專(zhuān)利名稱(chēng)：核酸濃縮回收盒及其制造方法、和核酸濃縮回收方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸濃縮回收盒(核酸濃縮回收筒，nucleic acid concentration recovery cartridge)、一種核酸濃縮回收方法、以及該一種該盒的制造方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)在通道中的電泳濃縮核酸并回收核酸的盒。
背景技術(shù)：
已發(fā)現(xiàn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)如PCR (聚合酶鏈反應(yīng))方法和LAMP (環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)方法可以用于各種技術(shù)領(lǐng)域。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，例如，基于DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸) 堿基序列進(jìn)行診斷，而在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，應(yīng)用DNA鑒定以進(jìn)行遺傳改性農(nóng)作物的確定等。根據(jù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)，微量樣品中的核酸能夠以高效率擴(kuò)增并檢測(cè)。然而，當(dāng)樣品中包含的核酸的濃度處于極微量時(shí)，核酸的含量可以低于其檢測(cè)下限。此外，當(dāng)樣品中的核酸的濃度極低時(shí)，就有可能不能檢測(cè)到核酸，因?yàn)榇龜U(kuò)增的核酸沒(méi)有以能夠引入反應(yīng)部位的量包含在樣品中。在這些情形下，在預(yù)先濃縮樣品中的核酸之后，將樣品弓丨入反應(yīng)部位是有效的。在過(guò)去，利用苯酚、氯仿或乙醇的方法，利用吸附核酸的柱子、過(guò)濾器等的方法，利用磁性硅珠的方法等作為核酸濃縮方法是已知的。例如，日本專(zhuān)利臨時(shí)公開(kāi) No. 2005-080555披露了一種核酸的濃縮方法，其利用具有核酸吸附能力的多孔載體。而且， 在"On-line sample preconcentration in capillary electrophoresis -Fundamentals and applications，"Journal of Chromatography A. ,Vol. 1184,Pages 504 to 541(2008) 中披露了一種通過(guò)毛細(xì)電泳來(lái)濃縮核酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容
利用苯酚、氯仿或乙醇的相關(guān)方法必須利用有害的有機(jī)溶劑，并且濃縮操作等很艱苦。利用能夠吸附核酸的柱子、過(guò)濾器等的方法從操作簡(jiǎn)單和方便角度看存在問(wèn)題，因?yàn)橹?、過(guò)濾器等易于堵塞。因此，期望提供一種操作簡(jiǎn)單方便且能夠以高效率在短時(shí)間內(nèi)濃縮和回收核酸的核酸濃縮回收盒。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，提供了一種核酸濃縮回收盒，包括基板(襯底，substrate)，通道，設(shè)置在基板上，其中能夠引入液體，布置在通道的預(yù)定位置處的高分子凝膠，以及分別布置在通道的相對(duì)端(兩端，opposing ends)的正極(陽(yáng)極，anode)和負(fù)極 (陰極，cathode)。在該核酸濃縮回收盒中，高分子凝膠可以?xún)?yōu)選地包含陰離子官能團(tuán)，并且該高分子凝膠可以?xún)?yōu)選地構(gòu)造成具有從負(fù)極側(cè)向正極側(cè)的凹入形狀。在該核酸濃縮回收盒中，通道的至少一部分可以?xún)?yōu)選形成有將高分子凝膠保持在適當(dāng)位置(in place)的凝膠保持部(gel-holding portion)。凝膠保持部可以在其中該凝膠保持部與高分子凝膠接觸的位置(部位，position)處經(jīng)受親水化處理。凝膠保持部可以?xún)?yōu)選地在其中該凝膠保持部與高分子凝膠接觸的位置處用硅土(二氧化硅，silica)涂覆。而且，凝膠保持部可以?xún)?yōu)選地具有以使高分子凝膠與該凝膠保持部嵌合(裝配或嚙合， fit)并保持在適當(dāng)位置的預(yù)定形狀。另外，相比于正極端和高分子凝膠之間的通道，在高分子凝膠和負(fù)極端之間的通道可以?xún)?yōu)選地具有更大的容積。正極和負(fù)極可以?xún)?yōu)選地通過(guò)濺射或蒸鍍(vapor deposition)形成。而且，正極和負(fù)極可以預(yù)選地包含金或鉬。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，提供了一種核酸濃縮回收方法，包括用緩沖液填充通道，該通道在其預(yù)定位置處設(shè)置有高分子凝膠并且在該通道的相對(duì)端分別布置有正極和負(fù)極，將核酸引入到高分子凝膠和負(fù)極端之間的通道中，在正極和負(fù)極之間施加電壓以使核酸經(jīng)歷電泳，以及通過(guò)高分子凝膠阻擋(阻止，block)朝向正極端移動(dòng)的核酸。根據(jù)這種核酸濃縮回收方法，核酸能夠通過(guò)用高分子凝膠阻擋移動(dòng)的核酸而濃縮在高分子凝膠附近。在核酸濃縮回收方法中，高分子凝膠可以?xún)?yōu)選地包含陰離子官能團(tuán)。而且，高分子凝膠可以?xún)?yōu)選地以在核酸電泳的方向上具有凹入形狀布置在通道中。優(yōu)選地，該核酸濃縮回收方法可以進(jìn)一步包括在電泳之后在正極和負(fù)極之間施加反向電壓。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，還提供了一種上述核酸濃縮回收盒的制造方法，包括通過(guò)光聚合使引入到設(shè)置在基板上的通道中的單體溶液凝膠化成預(yù)定形狀，從而形成高分子凝膠。在該制造方法中，單體溶液可以?xún)?yōu)選地包含陰離子官能團(tuán)。高分子凝膠可以可選地凝膠化成具有從負(fù)極側(cè)朝向正極側(cè)的凹入形狀。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒操作簡(jiǎn)單方便，并且能夠以高效率在短時(shí)間內(nèi)濃縮和回收核酸。


圖IA至圖ID是根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒以及利用該盒的核酸濃縮回收方法的程序的示意圖；圖2A和圖2B是根據(jù)第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒的變形例的示意圖3是根據(jù)第--實(shí)施方式的核酉旨回收盒的進(jìn)--步變形例的示意圖4是根據(jù)第--實(shí)施方式的核酉旨回收盒的進(jìn)--步變形例的示意圖5是根據(jù)第--實(shí)施方式的核酉旨回收盒的進(jìn)--步變形例的示意圖6是根據(jù)第--實(shí)施方式的核酉旨回收盒的進(jìn)--步變形例的示意圖 是根據(jù)第--實(shí)施方式的核酉旨回收盒的進(jìn)--步變形例的示意圖8A至圖8D根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施方式的核酸濃_i回收盒以及利用該盒的核
縮回收方法的程序的示意圖； 圖9A和圖9B示出了作為附圖替代的照片，其示出了在高分子凝膠附近觀察到的熒光圖像(實(shí)施例2)；圖10是示出了在啟動(dòng)電泳之后在凝膠界面處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化的圖示 (實(shí)施例2)；圖11示出了作為附圖替代的照片，其示出了作為高分子凝膠中包含的陰離子官能團(tuán)的酸殘基基團(tuán)的變化PKa下，在核酸濃縮回收盒中的高分子凝膠附近觀察到的通道的熒光圖像(實(shí)施例3)；以及圖12A和圖12B示出了作為附圖替代的照片，其示出了在高分子凝膠附近觀察到的通道熒光圖像(實(shí)施例4)。
具體實(shí)施例方式下文將描述關(guān)于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)注意，下文將要描述的實(shí)施方式僅僅是本發(fā)明的代表性實(shí)施例并且絕不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。將以以下順序進(jìn)行描述1、根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒和利用該盒的核酸濃縮回收方法(1)核酸濃縮回收盒(2)核酸濃縮回收方法2、根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒的制造方法以及核酸濃縮回收盒的變形例(1)核酸濃縮回收盒的制造方法(2)核酸濃縮回收盒的變形例(3)核酸濃縮回收盒的其他變形例3、根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒以及利用該盒的核酸濃縮回收方法(1)核酸濃縮回收盒(2)核酸濃縮回收方法4、根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒的制造方法1、根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒以及利用該盒的核酸濃縮回收方法(1)核酸濃縮回收盒參考圖IA至圖1D，將描述根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒的構(gòu)造以及利用該盒的核酸濃縮回收方法的程序。在圖IA中，標(biāo)明標(biāo)號(hào)1的核酸濃縮回收盒具有基板、形成在基板上的通道11、以及分別布置在通道11的相對(duì)端的正極12和負(fù)極13。形成通道11以允許向其內(nèi)引入液體，并且高分子凝膠14在通道11中布置在正極12和負(fù)極13之間。而且，電源V連接至正極12 和負(fù)極13以能夠橫跨(跨越，cross)引入通道11中的液體施加電壓或從引入通道11中的液體移除電壓。作為基板的材料，可以采用玻璃或各種塑料(聚丙烯、聚碳酸酯、環(huán)烯烴聚合物、 聚二甲基硅氧烷)中的一種。作為正極12和負(fù)極13，可以適當(dāng)采用包括通過(guò)濺射或蒸鍍施加的金(Au)或鉬(Pt)的那些材料。作為高分子凝膠14，可以合適地采用聚丙烯酰胺。更優(yōu)選地，可以使用其中包含陰離子官能團(tuán)的聚丙烯酰胺，更優(yōu)選利用其中包含作為具有酸離解常數(shù)(PKa)為1至5的酸或其衍生物的殘基基團(tuán)的陰離子官能團(tuán)的聚丙烯酰胺。應(yīng)當(dāng)注意，如本發(fā)明使用的，術(shù)語(yǔ) “丙烯酰胺”是指丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。陰離子官能團(tuán)的實(shí)例包括但不具體限于羧酸如乙酸、丙酸和丁酸的殘基基團(tuán)；多元酸如草酸和鄰苯二甲酸的殘基基團(tuán)；羥酸如檸檬酸、乙醇酸和乳酸的殘基基團(tuán)；不飽和酸或不飽和多元酸如丙烯酸和甲基丙烯酸的殘基基團(tuán)；以及氨基酸如甘氨酸、磷酸的部分酯、硫酸的部分酯、膦酸、磺酸等的殘基基團(tuán)。酸或其衍生物的具體實(shí)例包括，作為羧酸的脂族單羧酸如甲酸(pKa:3.55)、乙酸(pKa 4. 56)、丙酸(pKa :4. 67)、丁酸(pKa :4. 63)、戊酸(pKa :4. 68)、己酸(pKa :4. 63)、 庚酸(pKa 4. 66)、棕櫚酸(pKa :4. 64)和硬脂酸(pKa :4. 69)；脂族或芳族二羧酸如琥珀酸(PKa1 4. 00，pKa2 :5. 24)、戊二酸(PKa1 :4. 13，pKa2 :5. 03)、己二酸(PKa1 :4. 26，pKa2 5. 03)、庚二酸(PKa1 4. 31, pKa2 :5. 08)、辛二酸(PKa1 :4. 35，pKa2 :5. 10)、壬二酸(PKa1 4. 39，pKa2 5. 12)、蘋(píng)果酸(PKa1 :3. 24，pKa2 :4. 71)和對(duì)苯二甲酸(PKa1 :3. 54，pKa2 :4. 46)； 不飽和羧酸如巴豆酸(pKa 4. 69)、丙烯酸(pKa :4. 26)和甲基丙烯酸(pKa :4. 66)；取代苯甲酸如茴香酸(pKa 4. 09)、間-氨基苯甲酸(PKa1 :3. 12,pKa2 :4. 74)、間-或?qū)?氯苯甲酸 (PKa1 3. 82，pKa2 :3. 99)和羥基苯甲酸(PKa1 :4. 08，pKa2 :9. 96)；多羧酸如檸檬酸(PKa1 2. 87，pKa2 4. 35，pKa3 :5. 69)以及它們的衍生物。作為包含陰離子官能團(tuán)的丙烯酰胺單體，可以?xún)?yōu)選丙烯酰烷磺酸 (acrylamidoalkanesulfonic acid)。該磺酸的實(shí)例包括含可聚合不飽和基團(tuán)的磺酸如苯乙烯磺酸(pKa -2. 8)、間-苯胺磺酸(pKa :3. 74)、對(duì)-苯胺磺酸(pKa :3. 23)和2_(甲基)丙烯?；?2-烷基(碳數(shù)1至4)丙磺酸，更具體地2-丙烯?；?2-甲基丙磺酸 (pKa -1. 7) ο聚丙烯酰胺凝膠中陰離子官能團(tuán)的濃度)可以?xún)?yōu)選為0至30%。(2)核酸濃縮回收方法參考圖IB至圖1D，將描述利用核酸濃縮回收盒1的核酸濃縮回收方法的程序。首先，將其中包含核酸的樣品引入到通道11中的高分子凝膠14和負(fù)極13之間的區(qū)域中(參見(jiàn)，圖1B)。這時(shí)，通道11已用電泳緩沖液填充。接著，在正極12和負(fù)極13之間施加電壓以橫跨緩沖液施加電壓，由此使核酸經(jīng)歷電泳。帶負(fù)電荷的核酸在通道11中經(jīng)電泳朝向正極12。在這種情形下，高分子凝膠14阻擋核酸的移動(dòng)并阻擋核酸，使得核酸在高分子凝膠14的界面處和附近濃縮(參見(jiàn)圖1C)。 電泳時(shí)間可以根據(jù)需要設(shè)置，取決于通道11的尺寸，并且能夠例如為大約10秒至10分鐘。 應(yīng)當(dāng)注意，術(shù)語(yǔ)高分子凝膠的“界面”是指高分子凝膠14和填充在區(qū)域113側(cè)上的緩沖液之間的接觸平面。最后，區(qū)域113中的高分子凝膠14附近的緩沖液通過(guò)微管2等吸取以回收濃縮的核酸(參見(jiàn)圖1D)。這時(shí)，高分子凝膠14中包含陰離子官能團(tuán)使得可以防止由于帶負(fù)電荷核酸和陰離子官能團(tuán)之間的電排斥力而移動(dòng)到高分子凝膠14內(nèi)部。如果核酸移動(dòng)到高分子凝膠14內(nèi)部或穿過(guò)高分子凝膠14內(nèi)部并進(jìn)一步移到正極12側(cè)上的區(qū)域112，則核酸將以較少的量被回收。陰離子官能團(tuán)可以?xún)?yōu)選地為酸或其衍生物的殘基基團(tuán)，其酸離解常數(shù)(PKa)為 1至5。由于該酸或其衍生物具有較低的pKa并且官能團(tuán)具有較大的負(fù)電荷，所以它們對(duì)于核酸由于電排斥力而移動(dòng)到高分子凝膠14中的阻礙更有效。為了以較大的量回收核酸，在吸取區(qū)域113中的高分子凝膠14附近的緩沖液之后，在正極12和負(fù)極13之間短時(shí)間施加反向電壓也是有效的。在回收核酸時(shí)短時(shí)間施加反向電壓可以使凝膠界面處存在的核酸以及凝膠內(nèi)部和界面附近存在的核酸移動(dòng)到區(qū)域113 中的高分子凝膠14附近，并且可以通過(guò)微管2吸取并回收核酸。施加反向電壓的時(shí)間根據(jù)需要設(shè)置，取決于通道11的尺寸，并且能夠例如為大約1秒至10秒。2、核酸濃縮回收盒的制造方法以及核酸濃縮回收盒的變形例(1)核酸濃縮回收盒的制造方法根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒能夠制造如下通過(guò)光聚合使已引入到形成在基板上的通道11中的單體溶液凝膠化成預(yù)定形狀，從而形成高分子凝膠14?；迳贤ǖ?1的形成能夠例如通過(guò)使玻璃制成的基板層經(jīng)受濕蝕刻或干蝕刻、 通過(guò)使塑料制成的基板層經(jīng)歷納米壓印光刻(nanoimprint lithography)、或通過(guò)使塑料制成的基板層注塑成型接著使其經(jīng)受切割加工而完成。應(yīng)當(dāng)注意，作為通道11，在盒1上能夠形成一個(gè)或多個(gè)通道。在單體溶液中，可以適當(dāng)采用丙烯酰胺單體。更優(yōu)選地，可以使用包含一個(gè)或多個(gè)陰離子官能團(tuán)的丙烯酰胺單體，其中更優(yōu)選利用包含一個(gè)或多個(gè)作為酸離解常數(shù)(PKa)為 1至5的酸或其衍生物的一個(gè)殘基基團(tuán)或多個(gè)殘基基團(tuán)的陰離子官能團(tuán)的丙烯酰胺單體。 具體地，在單體溶液中優(yōu)選采用丙烯酰烷磺酸。正極12和負(fù)極13可以通過(guò)濺射或蒸鍍金(Au)或鉬(Pt)而形成。在這方面，根據(jù)相關(guān)技術(shù)的盒包括利用鉬線(xiàn)(鉬絲，platinum wire)作為電極的那些。在這種情況下，無(wú)論什么時(shí)候進(jìn)行試驗(yàn)，都需要將鉬線(xiàn)布置在核酸濃縮回收盒中。此外，鑒于鉬線(xiàn)的高價(jià)格， 這些盒不能作為可拋棄(一次性處理)的盒提供。在在另一方面，根據(jù)這個(gè)實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒1中，正極12和負(fù)極13如上所述通過(guò)濺射或蒸鍍金(Au)或鉬(Pt)制造，并且這些電極已預(yù)先形成在盒1中。因此，該盒能夠易于處理。與根據(jù)相關(guān)技術(shù)的核酸濃縮回收盒相反，這樣的核酸濃縮回收盒1可拋棄。因此，利用核酸濃縮回收盒1，可以避免樣品在其濃縮之后的污染。(2)核酸濃縮回收盒的變形例參考圖2A至圖4，將描述根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒的變形例的構(gòu)造。在根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒中，高分子凝膠14可以?xún)?yōu)選地布置在通道11中從而在核酸電泳的方向上具有凹入形狀。具體地描述，高分子凝膠14能夠布置成這樣的構(gòu)造，從上面看，從負(fù)極13側(cè)朝向正極12側(cè)以三角形(圖2A)或半圓形形狀 (圖2B)凹入。當(dāng)在正極12和負(fù)極13之間施加電壓以使帶負(fù)電荷的核酸電泳朝向正極12時(shí)，移動(dòng)的核酸被高分子凝膠14阻擋并在高分子凝膠14附近濃縮(參見(jiàn)圖1C)。通過(guò)將高分子凝膠14布置成從負(fù)極13側(cè)朝向正極12側(cè)凹入的構(gòu)造，要濃縮的核酸能夠在這時(shí)被收集在凹入部中，由此使得可以增大核酸的濃縮速率以及有效地回收核酸。為了將高分子凝膠14構(gòu)造成在核酸電泳的方向上凹入的形狀，在通過(guò)光聚合引入到通道11中的單體溶液發(fā)生凝膠化之后，通過(guò)光掩膜暴露、激光束掃描等方法依照所述形狀進(jìn)行光照射。在根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒中，相比于正極端和高分子凝膠14 之間的區(qū)域112的通道容積，引入包含核酸的樣品的區(qū)域113(通道11的區(qū)域，其位于高分子凝膠14和負(fù)極13之間)的通道容積可以形成為更大(參見(jiàn)圖幻。在這種情況下，優(yōu)選將區(qū)域113的負(fù)極側(cè)形成為圓弧形狀以及將負(fù)極13布置在相同圓弧形狀中(參見(jiàn)圖4)。 當(dāng)核酸濃縮回收盒形成為圖4所示的構(gòu)造時(shí)，圓弧的中心角可以?xún)?yōu)選設(shè)置在0至30度。而且，還適合將中心角設(shè)置在30度至60度。此外，還適合將中心角設(shè)置在60度至90度。此外，還適合將中心角設(shè)置在90度至120度。以更大尺寸形成區(qū)域113使得可以以增大的容積引入樣品溶液，并因此可以獲得更大量的濃縮核酸。在這種變形例中，區(qū)域113的負(fù)極側(cè)和負(fù)極13形成為圓弧形狀，使得可以形成更均勻的電場(chǎng)，因此可以增加核酸的濃縮效率。(3)核酸濃縮回收盒的其他變形例接下來(lái)參考圖5至圖7，將描述根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒的其他變形例。在下文將參考圖5至圖7描述的變形例中，通道11分別設(shè)置有凝膠保持部15， 以示例性方式基于圖3中所示的核酸濃縮回收盒1，但本發(fā)明不應(yīng)限于這樣的例舉變形例。 這些凝膠保持部15的每一個(gè)例如也可以布置在參考圖IA至圖1D、圖2A、圖2B和圖3描述的各種核酸濃縮回收盒中。在根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒中，通道11的至少一部分可以?xún)?yōu)選地形成有將高分子凝膠14保持在適當(dāng)位置(在原位，in place)的凝膠保持部15(參見(jiàn)圖5)。凝膠保持部15可以經(jīng)受親水化處理，例如在凝膠保持部15接觸高分子凝膠14的位置(或部位)處。在這種情況下，凝膠保持部15可以?xún)?yōu)選地在該凝膠保持部15接觸高分子凝膠14的位置處用硅土涂覆。當(dāng)如上所述的凝膠保持部15在其中該凝膠保持部接觸高分子凝膠14的位置處經(jīng)受親水化處理時(shí)，接觸位置和高分子凝膠14之間的相容性被改善，由此使得可以防止高分子凝膠14在通過(guò)電泳進(jìn)行核酸濃縮之后移動(dòng)到位置外。利用根據(jù)這種變形例的核酸濃縮回收盒1，核酸能夠因此由于布置凝膠保持部15而更穩(wěn)定地被濃縮和回收。在根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施方式的每一種變形例的核酸濃縮回收盒1中，凝膠保持部 15可以具有預(yù)定形狀以使高分子凝膠14填充在該凝膠保持部15中。如圖6中所示，例如， 凝膠保持部15具有在垂直于核酸電泳方向的方向上凹入的形狀，使得用于高分子凝膠14 的容納區(qū)域被放大，因此能夠以嵌合(fitting engagement)方式保持該高分子凝膠14。如通過(guò)示例方式在圖7中示出的，在另一方面，凝膠保持部15可以具有形成了多個(gè)細(xì)刻痕的形狀，并因此也能夠以嵌合嚙合地保持高分子凝膠14。當(dāng)如上所述的高分子凝膠14能夠嵌合到凝膠保持部15中時(shí)，核酸濃縮回收盒1 還能夠防止高分子凝膠14在通過(guò)電泳進(jìn)行核酸濃縮之后移動(dòng)到位置外。利用該核酸濃縮回收盒1，由于凝膠保持部15的布置而能夠更穩(wěn)定地濃縮和回收核酸。3、根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒以及利用該盒的核酸濃縮回收方法(1)核酸濃縮回收盒參考圖8A至圖8D，將描述根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒的構(gòu)造以及利用該盒的核酸濃縮回收方法的程序。在圖8A中，以標(biāo)號(hào)1標(biāo)明的核酸濃縮回收盒具有基板、穿過(guò)基板形成的通道11、以及分別布置在通道相對(duì)端的正極12和負(fù)極13。形成通道11以允許向其中引入液體，并且高分子凝膠14在通道11中布置在正極12和負(fù)極13之間。而且，電源V連接至正極12和負(fù)極13以能夠橫跨引入到通道11中的液體施加電壓或從引入到通道11中的液體移除電壓。通道11包括向其中引入液體的區(qū)域113。通過(guò)將圓錐形小室作為一個(gè)實(shí)例描述這個(gè)區(qū)域113，但不應(yīng)限于這樣的形狀。也可以采用不同的形狀例如椎體形狀、棱柱形狀和圓柱形形狀。核酸濃縮回收盒的外部形狀通過(guò)將圓柱形作為一個(gè)實(shí)例進(jìn)行描述，但不應(yīng)限于這樣的形狀。也能夠采用不同形狀例如椎體形狀和棱柱形狀。作為高分子凝膠14，可以選取與根據(jù)第一實(shí)施方式的上述核酸濃縮回收盒中的類(lèi)似材料和組成。盡管未在圖8A至圖8D示出，布置在根據(jù)第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒中并參考圖5至圖7描述的凝膠保持部15可以分別布置在根據(jù)第二實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒中以防止高分子凝膠14移動(dòng)到位置外。(2)核酸濃縮回收方法參考圖8B至圖8D，將描述利用根據(jù)第二實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒1的核酸濃縮回收方法的程序。首先，將其中包含核酸的樣品引入到通道11中的高分子凝膠14和負(fù)極13之間的區(qū)域113中(參見(jiàn)圖8B)。在這時(shí)，通道11預(yù)先用電泳緩沖液填充。接著，將電壓施加在正極12和負(fù)極13之間以橫跨緩沖液施加該電壓，由此使核酸經(jīng)歷電泳。帶負(fù)電荷的核酸在通道11中電泳朝向正極12。在這種情況下，高分子凝膠14 阻擋核酸的移動(dòng)并阻擋核酸，使得核酸在高分子凝膠14的界面處和附近濃縮(參見(jiàn)圖8C)。 電泳時(shí)間可以根據(jù)需要設(shè)置，取決于通道11的尺寸，并且能夠例如為大約10秒至10分鐘。最后，在區(qū)域113中的高分子凝膠14附近的緩沖液通過(guò)微管2等吸取從而回收濃縮的核酸(參見(jiàn)圖8D)。在根據(jù)第二實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒中，相比于在正極端和高分子凝膠14之間的區(qū)域112的通道容積，其中引入包含核酸的樣品的區(qū)域113(通道11的區(qū)域，其位于高分子凝膠14和負(fù)極13之間)的通道容積形成為非常大。因此核酸能夠以大的量被有效濃縮和回收。特別是如在圖8A至圖8D中所示的，當(dāng)區(qū)域113構(gòu)造成在核酸發(fā)生電泳的方向上逐漸變得更窄時(shí)，核酸能夠以大的量被有效濃縮和回收。而且，如同在根據(jù)第一實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒中一樣，在高分子凝膠14中包含陰離子官能團(tuán)，使得可以防止核酸由于帶負(fù)電荷的核酸和陰離子官能團(tuán)之間的電排斥力而移動(dòng)到高分子凝膠14內(nèi)部。如果核酸移動(dòng)到高分子凝膠14的內(nèi)部或穿過(guò)高分子凝膠14 的內(nèi)部并進(jìn)一步移動(dòng)到在正極12側(cè)上的區(qū)域112中，則核酸將以較小的量被回收。陰離子官能團(tuán)可以?xún)?yōu)選地是酸離解常數(shù)(PKa)為1至5的酸或其衍生物的殘基基團(tuán)。由于酸或其衍生物具有較低的PKa并且官能團(tuán)具有更大的負(fù)電荷，所以它們對(duì)于阻礙核酸由于電排斥力而移動(dòng)到高分子凝膠14中是更有效的。為了以更大的量回收核酸，在吸取區(qū)域113中的高分子凝膠14附近的緩沖液之后，在正極12和負(fù)極13之間短時(shí)間施加反向電壓也是有效的。在回收核酸時(shí)短時(shí)間施加反向電壓可以使凝膠界面處存在的核酸以及凝膠內(nèi)部和界面附近存在的核酸移動(dòng)到區(qū)域113 中的高分子凝膠14附近，并通過(guò)微管2吸取和回收核酸。施加反向電壓的時(shí)間可以根據(jù)需要設(shè)置，取決于通道11的尺寸，并且能夠例如為大約1秒至10秒。4、根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒的制造方法根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒1能夠制造如下通過(guò)光聚合將已引入到穿過(guò)基板形成的通道11中的單體溶液凝膠化成預(yù)定形狀，從而形成高分子凝膠14。在單體溶液中，可以合適地采用材料丙烯酰胺單體。更優(yōu)選地，可以使用包含一個(gè)或多個(gè)陰離子官能團(tuán)的丙烯酰胺單體，其中更優(yōu)選使用包含作為一個(gè)或多個(gè)陰離子官能團(tuán)的酸或其衍生物(其酸離解常數(shù)(pKa)為1至5)的一個(gè)殘基基團(tuán)或多個(gè)殘基基團(tuán)的丙烯酰胺單體。具體地，在單體溶液中優(yōu)選采用丙烯酰烷磺酸。作為正極12和負(fù)極13，可以合適采用包含金(Au)或鉬(Pt)的那些。在這種情況下，正極12和負(fù)極13可以通過(guò)濺射或蒸鍍金或鉬而形成。核酸濃縮回收盒1能夠易于處理，因?yàn)檎龢O12和負(fù)極13通過(guò)濺射或蒸鍍金或鉬預(yù)先形成在盒中。而且，核酸濃縮回收盒 1能夠作為可拋棄盒提供。利用該核酸濃縮回收盒1，因此可以避免樣品的污染。關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的核酸濃縮回收盒的代表性實(shí)施方式的某些實(shí)例已經(jīng)如上描述了。根據(jù)每一個(gè)實(shí)施方式的核酸濃縮回收盒通過(guò)利用高分子凝膠14的盒作為實(shí)例進(jìn)行了描述。代替高分子凝膠14，可以使用商購(gòu)多孔膜如透析膜、反滲透膜、半可滲透膜或離子交換膜，或者纖維素、聚丙烯腈、陶瓷、沸石、聚砜、聚酰亞胺、鈀等的商購(gòu)膜。實(shí)施例11、核酸濃縮回收盒的制造在PMMA基板上，形成5mm寬、60mm長(zhǎng)和2mm深的通道。在該通道的相對(duì)端，分別布置由鉬線(xiàn)(直徑0. 5mm，長(zhǎng)10mm，The Nilaco Corporation的產(chǎn)品)形成的正極和負(fù)極。通道用依據(jù)表1和表2制備的丙烯酰胺溶液(溶液幻填充。利用共焦激光掃描顯微鏡(“FV1000”，商標(biāo)名；由Olympus Corporation制造)，進(jìn)行丙烯酰胺的光聚合從而在通道中形成5mm寬和3mm長(zhǎng)的高分子凝膠。接著，將未聚合的丙烯酰胺溶液替換為電泳緩沖液(IXTBE)。表權(quán)利要求
1.一種核酸濃縮回收盒，包括基板；通道，設(shè)置在所述基板上，其中能夠引入液體；布置在所述通道的預(yù)定位置處的高分子凝膠；以及分別布置在所述通道的相對(duì)端的正極和負(fù)極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸濃縮回收盒，其中，所述高分子凝膠包含陰離子官能團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸濃縮回收盒，其中，所述高分子凝膠構(gòu)造成具有從所述負(fù)極側(cè)朝向所述正極側(cè)的凹入形狀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸濃縮回收盒，其中，所述通道的至少一部分形成有將所述高分子凝膠保持在適當(dāng)位置的凝膠保持部。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸濃縮回收盒，其中，所述凝膠保持部在其與所述高分子凝膠接觸的位置處經(jīng)受親水化處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸濃縮回收盒，其中，所述凝膠保持部在其與所述高分子凝膠接觸的位置處用硅土涂覆。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸濃縮回收盒，其中，所述凝膠保持部具有使所述高分子凝膠與所述凝膠保持部嵌合并保持在適當(dāng)位置的預(yù)定形狀。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸濃縮回收盒，其中，所述高分子凝膠和所述負(fù)極端之間的通道具有比所述正極端和所述高分子凝膠之間的通道更大的容積。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸濃縮回收盒，其中，所述正極和負(fù)極通過(guò)濺射或蒸鍍形成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸濃縮回收盒，其中，所述正極和負(fù)極包含金或鉬。
11.一種核酸濃縮回收方法，包括用緩沖液填充通道，所述通道設(shè)置有布置在其預(yù)定位置處的高分子凝膠以及分別布置在所述通道的相對(duì)端的正極和負(fù)極，將核酸引入到在所述高分子凝膠和所述負(fù)極端之間的所述通道中，在所述正極和負(fù)極之間施加電壓以使所述核酸經(jīng)歷電泳，以及通過(guò)所述高分子凝膠阻擋移向所述正極端的所述核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的核酸濃縮回收方法，其中，所述高分子凝膠包含陰離子官能團(tuán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的核酸濃縮回收方法，其中，所述高分子凝膠以在所述核酸的電泳方向上具有凹入形狀的方式布置在所述通道中。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的核酸濃縮回收方法，進(jìn)一步包括在所述電泳之后在所述正極和所述負(fù)極之間施加反向電壓。
15.一種核酸濃縮回收盒的制造方法，所述核酸濃縮回收盒包括基板、設(shè)置在所述基板上且其中能夠引入液體的通道、布置在所述通道的預(yù)定位置處的高分子凝膠、以及分別布置在所述通道相對(duì)端的正極和負(fù)極，所述方法包括通過(guò)光聚合使引入到設(shè)置在所述基板上的所述通道中的單體溶液凝膠化成預(yù)定形狀， 從而形成所述高分子凝膠。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸濃縮回收盒的制造方法，其中，所述單體溶液包含陰離子官能團(tuán)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸濃縮回收盒的制造方法，其中，所述高分子凝膠被凝膠化成具有從所述負(fù)極側(cè)朝向所述正極側(cè)的凹入形狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及核酸濃縮回收盒及其制造方法、和核酸濃縮回收方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種核酸濃縮回收盒，包括基板、設(shè)置在該基板上且其中能夠引入液體的通道、布置在通道的預(yù)定位置處的高分子凝膠、以及分別布置在通道的相對(duì)端的正極和負(fù)極。本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)便且能夠在短時(shí)間內(nèi)高效地濃縮和回收核酸的核酸濃縮回收盒。
文檔編號(hào)C12M1/42GK102311916SQ20111018002
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者中村友彥 申請(qǐng)人:索尼公司