偵測核酸之方法
【專利摘要】本發(fā)明提供偵測核酸之方法，包括于樣本中提供磁性納米粒子與可偵測性納米粒子，其中該磁性納米粒子與該可偵測性納米粒子的表面分別具有寡核苷酸連接于其上，該可偵測性納米粒子包含至少一種具有不同偵測訊號的納米粒子，且連接于該磁性納米粒子與該可偵測性納米粒子的表面的該寡核苷酸與該樣本中的核酸一區(qū)域形成互補；使該磁性納米粒子與該可偵測性納米粒子與該樣本反應；以及偵測來自該可偵測性納米粒子的訊號以確認該樣本中的每種核酸。
【專利說明】偵測核酸之方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明關(guān)于偵測核酸的方法與套組。【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction ；PCR)已發(fā)展數(shù)十年,廣泛地運用在核酸分析。近年來，實時聚合酶鏈反應(real-time PCR)因為高靈敏度以及可定量分析的能力，而被大量地使用。實時PCR的定量結(jié)果系來自于偵測連接于目標DNA或RNA的熒光染料例如SYBR熒光(SYBR green(DreamTaq?))的熒光強度。然而，熒光的結(jié)果容易受到背景噪聲的影響而誤判，且熒光染料經(jīng)時衰退，造成偵測上的限制。因此，有需要發(fā)展改善PCR反應的靈敏性與偵測限制的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明一實施形態(tài)提供一種偵測樣本中至少一種核酸的方法，包括:提供磁性納米粒子與可偵測性納米粒子；使該磁性納米粒子與該可偵測性納米粒子與該樣本反應；以及偵測來自該可偵測性納米粒子的訊號以確認該樣本中的每種核酸；其中，該磁性納米粒子與該可偵測性納米粒子的表面分別具有寡核苷酸連接于其上，該可偵測性納米粒子包含至少一種具有不同偵測訊號的納米粒子，且連接于該磁性納米粒子與該可偵測性納米粒子的表面的該寡核苷酸與該樣本中的核酸一區(qū)域形成互補。
[0004]本發(fā)明另一實施形態(tài)提供一種偵測核酸的套組，包括含有磁性納米粒子與可偵測性粒子的混合物，其中該磁性納米粒子與該可偵測性納米粒子的表面分別具有寡核苷酸連接于其上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0005]第I圖為顯示本案一實施例之磁性納米粒子及可偵測性納米粒子與目標核酸在PCR循環(huán)中反應的示意圖。
[0006]第2圖為顯示使用SYBR Green偵測進行實時PCR分析的目標DNA濃度與熒光強度關(guān)系的圖。
[0007]第3圖為顯示本案一實施例中使用寡核苷酸連接的納米粒子進行PCR分析法的目標DNA濃度與SERS訊號強度關(guān)系的圖。
[0008]第4圖為顯示本案一實施例中對于10介摩爾(zeptomole)的目標DNA濃度，使用寡核苷酸連接的納米粒子于PCR分析法的40個循環(huán)后，呈現(xiàn)的SERS訊號強度圖。
[0009]【主要組件符號說明】
[0010]f可偵測性納米粒子
[0011]2~磁性納米粒子
[0012]3，4~寡核苷酸
[0013]5~目標核酸[0014]6~單股核酸
[0015]101，201，301，401，501，601 ~步驟
[0016]本發(fā)明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用于進一步揭露本發(fā)明之技術(shù)內(nèi)容，不應藉以限制本案的發(fā)明范疇。
【具體實施方式】
[0017]本案一實施形態(tài)提供使用納米粒子為主的系統(tǒng)于核酸擴增反應，例如聚合酶鏈反應(PCR)或?qū)崟rPCR，確認核酸的方法。以納米粒子為主的系統(tǒng)包括磁性納米粒子與可偵測性納米粒子，此二種納米粒子的表面分別具有寡核苷酸連接于其上。位于磁性納米粒子表面的寡核苷酸與位于可偵測性納米粒子表面的寡核苷酸彼此不互補(complementary),因此在一般條件下，磁性納米粒子與可偵測納米粒子兩者不會發(fā)生交互作用。位于磁性納米粒子或任一種可偵測納米粒子的表面的寡核苷酸被設計為與欲偵測的目標DNA的一區(qū)域互補，作用如核酸引子(primer)，可與目標核酸雜交并以該目標核酸作為鑄模(template)而延伸，形成與目標核酸互補的序列。位于磁性納米粒子與可偵測性納米粒子的表面的寡核苷酸以該目標核酸作為鑄模而延伸后，延伸出的序列因為彼此互補而可雜交，使得磁性納米粒子與可偵測性納米粒子連結(jié)形成復合物。之后，可透過磁性捕捉技術(shù)等，收集此復合物，并且根據(jù)可偵測性納米粒子發(fā)出的訊號以及核酸擴增反應的循環(huán)次數(shù)，以確認目標核酸。
[0018]如第I圖所示之一實施形態(tài)(以PCR反應進行偵測)，將欲偵測的樣本5與可偵測性納米粒子I及磁性納米粒子2混合(步驟101)?？蓚蓽y納米粒子I或磁性納米粒子2的表面分別連接寡核苷酸3，4，該寡核苷酸設計為目標核酸5的引子。位于磁性納米粒子表面的寡核苷酸與位于可偵測納米粒子表面的寡核苷酸彼此不互補，因此磁性納米粒子與可偵測納米粒子彼此不會反應(雜交)。在PCR反應中，目標核酸先變性，形成單股核酸6(步驟201)。在變性步驟結(jié)束后，單股核酸彼此黏合(anneal)并分別與磁性納米粒子及可偵測納米粒子表面的寡核苷酸雜`交(步驟301)。之后，以目標核酸為鑄模，位于磁性納米粒子與可偵測性納米粒子表面的寡核苷酸開始延伸(extend)，形成與目標核酸互補之序列(步驟401)。此PCR反應繼續(xù)進行下一個變性，使得單股核酸以及位于磁性納米粒子及可偵測納米粒子表面的延伸的寡核苷酸分離(步驟501)。游離的核酸及連接于磁性納米粒子及可偵測納米粒子表面的延伸的寡核苷酸序列經(jīng)互補序列的交聯(lián)而黏合，形成復合體(步驟601)。此復合體由磁性納米粒子及可偵測納米粒子經(jīng)由延伸的核苷酸序列雜交、交聯(lián)而構(gòu)成。之后，此復合體不僅可以透過磁場磁性捕捉技術(shù)而收集，也可偵測來自可偵測性納米粒子所發(fā)出的訊號，透過偵測到的訊號，得知目標核酸。
[0019]根據(jù)本案之實施形態(tài)，核酸擴增反應的偵測限制可大幅地降低，而且不需增加反應循環(huán)次數(shù)，因此可減少反應時間。
[0020]本案另一實施形態(tài)提供偵測一樣本中至少一種核酸的方法，使用至少一種具有不同偵測訊號的可偵測性納米粒子。此方法具體包括如上述之表面連接寡核苷酸的磁性納米粒子及可偵測性納米粒子。特征在于，可偵測性納米粒子包括至少一種具有不同偵測訊號的納米粒子，且位于任一種可偵測納米粒子表面的寡核苷酸與樣本中對應的核酸的一區(qū)域互補，作用如對應的核酸的引子。位于不同種類的磁性納米粒子與可偵測納米粒子的表面之寡核苷酸彼此之間不互補，因此在不同納米粒子表面上的寡核苷酸彼此不會交互作用(例如雜交)。藉由偵測來自不同種類的可偵測性納米粒子的訊號，在單一的PCR反應中可偵測一種以上的核酸，因而簡化多種基因擴增(multiplex)的步驟。
[0021]本案所述之磁性納米粒子系指任何具有磁性的納米粒子，沒有特別限制。本發(fā)明之磁性納米粒子可包括氧化鐵納米粒子(iron-oxide nanoparticles ;10NPs)、超磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles; SPIONs)或其組合。為了穩(wěn)定性、應用性或寡核苷酸的連接，磁性納米粒子可經(jīng)表面修飾，例如以二氧化硅(SiO2)、葡聚糖(dextran)等進行表面修飾。
[0022]本案所述之可偵測性納米粒子可例如任何具有化學可偵測性、光學可偵測性或電化學可偵測性的納米粒子?？蓚蓽y性納米粒子較佳為光學可偵測性，例如具有表面增加拉曼散射(surface enhanced Raman scattering ；SERS)活性的納米粒子、突光納米粒子(fluorescent nanoparticle)、量子點(quantum dots)等、或其組合。例如具有表面增加拉曼散射(SERS)活性的納米粒子可為商業(yè)上可購買者或由實驗室制造者。具有SERS活性的納米粒子可例如金、銀等、或其合金。具有SERS活性的納米粒子的表面可經(jīng)修飾以符合寡核苷酸的連接或因應其用途。
[0023]熒光納米粒子可為任何顯示熒光訊號的納米顆粒。熒光納米粒子可包括熒光染劑(fluorochrome)、異硫氰酸突光素(fluorescein isothiocyanate ；FITC) > Alexa Fluor染料、花青染料(Cyanine dyes C2，Cy3，Cy5)、熒光蛋白光敏素為主的近紅外線熒光蛋白(fluorescent protein phytochrome-based near-1nfrared fluorescent protein ；iRFP)、生物性冷光(bioluminescence)、螢火蟲發(fā)光酶(firefly luciferase ;Fluc)、Gaussia冷光素酶(Gaussia luciferase ；Gluc)、或其組合,或例如以CdSe或ZnS為主的量子點(quantum dots)。 在確認樣本中不同核酸序列的情形中，具有不同、可分辨的SERS訊號的SERS活性納米粒子、或具有不同熒光訊號的熒光納米粒子、或帶有不同偵測訊號的SERS活性納米粒子與熒光納米粒子的組合，皆可使用。由于磁性納米粒子可被捕捉于磁場，可偵測性納米粒子可偵測于光學偵測系統(tǒng)，因此，本案所述方法可縮短讀取時間以及簡化核酸擴增反應例如PCR或?qū)崟rPCR的步驟。而且，因為可偵測性納米粒子，特別是SERS活性納米粒子，可降低偵測核酸的限制至次阿摩爾(sub-attomole)或介摩爾(zeptomole)的程度，并且背景噪聲少。
[0024]此述的寡核苷酸系指具有50個以下堿基(base)長度的短核苷酸序列。本案所述之寡核苷酸與目標核酸的一區(qū)域互補，作用如同目標核酸的引子，特別是在PCR或?qū)崟rPCR反應之中。寡核苷酸可根據(jù)習知步驟設計及合成，沒有特別限制。于一實施例中，連接于該可偵測性納米粒子表面的寡核苷酸為目標核酸的順向引子，而連接于該磁性納米粒子表面的寡核苷酸為目標核酸的反向引子。但本發(fā)明不限于此實施例，也可為連接于該磁性納米粒子表面的寡核苷酸為目標核酸的順向引子，而連接于該可偵測納米粒子表面的寡核苷酸為目標核酸的反向引子。在不同納米粒子表面的寡核苷酸可分別作用為順向或反向引子，沒有特別限制。磁性納米粒子及可偵測性納米粒子表面的寡核苷酸的連接可依習知步驟進行，例如化學I禹合法(chemical coupling)、生物素(biotin)與鏈酶抗生物素蛋白(streptavidin)的共軛鍵結(jié)等,沒有特別限制。但是應注意,在不同納米粒子上的寡核苷酸彼此不互補，以避免納米粒子上的寡核甘酸互相作用而不與目標核酸雜交或黏合。在偵測數(shù)種不同核酸時可設計在不同可偵測性納米粒子上的寡核苷酸為不同引子，并專一性地連接于目標核酸序列。
[0025]本案所述之方法可應用于核酸擴增反應，例如PCR、實時PCR等。核酸擴增反應主要包括三個步驟:變性、黏合及延伸，為一循環(huán)而重復數(shù)次。根據(jù)本案所述之方法，核酸擴增反應循環(huán)數(shù)可為1~40循環(huán)數(shù)，或20-40循環(huán)數(shù)，但不限于此。
[0026]本案一實施形態(tài)之方法可更包括收集納米粒子的步驟。當磁性納米粒子與可偵測納米粒子藉由互補序列的交聯(lián)(雜交)而形成復合體時，利用磁性捕捉技術(shù)可收集納米粒子以進行訊號偵測。磁性捕捉技術(shù)可包括習知的磁性分離法，例如磁性分離柱、盤或芯片，或是自動收集裝置。
[0027]根據(jù)本案一實施形態(tài)，本案所述之方法可有效用于微生物的偵測、致病菌的偵測、疾病的診斷、水質(zhì)的偵測、食品安全的偵測、搭配診斷(companion diagnostics)等。例如藉由偵測特定的核酸濃度以確認污染水質(zhì)及食物中的微生物濃度、或者對于懷疑受致病菌感染之個體或罹患癌癥或其它疾病之個體的生物樣本偵測其生物標志(特定核酸)的濃度等。根據(jù)本發(fā)明，可輕易地完成水質(zhì)、食品安全及疾病等的偵測。
[0028]本案一實施形態(tài)亦提供偵測核酸用的套組，可包括含有如上述之表面連接寡核苷酸的磁性納米粒子與可偵測性納米粒子的混合物。此述套組還可包含核酸擴增用的溶液，例如包含聚合酶、脫氧核苷酸、緩沖液等。
[0029]實施例
[0030]具有SERS活性的納米金粒子的制備
[0031 ] 首先，根據(jù)檸檬酸還原法制造納米金粒子(AuNPs)。
[0032]檸檬酸還原法中，先形成小的AuNP粒子，以此粒子為種粒子，生長AuNP。種粒子的形成系將檸檬酸三鈉(50mg)溶于蒸餾水(5mL)中，形成1%溶液。將其加入于四氯金酸(hydrogen tetrachloroaurate) (20mg)于蒸懼水(50mL)中的回流溶液中。此溶液的顏色由淡黃色轉(zhuǎn)為深紅紫色。在回流30分鐘后移除加熱。紀錄此溶液在300nm至900nm的UV-Vis光譜，顯示具特征的表面電漿共振(SPR)峰在517nm波長。電子掃描顯微鏡(TEM)的影像分析顯示此納米粒子的粒徑為12nm±lnm (可作為種粒子)。
[0033]之后，以上述種粒子合成較大的AuNP。
[0034]首先將四氯金酸(hydrogentetrachloroaurate) (lmL, IlmmoldnT3 溶液)加入蒸餾水(32mL)中，于冷凝器中回流。將上述合成的種粒子AuNP加入此溶液(ImL)，隨后加入檸檬酸三鈉溶液(0.34mL, 1%溶液)。30秒后，此溶液開始變?yōu)樗{色，I分鐘后變?yōu)榧t色。10分鐘后，移除加熱，攪拌并使溶液冷卻。紀錄此溶液在300nm至900nm的UV-Vis光譜，顯示具特征的SPR峰在535nm波長。TEM的影像分析顯示此納米粒子的粒徑為51nm±2nm。將此成長的AuNP與溶于5mL氨水(lmol/dm3)的50mg的4-對硫醇苯甲酸(MBA)混合。
[0035]之后，使用桌上型系統(tǒng)紀錄MBA-AuNPs的SERS光譜。
[0036]將上述的終溶液(0.2mL)以水(0.8mL)稀釋，放置于液態(tài)樣本架，使雷射照射點位于此溶液的中心。此雷射發(fā)射105 μ m直徑的波導，透過透鏡形成0.25cm寬的光束。此光束通過焦點長度0.7cm的透鏡，形成光直徑100 μ m的焦點。之后，使此雷射有效地發(fā)射及收集來自該樣本體積6.9nL的訊號。
[0037]寡核苷酸被覆的AuNP的制備[0038]使用標準1-乙基-3- (3- 二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)使MBA上的-COOH基與具有C6-胺基修飾的序列識別號2所示之寡核苷酸序列的末端-NH2基耦合，使得序列識別號2所不之寡核苷酸序列被覆于上述所得的MBA-AuNP表面。
[0039]具體地說，將上述所得的MBA-AuNP (118 μ L)與I μ L新鮮制備的于水中的EDC溶液(7mg/mL)混合。加入含有序列識別號2所示之寡核苷酸序列的DNA溶液(該寡核苷酸序列2 μ L于100pmol/L的DNA溶液)，使其攪拌過夜。之后離心及再分散于120 μ L水中。于完全再懸浮后緩慢倒掉澄清液體，所得的產(chǎn)物為具有寡核苷酸序列被覆的SERS活性納米粒子。
[0040]氧化鐵納米粒子的制備
[0041]氧化鐵納米粒子(IONP)系于氬雰圍氣下合成。
[0042]具體為，于一反應燒瓶內(nèi)加入FeCl2(0.0345moles)、FeCl3(0.069moles)及去離子水(150mL)，之后加入Na0H(5mol/dm3)調(diào)整混合物的pH值。持續(xù)攪拌此溶液直到成為堿性。以去離子水清洗形成黑色沉淀物，并以冰醋酸調(diào)整溶液PH值為5以下。最后逐漸加入Η202 (10νο1%)直到?jīng)]有再出現(xiàn)冒泡的現(xiàn)象，表示沒有反應發(fā)生。之后以新鮮去離子水清洗產(chǎn)物并懸浮，加入葡聚醣(dextran) (MW=10, OOODa)。于超音波混合后，加入NH4OH調(diào)整pH為10。然后使此混合物持續(xù)攪拌并加熱至75°C，維持在此溫度60分鐘。之后使用分子量截取值(molecular weight cut-off ;MWC0) 10，OOODa的膜透析此懸浮液,去除多余的葡聚醣。將此懸浮液于6000rpm離心30分鐘,移除大的凝結(jié)塊。最后通過0.2 μ m過濾器。
[0043]接著，使上述所得的氧化鐵納米粒子(IONP)表面涂布Si02。
[0044]具體步驟為， 將上述所得IONP (5 μ L，3.6mg/mL)與Ig聚乙烯吡咯啶(polyvinylpyrrolidone ；PVP)于5mL水的溶液混合。使用的PVP的平均分子量為
10,OOODa0 30分鐘后，使IONP于乙醇中沉淀，于40mL蒸餾水中再懸浮。之后加入(3-胺基丙基)三乙氧基硅烷((3-Aminopropyl) triethoxysilane ；APTES) (500L),再加入 6 滴濃縮NH30 30分鐘后，將此產(chǎn)物磁性沉淀，以連續(xù)5次的丙酮與水清洗。最后將所得產(chǎn)物分散于水(2mL)中。從TEM分析中顯示最終產(chǎn)物中，核心Fe3O4為20nm±3nm，殼SiO2具有3nm±lnm的厚度。
[0045]寡核苷酸被覆的IONP的制備
[0046]使用標準1-乙基-3- (3- 二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)使具有C6-羧基修飾的序列識別號3所示之寡核苷酸序列的末端-C00H基與上述所得的IONP表面的-NH2基耦合，使得序列識別號3所示之寡核苷酸序列被覆于上述所得的IONP表面。
[0047]具體步驟為，將上述所得的10NP(118yL于lmg/mL水)與IyL新鮮制備的EDC溶液(7mg/mL)混合。加入含有序列識別號3所示之寡核苷酸序列的DNA溶液(該寡核苷酸序列2 μ L于100pmol/L的DNA溶液)，使其攪拌過夜。之后磁性沉淀，于120 μ L水中再分散。以5倍體積的水清洗，所得產(chǎn)物為具有寡核苷酸序列被覆的具磁性的納米粒子。
[0048]以SYBR Green偵測的PCR分析法
[0049]使用SYBR Green (DreamTaq? Green PCR Master Mix K1081)于 AppliedBiosystems7500實時PCR偵測系統(tǒng)進行實時PCR分析。所有合成的DNA購買自ThermoFisher Scientific。分析中的目標DNA序列為如序列識別號I所示之人工合成序列，來自例如E.col1-K.pastoris轉(zhuǎn)運載體pPpHIS4的大腸桿菌質(zhì)體之單股IOObp的DNA。引子為44bp長、5’端具有20bp的胸腺嘧唳間隔(thymine spacer)以及24bp活性引子區(qū)域如序列識別號2、3所示之寡核苷酸序列。每一分析進行下列流程40個循環(huán):預熱95°C、10分鐘，變性95°C、15秒，黏合與延長60°C、60秒。反應中每一引子的DNA量為10皮摩爾(picomole)。目標DNA的量則為10菲摩爾(femtomole)至10介摩爾(zeptomole)。實時PCR分析的結(jié)果如第2圖所示。圖中顯示，當反應中目標DNA的濃度從IX 10_14摩爾降低至1X10_17摩爾(總體積為24 μ I)時，SYBR Green熒光的可計量的循環(huán)數(shù)已達到閾值。超過此閾值，即使再降低目標DNA的量，所得到的結(jié)果也會是一樣(如1χ10_17摩爾至1χ10_2°摩爾的目標DNA量)。而且，目標DNA量IxlO-17摩爾至lxl(T2°摩爾所需的SYBR Green熒光訊號到達閾值的時間相同。由此可知，使用SYBR Green偵測(DreamTaq? Green PCR MasterMix)的DNA分析的可計量偵測限制為10阿摩爾(attomole)。
[0050]以寡核苷酸被覆的納米粒子偵測的PCR分析法
[0051 ] 使用上述SYBR GREEN偵測的PCR分析法相同的目標DNA及引子對(B卩前述實施例的目標DNA及引子對)，但是將引子被覆于SERS活性納米粒子及氧化鐵納米粒子(IONP)上取代使用傳統(tǒng)的PCR引子，進行以SERS為主的偵測。
[0052]具體步驟為，使用如前所得到的被覆序列識別號2所示之寡核苷酸序列的SERS活性納米粒子，與被覆序列識別號3所示之寡核苷酸序列的氧化鐵納米粒子，以相同于上述SYBR GREEN偵測的PCR操作步驟進行，包括添加的反應物及PCR循環(huán)流程。在40個循環(huán)后，從PCR裝置中移出樣本。收集磁性物質(zhì)并以蒸餾水清洗數(shù)次，最后以丙酮清洗。清洗步驟中，紀錄SERS訊號，顯示由SERS活性納米粒子所呈現(xiàn)的拉曼訊號(Raman signal)。校正SERS訊號強度1077CHT1為起始的目標核酸濃度。結(jié)果如第3圖所示，所得的SERS峰強度與全部目標DNA的濃度呈現(xiàn)良好的正相關(guān)性。基于SERS訊號強度約1000且背景噪聲為300的程度，預估100秒整合時間的偵測限制為約I介摩爾(zeptomole)的目標DNA濃度。
[0053]再一方面，分析10介摩爾(z印tomole)的目標DNA的SERS訊號強度，如第4圖所示。圖中，訊號高度在1077CHT1有300次，背景噪聲約±100次，在516CHT1的峰來自Si表面，可作為參考波峰。從此樣本的訊號表現(xiàn)與背景噪聲比例來看，以寡核苷酸被覆納米粒子偵測的PCR分析法可達到I介摩爾(zeptomole)的核酸濃度的偵測限制。相較于傳統(tǒng)基于熒光表現(xiàn)的標準PCR反應系統(tǒng)具有10阿摩爾(attomole)的偵測限制，以寡核苷酸被覆納米粒子偵測的PCR分析法的偵測限制具有較傳統(tǒng)PCR反應系統(tǒng)1000倍以上的靈敏度。
[0054]雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當可做些許更動與潤飾，因此本發(fā)明之保護范圍當視后附之申請專利范圍所界定者為準。
【權(quán)利要求】
1.一種偵測樣本中至少一種核酸的方法，包括: 提供磁性納米粒子與可偵測性納米粒子； 使該磁性納米粒子與該可偵測性納米粒子與該樣本反應； 以及偵測來自該可偵測性納米粒子的訊號以確認該樣本中的每種核酸； 其中，該磁性納米粒子與該可偵測性納米粒子的表面分別具有寡核苷酸連接于其上，該可偵測性納米粒子包含至少一種具有不同偵測訊號的納米粒子，且連接于該磁性納米粒子與該可偵測性納米粒子的表面的該寡核苷酸與該樣本中的核酸一區(qū)域形成互補。
2.權(quán)利要求1所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中位于該磁性納米粒子與任一種該可偵測性粒子的表面的該寡核苷酸彼此不互補。
3.權(quán)利要求1所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中位于該磁性納米粒子與任一種該可偵測性粒子的表面的該寡核苷酸為該樣本中該核酸的引子。
4.權(quán)利要求1所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中該磁性納米粒子包括氧化鐵納米粒子、超磁性氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles)或其組合。
5.權(quán)利要求1所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中該可偵測性納米粒子具有化學可偵測性、光學可偵測性或電化學可偵測性。
6.權(quán)利要求1所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中該可偵測性納米粒子包括具有表面增加拉曼散射(SERS)活性的納米粒子、突光納米粒子、量子點(quantum dots)或其組合。
7.權(quán)利要求6所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中該具有表面增加拉曼散射活性(SERS)的納米粒子包括納米金粒子、納米銀粒子或其組合。
8.權(quán)利要求6所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中該熒光納米粒子包括熒光染劑(fIuorochrome)、異硫氰酸突光素(fluorescein isothiocyanate ;FITC)、AlexaFluor染料、花青染料(Cyanine dyes C2，Cy3，Cy5)、熒光蛋白光敏素為主的近紅外線熒光蛋白(fluorescent protein phytochrome-based near-1nfrared fluorescent protein ；iRFP)、生物性冷光(bioluminescence)、螢火蟲發(fā)光酶(firefly luciferase ;Fluc)、Gaussia 冷光素酶(Gaussia luciferase ；Gluc)或其組合。
9.權(quán)利要求1所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中該樣本中核酸與該磁性納米粒子與可偵測性納米粒子進行核酸擴增反應。
10.權(quán)利要求9所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中該核酸擴增反應包括聚合酶鏈反應(PCR)或?qū)崟r聚合酶鏈反應(real-time PCR)。
11.權(quán)利要求9所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中該核酸擴增反應包括1-40個循環(huán)。
12.權(quán)利要求1所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中該樣本中的核酸包括單股核酸、雙股核酸或其混合。
13.權(quán)利要求1所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中該樣本中的核酸包括DNA、RNA或其混合。
14.權(quán)利要求1所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，更包括收集該磁性納米粒子及該可偵測性粒子的步驟。
15.權(quán)利要求14所述之偵測樣本中至少一種核酸的方法，其中該收集步驟包括磁性捕捉技術(shù)。
16.權(quán)利要求1所述之偵測樣本 中至少一種核酸的方法，用于微生物的偵測、疾病的診斷、水質(zhì)的偵測、食品安全的偵測、或搭配診斷(companion diagnostics)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103805690SQ201210574505
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月6日
【發(fā)明者】P-L.德瑞克 申請人:財團法人工業(yè)技術(shù)研究院