōu)選的是當(dāng)使用LNA修飾的堿基時(shí)，這些G或C被修飾以增加局部解鏈溫度。最優(yōu)選的是在引物的5’末端使用至少1、2或者至少3個LNA修飾的堿基。因此，優(yōu)選至少2、3個修飾的核苷酸任選選自G或C。
[0121]現(xiàn)有一些方法和方式以保證當(dāng)延伸反應(yīng)到達(dá)寡核苷酸終止物的位置或者進(jìn)一步地或另外引物與模板退火時(shí)所述延伸反應(yīng)被終止。這種終止在本文也被稱作防止鏈置換。由于逆轉(zhuǎn)錄酶的增加的或高鏈置換活性導(dǎo)致鏈置換是逆轉(zhuǎn)錄的一個特殊問題。本發(fā)明的抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的鏈置換已經(jīng)拷貝的RNA部分的cDNA的步驟保證了已經(jīng)拷貝的RNA分子的任何部分不再拷貝。因此，沒有RNA已拷貝的部分在合成的cDNA文庫中過度表現(xiàn)。這種鏈置換的抑制可以通過不同方式實(shí)現(xiàn)，如降低反應(yīng)溫度、使用無鏈置換活性的逆轉(zhuǎn)錄酶、提高解鏈溫度或者引物:RNA雜交體的雜交能量或者增加RNA或引物的硬度或者穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)。在實(shí)施中，通常選擇這些方式的組合，以實(shí)現(xiàn)無鏈置換的最佳反應(yīng)條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇如本文所述或本領(lǐng)域已知的合適參數(shù)以適于特定的模板和反應(yīng)條件。
[0122]一個選項(xiàng)是修飾反應(yīng)溫度。通常地，在RT期間反應(yīng)溫度高于37°C是有利的，以更好地溶解RNA模板中的二級結(jié)構(gòu)，其導(dǎo)致更有效的置換合成。在一個實(shí)施方案中，引物的鏈置換終止是通過降低反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。使用低于37°C的反應(yīng)溫度及降至4°C以降低鏈置換。優(yōu)選在RT期間的聚合是在20°C-37°C之間進(jìn)行。然而，當(dāng)使用具有鏈置換活性的逆轉(zhuǎn)錄酶時(shí)和/或使用沒有改變其解鏈溫度的修飾的簡單的終止物寡核苷酸時(shí)，甚至在這些低反應(yīng)溫度，鏈置換終止也是不完全的。
[0123]在一個實(shí)施方案中，除了降低反應(yīng)溫度以實(shí)現(xiàn)在所述另外的引物或終止物的位置延伸反應(yīng)的更好的終止(及 降低鏈置換)外，可以使用在鏈置換中缺陷的逆轉(zhuǎn)錄酶如Y64AM-MLV突變體[12]或者F61W(Phe-61-Trp)HIV突變體[13，14]。當(dāng)未修飾時(shí)鏈置換缺陷的突變體能置換下一引物或終止物至多3個核苷酸。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以組合鏈置換終止措施，通過降低反應(yīng)溫度及使用置換合成缺陷突變體如Y64A M-MLV或F61W HIV或者具有削弱的置換合成活性的任何其它逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0124]在RT期間降低反應(yīng)溫度或者使用具有降低的或削弱的鏈置換活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的一個缺點(diǎn)是所述逆轉(zhuǎn)錄酶難以讀取通過RNA 二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。二級結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，RNA的這個部分越不可能拷貝為cDNA。這意味著盡管一個RNA分子沒有一部分被拷貝超過一次，但是形成二級結(jié)構(gòu)的RNA部分不會被拷貝。這意味著RNA的一些部分在產(chǎn)生的cDNA文庫中將被過低表現(xiàn)。
[0125]因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用具有鏈置換活性的逆轉(zhuǎn)錄酶和/或在足以溶解二級RNA結(jié)構(gòu)的提高的溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在這些條件下，RNA的每一部分均可接近逆轉(zhuǎn)錄酶。然而，由于RNA = RNA雜交體通常比RNA = DNA雜交體更穩(wěn)定，如果不使用進(jìn)一步修飾，則cDNA拷貝可再次被鏈置換。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是在不允許RNA模板(RNA:RNA雜交體)的二級或三級結(jié)構(gòu)形成的條件下或者在允許這些二級結(jié)構(gòu)被逆轉(zhuǎn)錄酶鏈置換而同時(shí)引物延伸產(chǎn)物(cDNA拷貝)不可被置換的條件下進(jìn)行的。
[0126]增加單價(jià)抗衡離子的濃度也穩(wěn)定所述雜交體(以及RNA 二級結(jié)構(gòu))，因?yàn)獒槍IV-RT已經(jīng)報(bào)道了在75mM KC1，鏈置換活性被削弱，但是不被抑制[26，27]。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，單價(jià)正離子的濃度優(yōu)選選自至少20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM。對于單一負(fù)電荷離子可獨(dú)立地選擇相似濃度。
[0127]在延伸反應(yīng)期間使用的逆轉(zhuǎn)錄酶可以是病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，可選自AMVRT (及其突變體如 Thermoscript RT)、MMLV RT(及其突變體,包括但不限于 Superscript 1、II 或 III,Maxima RT,RevertAid,RevertAid Premium,Omniscript,GoScript)、HIV RT>RSV RT>EIAVRT、RAV2RT、Tth DNA聚合酶、C.hydrogenoformans DNA聚合酶、禽肉瘤造白細(xì)胞組織增生病毒(ASLV)和RNase H，其突變體?？梢允褂萌魏芜@些逆轉(zhuǎn)錄酶的混合物。特別地，可以使用病毒RT酶的混合物，如MMLV與ASLV的混合物，和/或可以使用其RNase H降低的或者RNase H minus類似物。在任何這些方法和組合物中,可以使用兩或多種逆轉(zhuǎn)錄酶,包括任何上述逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0128]在本發(fā)明范圍內(nèi)可組合鏈置換終止措施，通過降低反應(yīng)溫度及使用置換合成缺陷的突變體如Y64A M-MLV或F61W HIV或者具有削弱的置換合成活性的任何其它逆轉(zhuǎn)錄酶及增加寡核苷酸與RNA的Tm。
[0129]在任何這些方法和組合物中，也可以使用耐熱的DNA聚合酶，不過關(guān)于RNA穩(wěn)定性及引物的雜交動力學(xué)，這不是在所有情況中均推薦的。
[0130]特別但不限于在隨機(jī)引發(fā)的cDNA文庫中的最佳表現(xiàn)，隨機(jī)引物存在的濃度可以是50ηΜ-100μΜ，更優(yōu)選大約2.5 μ Μ，但是也可以是至少300ηΜ。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，弓丨物與模板核酸的比率(w/w)在5:1至1:1000之間，優(yōu)選在2:1至1:500之間，優(yōu)選在1:1至1:300之間，優(yōu)選在1:2至1:250之間，優(yōu)選在1:5至1:150之間，優(yōu)選在1:10至1:100之間，優(yōu)選在1:12至1:50之間。引物與模板核酸的摩爾比率可以在1000:1至5000000:1之間，優(yōu)選在5000:1至1000000:1之間，在10000:1至500000:1之間，或者在20000:1至300000:1之間。在一個實(shí)例中，使用150ng的mRNA起始物并假定mRNA長度為500_5000nt，這意味著以2.5 μ M終濃度加入的引物以摩爾過量1:280000-1:28000加入。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，引物與終止物的摩爾或w/w比率在2:1至1:10之間，優(yōu)選在1:1至1:5之間，尤其為大約1:1。
[0131]然而，降低寡聚物的濃度是可能的，例如使用34ng的mRNA起始物并假定mRNA長度為500-5000nt，這意味著以300nM終濃度加入的引物是以摩爾比率1:33_1:3.3加入的，模板是摩爾過量的。優(yōu)選的在聚合反應(yīng)期間降低的核苷酸濃度可幫助降低聚合酶的鏈置換及假第二鏈合成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，引物與終止物的摩爾或(w/w)比率在2:1至1:10之間，優(yōu)選在1:1至1:5之間，特別是為大約1:1。
[0132]當(dāng)mRNA被逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，可以加入寡聚dT引物以更好地覆蓋mRNA的多聚A尾部。任選地，寡聚dT引物的加入可以省略，因?yàn)槠涫请S機(jī)引物混合物的一部分，但是在優(yōu)選的實(shí)施方案中，為了保證mRNA相等表現(xiàn)，其應(yīng)該加入。寡聚dT的長度可以從8個堿基至27個堿基，但是優(yōu)選使用長度為25nt的寡聚dT引物?？梢允褂镁哂胁煌M合物的其它類型引物代替寡聚dT。舉例的這種組合物包括但不限于寡聚dT，其中3’堿基是A或者C或者G (錨定dT)。此外，也可以使用可以與mRNA的多聚A序列堿基配對的其它序列或成分。一個非限制性實(shí)例是脫氧尿苷(dU)。
[0133]所述寡聚(dT)基本上可由大約12-25個dT殘基組成，可以是含有末端非-T核苷酸的錨定寡聚(dT)。所述寡聚(dT)可以是長度為18-25nt的寡聚(dT)或者其錨定等價(jià)物。
[0134] 所述寡聚(dT)的濃度可以是在大約20ηΜ_1μΜ之間，最優(yōu)選使用500nM。隨機(jī)引物的長度可以是5-15個核苷酸，可以是在5’位點(diǎn)具有至少3個LNA或者至少3個2’氟代修飾的堿基以有效地終止鏈置換的隨機(jī)六聚體。
[0135]一個額外的特征是根據(jù)隨機(jī)引物的濃度，產(chǎn)物核酸的平均長度會受影響。通過增加隨機(jī)引物的濃度，可以降低所得延伸產(chǎn)物的大小。希望的片段大小依賴于隨后的應(yīng)用。如果希望的擴(kuò)增的核酸部分應(yīng)低于300nt (通常為第二代測序所需)，則隨機(jī)引物濃度應(yīng)在125nM-350nM終濃度范圍。
[0136]根據(jù)本發(fā)明的方法，寡聚dT的濃度可以是例如44nM_750nM，或者為中間值。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可以使用隨機(jī)引物和寡聚dT的各種比率。
[0137]當(dāng)在研究mRNA的情況中，優(yōu)選應(yīng)使用mRNA經(jīng)富集的RNA樣品。關(guān)于mRNA富集的一些方法已經(jīng)充分論證并為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。最常用的是通過寡聚dT順磁性珠或寡聚dT纖維素的多聚A+富集[28]?？衫藐P(guān)于mRNA富集的許多商購的試劑盒?；蛘?，mRNA可以通過Terminator treatment (Epicentre)富集。此外，一些公司提供了來自許多生物體和組織的可商購的mRNA。
[0138]本發(fā)明中使用的修飾的隨機(jī)引物和寡聚dT的濃度和組合提供了有效的和代表性的mRNA序列至cDNA的轉(zhuǎn)換。這種方法提供了較好的及無偏差的mRNA序列至cDNA的轉(zhuǎn)換，與離mRNA的3’末端的距離無關(guān)。此外，通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的鏈置換活性，其保證了任何RNA分子均僅被逆轉(zhuǎn)錄一次。
[0139]本發(fā)明因此涉及增加mRNA相等表現(xiàn)的方法，及更特別涉及增加基因表達(dá)定量的精確性。因此，本發(fā)明提供了改良的cDNA合成，可用于基因發(fā)現(xiàn)、基因組研究、診斷和差異表達(dá)的基因的鑒別及對于疾病重要的基因的鑒別。 [0140]在另一實(shí)施方案中，寡核苷酸終止物可用于在逆轉(zhuǎn)錄期間特異性阻斷不希望的例如但不限于高豐度或核糖體轉(zhuǎn)錄物的逆轉(zhuǎn)錄。這個步驟可用于抑制特定模板產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)物混合物。一種實(shí)際應(yīng)用是抑制豐度mRNA產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫。用于抑制模板的寡核苷酸終止物，即不用于產(chǎn)生成分限定的延伸產(chǎn)物的寡核苷酸終止物，在本文被稱作阻斷寡核苷酸或者阻斷劑。阻斷寡核苷酸見于GB2293238、US2002/0076767AU US6, 391，592B1、W099/61661、W002/086155、US5, 849，497.W02009/019008 所述，可根據(jù)本發(fā)明加以應(yīng)用。優(yōu)選地，這種阻斷寡核苷酸高度特異于應(yīng)被阻止逆轉(zhuǎn)錄的那些轉(zhuǎn)錄物，因此優(yōu)選長于15nt。較長的寡核苷酸具有較高的Tm，因此更難以被逆轉(zhuǎn)錄酶置換。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述阻斷寡核苷酸通過在5’末端導(dǎo)入修飾(例如但不限于LNA、ZNA、PNA或者吖啶)也具有提高的Tm。這些阻斷寡核苷酸需要在3’末端被阻斷，以防止其被延伸。這種阻斷包括但不限于C3、C6、C12間隔物或雙脫氧核苷酸。所述阻斷寡核苷酸應(yīng)優(yōu)選針對位于RNA的3’末端附近、但位于多聚A尾部上游的序列設(shè)計(jì)。
[0141]本發(fā)明的范圍包括組合本發(fā)明的方法，其通過一起使用上述阻斷寡聚物及鏈置換合成缺陷的突變體(如Y64A M-MLV或F61W HIV)或者具有削弱的鏈置換合成活性的任何其它逆轉(zhuǎn)錄酶，以及降低反應(yīng)溫度和使用不同添加劑以增加寡核苷酸與RNA的結(jié)合。
[0142]或者，如果不知道高豐度轉(zhuǎn)錄物的序列，因此不能設(shè)計(jì)特異性阻斷寡聚物，則鏈置換終止也可用于文庫標(biāo)準(zhǔn)化。使用SDS寡核苷酸合成驅(qū)動文庫(優(yōu)選在5’末端具有提高的局部Tm，如LNA、PNA或ZNA修飾的寡核苷酸)。
[0143]使用末端轉(zhuǎn)移酶，雙脫氧核苷酸可以被加入那些擴(kuò)增的核酸部分以產(chǎn)生阻斷寡聚物。隨后這個文庫可以與檢測模板樣品雜交。高豐度轉(zhuǎn)錄物將具有優(yōu)勢，且來自驅(qū)動文庫的單鏈的擴(kuò)增的核酸部分更快速及更有效地雜交至相應(yīng)模板。然后可以使用引物(如針對mRNA的寡聚dT引物)起始產(chǎn)物合成，由于大多數(shù)高豐度轉(zhuǎn)錄物被雜交以阻斷寡核苷酸，因此低豐度的轉(zhuǎn)錄物具有更大機(jī)會被逆轉(zhuǎn)錄。如果也使用模板切換或者寡聚物加帽方案，所得低豐度轉(zhuǎn)錄物的cDNA甚至可以插入PCR反應(yīng)中，使用相應(yīng)于寡聚-dT引物的引物及模板切換或寡聚物加帽核苷酸?；蛘?，選擇性末端加標(biāo)簽(US2009/0227009A1)可用以對新合成的cDNA的3’末端加標(biāo)簽。因?yàn)楦哓S度的轉(zhuǎn)錄物由于阻斷寡核苷酸而最可能從未達(dá)到全長，因此僅低豐度轉(zhuǎn)錄物將在使用相應(yīng)于寡聚dT引物的引物及3’ cDNA標(biāo)簽的PCR中擴(kuò)增。
[0144]或者，如果cDNA的3’末端未加標(biāo)簽，可使用雙鏈T7RNA聚合酶啟動子引發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫的RT反應(yīng)，及可以使用通過在體外轉(zhuǎn)錄的線性擴(kuò)增。
[0145]因此，在延伸反應(yīng)中可以加入阻斷寡核苷酸，以終止模板分子的不希望的序列部分被延伸。選擇不希望的模板序列的預(yù)選序列用作阻斷劑。
[0146]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述模板核酸如RNA模板是單鏈的。特別地，有可能獲得的模板核酸在其至少30%的長度上缺少互補(bǔ)鏈，和/或缺少長度為至少100個核苷酸的互補(bǔ)鏈，優(yōu)選在其全長缺少互補(bǔ)核酸。本發(fā)明的方法還涵蓋從本發(fā)明的模板核酸鏈中分離可能存在的互補(bǔ)鏈，并將這 樣純化的無互補(bǔ)鏈的模板核酸導(dǎo)入本發(fā)明的方法中。
[0147]特別優(yōu)選地，本發(fā)明的一或多種引物及一或多種終止物結(jié)合模板鏈，特別地不結(jié)合互補(bǔ)鏈。
[0148]再一方面，本發(fā)明涉及使用上述方法產(chǎn)生一或多種模板核酸以產(chǎn)生包含所述模板核酸的擴(kuò)增的核酸部分的混合物的序列文庫。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增的核酸部分提供了模板的重疊序列部分。這可以例如通過使用多種不同引物而促進(jìn)，其產(chǎn)生各種延伸的產(chǎn)物，隨后被用作文庫的擴(kuò)增的核酸部分。
[0149]本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生如本文所述模板核酸的擴(kuò)增的核酸部分或者產(chǎn)生如本文所述序列文庫的試劑盒，其包含DNA聚合酶，包含增加Tm的修飾的隨機(jī)寡核苷酸引物和不適于核苷酸延伸的并包含增加Tm的修飾的隨機(jī)寡核苷酸終止物,任選其它的一或多種反應(yīng)緩沖液，其包含Mn2+或Mg2+，連接酶，優(yōu)選DNA連接酶或者具有DNA連接活性的RNA連接酶，適于連接反應(yīng)的擁擠劑如PEG。連接酶也可以是RNA連接酶，特別是具有DNA連接活性的RNA連接酶，如T4RNA連接酶2。擁擠劑是惰性分子，可以高濃度使用及可用于模擬在細(xì)胞內(nèi)部擁擠的大分子的作用。擁擠劑的實(shí)例是PEG (聚乙二醇)、PVP (聚乙烯吡咯烷酮)、海藻糖、聚蔗糖和葡聚糖。擁擠劑在例如US5，554，730或US8，017，339中揭示?；蛘咚鲈噭┖锌砂珼NA聚合酶和連接酶及任選任何其它的上述化合物。
[0150]適于產(chǎn)生模板核酸的擴(kuò)增的核酸部分的本發(fā)明的另外的試劑盒包含或含有:a)隨機(jī)寡核苷酸引物，其包含增加Tm的修飾，及b)隨機(jī)寡核苷酸終止物，其不適于核苷酸延伸并包含增加Tm的修飾。所述試劑盒可進(jìn)一步包含一或多種反應(yīng)緩沖液，其包含Mn2+或Mg2+，連接酶，擁擠劑如PEG。所述試劑盒也可進(jìn)一步包含DNA聚合酶和/或連接酶。
[0151]用于本發(fā)明的試劑盒也可包含一種載體裝置，如盒子或硬紙盒，其中具有密閉的一或多個容器，如小瓶、試管、試劑瓶等。所述試劑盒可包含(在相同或單獨(dú)的容器中)一或多種如下物質(zhì):一或多種逆轉(zhuǎn)錄酶，合適的緩沖液，一或多種核苷酸特別是dNTPs，和/或一或多種引物(例如寡聚(dT，起始物，終止物，反向互補(bǔ)，PCR引物)以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及隨后的PCR反應(yīng)。本發(fā)明的這個方面涵蓋的試劑盒可進(jìn)一步包含為進(jìn)行本發(fā)明的核酸逆轉(zhuǎn)錄方案所需的另外的試劑和化合物，如寡聚dT珠或者鏈霉親和素偶聯(lián)的珠。此外，所述引物或終止物可以固定在固體表面上。
[0152]本發(fā)明在如下圖和實(shí)施例中進(jìn)一步舉例說明，但不限于本發(fā)明的這些實(shí)施方案?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0153]圖1:本發(fā)明嘗試解決的原則問題示意圖。
[0154]a)引物P1、P2直至Pn與模板RNA雜交。引物P2比Pl雜交在模板RNA的更上游(5，)位置，更一般地，引物Pn比P (η-1)雜交在模板RNA的更上游位置?；蛘邠Q句話說，弓丨物Pl比P2雜交在模板上更下游的(3’ )位置，及更一般地，P(n-l)比Pn雜交在模板上更下游的位置。每個引物的延伸由逆轉(zhuǎn)錄酶起始。b)當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶在聚合P2的延伸產(chǎn)物達(dá)到引物P3時(shí)，引物P3及其延伸產(chǎn)物被逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行鏈置換，逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)延伸引物P2延伸產(chǎn)物。對于Pl的延伸產(chǎn)物也是同樣，其置換引物P2及其延伸產(chǎn)物。c)因此，當(dāng)所有延伸產(chǎn)物完成時(shí)，在Pl與P2之間存在一個模板序列的cDNA拷貝，但是在P2與P3之間存在兩個cDNA拷貝。這個現(xiàn)象導(dǎo)致多次引發(fā)的RNA的5’末端過度表現(xiàn)，其在使用隨機(jī)引物如隨機(jī)六聚體的標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄期間發(fā)生。更一般而言，當(dāng)η個引物已經(jīng)雜交并由聚合酶延伸至模板RNA的5’末端時(shí),所述RNA的5’末端將被表現(xiàn)η次,而RNA的3’末端僅被表現(xiàn)一次。
[0155]圖2:本發(fā)明的一個實(shí)施方案的不意圖，產(chǎn)生5’_3’平衡的cDNA文庫及全長cDNA。
[0156]a)通過 使用例如鎖定核酸(LNA)抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的鏈置換活性以加強(qiáng)引物P1、P2至Pn的雜交。在此使用在引物的恰好5’末端上的三個修飾。b)在延伸位于模板RNA上更下游的引物時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄酶不能置換已經(jīng)與模板上更上游位置雜交的引物。因此，所述RNA的每個部分作為cDNA僅被表現(xiàn)一次。以此方式不發(fā)生RNA5’末端的過度表現(xiàn)。c)當(dāng)希望的是全長cDNA時(shí)，連接各個引物延伸產(chǎn)物產(chǎn)生d)模板RNA的一個全長cDNA拷貝。
[0157]圖3:產(chǎn)生接頭標(biāo)記的短cDNA文庫的示意圖。
[0158]對于cDNA文庫的許多下游分析，需要一個通用接頭位于cDNA的一端或兩個末端，以例如擴(kuò)增所述文庫或者起始測序反應(yīng)。在此示出了具有兩個接頭的文庫的制備。a)引物P1、P2至Pn具有5’通用接頭序列延伸(LI)。此外，使用終止物寡聚物S1、S2至Sm，其具有3’通用接頭序列延伸(L2)。所述終止物寡聚物也被修飾(例如LNA)，由此其也不被逆轉(zhuǎn)錄酶置換。b)在第二個反應(yīng)步驟中，延伸產(chǎn)物的3’末端與終止物寡聚物的5’末端連接。以此方式，產(chǎn)生具有兩個接頭序列(L1，L2)的cDNA文庫，以c)在隨后的PCR期間擴(kuò)增整個文庫。
[0159]圖4:使用備選終止物寡聚物概念產(chǎn)生接頭標(biāo)記的短cDNA文庫的示意圖。
[0160]因?yàn)橥ㄟ^終止物寡聚物序列的錯誤雜交而在cDNA文庫中導(dǎo)入的錯誤率高于如果這個部分由聚合酶轉(zhuǎn)錄，因此圖中示出了備選終止物寡聚物概念。a)與圖3相比，終止物寡聚物Sm在其5’側(cè)通過L2rc (反向互補(bǔ))序列被延伸。這個L2rc與L2雜交形成連接物(adapter)。b)同樣如圖3所示,逆轉(zhuǎn)錄酶延伸引物Pn直至其達(dá)到終止物寡聚物Sm。在連接期間，延伸產(chǎn)物與連接物(adapter)的L2鏈連接。同樣以此方式，產(chǎn)生在末端上具有兩個接頭序列(LI，L2)的cDNA文庫。然而，在此無終止物寡聚物序列被導(dǎo)入。因此，當(dāng)從文庫的L2側(cè)測序時(shí)，沒有由終止物寡聚物的潛在錯誤雜交引起的關(guān)于最初核苷酸身份的歧義。c)最后，進(jìn)行PCR。[0161]圖5:使用備選終止物寡聚物概念產(chǎn)生接頭標(biāo)記的短cDNA文庫的示意圖。
[0162]在備選概念中，起始物與寡聚物在其各自的接頭序列LI和L2中的互補(bǔ)序列形成異二聚體。序列缺口會減少，因?yàn)樵谌魏谓K止處還有由起始物起始的聚合。a)起始物/終止物雜交體在起始物序列Pl至Pn的3’末端延伸，直至達(dá)到下一起始物/終止物雜交體。終止物寡聚物S1、S2至Sm具有3’通用接頭序列延伸(L2)，其與起始物的LI序列雜交。如果終止物被修飾以防止鏈置換這就足夠了，不過在圖Se所示的這種起始物/終止物雜交體的備選子集中，如果L2序列不具有與模板核酸雜交的5’序列延伸，則所述修飾需要位于起始物。b)在第二個反應(yīng)步驟中，延伸產(chǎn)物的3’末端與終止物寡聚物的5’末端連接。以此方式，產(chǎn)生具有兩個接頭序列(L1，L2)的cDNA文庫，以用于c)在例如隨后的PCR期間擴(kuò)增整個文庫。
[0163]圖6:優(yōu)選的引物修飾的示意圖。
[0164]圖中描述了優(yōu)選的引物修飾。也可以組合這些修飾。a)引發(fā)寡聚物的一般結(jié)構(gòu)，具有引物和接頭序列。當(dāng)產(chǎn)生隨機(jī)引發(fā)的cDNA文庫時(shí)，所述引物序列典型是隨機(jī)序列，如隨機(jī)六聚體。b)所述引物序列部分含有修飾的核苷酸。所述修飾降低或抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的鏈置換活性。c)導(dǎo)入反向互補(bǔ)(Lire)，其抑制所述寡聚物的LI序列部分參與與模板RNA鏈的雜交。因此，關(guān)于LI序列的偏差被阻斷。d)為了防止逆轉(zhuǎn)錄酶與接頭連接物結(jié)合及因此降低逆轉(zhuǎn)錄的效力，在Llrc的3’末端使用一個3’突出端。e)修飾Llrc序列以增加與LI序列的雜交強(qiáng)度，以進(jìn)一步降低文庫中關(guān)于LI序列的偏差的可能性。f)阻斷不參與聚合酶延伸或連接酶反應(yīng)的所有末端。g)通過共價(jià)鍵如Cn間隔物或發(fā)夾序列連接LI序列的5’末端與Llrc序列的3’末端。
[0165]圖7:優(yōu)選的寡聚物終止物修飾的示意圖。
[0166]圖中描述了優(yōu)選的終止物寡核苷酸修飾。也可以組合這些修飾。a)終止物寡聚物的一般結(jié)構(gòu)，具有終止物和接頭序列。所述終止物序列典型是隨機(jī)序列，如隨機(jī)九聚體。
b)所述終止物序列部分含有修飾的核苷酸。所述修飾降低或抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的鏈置換活性。
c)導(dǎo)入反向互補(bǔ)序列(L2rc)，其抑制所述寡聚物的L2序列部分參與與模板RNA鏈的雜交。因此，關(guān)于L2序列的偏差被阻斷。d)為了防止逆轉(zhuǎn)錄酶與接頭連接物結(jié)合及因此降低逆轉(zhuǎn)錄效率，在L2的3’末端使用一個3’突出端。e)修飾L2rc序列以增加與L2序列的雜交強(qiáng)度，以進(jìn)一步降低文庫中關(guān)于L2序列的偏差可能性。f)阻斷不參與聚合酶延伸或者連接酶反應(yīng)的所有末端。g)通過共價(jià)鍵如C間隔物或發(fā)夾序列連接LI序列的5’末端與Llrc序列的3’末端。h)使所述終止物寡聚物的5’末端磷酸化，以能在連接反應(yīng)中作為供體?；蛘撸瑢?’末端進(jìn)行腺苷酸化。i)描述了在圖4中備選寡聚物終止物概念中使用的終止物寡聚物的一般結(jié)構(gòu)。L2序列的5’末端可以被磷酸化，以能在連接反應(yīng)中作為供體，或者腺苷酸化。
[0167]圖8:最優(yōu)選的寡聚物起始物和終止物組合。
[0168]圖中描述了優(yōu)選的起始物/終止物組合。起始物與終止物寡核苷酸在其接頭序列中含有一段互補(bǔ)序列(例如14nt)，使得其可以彼此雜交，因此無需加入另外的反向互補(bǔ)序列。圖6和圖7的起始物和終止物設(shè)計(jì)仍是有效的。起始物通過5’OH阻斷。所述終止物寡核苷酸任選在3’末端由例如雙脫氧核苷酸、二氧核苷酸(dioxynucleotides)、間隔物或反向核苷酸阻斷。a)終止物寡核苷酸與起始物寡核苷酸在雜交體中的一般結(jié)構(gòu)。寡聚物在例如一段14nt序列雜交。起始物與終止物寡核苷酸均與模板鏈一起雜交。起始物與終止物可具有與不同長度的模板核酸雜交的基礎(chǔ)(base)。終止物寡核苷酸與起始物相比可具有較長或較短的雜交基礎(chǔ)，反之亦然。b)起始物與終止物均被修飾以抑制聚合酶的鏈置換。
c)在此僅終止物的5’末端核苷酸被修飾。這是足夠的，因?yàn)樾枰灰种奇溨脫Q的聚合酶僅在終止物的5’末端。事實(shí)上，單修飾(如LNA或2’氟代)即是足夠的。d)示出起始物的修飾，不是所有延伸的起始物均可以與終止物(其也與模板雜交)雜交。e)當(dāng)終止物與模板雜交的序列降低為O時(shí)，則需要起始物也提供終止作用，因此需要終止鏈置換的修飾。f)LI和L2序列可具有不雜交的部分。g)示出備選構(gòu)型，其中接頭序列具有彼此雜交的部分及不雜交的部分。h)示出其中起始物和終止物寡聚物連接在一起形成實(shí)際上一個寡核苷酸的構(gòu)型。當(dāng)然，存在本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用的許多更多的起始物和終止物變化。
[0169]圖9:寡聚物起始物與終止物結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0170]a)起始物寡核苷酸從3’至5’描述，b)終止物寡核苷酸從5’至3’描述。起始物(a)由如下部分組成:
[0171](I)引發(fā)序列(priming sequence),如在3’側(cè)結(jié)合模板鏈的隨機(jī)六聚體序列，其優(yōu)選被修飾以被保護(hù)免于鏈置換。
[0172](II)任選地，條碼序列可位于隨機(jī)引發(fā)序列的5’端。所述條碼序列優(yōu)選由
3-9個核苷酸組成，其使得可以獨(dú)特及特異性鑒別文庫。這種條碼使得例如可以混合來自不同樣品的文庫 并且一起在流動池上測序。在測序之后，根據(jù)特異性條碼多路解編(demultiplexed)讀段。
[0173](III)測序引物結(jié)合位點(diǎn)。這是在測序期間用于結(jié)合測序引物的序列。
[0174](IV)用于橋接擴(kuò)增(例如Illumina NGS測序)的序列或者為了附著于固體表面如珠的序列(例如SOLiD NGS測序)。
[0175](V)序列標(biāo)簽，其提供了起始物與終止物寡聚物的雜交偏差。
[0176]最小的起始物可以由隨機(jī)引發(fā)部分⑴和測序引物結(jié)合位點(diǎn)(III)組成，在這種情況中優(yōu)選如圖6c_g所述的反向互補(bǔ)序列以防止測序引物部分在雜交過程中發(fā)生。或者，起始物可以由隨機(jī)引物部分(I)和測序引物結(jié)合位點(diǎn)(III)及與終止物雜交基礎(chǔ)組成，從而III和V可以完全或部分相同，例如通過測序引物結(jié)合位點(diǎn)與終止物區(qū)域中序列部分III互補(bǔ)。或者，起始物可以由1、I1、III和V組成，從而同樣III和V可以完全或部分相同，例如如果測序引物結(jié)合位點(diǎn)與終止物區(qū)域中序列部分III互補(bǔ)。起始物也可以由1、I1、II1、IV和V組成。
[0177]如果使用具有較短接頭序列的起始物，則在產(chǎn)生的文庫擴(kuò)增期間可以導(dǎo)入相應(yīng)于序列引物結(jié)合位點(diǎn)(III)、條碼(II)和/或表面吸附(IV)的序列，例如在PCR期間與PCR引物一起導(dǎo)入這些序列標(biāo)簽。
[0178]終止物寡核苷酸在b)中從5’至3’描述。終止物(b)可由如下部分組成:
[0179](I)在5’側(cè)結(jié)合模板的隨機(jī)序列，其優(yōu)選被修飾以防止鏈置換。
[0180](II)任選地，起始物(II)上的條碼序列或者與條碼序列反向互補(bǔ)的序列可以位于隨機(jī)引發(fā)序列的3’端。所述條碼序列優(yōu)選由3-9個核苷酸組成，其使得可以獨(dú)特及特異性鑒別文庫。
[0181](III)測序引物結(jié)合位點(diǎn)。[0182](IV)任選地,序列標(biāo)簽,其用于表面附著以橋接擴(kuò)增(bridge amplification)(例如Illumina NGS測序)或者為了附著于固體表面如珠(例如SOLiD NGS測序)，以及
[0183](V)序列標(biāo)簽，其提供起始物與終止物寡聚物的雜交基礎(chǔ)。最小的終止物可以由隨機(jī)引物部分(I)和測序引物結(jié)合位點(diǎn)(III)組成，在這種情況中，優(yōu)選如圖7C-g所述反向互補(bǔ)序列，以防止測序引物部分在雜交過程中發(fā)生?；蛘?，終止物可以由隨機(jī)引發(fā)部分(I)和測序引物結(jié)合位點(diǎn)(III)及與起始物的雜交基礎(chǔ)組成，從而III和V可以完全或者部分相同，例如如果測序引物結(jié)合位點(diǎn)與終止物區(qū)域中序列部分III互補(bǔ)。在另一實(shí)施方案中，這個最小終止物也可以缺少隨機(jī)序列，如圖4或Se所示?；蛘撸K止物可以由1、I1、III和V組成，從而III和V可以完全或部分相同，例如如果測序引物結(jié)合位點(diǎn)與終止物區(qū)域中的序列部分III互補(bǔ)。起始物也可以由1、I1、II1、IV和V組成。
[0184]如果使用具有較短接頭序列的終止物，則在產(chǎn)生的文庫擴(kuò)增期間可以導(dǎo)入相應(yīng)于序列結(jié)合位點(diǎn)(III)、條碼(II)和/或表面附著(IV)的序列，例如在PCR期間與PCR引物一起導(dǎo)入這些序列標(biāo)簽。
[0185]圖10:在逆轉(zhuǎn)錄期間鏈置換的終止。
[0186]a)例證了用于確定修飾的或未修飾的寡核苷酸(Seq ID No:5_8)抑制逆轉(zhuǎn)錄酶鏈置換活性的能力的測定設(shè)置，寡聚dT引物(Seq ID No:9)也使用。鏈置換終止寡聚物的延伸是35nt(Seq ID No: 10)，鏈置換終止產(chǎn)物是103nt (Seq ID No: 11)，全長cDNA產(chǎn)物是138nt(Seq ID No:12)。
[0187]b)示出實(shí)施例1的結(jié)果。
[0188]圖11:通過插入RT中終止寡聚物的量調(diào)節(jié)cDNA片段大小。
[0189]圖中示出實(shí)施例2的結(jié)果。cDNA片段通過有或無鏈置換終止寡聚物隨機(jī)引發(fā)的cDNA合成而獲得,在免疫印跡上分析。
[0190]圖12:在逆轉(zhuǎn)錄期間終止鏈置換加上cDNA片段與全長產(chǎn)物的連接。
[0191]圖中示出實(shí)施例3的結(jié)果。在此，鏈置換終止是由在5’末端具有3個LNA的寡聚物誘導(dǎo)的，隨后將所得 2 種 DNA 片段(35nt，Seq ID No: 10 ；103nt,Seq ID No: 11)與 138nt全長產(chǎn)物(Seq ID No: 12)連接，使用T4DNA連接酶(泳道3)、截短的T4RNA連接酶2 (泳道5)或者這兩種酶的組合(泳道4).在泳道6中示出省略SDS寡聚物的對照反應(yīng)。在泳道2中，加入SDS寡聚物，但是在連接反應(yīng)中未加入連接酶。
[0192]圖13:在mRNA上SDS/連接的確認(rèn)
[0193]圖中示出實(shí)施例4的結(jié)果。免疫印跡示出如果使用T4DNA連接酶連接短的鏈置換終止cDNA片段，則顯著增加長度。
[0194]圖14:在逆轉(zhuǎn)錄期間鏈置換終止加上cDNA片段與全長產(chǎn)物的連接導(dǎo)致更多的選擇的cDNA的產(chǎn)物。
[0195] 圖中示出實(shí)施例5的結(jié)果。圖中示出來自擴(kuò)增自不同逆轉(zhuǎn)錄(RT)的Dynclhl (NM_030238)的5kb片段的qPCR結(jié)果。使用SDS寡聚物(Seq ID No: 15)和寡聚物dT引物(Seq ID No: 17)或者使用寡聚物dT引物(Seq ID No: 17)自身進(jìn)行RT。加入T4DNA連接酶或者在對照反應(yīng)中不加入，對所得cDNA進(jìn)行qPCR。只有在連接的情況中，SDS寡聚物在PCR反應(yīng)中才能產(chǎn)生5kb片段(引物Seq ID No: 18和Seq ID No: 19)。在SDS/連接cDNA上進(jìn)行的反應(yīng)(即更多的cDNA模板可利用)比在常規(guī)的寡聚物dT引發(fā)的cDNA中有更多的PCR產(chǎn)物(比較泳道2與泳道6和8)。
[0196]圖15:在15kb cDNA上SDS/連接vs寡聚物dT引發(fā)的cDNA長度對比。
[0197]圖15示出實(shí)施例6的結(jié)果，設(shè)計(jì)為評估在RT反應(yīng)中產(chǎn)生的cDNA長度的qPCR測定。三角形:寡聚dT引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄；方形:隨機(jī)六聚體引發(fā)的轉(zhuǎn)錄；圓形，本發(fā)明的在下游引物終止的延伸加上連接的轉(zhuǎn)錄。
[0198]圖16:從mRNA中產(chǎn)生雙標(biāo)簽的DNA文庫。
[0199]圖中示出使用SDS/連接方法(見泳道2)產(chǎn)生的DNA文庫，而無連接的對照組保持空白(見泳道3)。不加入RNA模板，可以產(chǎn)生一些接頭-接頭副產(chǎn)品，因?yàn)楣丫踕T引物在此作為模板以雜交(見泳道4)。無模板對照組的PCR是干凈的(見泳道5)。
[0200]圖17:對比文庫制備的發(fā)現(xiàn)印跡，使用新的鏈置換終止和連接方案(SDS-連接)及標(biāo)準(zhǔn)mRNA Seq方案(TruSeqTM RNA樣品制備試劑盒，Catalog#RS-930_2001)。均在Illumina GAIIx測序儀(單一讀段，72bp)測序。X-軸示出唯一地定位至注解基因組的讀段數(shù)，發(fā)現(xiàn)的基因的數(shù)目在Y-軸上。圖對比示出SDS-連接方案是可行的，實(shí)際上與標(biāo)準(zhǔn)方案相比需要較少的讀取以檢測基因的量。
[0201]縮寫
[0202]qPCR:定量 聚合酶鏈反應(yīng)
[0203]SDS:鏈置換終止
[0204]RT:逆轉(zhuǎn)錄或者逆轉(zhuǎn)錄酶(根據(jù)上下文而定)
[0205]LNA:鎖定核酸
[0206]PNA:肽核酸
[0207]rc:反向互補(bǔ)
[0208]Tm:解鏈溫度
[0209]SNP:單核苷酸多態(tài)性
[0210]CGH:對比基因組雜交
[0211]CNV:拷貝數(shù)變化
[0212]ΡΤ0:硫代磷酸鍵
[0213]Phos:磷酸化
[0214]定義
[0215]起始物:起始物是可以引發(fā)模板聚合酶延伸反應(yīng)的分子。通常地，起始物具有通常稱作引物的寡核苷酸 序列。起始物可具有5’序列延伸，如在圖6、7、8和9中描述的通用接頭序列。
實(shí)施例
[0216]實(shí)施例1:使用LNA修飾的寡核苷酸進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄酶的鏈置換終止。
[0217]序列:
[0218]星號表示硫代磷酸酯(PTO)鍵，在核苷酸前面的加號“ + ”表示鎖定核酸(LNA)。
[0219]“Phos”表示磷酸化，
[0220]SEQ ID N0.1:
[0221]5’ -GCTAATACGACTCACTATAGTTGTCACCAGCATCCC-3’[0222]SEQ ID N0.2:
[0223]5’ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGAATGGGCCGCAGGA-3’
[0224]SEQ ID N0.3:
[0225]5， -GCTAATACGACTCACTATAGTTGTCACCAGCATCCCTAGACCCGTACAGTGCCCACTCCCCT-TCCCAGTTTCCGACTGTCCCCGGCCTCCTGCGGCCCATTCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-AAAAAA-3，
[0226]SEQ ID N0.4:
[0227]5，-guugucaccagcaucccuagacccguacagugcccacuccccuucccaguuuccgacugucc-ccggccuccugcggcccauucgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3， (RNA)
[0228]SEQ ID N0.5:(Phos)(5，-+GGGCACTGTACG-3’)
[0229]SEQ ID N0.6:(Phos)(5，-GGGCACTGTACG-3')
[0230]SEQ ID N0.7:(Phos)(5，-G*GGCACTGTAC*G_3’)
[0231]SEQ ID N0.8: (Phos) (5’ -+G+G+GCACTGTAOG-3’)
[0232]SEQ ID N0.9:
[0233]5’-A*CGGAGCCTATCTATATGTTCTTGACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT*T*V-3’
[0234]SEQ ID N0.10:
[0235]5’ -GGGCACTGTACGGGTCTAGGGATGCTGGTGACAAC-3’
[0236]SEQ ID N0.11:
[0237]5，-A*CGGAGCCTATCTATATGTTCTTGACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGAATGGGCCGCAGGAGGCCGGGGACAGTCGGAAACTGGGAAGGGGAGT-3，
[0238]SEQ ID N0.12:
[0239]5，-A*CGGAGCCTATCTATATGTTCTTGACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGAATGGGCCGCAGGAGGCCGGGGACAGTCGGAAACTGGGAAGGGGAGTGGGCACTGTACGGGTCTAGGGATGCTGGTGACAAC-3’
[0240]為了研究 在使得引物退火及cDNA聚合的條件下抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的鏈置換活性的可行性，示出概念證明實(shí)驗(yàn)。對于測定設(shè)置的概況見圖10a，結(jié)果見圖1Ob所示。
[0241]在體外轉(zhuǎn)錄的lllnt RNA模板的產(chǎn)生:
[0242]將75bp 的 GAPDH 片段(NC_000072，48nt_122nt)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，使用含有 T7 啟動子序列(Seq ID No:1)或者T27尾部(Seq ID No: 2)的引物。所得PCR產(chǎn)物(SEQ ID No: 3)作為T7模板在體外轉(zhuǎn)錄,使用Epicentre’sAmpliScribe Flash T7轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。在體外轉(zhuǎn)錄的lllnt RNA(Seq ID No:4)在逆轉(zhuǎn)錄期間作為模板進(jìn)行鏈置換終止測定。
[0243]cDNA 合成:
[0244]進(jìn)行第一鏈cDNA合成，使用來自Promega的MMLV-H進(jìn)行(250U/20 μ I反應(yīng))。鏈置換測定設(shè)置在圖1Oa中描述。cDNA合成的引物、LNA-修飾的寡聚物(1LNA-G(Seq IDNo:5)、未修飾的寡聚物(Seq ID No:6)、ΡΤ0_修飾的寡聚物(Seq ID No: 7)、3LNA_G寡聚物(Seq ID No: 8)或者寡聚 dT (Seq ID No: 9)得自 Microsynth AG (Balgach Switzerland)或者 Eurogentec (Seraing, Belgium)。將 800ng 體外轉(zhuǎn)錄的 lllnt RNA(Seq ID No:4)和寡聚物(Seq ID No: 5-9 ;50nM 寡聚 dT 引物 SEQ ID Νο:_1.5μΜ SEQ ID No: 5-8)加熱至 70 °C持續(xù)2分鐘，所有需要的成分(除了逆轉(zhuǎn)錄之外)包括:緩沖液(50mM Bis-Tris-MethanepH7.9,75mM KCl,4mM MgC12，0.6M 海藻糖和 7.5%甘油)，0.5mM 每種 dNTP，IOmM 二硫蘇糖醇(DTT)，通過降低溫度至40°C緩慢退火，每降低2°C持續(xù)30秒。在40°C，加入250單位的逆轉(zhuǎn)錄酶，并將溫度緩慢升至45°C，每升高1°C持續(xù)I分鐘，隨后在46°C保溫30分鐘。在第一鏈合成后，將樣品在0.1M NaOH中加熱至95°C持續(xù)5分鐘，用等摩爾濃度的HCl中和，并通過EtOH沉淀純化。在用75% EtOH洗滌后，將沉淀物溶解于5 μ IlOmM Tris, ρΗ8.0中，與等體積的100%甲酰胺加樣緩沖液混合，在95°C變性2分鐘，在冰上冷卻，并通過在15%丙烯酰胺/7M尿素中電泳解析。
[0245]結(jié)果在圖1Ob中示出。
[0246]在不同的泳道中，第二下游寡聚物(與模板的更上游部分雜交)是不同的(Seq IDNos:5-8)，在泳道2中使用具有一個LNA修飾的寡聚物(Seq ID No:5)，在泳道3中使用無修飾的寡聚物(Seq ID No: 6)，在泳道4中使用PTO (Seq ID No: 7)，在泳道5中使用三個LNA修飾(Seq ID No:8)，在泳道6中無第二寡聚物。泳道I和7示出大小標(biāo)志物(IObp標(biāo)志物，Invitrogen)?？梢钥闯鑫葱揎椀?泳道3)或者PTO修飾的(泳道4)寡核苷酸由MMLV-H逆轉(zhuǎn)錄酶完全鏈置換，因?yàn)閮H138nt的全長產(chǎn)物(Seq ID No: 12)可觀測到，無103nt的鏈置換終止產(chǎn)物(Seq ID No: 11)。所述第二寡聚物也已經(jīng)延伸至35nt ((Seq ID No: 10)，因此lllnt RNA的5’末端被表現(xiàn)兩次(一次在全長產(chǎn)物(138nt)中，一次由第二寡聚物的35nt延伸產(chǎn)物被表現(xiàn))。在第二寡聚物的5’序列導(dǎo)入I個LNA引起一些鏈置換的終止(138nt和103nt產(chǎn)物可見)，而3個LNA導(dǎo)致鏈置換幾乎完全終止(不超過138nt產(chǎn)物，僅103nt鏈置換終止產(chǎn)物(Seq ID No: 11)。
[0247]實(shí)施例2:cDNA片段大小調(diào)節(jié)
[0248]這個實(shí)施例示出自mRNA中產(chǎn)生的cDNA文庫的大小可以通過終止延伸反應(yīng)的隨機(jī)引物的濃度而調(diào)節(jié)。結(jié)果見圖11.[0249]RNA分離和純化:
[0250]分離小鼠肝臟總RNA，使用PeqLab Gold柱組合酸性苯酚提取(PeqLab，PEQLABBiotechnologie GMBH, D_91052Erlangen)，根據(jù)廠商推薦方案進(jìn)行。RNA的量通過在260nm的吸光度測量，并在甲醒瓊脂糖凝膠或者Agilent Bioanalyzer上核查完整性。
[0251]終止物(Terminator)處理總RNA以富集mRNA:
[0252]將2-5 μ g的總RNA用Terminator?5’ -磷酸酯依賴性核酸外切酶(EpicentreBiotechnologies, Madison, WI53713)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行處理。
[0253]cDNA合成及免疫印跡:
[0254]在具有 50mM Tris-HCl (pH8.3, 25 °C ) >75mM KCl、3mM MgCl2UOmM DTT、0.75mMdNTP及堿穩(wěn)定的地高辛-11-2’ -脫氧-尿苷-5’ -三磷酸的20 μ I反應(yīng)物中進(jìn)行cDNA合成。將135ng的mRNA (終止物處理的總RNA)在存在引物及除了酶和dNTP之外的所有反應(yīng)成分的條件下在70°C保溫2分鐘。選擇緩慢退火程序，在如下溫度保持30秒:45°C、43°C、40 V、38°C、35°C、30°C、28 V，及在 25°C保持 I 分鐘。每 20 μ I 反應(yīng)物加入 200U 的 MMLV-H、點(diǎn)突變(Promega)和dNTP，在如下溫度各保溫2分鐘:25°C，28°C，30°C和35°C，之后在37°C最終延伸10分鐘。在第一鏈合成之后，將樣品在0.1M NaOH中加熱至55°C進(jìn)行15分鐘，用等摩爾濃度的HCl中和，通過EtOH沉淀純化。將cDNA片段通過甲醛瓊脂糖凝膠電泳(0.8 % )分離，移至 Zeta-Probe GT 基因組印跡膜(BioRAD),根據(jù) “Mini Trans-BlotRElectrophoretic Transfer Cell”指導(dǎo)手冊(BioRAD)指導(dǎo)在50V電印跡I小時(shí)，然后交聯(lián)劑UV-光處理。[0255]將膜在I X阻斷緩沖液(IOOmM馬來酸/150mM NaCl，pH7.5)中平衡5分鐘，之后在阻斷溶液(5%牛奶于阻斷緩沖液中)中阻斷所述膜的非特異性結(jié)合位點(diǎn)30分鐘。將1:2,000 稀釋的抗 Fab 抗體(抗地高辛-AP FAB 片段，Roche cat#11093274910)、30ml 阻斷溶液在室溫?fù)u動下保溫30分鐘。將膜在I X阻斷緩沖液中洗滌2次，每次15分鐘，然后在IX染色緩沖液(0.1M Tris-HCl，pH9.5(20°C ),0.1M NaCl)中平衡5分鐘。在室溫(避
光)在染色溶液(BCIPjVnbt Liquid Substrate, 800 μ I的30mlI X染色緩沖液)中不
搖動染色過夜。
[0256]結(jié)果可以見圖11所示。
[0257]在泳道1-5中，以增加的濃度使用在其5’側(cè)具有三個LNA的寡聚物(SDS-oligo)(SEQ ID No: 13: (Phos) (5，-+N+N+NNNN-3，))(泳道 2:0.25 μ M ;泳道 3:2.5 μ M ;泳道4:25 μ Μ，泳道5:50 μ M及泳道6:100 μ Μ)。在泳道I中，示出2 μ M具有未修飾的隨機(jī)六聚體(SEQ ID No:14: (Phos) (5，-ΝΝΝΝΝΝ-3，))的對照反應(yīng)。通過增加SDS寡聚物的量，可以降低產(chǎn)生的cDNA片段的大小。
[0258]實(shí)施例3:使用人工模板連接
[0259]該實(shí)施例示出更上游的引物(Pl)的延伸產(chǎn)物可以通過在其5’末端具有三個LNA修飾的更下游的引物(P2)終止，當(dāng)與模板雜交時(shí)上游引物(Pl)的延伸產(chǎn)物可以與下游引物(P2)連接。關(guān)于包含的序列的概述見圖10a。結(jié)果見圖12。使用實(shí)施例1中描述的寡聚物、模板和條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0260]在RT之后，將樣品用乙醇沉淀，插入具有ImM HCC,20 % PEG_8000、30mMTris-HCl (pH7.8,25 °C ) UOmM MgC12、10mM DTTUmM ATP 和 1.5μ I 的 T4DNA 連接酶(l-3ffeiss units/ μ l,Promega)和 / 或 I μ I 的截短的 T4RNA 連接酶 2 (IOunits/ μ I,NEB)的15 μ I連接反應(yīng)物中，在37°C保溫2小時(shí)。未連接的小片段和剩余的寡聚物通過PEG沉淀除去。之后，增加反應(yīng)體積，獲得11.5%終PEG濃度，加入2μ1線性聚丙烯酰胺(IOmg/ml)作為載體。徹底旋動反應(yīng)物，之后在20，OOOXg在18°C離心15分鐘。將沉淀物在75%EtOH中洗滌2次，溶解于5 μ IlOmM Tris (ρΗ8.0)中，與等體積的100%甲酰胺加樣緩沖液混合，在95°C變性2分鐘，在冰上冷卻，并加樣于15%丙烯酰胺/7M尿素凝膠上。結(jié)果可見于圖12。在泳道6中，人工RNA被逆轉(zhuǎn)錄，僅使用寡聚dT引物(SEQ ID No:9)進(jìn)行。當(dāng)除了寡聚dT引物(SEQ ID No: 9)之外還加入SDS寡聚物(SEQ ID No: 8)時(shí)，鏈置換完全終止，如通過出現(xiàn)103nt SDS產(chǎn)物(Seq ID No:ll，見圖12，泳道2)產(chǎn)物可見。此外，產(chǎn)生35nt SDS寡聚物延伸產(chǎn)物(Seq ID No: 10)。檢測T4DNA連接酶(圖12，泳道3)或者截短的T4RNA連接酶2 (圖12，泳道5)以及這兩種酶的組合(圖12，泳道4)的在RNA雜交體中連接兩個cDNA片段的效力。截短的T4RNA連接酶2不具有腺苷酸化功能，因此可僅連接已經(jīng)腺苷酸化的寡聚物，即預(yù)先在雜交體中通過連接酶腺苷酸化的寡聚物。不使用T4RNA連接酶1，因?yàn)閱捂湻肿拥膬?yōu)選連接然后也導(dǎo)致未雜交的寡聚物優(yōu)選與RNA模板連接。在泳道3-5中可以看出，終止的產(chǎn)物(103nt, Seq IDNo: 11)和SDS寡聚物延伸產(chǎn)物(35nt，Seq ID No: 10)可以在RNA雜交體中連接，獲得全長138nt cDNA(Seq ID No:12)。
[0261]實(shí)施例 4:從多聚A-mRNA中合成的cDNA片段的連接
[0262]這個實(shí)施例示出通過連接通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的短的cDNA片段，在免疫印跡上發(fā)生大小移位，表明通過連接程序產(chǎn)生較長的cDNA。方法見實(shí)施例2和3所述。結(jié)果見圖13。多聚A選擇的mRNA (小鼠肝多聚A+mRNA, Stratagene)用作模板。使用寡聚dT引物(SEQ ID No:9)與具有三個LNA修飾的核苷酸的隨機(jī)十二聚體(SEQ ID No: 15: (Phos)(5，-+G+G+GHHHNNNNNN-3，))組合產(chǎn)生的短 cDNA 片段(見圖 13，泳道 1，在 100_700nt 之間的片段)，在RNA雜交體中使用T4DNA連接酶連接，獲得甚至長于6，OOOnt的長(全長)cDNA (見圖13，泳道2)。
[0263]實(shí)施例5:在基因特異性qPCR中，SDS/連接逆轉(zhuǎn)錄比常規(guī)的寡聚dT引發(fā)的RT產(chǎn)生更多的產(chǎn)物
[0264]在含有I μ I cDNA (從800ng總RNA中合成，純化后溶解于42 μ IlOmM Tris，pH8.0中)、50mM Tris-Cl ρΗ9.2、16mM硫酸銨、0.1 % Tween20 及 5.1mM MgCl2、L 5Μ甜菜堿、L 3%DMSO、0.5X SYBRGreen Ι、0.2mM 每種 dNTP、0.3 μ M 每種引物(SEQ ID No: 18: 5，-CTGGATGAATGGCTTGAGTGT-3’ 和 SEQ ID No: 19:5’ -GCAACTCCACGCTCATAGAAG-3’，針對 NM_030238 設(shè)計(jì)的引物)、0.8單位的KlenTaq AC聚合酶及0.2單位的Pfu聚合酶的20 μ I反應(yīng)物中進(jìn)行基因特異性PCR。將樣品在95.8°C變性15秒，并進(jìn)行20次如下循環(huán):在95.8°C持續(xù)15秒，在55°C持續(xù)30秒，在74°C持續(xù)20分鐘(ABI9700速度斜率:50% )。隨后進(jìn)行19次如下循環(huán):在95.8°C持續(xù)15秒，在58°C持續(xù)30秒，在74°C持續(xù)20分鐘(ABI9700速度斜率:10% )，隨后是最終延伸步驟是在72°C進(jìn)行3分鐘。PCR產(chǎn)物使用硅石柱純化，加樣于
0.7%瓊脂糖凝膠上。結(jié) 果示于圖14。泳道8示出從用寡聚dT引物(Seq ID N0:17:5’_G*GCGTTTTTTTTTTTTTTTTTT*V-3’)合成的cDNA中產(chǎn)生的5096bpPCR產(chǎn)物。作為對照，對寡聚dT引發(fā)的cDNA也進(jìn)行所述連接方案，其通常用于鏈置換終止寡聚物(見泳道6)。當(dāng)使用Seq ID No: 15 (SDS寡聚物)和Seq ID No:17(寡聚dT)引發(fā)RT反應(yīng)，隨后是如實(shí)施例3所述的連接方案，從這種cDNA中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的量甚至多于常規(guī)寡聚dT引發(fā)的cDNA (對比圖14，泳道2分別與泳道6和8對比)。這可以由SDS寡聚物由于雜交而阻止二級結(jié)構(gòu)形成加以解釋，如果僅寡聚dT使用引物，這些二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致提前聚合終止事件。使用SDS/連接方案，RT在多個位置起始，然后連接所得cDNA片段，獲得全長cDNA產(chǎn)物，或者在這種情況中，來自隨機(jī)選擇的特異性轉(zhuǎn)錄物的選擇的選擇的5kb片段。不用連接，在隨后的用SDS寡聚物合成的cDNA的PCR中無PCR產(chǎn)物產(chǎn)生(見泳道4)。這清晰示出鏈置換確實(shí)被終止，產(chǎn)生的cDNA片段未連接，因此無PCR產(chǎn)物可獲得，因?yàn)闆]有含有這兩個PCR引物結(jié)合位點(diǎn)的模板。泳道3、5和7是對照組，在RT反應(yīng)中未加入逆轉(zhuǎn)錄酶，因此示出無基因組DNA污染，及SDS寡聚物不產(chǎn)生任何非特異性背景。
[0265]實(shí)施例6:使用SDS/連接RT方案，長轉(zhuǎn)錄物更有效地被逆轉(zhuǎn)錄
[0266]選擇長轉(zhuǎn)錄物(遍在蛋白連接酶E3成分n_recognin4 ;Ubr4 ;NM_001160319),沿著cDNA設(shè)計(jì)200bp擴(kuò)增子。擴(kuò)增子彼此間隔大約2kb (引物Seq ID No: 20-29) ?
[0267]SEQ ID N0.20:5 ’-CCTTCCAGGAGGAGTTCATGCCAGT-3 ’
[0268]SEQ ID N0.21:5，-CACACGGAGAGATGAATGAGGGGAGA-3 ’
[0269]SEQ ID N0.22:5’-GCCTTCATGGCTGTGTGCATTGA-3’
[0270]SEQ ID N0.23:5’-CATCCTGCCCTGTAGAAAGTCCTCTTG-3’
[0271]SEQ ID N0.24:5 ’-CCAGTGTCACAAGTGCAGGTCCATC-3 ’
[0272]SEQ ID N0.25:5，-GCGGTCAGCTTTGTCCAGAAGTGTGT-3，
[0273]SEQ ID N0.26:5，-GTAAGATGGTGGATGGGGTGGGTGT-3，[0274]SEQ ID N0.27:5，-TCGCTCTGAAATGCTGACTCCTTCA-3’
[0275]SEQ ID N0.28:5 ’-ACCCAGGTTCTACTGCGTCCTGTCC-3 ’
[0276]SEQ ID N0.29:5 ’-CCTCCAGGGCTGTCACGTTCTTCTT-3 ’
[0277]在更3’擴(kuò)增子與最5’擴(kuò)增子之間的δ Ct (互補(bǔ)于mRNA的3’末端，接近多聚A尾部)用于計(jì)算倍數(shù)差異(根據(jù)Pfaffl所述[34])，因此示出在mRNA模板長度產(chǎn)生的cDNA的相關(guān)降低。對比寡聚dT(Seq ID No: 17)引發(fā)的cDNA與Seq ID: 15和Seq ID No: 14引發(fā)的cDNA，隨后在RNA雜交體中連接所得cDNA片段。每個反應(yīng)均一式三份進(jìn)行，平均值在圖15中示出。圓形描述了使用SDS-寡聚物測量的數(shù)值(虛線)；使用隨機(jī)六聚體以方形示出(實(shí)線)，使用寡聚dT以三角形示出(點(diǎn)虛線)。僅SDS/連接方案保證在具有幾乎完美的3’與5’比率為I的轉(zhuǎn)錄物長度的更相等的cDNA合成。
[0278]寡聚dT引發(fā)的cDNA(三角形，點(diǎn)虛線)示出在15kb mRNA長度產(chǎn)生的cDNA中的穩(wěn)定下降。僅大約10%的原始起始的cDNA合成達(dá)到6kb。無鏈置換的隨機(jī)引發(fā)導(dǎo)致mRNA的5’末端的過度表現(xiàn)(方形,實(shí)線)。
[0279]實(shí)施例7:從mRNA中產(chǎn)生雙標(biāo)簽的DNA文庫
[0280]將0.11 μ M生物素標(biāo)簽的寡聚dT引物(SEQ ID N0.30:(生物素-TEG) (5，-TTTTτττττττττττττττττττττττ_3’)、2.5μΜ 標(biāo)簽的引物(SEQ ID N0.31: (C12-間隔物)(5’-TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGACTG+G+G+GNNN-3 ’)+2.5 μ M 引物標(biāo)簽的反向互補(bǔ)(SEQ IDN0.32: (C3-間隔物)(5，-CAGTCAGATCG+GAA+GA+GC+GTC+GT+GTAGGGA-3’ ) (C3-間隔物))、5 μ M 標(biāo)簽的終止物(SEQ ID N0.33: (Phos) (5，-+G+G+GHHNNNNAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGA-3，) (C3間隔物))+5 μ M終止物標(biāo)簽的反向互補(bǔ)(SEQ ID N0.34: (C12-間隔物)(5，-TCCT+GCT+GAACC+GCTCTTCC+GATC-脫氧Τ-3’)，脫氧T表示3’阻斷的脫氧Τ)，與150ng的多聚A+mRNA (BioCat Heidelberg, Germany)在 Tris、pH7.0 中雜交(70°C, I 分鐘，然后在冰上緩慢冷卻)。假定mRNA長度為500-5，OOOnt，這意味著起始物以1:280，000-1:28，000摩爾過量加入，而終止物以1:560,000-1:56,000摩爾過量加入。然后雜交的核酸結(jié)合(在室溫20分鐘)預(yù)洗的1.1 μ I鏈霉親和素包被的Dynabeads (Μ-280, 10mg/ml)。洗去未雜交的核酸(根據(jù)廠商指導(dǎo)洗滌4次)。之后，加入RT緩沖液至終濃度為lx(50mM Tris-HCl (pH8.3，25°C )，75mM KCl,3mM MgCl2, IOmMDTT)，0.5mM dNTPs, 200 單位 MMLV-H 以及 8U 的 T4DNA 連接酶，加上10% PEG和0.4μ M ATP。在珠上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-連接反應(yīng)，通過將該反應(yīng)物加熱緩慢升高溫度(25°C進(jìn)行2分鐘，28 °C進(jìn)行I分鐘，31°C進(jìn)行I分鐘，34 °C進(jìn)行I分鐘)，之后在37°C保溫2小時(shí)。再次洗滌該珠(4次)，之后水解RNA (55°C在0.1N NaOH中進(jìn)行15分鐘)。在用0.1N HCl中和后，沉淀樣品，溶解于20 μ I中，然后取4μ I插入Illumina qPCR中(引物:SEQ IDN0.35:5，-A*ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATOT-3，和 SEQ ID N0.36:5 ’ -OAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATOT-3’)。結(jié)果在圖16中示出。使用SDS/連接方法產(chǎn)生文庫涂帶(見泳道2)，而無連接對照保持空白(見泳道3)。不用加入RNA模板，可以產(chǎn)生一些接頭-接頭副產(chǎn)品，因?yàn)楣丫踕T引物然后作為雜交模板(見泳道4)。PCR無模板對照組是干凈的(見泳道5)。
[0281]實(shí)施例8 =SDS-連接樣品如實(shí)施例7所述制備。為了對比，制備標(biāo)準(zhǔn)mRNA-Seq文庫，根據(jù)Illumina文庫制備方案(TruSeq? RNA樣品制備試劑盒，Catalog#RS-930-2001)進(jìn)行。對這兩個文庫在Illumina GAIIx機(jī)器(單一讀段，72bp)上進(jìn)行NGS測序。為了對比兩個文庫的性能，計(jì)算揭示印跡，示出相對于唯一定位至注解基因組的指定讀段數(shù)的檢測出的基因數(shù)。所述發(fā)現(xiàn)印跡在圖17中示出。圖中示出SDS-連接方案的可行性，其實(shí)際上勝于標(biāo)準(zhǔn)m-RNA Seq文庫制備方案。
[0282]實(shí)施例9:根據(jù)廠商指導(dǎo)從通用人參考RNA(AgilentTechnologies, Catalog#740000)中制備雙標(biāo)簽的文庫，ERCC RNA摻入在對照混合物(Catalog#4456740)中。使用兩種NGS樣品制備方法=ScriptSeq V2試劑盒(cat#SSV21106, Epicentre, WI)，根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行，或者如實(shí)施例7所述樣品制備，具有如下修改:使用得自Dynazyme的寡聚dT25磁珠(得自mRNA直接試劑盒,Catalog#610_12)以及LNA-N修飾的起始物。
[0283]SEQ ID N0.37:
[0284](5Sp9)(5，-TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGC+N+N+NNNN-3’)
[0285]及終止物
[0286]SEQ ID N0.38:
[0287](phos) (5，-+N+N+NNNNNNNAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGA-3，) (C3 間隔物)。
[0288]在表1中列出了 NGS測序的結(jié)果。
[0289]表1:確定轉(zhuǎn)錄物中ERCC摻入物的文庫鏈型。
[0290]
【權(quán)利要求】
1.產(chǎn)生模板核酸的擴(kuò)增的核酸部分的方法，所述模板核酸是RNA，所述方法包括: 獲得所述模板RNA， 使至少一種寡核苷酸引物與所述模板RNA退火， 使至少一種寡核苷酸終止物和/或另外的引物與所述模板RNA退火， 以模板特異性方式延伸所述至少一種寡核苷酸引物，直至延伸產(chǎn)物核酸到達(dá)退火的寡核苷酸終止物或另外的引物的位置，從而延伸反應(yīng)被終止，其中在所述延伸反應(yīng)中，所述任選的寡核苷酸終止物不被延伸和/或所述另外的寡核苷酸引物以模板特異性方式被延伸，其中延伸的產(chǎn)物核酸被連接到所述寡核苷酸終止物或另外的引物的5’末端。
2.產(chǎn)生模板核酸的擴(kuò)增的核酸部分的方法，包括: 獲得所述模板核酸， 使至少一種寡核苷酸引物與所述模板核酸退火， 使至少一種寡核苷酸終止物與所述模板核酸退火， 以模板特異性方式延伸所述至少一種寡核苷酸引物，直至延伸的產(chǎn)物核酸到達(dá)退火的寡核苷酸終止物的位置，從而所述延伸反應(yīng)被終止，其中在所述延伸反應(yīng)中，所述寡核苷酸終止物不被延伸，以及 其中延伸的產(chǎn)物核酸被連接到所述寡核苷酸終止物的5’末端。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述寡核苷酸終止物與至少一種另外的寡核苷酸引物雜父。
4.產(chǎn)生模板核酸的擴(kuò)增的核酸的方法，包括: 獲得所述模板核酸， 使第一寡核苷酸引物與所述模板核酸退火， 使至少一種另外的寡核苷酸引物與所述模板核酸退火， 以模板特異性方式延伸所述第一寡核苷酸引物，直至延伸的產(chǎn)物核酸到達(dá)所述另外的寡核苷酸引物中的一種的位置，從而所述延伸反應(yīng)被終止，并且至少一種另外的寡核苷酸引物以模板特異性方式被延伸，其中被終止的延伸的產(chǎn)物核酸被連接到所述另外的寡核苷酸引物的5’末端。
5.權(quán)利要求1、3或4的方法,其中至少一種、優(yōu)選全部的寡核苷酸引物與寡核苷酸終止物雜交。
6.權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)的方法，其中所述模板核酸是RNA或DNA，優(yōu)選RNA。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法,進(jìn)一步包括使額外的寡核苷酸引物與所述模板核酸退火，并延伸所述額外的寡核苷酸引物，直至延伸的產(chǎn)物核酸達(dá)到另一寡核苷酸引物或寡核苷酸終止物的位置，優(yōu)選其中使用3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或者更多種不同的寡核苷酸引物，特別優(yōu)選其中所述寡核苷酸引物是隨機(jī)引物。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括使額外的寡核苷酸終止物與所述模板核酸退火，并且其中在所述延伸反應(yīng)中，所述額外的寡核苷酸終止物不被延伸，優(yōu)選其中使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或者更多種不同的寡核苷酸終止物，特別優(yōu)選其中所述寡核苷酸終止物是隨機(jī)終止物。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法,特征在于所述寡核苷酸終止物中的任一種包含序列標(biāo)簽、優(yōu)選均一序列標(biāo)簽，所述序列標(biāo)簽附著于多于一種的所述寡核苷酸終止物、特別優(yōu)選附著于全部的所述寡核苷酸終止物，特別是其中所述序列標(biāo)簽附著于所述寡核苷酸終止物的3’末端。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法,特征在于所述寡核苷酸引物中任一種包含序列標(biāo)簽、優(yōu)選均一序列標(biāo)簽，所述序列標(biāo)簽附著于多于一種的所述寡核苷酸引物、特別優(yōu)選附著于全部的所述寡核苷酸引物，特別是其中所述序列標(biāo)簽附著于所述寡核苷酸引物的5’末端。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述寡核苷酸終止物的任一種和所述寡核苷酸引物的任一種包含序列標(biāo)簽，并且優(yōu)選其中所述寡核苷酸引物的序列標(biāo)簽與所述寡核苷酸終止物的序列標(biāo)簽的序列至少部分互補(bǔ)，從而使得所述寡核苷酸終止物與寡核苷酸引物彼此至少在各自序列標(biāo)簽的一部分雜交。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，特征在于所述標(biāo)記步驟包括連接附著于所述寡核苷酸引物或寡核苷酸終止物的序列標(biāo)簽，或者包括連接包含序列標(biāo)簽的所述寡核苷酸引物或寡核苷酸終止物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述序列標(biāo)簽與所述寡核苷酸引物或寡核苷酸終止物的5’末端雜交，優(yōu)選其中所述序列標(biāo)簽與上游引物的延伸產(chǎn)物連接。
14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法，特征在于所述標(biāo)記步驟包括連接包含序列標(biāo)簽的寡核苷酸引物或者寡核苷酸終止物，優(yōu)選其中所述序列標(biāo)簽與所述寡核苷酸引物或寡核苷酸終止物共價(jià)附著，或者其中包含所述序列標(biāo)簽的核酸與所述寡核苷酸引物或寡核苷酸終止物雜交。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述序列標(biāo)簽與寡核苷酸終止物的3’末端連接或雜交。
16.權(quán)利要求8-15任一項(xiàng)的方法，其中具有所述標(biāo)簽序列的反向互補(bǔ)序列的核酸在退火或延伸反應(yīng)期間加入，或者與所述序列標(biāo)簽雜交。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述序列標(biāo)簽與所述具有反向互補(bǔ)序列的核酸的解鏈溫度由于修飾的核苷酸而與未修飾的核酸相比升高，所述修飾的核苷酸優(yōu)選選自一或多個LNA核苷酸、2’氟代核苷酸或PNA核苷酸。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中所述具有反向互補(bǔ)序列的核酸與所述序列標(biāo)簽共價(jià)連接，優(yōu)選通過間隔物或發(fā)夾環(huán)連接。
19.權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括擴(kuò)增包含所述連接的標(biāo)簽的所述延伸的產(chǎn)物，優(yōu)選使用標(biāo)簽特異性引物通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。
20.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，特征在于所述寡核苷酸引物和/或寡核苷酸終止物在5’末端是磷酸化的或腺苷酸化的。
21.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的方法，特征在于所述模板核酸固定化于固相或者固體支持物上。
22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括洗滌延伸的產(chǎn)物核酸的步驟，所述延伸的產(chǎn)物核酸優(yōu)選與模板核酸雜交，特別是與權(quán)利要求21的固定化的模板核酸雜交。
23.權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)的方法，特征在于延伸和連接反應(yīng)在一個反應(yīng)步驟中同時(shí)進(jìn)行。
24.權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法，其中所述方法通過加入DNA聚合酶和/或連接酶進(jìn)行，優(yōu)選其中所述DNA聚合酶和連接酶加入到具有所述模板核酸的一個反應(yīng)混合物中。
25.權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)的方法，特征在于所述寡核苷酸引物和/或寡核苷酸終止物包含增加Tm或者強(qiáng)化所述寡核苷酸的糖磷酸主鏈的核苷酸修飾，優(yōu)選選自2’氟代核苷、LNA、ZNA、PNA,或者通過使用特異性結(jié)合核酸的嵌入劑或添加劑，如溴化乙錠、Sybr Green,優(yōu)選特異于RNA = DNA雜交體的嵌入劑。
26.權(quán)利要求25的方法，特征在于所述寡核苷酸引物和/或寡核苷酸終止物包含至少1個、優(yōu)選至少2個、更優(yōu)選至少3個選自G或C的修飾的核苷酸，優(yōu)選在所述引物序列的5，末端。
27.權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的方法，特征在于使用具有核苷酸鏈置換活性的聚合酶進(jìn)行所述延伸反應(yīng)。
28.權(quán)利要求1-27任一項(xiàng)的方法，特征在于在聚合反應(yīng)期間的核苷酸濃度低于模板濃度，優(yōu)選核苷酸濃度與模板濃度的摩爾比率在1:33至1:3.3的范圍。
29.權(quán)利要求1-28任一項(xiàng)的方法，特征在于向聚合反應(yīng)加入足量的放線菌素D以避免第二鏈合成及降低聚合酶的鏈置換。
30.權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的方法，其中所述模板核酸是單鏈的。
31.權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的方法，其中獲得的模板核酸在其至少30%長度上缺少互補(bǔ)鏈，和/或缺少長度為至少100個核苷酸的互補(bǔ)鏈，優(yōu)選在其全長上缺少互補(bǔ)核酸。
32.權(quán)利要求1-31任一項(xiàng)的方法在產(chǎn)生一或多種模板核酸的序列文庫中的應(yīng)用，所述序列文庫包含所述模板核酸的優(yōu)選重疊的、擴(kuò)增的核酸部分的混合物。
33.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-31任一項(xiàng)的模板核酸的擴(kuò)增的核酸部分或者用于產(chǎn)生權(quán)利要求32的序列文庫的試劑盒，其包含DNA聚合酶、包含增加Tm的修飾的隨機(jī)寡核苷酸引物和不適于核苷酸延伸并且包含增加Tm的修飾的隨機(jī)寡核苷酸終止物，任選進(jìn)一步包含一或多種反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液包含Mn2+或Mg2+、連接酶、擁擠劑如PEG。
34.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-31任一項(xiàng)的模板核酸的擴(kuò)增的核酸部分或者用于產(chǎn)生權(quán)利要求32的序列文庫的試劑盒，其包含DNA聚合酶和連接酶，優(yōu)選進(jìn)一步包含寡核苷酸引物、寡核苷酸終止物、擁擠劑特別是PEG，或者其組合。
35.用于產(chǎn)生模板核酸的擴(kuò)增的核酸部分的試劑盒，其含有a)隨機(jī)寡核苷酸引物，所述引物包含增加Tm的修飾，及b)隨機(jī)寡核苷酸終止物，所述終止物不適于核苷酸延伸并且包含增加Tm的修飾。
36.權(quán)利要求35的試劑盒，其進(jìn)一步包含一或多種反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液包含Mn2+或Mg2+、連接酶、擁擠劑如PEG。
37.權(quán)利要求35或36的試劑盒，其進(jìn)一步包含DNA聚合酶和/或連接酶。
【文檔編號】C12Q1/68GK103930570SQ201280056141
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月16日
【發(fā)明者】A·塞茨, P·默爾, M·A·納波拉 申請人:萊克斯奧根有限公司