水解和發(fā)酵纖維素材料的方法【專利摘要】本文中描述了使用連二亞硫酸鹽將纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖的改善的方法。亦描述了在連二亞硫酸鹽存在下改善的發(fā)酵方法?！緦＠f明】水解和發(fā)酵纖維素材料的方法涉及序列表本申請包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。所述計(jì)算機(jī)可讀形式通過提述并入本文。發(fā)明背景纖維素材料對于生成可替代化石燃料的能源提供了有吸引力的平臺(tái)。將纖維素材料轉(zhuǎn)化(例如從木素纖維素原料)為生物燃料具有下述優(yōu)點(diǎn):大量原料現(xiàn)成可用，可以理想地避免燃燒或填埋材料，以及生物燃料(如乙醇)的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認(rèn)為是用于生物燃料生產(chǎn)的原料。一旦將纖維素轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的糖例如葡萄糖，所述可發(fā)酵的糖容易地由酵母發(fā)酵成生物燃料，如乙醇。對木素纖維素(來自細(xì)胞壁的纖維素材料，其在混合基質(zhì)中含有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素)進(jìn)行化學(xué)和物理預(yù)處理以破壞植物細(xì)胞壁組分，并允許纖維素酶改善的攻擊(access)是增加糖化產(chǎn)量/產(chǎn)率(yield)的常見方法。然而,預(yù)處理的嚴(yán)酷條件亦會(huì)在木質(zhì)素結(jié)構(gòu)內(nèi)生成官能團(tuán)，其導(dǎo)致木質(zhì)素與纖維素酶之間不合意的相互作用，使得糖化的產(chǎn)量/產(chǎn)率不理想。Soudham等，2011,JournalofBiotechnologyl55:244-250涉及在預(yù)處理液體的存在下使用還原劑改善纖維素底物的酶促水解。在本領(lǐng)域中，改善水解經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料的方法會(huì)是有利的?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】在本文中描述了使用連二亞硫酸鹽(例如連二亞硫酸鈉)將纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖的方法。亦描述了在連二亞硫酸鹽存在下的發(fā)酵方法。在一個(gè)方面，為降解經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料(例如纖維素材料)的方法，其包括:(a)用連二亞硫酸鹽溫育經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料；和(b)用包含一種或多種纖維素酶的酶組合物糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料。在另一個(gè)方面，為產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:(a)用包含一種或多種纖維素酶的酶組合物糖化生物質(zhì)材料(例如纖維素材料)；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物在連二亞硫酸鹽存在下發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料；和(C)從(b)回收發(fā)酵產(chǎn)物?！緦＠綀D】【附圖說明】圖1顯示連二亞硫酸鹽對里氏木霉(Trichodermareesei)纖維素酶制備物水解經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)的作用。圖2顯示不同的GH6IA濃度對在連二亞硫酸鹽存在下里氏木霉纖維素酶制備物水解經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)的作用。圖3顯示當(dāng)將0-3%Na2S2O4添加至使用15%TSNREL未洗滌的PCS的乙醇發(fā)酵時(shí)，使用C5酵母在50小時(shí)發(fā)酵之后的乙醇產(chǎn)量。圖4顯示當(dāng)使用15%TSNREL未洗滌的PCS添加0_3%Na2S2O4時(shí)，使用C5酵母在乙醇發(fā)酵過程中的木糖消耗。圖5顯示使用添加0、1、2和3%Na2S2O4的15%TSNREL未洗滌PCS使用C5酵母在50小時(shí)和72小時(shí)乙醇發(fā)酵之后的乙醇產(chǎn)率。定義乙酰木聚糖酯酶:術(shù)語“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙?；鶑木酆夏揪厶?、乙酰化木糖、乙?；咸烟?、乙酸ct-萘酯(alpha-napthylacetate)和乙酸對硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEEN?20(聚乙二醇山梨坦單月桂酸酯)的50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM乙酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個(gè)單位的乙酰木聚糖酯酶定義為能夠在pH5，25°C每分鐘釋放I微摩爾對硝基苯酹陰離子(p-nitrophenolateanion)的酶量。等位變體(allelicvariant):術(shù)語“等位變體”意指占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶:術(shù)語“a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指a_L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化對a-L-阿拉伯糖苷中的末端非還原性a-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和/或(1，5)_鍵的a-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或a-L-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200μI中的每ml的IOOmM乙酸鈉pH5中5mg的中等粘度小麥阿拉伯木聚糖(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Bray,C0.Wicklow,Ireland)在40V進(jìn)行30分鐘，接著通過AMINEX?HPX-87H柱層析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析來確定的。α-葡糖醛酸糖苷酶:術(shù)語“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指a-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化a-D-葡糖醛酸糖苷水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)deVries,1998,J.Bacteriol.180:243-249確定的。一個(gè)單位的α_葡糖醒酸糖苷酶等于能夠在pH5，40°C每分鐘釋放I微摩爾葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。β-葡糖苷酶:術(shù)語“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.N0.3.2.1.21)，其催化末端非還原β-D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，β-葡糖苷酶活性根據(jù)Venturi等，2002，Extracellularbeta—D—glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum:production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本步驟確定。一個(gè)單位的β-葡糖苷酶定義為在25°C，pH4.8，在含有0.01%TWEEN?20的50mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對硝基苯酚陰離子。β-木糖苷酶:術(shù)語“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(I—4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個(gè)單位的β_木糖苷酶定義為在40°C，pH5在含有0.01%TWEEN?20的IOOmM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對硝基苯基-β-D-木糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對硝基苯酚陰離子。生物質(zhì)材料:如本文中使用的術(shù)語“生物質(zhì)材料”指任何含糖生物質(zhì)(例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材)及其任何組分，如纖維素、半纖維素或木質(zhì)素。應(yīng)理解的是，除非另行指明，生物質(zhì)材料包括未處理的、預(yù)處理的和水解的或部分水解的形式(例如生物質(zhì)降解的產(chǎn)物，如寡糖)。cDNA:術(shù)語“cDNA”意指能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少可存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體,其通過一系列的步驟包括剪接進(jìn)行加工,然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。纖維二糖水解酶:術(shù)語“纖維二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(I,4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91),其催化纖維素、纖維寡糖，或任何包含β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri,1997,Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofcellobiohydrolases,TrendsinBiotechnologyl5:160-167；Teeri等，1998，Trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。根據(jù)Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279;vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLettersl49:152-156；vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLettersl87:283-288；以及Tomme等，1988，Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法確定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，Tomme等的方法可用于確定纖維二糖水解酶活性。纖維素分解酶或纖維素酶:術(shù)語“纖維素分解酶”或“纖維素酶”意指一種或多種(例如幾種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，β_葡糖苷酶，或其組合。測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括:(1)測量總纖維素分解活性，和(2)測量單獨(dú)的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β_葡糖苷酶)，如Zhang等，Outlookforcellulaseimprovement:Screeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481所綜述的?？偫w維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括Whatmanl號(hào)濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用Whatmanl號(hào)濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由InternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987，Measurementofcellulaseactivities,PureApp1.Chem.59:257-68)確立的。就本發(fā)明而言，纖維素分解酶活性通過測量在下述條件下由纖維素分解酶進(jìn)行的纖維素材料水解相比于未添加纖維素分解酶蛋白的對照水解的增加來確定:1-50mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS中纖維素(或其它經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料)在合適的溫度，例如50°C、55°C、60°C或65°C進(jìn)行3-7日。通常條件為:1ml反應(yīng)液，經(jīng)洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉pH5，lmMMnSO4,50°C、55°C、60°C或65°C，72小時(shí)，通過AMINEX?HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)進(jìn)行糖分析。纖維素材料:如用于本文中的術(shù)語“纖維素材料”指包含纖維素(一種化學(xué)上均質(zhì)的寡糖或多糖，即i3-(l_4)-D-葡聚糖(含β(1-4)連接的D-葡萄糖單元的聚合物))的任何生物質(zhì)材料。盡管通常是多形的，但存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙、以及紙衆(zhòng)和造紙廠殘余物(參見，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman編),pp.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719；Mosier等，1999，RecentProgressinBioconversionofLignocellulosicsj于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主編，Volume65,pp.23-40，Springer-VerlagjNewYork)。纖維素材料包含任何形式的纖維素，如降解或水解為寡糖的多糖。在本文中應(yīng)理解的是，纖維素可為木素纖維素組分的形式，木素纖維素是一種植物細(xì)胞壁材料，包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的混合基質(zhì)。在一個(gè)方面，纖維素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是木材(包括林業(yè)殘余物)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是廢紙。在另一個(gè)方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是麥桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個(gè)方面，纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個(gè)方面，纖維素材料是稻桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是芒草屬(miscanthus)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是橙皮。在另一個(gè)方面，纖維素材料是楊樹。在另一個(gè)方面，纖維素材料是松樹。在另一個(gè)方面，纖維素材料是柳樹。在另一個(gè)方面，纖維素材料是桉樹。在另一個(gè)方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是細(xì)菌纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是棉線頭(cottonlinter)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是無定型的經(jīng)磷酸處理的纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是濾紙。在另一個(gè)方面，纖維素材料是水生生物質(zhì)。如用于本文中，“水生生物質(zhì)”意指在水生環(huán)境中由光合作用過程產(chǎn)生的生物質(zhì)。水生生物質(zhì)可為藻類、沉水植物(submergedplant)、挺水植物(emergentplant)、或浮葉植物(floating-leafplant)。纖維素材料可以按原樣(asis)使用，或進(jìn)行預(yù)處理，使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，如本文所述。編碼序列:術(shù)語“編碼序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或其它起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的多核苷酸。調(diào)控序列(controlsequence):術(shù)語“調(diào)控序列”意指對編碼成熟多肽的多核苷酸表達(dá)而言為必需的核酸序列。各個(gè)調(diào)控序列對于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的(即，來自同一基因)或外來的(即，來自不同基因)，或者，各個(gè)調(diào)控序列對于彼此而言可以是天然的或外來的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。調(diào)控序列可以配備有接頭，用于引入促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接的特異性限制位點(diǎn)。內(nèi)切葡聚糖酶:術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”意指內(nèi)切-1，4-(1,3;1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-Ι,4_β-D-glucan4_glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4),其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的l，4-13-D-糖苷鍵、混合的β_1，3葡聚糖例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的β-1，4鍵的內(nèi)切水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可通過測量底物粘度的減少或由還原糖測定法(Zhang等，2006,BiotechnologyAdvances24:452-481)確定的還原端增加來確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)Ghose,1987,PureandApp1.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40°C使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。表達(dá):術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體:術(shù)語“表達(dá)載體”意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的調(diào)控序列可操作地連接。家族61糖苷水解酶:術(shù)語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定義為根據(jù)Henrissat,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat和Bairoch,1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。該家族中的酶最初是基于在一個(gè)家族成員測量到的非常弱的內(nèi)切-1，4-β-D葡聚糖酶活性而被歸類為糖苷水解酶家族的。這些酶的結(jié)構(gòu)和作用模式必然是非經(jīng)典的，且它們無法視為真正的(bonafide)糖苷酶。然而，基于它們與纖維素酶或纖維素酶的混合物一同使用時(shí)增強(qiáng)木素纖維素分解的能力，將它們保留在CAZy分類中。阿魏酸酯酶:術(shù)語“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)”意指4_羥基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團(tuán)從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、羥基肉桂?；ッ?、FAE-1I1、肉桂酸酯水解酶、FAEA、CinnAE、FAE-1或FAE-1I。就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM阿魏酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個(gè)單位的阿魏酸酯酶等于能夠在pH5，25°C每分鐘釋放I微摩爾對硝基苯酚陰離子的酶量。半纖維素:如用于本文中的術(shù)語“半纖維素”指除了纖維素之外的寡糖或多糖生物質(zhì)材料。半纖維素在化學(xué)上是異質(zhì)的，并在復(fù)雜的、異質(zhì)的支化的和直鏈的多糖或寡糖中含有多種聚合的糖，主要是D-戊糖，如木聚糖、葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，其通過氫鍵鍵合于植物細(xì)胞壁中的纖維素微纖維，且其中木糖通常含量最大。半纖維素可共價(jià)附接于木質(zhì)素，且通常氫鍵鍵合于纖維素，以及其它半纖維素，這幫助穩(wěn)定化細(xì)胞壁基質(zhì)，形成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素材料含有任何形式的半纖維素，如降解或水解為寡糖的多糖。在本文中應(yīng)理解的是，半纖維素可為木素纖維素組分的形式，木素纖維素是在混合基質(zhì)中含有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的細(xì)胞壁材料。半纖維素分解酶或半纖維素酶:術(shù)語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”意指一種或多種(幾種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如Shallom和Shoham,2003,Microbialhemicellulases.CurrentOpinionInMicrobiology,6(3):219-228)。半纖維素酶是植物生物質(zhì)降解中的關(guān)鍵成分。半纖維素酶的實(shí)例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素，是一種由支化和直鏈多糖構(gòu)成的異質(zhì)集團(tuán)，這些多糖通過氫鍵鍵合于植物細(xì)胞壁中的纖維素微纖維，將其交聯(lián)為一個(gè)魯棒(robust)的網(wǎng)絡(luò)。半纖維素亦共價(jià)地附接于木質(zhì)素，與纖維素一同形成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素的可變的結(jié)構(gòu)和組織形式需要許多酶的協(xié)同作用使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊為水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸側(cè)基的酯連接的糖酯酶(CE)。這些催化模塊，基于其一級結(jié)構(gòu)的同源性，可指派為GH和CE家族，并標(biāo)以數(shù)字。一些家族，具有總體上類似的折疊，可進(jìn)一步歸類為以字母標(biāo)記的宗族(clan)(例如，GH-A)。這些和其他糖活性酶的一種最具信息性和最新的分類可在Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)數(shù)據(jù)庫獲得。半纖維素分解酶活性可根據(jù)Ghose和Bisaria,1987，Pure&Appl.Chem.59:1739-1752進(jìn)行測量。宿主細(xì)胞:術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對于使用包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋任何親本細(xì)胞的后代，其由于在復(fù)制中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。分離的:術(shù)語“分離的”意指以不在自然界出現(xiàn)的形式或環(huán)境存在的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限定性實(shí)例包括(I)任何非天然存在的物質(zhì)，(2)任何至少部分地與一種或多種或所有與其天然伴隨的天然存在的成分分開的物質(zhì)，包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；(3)任何這樣的物質(zhì):相對于在自然界存在的該物質(zhì)，其經(jīng)過人工修飾；或(4)任何這樣的物質(zhì):該物質(zhì)經(jīng)過增加該物質(zhì)相對于與其自然伴隨的其他成分的量的修飾(例如，編碼該物質(zhì)的基因的多重拷貝；或與編碼該物質(zhì)的基因自然結(jié)合的啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子的使用)。分離的底物可存在于發(fā)酵液樣品中。成熟多肽:術(shù)語“成熟多肽”意指以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在本領(lǐng)域中已知宿主細(xì)胞可產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。成熟多肽可使用SignalP程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineeringlO:1-6)預(yù)測。成熟多肽編碼序列:術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。成熟多肽編碼序列可使用SignalP程序(Nielsen等，1997，見上文)預(yù)測。核酸構(gòu)建體:術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或其經(jīng)修飾以本來不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段，或其為合成的，其包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列?？刹僮鞯剡B接:術(shù)語“可操作地連接”意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。多肽片段:術(shù)語“片段”意指從成熟多肽的氨基和/或羧基端缺失一個(gè)或多個(gè)(例如幾個(gè))氨基酸的多肽。在一個(gè)方面，片段含有參照的成熟多肽的至少85%的氨基酸殘基，例如至少90%的氨基酸殘基或至少95%的氨基酸殘基。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽:術(shù)語“具有纖維素分解增強(qiáng)的多肽”意指催化具有纖維素分解活性的酶對纖維素材料的水解的增強(qiáng)的GH61多肽。就本發(fā)明而言，通過測量來自由纖維素分解酶在下述條件下水解纖維素材料的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強(qiáng)活性:l_50mg總蛋白/gPCS中纖維素，其中總蛋白包含50-99.5%w/w的纖維素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的蛋白質(zhì)，在合適的溫度，例如50°C、55°C或60°C歷時(shí)1_7天，與用等量的總蛋白加載量而無纖維素分解增強(qiáng)活性(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中纖維素)所進(jìn)行的對照水解相比。在一個(gè)優(yōu)選的方面，使用在總蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)W002/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白質(zhì)量的2_3%的煙曲霉β-葡糖苷酶(如W02002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的CELLUCLAST?1.5L(N0V0ZymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽通過降低達(dá)到相同水解水平所需的纖維素分解酶的量而增強(qiáng)由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少1.01倍，更優(yōu)選至少1.05倍，更優(yōu)選至少1.10倍，更優(yōu)選至少1.25倍，更優(yōu)選至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10倍，和最優(yōu)選至少20倍。預(yù)處理的玉米秸桿:術(shù)語“PCS”或“預(yù)處理的玉米秸桿”意指已經(jīng)經(jīng)預(yù)處理(例如通過用熱和稀硫酸處理)的源自玉米秸桿的纖維素材料。序列同一性:參數(shù)“序列同一性”描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277),優(yōu)選5.0.0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來測定。使用的參數(shù)為缺口罰分(gappenalty)10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性(longestidentity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為同一性百分比，并計(jì)算如下:(同樣的殘基X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,見上文)，優(yōu)選5.0.0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，見上文)來測定。使用的參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為同一性百分比，并計(jì)算如下:(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))亞序列:術(shù)語“亞序列(subsequence)”意指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有生物活性的片段。變體:術(shù)語“變體”意指在一個(gè)或多個(gè)位置包含一個(gè)或多個(gè)(例如幾個(gè))氨基酸改變，即取代、插入和/或缺失的殼多糖結(jié)合蛋白。取代意指將占據(jù)某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入意指在鄰接占據(jù)某位置的氨基酸之后添加氨基酸。木聚糖降解活性或木聚糖分解活性:術(shù)語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物學(xué)活性。兩種測定木聚糖分解活性的基礎(chǔ)方法包括:(I)測定總木聚糖分解活性，和(2)測定單獨(dú)的木聚糖分解活性(例如內(nèi)切木聚糖酶、β_木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醒酸酯酶(ct-glucuronylesterase))。最近在木聚糖分解酶測定法的進(jìn)展總結(jié)于幾個(gè)公開文獻(xiàn)中，包括Biely和Puchard,Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFood和Agriculture86(11):1636-1647;Spanikova和Biely,2006,Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophyllumcommune,FEBSLetters580(19):4597-4601;Herrmann等,1997,Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta-D-xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321:375—381。總木聚糖降解活性可通過確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測量，所述木聚糖包括例如燕麥小麥(oatspelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價(jià)染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測量。最常見的總木聚糖分解活性測定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖，如Bailey等，1992，Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在37°C在0.01%TRITON?X-100和200mM磷酸鈉緩沖液PH6中來確定。一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6在200mM磷酸鈉pH6緩沖液中從作為底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾天青精。就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測量由木聚糖降解酶在下述通常條件下造成的樺木木聚糖(SigmaChemicalC0.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加來確定的:1ml反應(yīng)液，5mg/ml底物(總固形物),5mg木聚糖分解蛋白質(zhì)/g底物，50mM乙酸鈉，pH5,50°C,24小時(shí)，如Lever,1972，Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用對羥基苯甲酸酸餅(PHBAH)測定法進(jìn)行糖分析。木聚糖酶:術(shù)語“木聚糖酶”意指1，4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(I,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8),其催化木聚糖中I,4_β-D-木糖苷鍵的內(nèi)切水解。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物，在0.0I%TRITON?X-100和200mM磷酸鈉緩沖液中、pH6、37°C確定的。一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6在200mM磷酸鈉pH6緩沖液中從作為底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾天青精。在本文中，提及“約”某值或參數(shù)包括了涉及該值或參數(shù)本身的方面。舉例而言，提及“約X”的描述包括了“X”的方面。如用于本文中和所附權(quán)利要求中，除非上下文明確地表示相反，單數(shù)形式“一(個(gè)/種...)&)”或“所述/該(the)”包括了對復(fù)數(shù)的提及。應(yīng)理解本文中所述的發(fā)明的各方面包括了“由…組成(consisting)”和/或“基本上由…組成(consistingessentiallyof)，，的方面。除非另行定義或上下文明確指出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含意。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及降解或轉(zhuǎn)化經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)的方法和發(fā)酵生物質(zhì)的方法等。如本文中所述，用連二亞硫酸鹽溫育經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料顯示增強(qiáng)的糖化產(chǎn)量/產(chǎn)率。此外，將連二亞硫酸鹽添加至發(fā)酵混合物導(dǎo)致糖化的糖至乙醇的發(fā)酵增強(qiáng)。因此，在一個(gè)方面，為降解經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)材料的方法，其包括:(a)用連二亞硫酸鹽溫育經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料；和(b)用包含一種或多種纖維素酶的酶組合物糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料。步驟(a)和(b)可全部或部分以任何順序和/或可同時(shí)進(jìn)行。例如，溫育用連二亞硫酸鹽預(yù)處理的纖維素材料可發(fā)生在糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料之前。在此情況下，在糖化之前可能溫育已完成(例如，全部或部分去除所述連二亞硫酸鹽)，或溫育可在糖化過程中繼續(xù)進(jìn)行(例如在糖化過程中，連二亞硫酸鹽留存在經(jīng)預(yù)處理的纖維素混合物中)。在一個(gè)方面，溫育用連二亞硫酸鹽預(yù)處理的纖維素材料進(jìn)行至少30分鐘，例如至少I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)或24小時(shí)，然后糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料。在一個(gè)方面，所述連二亞硫酸鹽在糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料步驟的過程中存在。在另一個(gè)方面，溫育和糖化同時(shí)開始和結(jié)束(例如，包含一種或多種纖維素酶的酶組合物亦包含連二亞硫酸鹽，并直接加入經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料中)。在另一個(gè)方面，在糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料步驟之前從經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料去除大部分的連二亞硫酸鹽。在另一個(gè)方面，為產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:(a)用包含一種或多種纖維素酶的酶組合物糖化纖維素材料(經(jīng)預(yù)處理或未經(jīng)預(yù)處理的)；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物在連二亞硫酸鹽存在下發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料；和(C)從(b)回收發(fā)酵產(chǎn)物。在產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的一些方面，糖化纖維素材料在發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料之前和/或同時(shí)(全部或部分)進(jìn)行。例如，糖化纖維素材料可在發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料開始之前開始和結(jié)束；或可在發(fā)酵開始之前開始，然后在發(fā)酵過程中繼續(xù)進(jìn)行。在一個(gè)方面，糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料進(jìn)行至少12小時(shí)，例如至少I日，2日，或5日，然后發(fā)酵開始。根據(jù)上述方法使用的連二亞硫酸鹽(S2O42O可為任何合適形式的連二亞硫酸鹽，并可為任何合適的濃度。例如，在一個(gè)方面，所述連二亞硫酸鹽可為連二亞硫酸鈉的形式。在溫育過程中合適濃度的非限定性實(shí)例包括，例如約0.1%至約5%，如約0.5%至4%，1%至3%，或約2%(w/w)，這基于所述連二亞硫酸鹽(例如Na2S2O4)的重量相比于經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料的干重量。在發(fā)酵過程中合適濃度的非限定性實(shí)例包括，例如約0.1%至約3%，如約0.5%M2%,0.75%至1.5%，或約1%(w/w)。在產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的一些方面，所述方法進(jìn)一步包括用連二亞硫酸鹽溫育預(yù)處理的纖維素材料在糖化纖維素材料之前和/或同時(shí)進(jìn)行。在溫育過程中的連二亞硫酸鹽濃度可為如上所述的任何合適濃度。在一些方面，所述連二亞硫酸鹽在溫育中處于較高濃度(例如約2%(w/w))，然后在發(fā)酵中減少至較低濃度(例如約I%(w/w))。在這些方面的一些中，所述較高濃度降低至少10%，例如至少15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，或95%。溫育用連二亞硫酸鹽預(yù)處理的纖維素材料可在任何合適溫度進(jìn)行，例如在約25°C至約85°C，例如351:至801:，451:至75°C，50°C至70°C，55°C至65°C，或約60°C進(jìn)行；且可進(jìn)行任何合適量的時(shí)間，如至少30分鐘，例如至少I小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，或24小時(shí)，或約30分鐘至24小時(shí)，或約I小時(shí)至16小時(shí)。預(yù)處理。經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料可例如通過化學(xué)預(yù)處理、物理預(yù)處理，或化學(xué)預(yù)處理和物理預(yù)處理進(jìn)行預(yù)處理，如下所述。在一個(gè)方面，所述經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料通過化學(xué)預(yù)處理進(jìn)行預(yù)處理。在另一個(gè)方面，所述經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料通過物理預(yù)處理進(jìn)行預(yù)處理。在另一個(gè)方面，所述經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料通過化學(xué)預(yù)處理和物理預(yù)處理進(jìn)行預(yù)處理。在一些方面，所述經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料是經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何預(yù)處理工藝破壞植物細(xì)胞壁的纖維素材料組分(Chandra等,2007,Substratepretreatment:Thekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics?Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93；GalbeandZacchi,2007,Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65；HendriksandZeeman,2009,Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.100:10-18;Mosier等,2005,Featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.96:673-686;TaherzadehandKarimi,2008,Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview,Int.J.0fMol.Sc1.9:1621-1651；YangandWyman,2008,Pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.2:26-40)。纖維素材料也可以在預(yù)處理之前使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行粒度減小、預(yù)浸泡、潤濕、洗漆或調(diào)理(conditioning)。常規(guī)的預(yù)處理包括但不限于，蒸汽預(yù)處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、堿性預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機(jī)溶劑預(yù)處理和生物預(yù)處理。其它預(yù)處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界!120、臭氧、和Y輻射預(yù)處理?？梢栽谒夂?或發(fā)酵之前預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理優(yōu)選在水解前進(jìn)行?；蛘?，預(yù)處理可以與酶水解同時(shí)進(jìn)行以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟本身使一些纖維素材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。蒸汽預(yù)處理。在蒸汽預(yù)處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細(xì)胞壁成分，包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，使酶可接觸纖維素和其它級分，例如，半纖維素。將纖維素材料經(jīng)過或通過反應(yīng)容器，其中注入蒸汽以增加溫度至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應(yīng)時(shí)間。蒸汽預(yù)處理優(yōu)選在140-230°C，例如160-200°C，或170-190°C進(jìn)行，其中最優(yōu)的溫度范圍依賴于任何化學(xué)催化劑的添加。蒸汽預(yù)處理的停留時(shí)間可為1-15分鐘，例如3-12分鐘，或4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時(shí)間依賴于溫度范圍和化學(xué)催化劑的添加。蒸汽預(yù)處理允許相對較高的固體加載量，使纖維素材料在預(yù)處理過程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后的物質(zhì)的爆炸放料(explosivedischarge)組合，這稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和物質(zhì)的湍流，以通過破碎增加可接觸的表面積(Duff和Murray,1996,BioresourceTechnology855:1-33；Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美國專利申請N0.2002/0164730)。在蒸汽預(yù)處理過程中，切割半纖維素乙?；鶊F(tuán)，并且得到的酸自催化半纖維素部分水解成為半纖維素單糖和半纖維素寡糖，其變得更加可溶。去除木質(zhì)素僅有限的程度。所得的液劑主要含有溶解的半纖維素材料(例如半纖維素單糖和半纖維素寡糖)，其中剩余的固形物主要由纖維素材料組成。經(jīng)常在蒸汽預(yù)處理之前加入催化劑如H2SO4或SO2(通常0.3至3%w/w)，其可減少時(shí)間，降低溫度，增加回收率，并改進(jìn)酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523;Sassner等.,2006,EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)?；瘜W(xué)預(yù)處理:術(shù)語“化學(xué)處理”指能促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/或釋放的任何化學(xué)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理工藝的實(shí)例包括例如稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)、和有機(jī)溶劑預(yù)處理。在稀酸預(yù)處理中，將纖維素材料與稀酸(通常是&504)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時(shí)間后閃變至大氣壓?？梢杂煤芏喾磻?yīng)器設(shè)計(jì)進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如，活塞流反應(yīng)器、逆流反應(yīng)器或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器(Duff和Murray,1996，supra;Schell等，2004，BioresourceTechnol.91:179-188;Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。還可以使用堿性條件下的幾種預(yù)處理方法。這些堿預(yù)處理包括，但不限于，石灰預(yù)處理、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨，在85-150°C的低溫進(jìn)行石灰預(yù)處理，停留時(shí)間從I小時(shí)到幾天(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.96:1959-1966；Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673-686)。W02006/11089UW02006/118099,W02006/110900和W02006/110901公開了使用氨的預(yù)處理方法。濕法氧化是熱預(yù)處理，通常在180-200°C進(jìn)行5-15分鐘，加入氧化劑如過氧化氫或過壓氧(Schmidt和Thomsen,1998，BioresourceTechnol.64:139-151;Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預(yù)處理以優(yōu)選1-40%干物質(zhì)，更優(yōu)選2-30%干物質(zhì)，和最優(yōu)選5-20%干物質(zhì)進(jìn)行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始PH常常會(huì)增加。濕法氧化預(yù)處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達(dá)30%的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在預(yù)處理過程中，在一定的停留時(shí)間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結(jié)束預(yù)處理(W02006/032282)。氨纖維爆炸(AFEX)涉及在溫和溫度如90-100°C和高壓如17-20巴，用液體或氣體氨將纖維素材料處理5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達(dá)60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96:219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等，2005,BioresourceTechnol.96:2014-2018)。AFEX預(yù)處理導(dǎo)致纖維素的解聚和半纖維素的部分水解。木質(zhì)素-糖復(fù)合物受切割。有機(jī)溶劑預(yù)處理通過用含水乙醇(40-60%乙醇)在160-200°C提取30-60分鐘而將纖維素材料去木質(zhì)素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851-861;Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。經(jīng)常加入硫酸作為催化劑。在有機(jī)溶劑預(yù)處理中，去除了大部分半纖維素。合適的預(yù)處理方法的其他實(shí)例如Schell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.105-108:69-85,和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686,和美國公開申請2002/0164730所述。在一個(gè)方面，化學(xué)預(yù)處理作為酸處理，如作為連續(xù)稀酸和/或弱酸處理進(jìn)行。酸可為硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸(mildacid)處理在優(yōu)選1_5，更優(yōu)選1_4，和最優(yōu)選1_3的pH范圍進(jìn)行。在一個(gè)方面，酸濃度在優(yōu)選0.01至20wt%酸,更優(yōu)選0.05至10wt%酸,甚至更優(yōu)選0.1至5wt%酸，和最優(yōu)選0.2至2.0wt%酸的范圍。將酸與生物質(zhì)接觸，并在優(yōu)選160-220°C，且更優(yōu)選165-195°C范圍的溫度保持?jǐn)?shù)秒至數(shù)分鐘，例如I秒至60分鐘的時(shí)間。在另一個(gè)方面，預(yù)處理作為氨纖維爆炸步驟(APEX預(yù)處理步驟)進(jìn)行。在另一個(gè)方面，預(yù)處理發(fā)生在含水漿料中。在一個(gè)方面，在預(yù)處理過程中纖維素材料以優(yōu)選10-80wt%，例如20-70wt%*30-60wt%，如約50wt%的量存在。預(yù)處理的纖維素材料可以不洗滌或者使用本領(lǐng)域任何已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。機(jī)械預(yù)處理或物理預(yù)處理:術(shù)語“機(jī)械預(yù)處理”或“物理預(yù)處理”指任何促進(jìn)顆粒大小減少的預(yù)處理。舉例而言，此種預(yù)處理可涉及各種類型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、濕磨或振動(dòng)球磨)。纖維素材料可經(jīng)物理(機(jī)械)和化學(xué)預(yù)處理。機(jī)械或物理預(yù)處理可與下述偶聯(lián):汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸處理、高溫、高壓處理、福射(例如微波福射)，或其組合。在一個(gè)方面，高壓指優(yōu)選約100至約400psi,更優(yōu)選約150至約250psi的范圍的壓強(qiáng)。在另一個(gè)方面，高溫指約100至300°C，優(yōu)選約140至約200°C范圍的溫度。在一個(gè)優(yōu)選的方面，機(jī)械或物理預(yù)處理在使用利用如上所定義的高溫和高壓的蒸汽槍水解器系統(tǒng)(例如來自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer)的分批過程中進(jìn)行。所述物理和化學(xué)預(yù)處理可視需要順序進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面，對纖維素材料進(jìn)行物理(機(jī)械)或化學(xué)預(yù)處理，或者它們的任何組合，以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。生物預(yù)處理:術(shù)語“生物預(yù)處理”指可以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從生物質(zhì)材料分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以包括應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物(參見，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E編,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMiIlan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,M.E.,Baker,J.0.,和Overend,R.P.，編,ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.,編,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；01sson和Hahn-HagerdaI,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331;和Vallander和Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。蘯化。在水解(也稱作糖化)步驟中，將纖維素材料，例如經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料水解以將纖維素和半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶組合物以酶法在殼多糖結(jié)合蛋白的存在下進(jìn)行。組合物的酶還可以同時(shí)或順序加入。在所述方法的一些方面，用于糖化的纖維素酶是非細(xì)菌、真核的纖維素酶，如下文所述。酶水解優(yōu)選在容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進(jìn)行。在一個(gè)方面，水解在適于酶的活性，即對于酶最佳的條件下進(jìn)行。水解可以以補(bǔ)料分批或連續(xù)的過程進(jìn)行，其中將經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料(底物)逐漸補(bǔ)入，例如，含酶的水解溶液中。糖化通常在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中在受控的pH、溫度和混合條件下進(jìn)行。合適的處理時(shí)間、溫度和pH條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如,糖化可持續(xù)長達(dá)200小時(shí)，例如約12至約96小時(shí)，約16至約72小時(shí)，或約24至約48小時(shí)。在一個(gè)方面，糖化進(jìn)行至少12小時(shí)，例如至少24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)或72小時(shí)。糖化過程中的溫度可為約25°C至約75°C，例如約30°C至約70°C，約35°C至約65°C，約40°C至60°C，約45°C至約55°C，或約50°C的范圍。糖化過程中的pH可為約3.0至7.0，例如3.5至6.5，4.0至6.0，4.5至5.5，或約5.0的范圍。在一些方面，糖化過程中的干固形物含量(例如纖維素材料中的總固形物)為少于約25wt%,20wt%,15wt%,IOwt%,7.5wt%,5wt%,2.5wt%,2wt%,Iwt%,或0.5wt%。在一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的蛋白:纖維素酶、具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。在另一個(gè)方面，所述纖維素酶為優(yōu)選一種或多種(幾種)選自下組的酶:內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述半纖維素酶為優(yōu)選一種或多種(幾種)選自下組的酶:乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶和一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶:纖維素分解酶和半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含纖維二糖水解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含β-葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步內(nèi)切葡聚糖酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含纖維二糖水解酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含β-葡糖苷酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述酶組合物包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，優(yōu)選GH61多肽，其與連二亞硫酸鹽在纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化中起協(xié)同作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，優(yōu)選GH61多肽，構(gòu)成本發(fā)明的方法中使用的酶組合物的0.1至15%，優(yōu)選0.5至10%，更優(yōu)選0.5至7%。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含乙酰木聚糖酯酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含阿拉伯聚糖酶(例如a-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含香豆酸酯酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含阿魏酸酯酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含葡糖醛酸糖苷酶(例如α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含葡糖醛酸酯酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含甘露聚糖酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含甘露糖苷酶(例如β_甘露糖苷酶)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含木聚糖酶。在一個(gè)方面，所述木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一個(gè)方面,所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含棒曲霉素。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含酯酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含漆酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含木質(zhì)素分解酶。在一個(gè)方面，所述木質(zhì)素分解酶是錳過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述木質(zhì)素分解酶是木質(zhì)素過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述木質(zhì)素分解酶是產(chǎn)生H2O2的酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含果膠酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含過氧化物酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含蛋白酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含膨脹素。在本發(fā)明的方法中，酶可在發(fā)酵之前或過程中，例如在糖化過程中，或在發(fā)酵微生物繁殖過程中或之后添加。所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分可為野生型蛋白、重組蛋白或野生型蛋白和重組蛋白的組合。舉例而言，一種或多種(幾種)組分可為細(xì)胞的天然蛋白，其用作宿主細(xì)胞以重組表達(dá)酶組合物的一種或多種(幾種)其他組分。酶組合物的一種或多種(幾種)組分可作為單組分產(chǎn)生，然后將其組合以形成酶組合物。所述酶組合物可為多組分和單組分蛋白制備物的組合。用于本發(fā)明方法中的酶可為任何適用于本文中所述工藝的形式，如例如去除或不去除細(xì)胞的發(fā)酵液配制物，含或不含細(xì)胞碎片的細(xì)胞裂解液，半純化或純化的酶制備物，或宿主細(xì)胞，作為酶的來源。所述酶組合物可為干粉或顆粒，無粉塵的顆粒，液體，穩(wěn)定化液體或穩(wěn)定化受保護(hù)的酶。液體酶制備物可根據(jù)確立的工藝，例如通過添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機(jī)酸來穩(wěn)定化。酶和最適量取決于幾個(gè)因素，其包括但不限于，組分酶的混合物、纖維素材料的濃度、纖維素材料的預(yù)處理、溫度、時(shí)間、PH和包括發(fā)酵生物體(例如，同步糖化和發(fā)酵的酵母)。在一個(gè)方面，在發(fā)酵過程中所述一種或多種(幾種)纖維素酶的有效量是約0.5至約50mg,例如約0.5至約40mg,約0.5至約25mg,約0.75至約20mg,約0.75至約15mg,約0.5至約IOmg,或約2.5至約IOmg每g纖維素材料。在另一個(gè)方面,在糖化過程中所述一種或多種(幾種)纖維素酶的總濃度為至少約0.005mg/mL,例如至少約0.01mg/mL,0.05mg/mL,0.075mg/mL,0.lmg/mL,0.2mg/mL,0.3mg/mL,0.4mg/mL,0.5mg/mL,0.6mg/mL,0.7mg/mL,0.8mg/mL,0.9mg/mL,1.0mg/mL,1.lmg/mL,1.2mg/mL,1.3mg/mL,1.4mg/mL,1.5mg/mL,1.6mg/mL,1.7mg/mL,1.8mg/mL,1.9mg/mL,2.0mg/mL,2.5mg/mL,3.0mg/mL,或5.0mg/mL。在另一個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的有效量是約0.005至約1.0g,例如約0.01至約1.0g,約0.15至約0.75g,約0.15至約0.5g,約0.1至約0.5g,約0.1至約0.25g，或約0.05至約0.2g每g纖維素分解酶。具有纖維素分解酶活性或半纖維素分解酶活性的多肽，以及其它可用于纖維素材料的降解的蛋白/多肽，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽(下文中稱為具有酶活性的多肽)可源自或獲得自任何合適的來源，包括細(xì)菌、真菌、酵母、植物或哺乳動(dòng)物來源。術(shù)語“獲得”在本文中意指所述酶已從將該酶作為天然酶天然產(chǎn)生的生物分離。術(shù)語“獲得”在本文中還意指該酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重組產(chǎn)生,其中經(jīng)重組產(chǎn)生的酶對于宿主生物是天然的或外源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，具有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶，其為天然氨基酸序列的片段和/或突變體或通過本領(lǐng)域已知的氨基酸改組方法產(chǎn)生的酶。天然酶的含義中涵蓋的是天然變體，而外來酶的含義中涵蓋的是重組(如通過定位誘變或重排)獲得的變體。具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可為細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可為具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的革蘭氏陽性細(xì)菌多肽例如具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽抱桿菌屬(Oceanobacillus)多肽；或具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、或脲原體屬(Ureaplasma)多妝。在一個(gè)方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個(gè)方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個(gè)方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(StreptomycesIividans)多月太。具有酶活性的多肽亦可為真菌多肽，且更優(yōu)選為酵母多肽如具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yairowia)多肽；或更優(yōu)選地為絲狀真菌多肽如具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、德抱屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、把齒菌屬(Irpex)、蘑燕屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、柱頂抱屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳燕屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在一個(gè)方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一個(gè)方面，所述多肽是具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的解纖維枝頂抱霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、白把齒菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無色梭抱殼(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimet1、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium)、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長枝木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)、或綠色木霉(Trichodermaviride)多妝。還可以使用具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽的經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分可以是重組組分，亦即，通過克隆編碼所述單獨(dú)組分的DNA序列并隨后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并在宿主中表達(dá)(參見，例如，W091/17243和W091/17244)產(chǎn)生。所述宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對宿主是外來的)，但該宿主在一定條件下也可以是同源宿主(酶對宿主是天然的)。單組分纖維素分解蛋白還可以通過從發(fā)酵液中提純這樣的蛋白質(zhì)來制備。在一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含商業(yè)性纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)的纖維素分解酶制備物的實(shí)例包括，例如，CELLIC?CTec(NovozymesA/S)、CELLIC?CTec2(NovozymesA/S)CELLUCLAST?(NovozymesA/S)、NOVOZYMtmI88(NovozymesA/S)、CELLUZYME?(NovozymesA/S)、CEREFLO?(NovozymesA/S)和ULTRAFLO?(NovozymesA/S)，ACCELERASE?(GenencorInt.),LAMINEX?(GenencorInt.)、SPEZYME?CP(GenencorInt.)，R0HAMENT?7069ff(RohmGinbH)，F(xiàn)IBREZYME?LDI(DyadicInternational,Inc.)、FIBREZYME?LBR(DyadicInternational,Inc.)或VISCOSTAR?150L(DyadicInternational,Inc.)。所述纖維素酶以約0.001至約5.0wt%的固體,更優(yōu)選約0.025至約4.0wt%的固體,和最優(yōu)選約0.005至約2.0wt%的固體的有效量添加。所述纖維素酶以約0.001至約5.0wt%的固體，更優(yōu)選約0.025至約4.0wt%的固體，和最優(yōu)選約0.005至約2.0wt%的固體的有效量添加。可以用于本發(fā)明的方法的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(W091/05039;W093/15186;美國專利5，275，944；W096/02551;美國專利5，536，655，W000/70031,W005/093050);Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶III(W005/093050)；和Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶V(W005/093050)。可以用于本發(fā)明的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253-263，里氏木霉Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶I(GENBANK?登錄號(hào)M15665；SEQIDNO:2);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene63:11-22)，里氏木霉Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶II(GENBANK?登錄號(hào)M19373;SEQIDN0:4);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Okada等，1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563;GENBANK?登錄號(hào)AB003694;SEQIDNO:6);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiologyl3:219-228;GENBANK?登錄號(hào)Z33381;SEQIDNO:8);棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearchl8:5884);川地曲霉(Aspergilluskawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435-439);胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9-14);尖鍵孢內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號(hào)L29381);灰腐質(zhì)霉thermoidea變種內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號(hào)AB003107)；Melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號(hào)MAL515703);粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號(hào)XM_324477);特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V(SEQIDNO:10);嗜熱毀絲霉CBS117.65內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO:14);擔(dān)子菌綱(basidiomycete)CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO:16);土生梭孢霉NRRL8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO:18);土生梭孢霉NRRL8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO:20)；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO:22);土生梭孢霉NRRL8126CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO:24);土生梭孢霉NRRL8126CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO:26)；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO:28);以及里氏木霉菌株N0.VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO:30;GENBANK?登錄號(hào)M15665)。如上所述的內(nèi)切葡聚糖酶SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24,SEQIDNO:26,SEQIDN0:28JPSEQIDNO:30分別由成熟多肽編碼序列SEQIDNO:1，SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDNO:9，SEQIDNO:11，SEQIDNO:13,SEQIDNO:15,SEQIDNO:17,SEQIDNO:19,SEQIDNO:21,SEQIDNO:23,SEQIDNO:25，SEQIDNO:27JPSEQIDNO:29編碼?？捎糜诒景l(fā)明的纖維二糖水解酶的實(shí)例包括但不僅限于，里氏木霉纖維二糖水解酶I(SEQIDNO:32);里氏木霉纖維二糖水解酶II(SEQIDNO:34);特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶I(SEQIDNO:36);嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶II(SEQIDNO:38和SEQIDNO:40);土生梭孢霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)(SEQIDNO:42);嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)纖維二糖水解酶I(SEQIDNO:44);和嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶II(SEQIDNO:46)，煙曲霉纖維二糖水解酶I(SEQIDNO:48)，和煙曲霉纖維二糖水解酶II(SEQIDN0:50)。上述的纖維二糖水解酶SEQIDN0:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36,SEQIDNO:38,SEQIDNO:40,SEQIDNO:42,SEQIDNO:44,SEQIDNO:46,SEQIDN0:48JPSEQIDNO:50分別由成熟多肽編碼序列SEQIDN0:31,SEQIDN0:33,SEQIDN0:35,SEQIDN0:37,SEQIDNO:39,SEQIDN0:41,SEQIDN0:43,SEQIDN0:45,SEQIDN0:47，和SEQIDNO:49編碼?？捎糜诒景l(fā)明的β_葡糖苷酶的實(shí)例包括但不僅限于米曲霉β_葡糖苷酶(SEQIDNO:52);煙曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDNO:54);巴西青霉ΙΒΤ20888β-葡糖苷酶(SEQIDNO:56);黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDNO:58);和棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDΝ0:60)。上述的β_葡糖苷酶SEQIDNO:52，SEQIDNO:54，SEQIDNO:56，SEQIDNO:58JPSEQIDNO:60分別由成熟多肽編碼序列SEQIDN0:51,SEQIDN0:53,SEQIDN0:55,SEQIDNO:57，和SEQIDNO:59編碼。其它可用于本發(fā)明的葡糖苷酶的實(shí)例包括SEQIDΝ0:62的米曲霉β-葡糖苷酶變體融合蛋白或SEQIDNO:64的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。SEQIDNO:62和SEQIDNO:64的β-葡糖苷酶融合蛋白分別由SEQIDNO:61和SEQIDNO:63編碼。米曲霉葡糖苷酶可根據(jù)W02002/095014獲得。煙曲霉葡糖苷酶可根據(jù)W02005/047499獲得。巴西青霉β-葡糖苷酶可根據(jù)W02007/019442獲得。黑曲霉β-葡糖苷酶可根據(jù)Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980獲得。棘孢曲霉β-葡糖苷酶可根據(jù)Kawaguchi等，1996，Genel73:287-288獲得。所述β_葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一個(gè)方面，所述β_葡糖苷酶是根據(jù)W02008/057637的米曲霉β-葡糖苷酶變體BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。其它可用的內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β_葡糖苷酶公開于使用根據(jù)Henrissat,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat和Bairoch,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696的分類的許多糖基水解酶家族中。其它可用于本發(fā)明的纖維素分解酶描述于EP495，257，EP531，315，EP531，372，W089/09259,W094/07998,W095/24471,W096/11262,W096/29397,W096/034108,W097/14804,W098/08940,W098/012307,W098/13465,W098/015619,W098/15633,W098/28411，W099/06574，W099/10481,W099/25846,W099/25847,W099/31255,W000/09707,W002/50245,W02002/076792,W02002/101078,W02003/027306,W02003/052054,W02003/052055,W02003/052056,W02003/052057,W02003/052118,W02004/016760,W02004/043980,W02004/048592,W02005/001065,W02005/028636,W02005/093050,W02005/093073,W02006/074005,W02006/117432,W02007/071818,W02007/071820,W02008/008070,W02008/008793,U.S.PatentN0.4，435，307，美國專利號(hào)5，457，046，美國專利號(hào)5，648，263，美國專利號(hào)5，686，593，美國專利號(hào)5，691，178，美國專利號(hào)5，763，254，和美國專利號(hào)5，776，757。在本發(fā)明的方法中，可使用任何具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽。在第一個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含下述基序:[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[Fff]-[TF]-K-[AIV]，其中X為任意氨基酸，X(4，5)為在4或5個(gè)連續(xù)位置上的任意氨基酸，而X(4)是在4個(gè)連續(xù)位置上的任意氨基酸。包含上述所示的基序的多肽可進(jìn)一步包含:H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV],[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或H-X(1，2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，其中X為任意氨基酸，X(1，2)為在I個(gè)位置或2個(gè)連續(xù)位置上的任意氨基酸，X(3)為3個(gè)連續(xù)位置上的任意氨基酸，而X(2)為2個(gè)連續(xù)位置上的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認(rèn)的IUPAC單字母氨基酸縮寫。在一個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽還包含H-X(l,2)-G-P-X(3)-[Yff]-[AILMV]0在另一個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽還包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽還包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X⑵-C_X_[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在第二個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含下述基序:[ILMV]-P-x(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-χ(3)-A-[HNQ]，其中X為任意氨基酸，χ(4，5)為在4或5個(gè)連續(xù)位置上的任意氨基酸，而χ(3)為3個(gè)連續(xù)位置上的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認(rèn)的IUPAC單字母氨基酸縮寫。在第三個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDN0:66,SEQIDN0:68,SEQIDNO:70,SEQIDN0:72,SEQIDNO:74,SEQIDNO:76，SEQIDNO:78，SEQIDNO:80，SEQIDNO:82，SEQIDNO:84，SEQIDNO:86，SEQIDNO:88,SEQIDNO:90，SEQIDNO:92，SEQIDNO:94，SEQIDNO:96，SEQIDNO:98，SEQIDNO:100，SEQIDNO:102，SEQIDNO:104，SEQIDNO:106，SEQIDNO:108，SEQIDNO:110,SEQIDNO:112，SEQIDNO:114，SEQIDNO:116，SEQIDNO:118，SEQIDNO:120，SEQIDNO:122,SEQIDNO:124,SEQIDNO:126，或SEQIDNO:128的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%或至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的同一'I"生。在第四個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少非常低嚴(yán)格條件下，例如至少低嚴(yán)格條件，至少中等嚴(yán)格條件，至少中等-高嚴(yán)格條件，至少高嚴(yán)格條件，或至少非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交:(i)SEQIDNO:65,SEQIDN0:67,SEQIDNO:69,SEQIDN0:71,SEQIDNO:73,SEQIDNO:75,SEQIDNO:77,SEQIDNO:79,SEQIDN0:81,SEQIDNO:83,SEQIDNO:85,SEQIDNO:87,SEQIDNO:89,SEQIDN0:91,SEQIDNO:93,SEQIDNO:95,SEQIDNO:97,SEQIDNO:99,SEQIDNO:101,SEQIDNO:103,SEQIDNO:105,SEQIDNO:107,SEQIDNO:109,SEQIDN0:111,SEQIDNO:113，SEQIDNO:115，SEQIDNO:117，SEQIDNO:119，SEQIDNO:121，SEQIDNO:123，SEQIDNO:125，或SEQIDNO:127的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQIDNO:71,SEQIDNO:73,SEQIDN0:75,或SEQIDNO:79的成熟多肽編碼序列的cDNA序列，或SEQIDNO:65，SEQIDNO:67，SEQIDNO:69,SEQIDNO:77,SEQIDN0:81,SEQIDNO:83,SEQIDNO:85,SEQIDNO:87,SEQIDNO:89,SEQIDN0:91,SEQIDNO:93，SEQIDNO:95，SEQIDNO:97，SEQIDNO:99，SEQIDNO:101,SEQIDNO:103,SEQIDNO:105,SEQIDNO:107,SEQIDNO:109,SEQIDNO:111，SEQIDN0:113,SEQIDNO:115，SEQIDNO:117，SEQIDNO:119，SEQIDNO:121，SEQIDNO:123,SEQIDN0:125，或SEQIDNO:127的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i),(ii)或(iii)的全長互補(bǔ)鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatus，1989，見上文^SEQIDNO:65，SEQIDNO:67，SEQIDNO:69，SEQIDNO:71，SEQIDNO:73,SEQIDNO:75,SEQIDNO:77,SEQIDNO:79,SEQIDN0:81,SEQIDN0:83,SEQIDNO:85,SEQIDNO:87,SEQIDNO:89,SEQIDN0:91,SEQIDNO:93,SEQIDNO:95,SEQIDN0:97,SEQIDN0:99,SEQIDNO:101,SEQIDNO:103,SEQIDNO:105,SEQIDNO:107，SEQIDNO:109，SEQIDNO:111，SEQIDN0:113,SEQIDNO:115，SEQIDNO:117，SEQIDNO:119，SEQIDNO:121，SEQIDNO:123，SEQIDNO:125，或SEQIDNO:127的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸，或優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)的核苷酸。而且，所述亞序列可編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽片段。在第五個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為(consistingof)核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:65,SEQIDN0:67,SEQIDNO:69,SEQIDNO:71,SEQIDNO:73,SEQIDNO:75,SEQIDNO:77,SEQIDNO:79,SEQIDN0:81，SEQIDNO:83,SEQIDNO:85,SEQIDNO:87,SEQIDNO:89,SEQIDN0:91,SEQIDN0:93,SEQIDN0:95,SEQIDN0:97,SEQIDN0:99,SEQIDNO:101，SEQIDNO:103,SEQIDNO:105,SEQIDNO:107,SEQIDNO:109,SEQIDNO:111，SEQIDNO:113，SEQIDNO:115，SEQIDNO:117，SEQIDNO:119，SEQIDN0:121,SEQIDNO:123，SEQIDNO:125，或SEQIDNO:127的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的同一性程度。在第六個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是人工變體，其包含SEQIDNO:66，SEQIDNO:68，SEQIDNO:70，SEQIDNO:72，SEQIDNO:74，SEQIDNO:76，SEQIDNO:78，SEQIDNO:80，SEQIDNO:82，SEQIDNO:84，SEQIDNO:86，SEQIDNO:88，SEQIDNO:90，SEQIDNO:92，SEQIDNO:94,SEQIDNO:96，SEQIDNO:98，SEQIDNO:100，SEQIDNO:102，SEQIDNO:104，SEQIDNO:106，SEQIDNO:108，SEQIDNO:110，SEQIDN0:112,SEQIDNO:114，SEQIDNO:116，SEQIDNO:118，SEQIDNO:120，SEQIDNO:122，SEQIDNO:124，SEQIDN0:126，或SEQIDNO:128的成熟多肽或其同源序列的一個(gè)或多個(gè)(或幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入。優(yōu)選地，氨基酸改變?yōu)樾再|(zhì)上較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為I至約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi):堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。或者，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改善多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸掃描誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且就纖維素分解增強(qiáng)活性測試所得突變分子以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù):如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；fflodaver等，1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份也可從與相關(guān)于親本多肽的多肽的同一性分析來推斷?？墒褂靡阎恼T變、重組和/或改組方法，然后進(jìn)行相關(guān)的篩選過程，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988，Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156；W095/17413；或者W095/22625所公開的那些，進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并加以測試。其他可使用的方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如Lowman等，1991,Biochemistry30:10832-10837;美國專利號(hào)5,223,409；W092/06204)和區(qū)域定向誘變(region-directedmutagenesis)(Derbyshire等，1986，Gene46:145;等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法可與高通量、自動(dòng)篩選方法組合以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的經(jīng)克隆、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnologyl7:893-896)。編碼活性多肽的經(jīng)誘變的DNA分子可自宿主細(xì)胞回收并使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法迅速測序。這些方法允許快速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。SEQIDNO:66，SEQIDNO:68，SEQIDNO:70，SEQIDNO:72，SEQIDNO:74,SEQIDNO:76,SEQIDNO:78,SEQIDNO:80，SEQIDNO:82，SEQIDNO:84,SEQIDNO:86，SEQIDNO:88，SEQIDNO:90，SEQIDNO:92，SEQIDNO:94，SEQIDNO:96，SEQIDNO:98，SEQIDNO:100，SEQIDNO:102，SEQIDNO:104，SEQIDNO:106，SEQIDNO:108，SEQIDNO:110，SEQIDNO:112，SEQIDNO:114，SEQIDNO:116，SEQIDNO:118，SEQIDNO:120，SEQIDNO:122，SEQIDNO:124,SEQIDNO:126，或SEQIDNO:128的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不超過4，例如1、2、3或4。在一個(gè)方面，所述一種或多種(例如幾種)半纖維素分解酶包含商業(yè)性半纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)性半纖維素分解酶制備物的實(shí)例包括，例如SHEARZYME?(NovozymesA/S)、CELLIC?HTec(NovozymesA/S)、CELLIC?HTec2(NovozymesA/S)>VISGOZYIVIEXE)(NovozymesA/S)>ULTRAFLO?(NovozymesA/S)>PULPZYME?HG(Novc)ZymesA/S)>MULTIFECT?Xylanase(Genencor)>ECOPULP?TX-200A(ABEnzymes)、HSP6000Xylanase(DSM)、DEP0L?333P(BiocatalystsLimit,Wales,UK),DEP0L?740L(BiocatalystsLimit,WaIes,UK)和DEP0L?762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)?？捎糜诒景l(fā)明方法的木聚糖酶的實(shí)例包括但不限于棘孢曲霉木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790；W094/21785,xyl3SEQIDNO:129[DNA序列]和SEQIDN0:130[推導(dǎo)的氨基酸序列])，和土生梭孢霉NRRL8126(W02009/079210)木聚糖酶?？捎糜诒景l(fā)明方法的β_木糖苷酶的實(shí)例包括但不限于里氏木霉β_木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登錄號(hào)Q92458；SEQIDNO:131[DNA序列]和SEQIDNO:132[推導(dǎo)的氨基酸序列])，埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登錄號(hào)Q8X212),粗糙脈孢霉(SwissProt登錄號(hào)Q7S0W4)，和煙曲霉β-木糖苷酶(Uniprot登錄號(hào)Q0H905；SEQIDNO:133[DNA序列]和SEQIDNO:134[推導(dǎo)的氨基酸序列])?？捎糜诒景l(fā)明方法的乙酰木聚糖酯酶的實(shí)例包括但不限于紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)乙酰木聚糖酯酶(W02005/001036),粗糙脈孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登錄號(hào)q7s259)，土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(W02009/042846)，球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號(hào)Q2GWX4),細(xì)麗毛殼菌(Chaetomiumgracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登錄號(hào)AAB82124),穎枯殼針孢(Phaeosphaerianodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號(hào)Q0UHJ1),和特異腐質(zhì)霉DSM1800乙酰木聚糖酯酶(W02009/073709)。可用于本發(fā)明方法的阿魏酸酯酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉DSM1800阿魏酸酯酶(W02009/076122)，粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登錄號(hào)Q9HGR3)，和費(fèi)希新薩托菌(Neosartoryafischer)阿魏酸酯酶(UniProt登錄號(hào)A1D9T4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(W02009/073383)和黑曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登錄號(hào)AAR94170)?？捎糜诒景l(fā)明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的實(shí)例包括但不限于棒曲霉(Aspergillusclavatus)α-葡糖醒酸糖苷酶(UniProt登錄號(hào)alccl2)、里氏木霉α-葡糖醒酸糖苷酶(Uniprot登錄號(hào)Q99024)、埃默森踝節(jié)菌α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登錄號(hào)Q8X211)、黑曲霉ct-葡糖醒酸糖苷酶(Uniprot登錄號(hào)Q96WX9)、土曲霉(Aspergillusterreus)α-葡糖醒酸糖苷酶和煙曲霉ct-葡糖醒酸糖苷酶(SwissProt登錄號(hào)Q4WW45)。用于本發(fā)明方法的酶和蛋白可通過在含有合適碳源和氮源和無機(jī)鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，使用本領(lǐng)域已知方法(參見，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(編)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991)發(fā)酵上述指出的微生物菌株來產(chǎn)生。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商獲得，或可根據(jù)已公開組合物制備(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。適于生長和酶產(chǎn)生的溫度范圍和其他條件在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。所述發(fā)酵可以是任何其結(jié)果為酶表達(dá)或分離的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。因此，發(fā)酵可以理解為包括在合適的培養(yǎng)基中并在允許所述酶得以表達(dá)或分離的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小-或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產(chǎn)生的所得的酶可從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并通過常規(guī)方法純化。發(fā)璧?？赏ㄟ^一種或多種(幾種)能將糖(例如木糖)直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物(例如乙醇)的發(fā)酵微生物發(fā)酵自經(jīng)水解的纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費(fèi)品醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如，發(fā)酵乳產(chǎn)品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且能由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和/或酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料釋放的糖，通過發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為產(chǎn)物，例如，乙醇。如本文中所述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是單獨(dú)或同時(shí)的。在實(shí)施本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料。通常根據(jù)所需發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來選擇所述材料，如本領(lǐng)域中所公知的。術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基?！鞍l(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細(xì)菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是己糖和/或戊糖發(fā)酵生物體，或它們的組合。己糖和戊糖發(fā)酵生物體均在本領(lǐng)域公知。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成所需的發(fā)酵產(chǎn)品?？僧a(chǎn)生乙醇的細(xì)菌和真菌發(fā)酵生物體的實(shí)例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。能發(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬種，優(yōu)選釀酒酵母的菌株。能發(fā)酵C5糖的發(fā)酵生物體的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的C5糖發(fā)酵酵母包括假絲酵母屬，優(yōu)選畢赤酵母屬的菌株，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如樹干畢赤酵母CBS5773的菌株；假絲酵母屬的菌株，優(yōu)選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、蕓薹假絲酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)的菌株。其它發(fā)酵生物包括發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas),如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株；漢遜酵母屬，如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克魯維酵母屬，如馬克斯克魯維酵母、乳酸克魯維酵母(K.1actis)、K.thermotoIerans和脆壁克魯維酵母的菌株；裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)的菌株；大腸桿菌，特別是經(jīng)遺傳修飾以改善乙醇的產(chǎn)量的大腸桿菌的菌株；梭菌屬，如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)和Chlostridiumphytofermentans的菌株；地芽孢桿菌屬菌種的菌株；熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter),如角軍糖熱厭氧桿菌(ThermoanaerobactersaccharoIyticum)的菌株；和芽孢桿菌屬，如凝結(jié)芽孢桿菌的菌株；假絲酵母屬，如Candidasonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假絲酵母、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)、C.naedodendra、C.blanki1、C.entomophilia、蕓薹假絲酵母、假熱帶假絲酵母、博伊丁假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和休哈塔假絲酵母(C.scehatae)的菌株；和克雷伯氏菌屬(Klebsiella),如產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)的菌株。在一個(gè)方面，所述酵母是酵母屬菌種。在另一個(gè)方面，酵母是釀酒酵母。在另一個(gè)方面，所述酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個(gè)方面，所述酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個(gè)方面，所述酵母是克魯維酵母。在另一個(gè)方面，所述酵母是馬克斯克魯維酵母。在另一個(gè)方面，所述酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個(gè)方面，所述酵母是假絲酵母屬。在另一個(gè)方面，所述酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個(gè)方面，所述酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個(gè)方面，所述酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個(gè)方面，所述酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個(gè)更方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)。在另一個(gè)方面,所述酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個(gè)方面,所述酵母是葡萄牙棒孢酵母(ClavisporaIusitaniae)。在另一個(gè)方面,所述酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一個(gè)方面，所述酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個(gè)方面，所述酵母是嗜鞋管囊酵母(Pachysolentannophilus)。在另一個(gè)方面,所述酵母是畢赤酵母。在另一個(gè)方面，所述酵母是樹干畢赤酵母。在另一個(gè)方面，所述酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在另一個(gè)方面，所述酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,inHandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細(xì)菌包括，例如，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、丙酮丁醇梭菌、熱纖維梭菌、Clostridiumphytofermentans、地芽孢桿菌屬菌種、解糖熱厭氧桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌(Philippidis,1996，見上文)。在一個(gè)方面，所述細(xì)菌是發(fā)酵單胞菌。在一個(gè)方面，所述細(xì)菌是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)方面，所述細(xì)菌是梭菌。在另一個(gè)方面，所述細(xì)菌是丙酮丁醇梭菌。在另一個(gè)方面，所述細(xì)菌是地芽孢桿菌屬菌種。在另一個(gè)方面，所述細(xì)菌是解糖熱厭氧桿菌。在另一個(gè)方面，所述細(xì)菌是凝結(jié)芽孢桿菌。適于乙醇產(chǎn)生的商業(yè)上可獲得的酵母包括，例如ETHANOLRED?酵母(可得自Fermentis/Lesaffre,USA),FALI?(可得自Fleischmann，sYeast,USA),SUPERSTART?和THERMOSACC?鮮酵母(可得自EthanolTechnology,WIjUSA)，BIOFERMtmAFT和XR(可得自NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA),GERTSTRAND?(可得自GertStrandAB，Sweden)，和FERM10L?(可得自DSMSpecialties).在一個(gè)方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾，提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通過將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen和Ho，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho等，1998，GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776—783；Walfridsson等，1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALlgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等，2004，MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4:655-664;BealI等，1991，ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等,1998,Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204-214；Zhang等，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis，Science267:240-243;Deanda等，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；W02003/062430,xyloseisomerase)。在一個(gè)方面，所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個(gè)方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個(gè)方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌。在另一個(gè)方面，所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是克魯維酵母屬菌種。本領(lǐng)域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。通常向降解的木素纖維素材料或水解物加入發(fā)酵微生物，并進(jìn)行約8至約96小時(shí)，如約24至約60小時(shí)發(fā)酵。溫度通常為約26°C至約60°C，特別是約32°C或50°C，和在約pH3至約pH8，如約pH4-5、6或7。在一個(gè)方面，對降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并進(jìn)行約12至約96小時(shí)，如通常為24-60小時(shí)發(fā)酵。在一個(gè)方面，溫度為約20°C至約60°C，例如約25°C至約50°C，約32°C至約50°C，并且pH通常為約pH3至約pH7，例如約pH4至7，如約pH5。然而，一些發(fā)酵生物體例如細(xì)菌，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約105-1012，例如約IO7-1Oltl,特別是約2xl08活細(xì)胞計(jì)數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關(guān)于使用酵母進(jìn)行發(fā)酵的進(jìn)一步指導(dǎo)可見于例如“TheAlcoholTextbook”(K.Jacques,Τ.P.Lyons和D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdoml999),其通過提述并入本文。對于乙醇產(chǎn)生，在發(fā)酵之后，將發(fā)酵漿料蒸餾以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可用作，例如燃料乙醇，飲用乙醇，即可飲用的中性含酒精的飲料，或工業(yè)乙醇。發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何方法組合使用，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵工藝，而且特定地，改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率?！鞍l(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長的刺激劑。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-1nositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D和E。參見,例如,Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,Springer-Verlag(2002),其通過提述并入本文。礦物質(zhì)的實(shí)例包括能夠提供營養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。發(fā)酵產(chǎn)物:發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機(jī)酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；燒烴(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；環(huán)烷烴(例如環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)庚烷、和環(huán)辛烷)；烯烴(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；和氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價(jià)值廣品的蛋白質(zhì)。在一個(gè)方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇?？衫斫獾氖?，術(shù)語“醇”包括包含一個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)的物質(zhì)。在一個(gè)方面，所述醇是阿拉伯糖醇。在另一個(gè)方面，所述醇是丁醇。在另一個(gè)方面，所述醇是乙醇。在一個(gè)方面，所述醇是甘油。在另一個(gè)方面，所述醇是甲醇。在另一個(gè)方面，所述醇是1，3-丙三醇。在另一個(gè)方面，所述醇是山梨醇。在另一個(gè)方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong等，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;Silveira和Jonas,2002,Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam和Singh,1995,Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124;Ezeji等，H.P.,2003,Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnologyl9(6):595-603。在另一個(gè)方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是有機(jī)酸。在一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是乙酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是醋酮酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是己二酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是檸檬酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是甲酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是反丁烯二酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是葡糖二酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是葡糖醛酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是戊二酸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是3-羥基丙酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是衣康酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是乳酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是蘋果酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是丙二酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是草酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是丙酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是木糖酸。參見，例如，Chen和Lee，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63—65:435—448。在另一個(gè)方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是酮。應(yīng)理解的是，術(shù)語“酮”涵蓋了含有一個(gè)或多個(gè)酮模塊的酮。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如Qureshi和Blaschek,2003,見上文。在另一個(gè)方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是氨基酸。在一個(gè)方面，所述有機(jī)酸是天冬氨酸。在另一個(gè)方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個(gè)方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個(gè)方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個(gè)方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard和Margaritis,2004，Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501-515。在另一個(gè)方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是烷烴。所述烷烴可為未支化或支化的烷烴。在一個(gè)方面，所述烷烴是戊烷。在另一個(gè)方面，所述烷烴是己烷。在另一個(gè)方面，所述烷烴是庚烷。在另一個(gè)方面，所述烷烴是辛烷。在另一個(gè)方面，所述烷烴是壬烷。在另一個(gè)方面，所述烷烴是癸烷。在另一個(gè)方面，所述烷烴是十一烷。在另一個(gè)方面，所述烷烴是十二烷。在另一個(gè)方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是環(huán)烷烴。在一個(gè)方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)戊烷。在另一個(gè)方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)己烷。在另一個(gè)方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)庚烷。在另一個(gè)方面，所述環(huán)烷烴是環(huán)辛烷。在另一個(gè)方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是烯烴。所述烯烴可為未支化或支化的烯烴。在一個(gè)方面，所述烯烴是戊烯。在另一個(gè)方面，所述烯烴是己烯。在另一個(gè)方面，所述烯烴是庚烯。在另一個(gè)方面，所述烯烴是辛烯。在一個(gè)方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是異戊二烯。在另一個(gè)方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是聚酮化合物。在另一個(gè)方面，所述物質(zhì)是氣體。在一個(gè)方面，所述氣體是甲烷。在另一個(gè)方面，所述氣體是h2。在另一個(gè)方面，所述氣體是co2。在另一個(gè)方面，所述氣體是CO。參見，例如，Kataoka等,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41-47;和Gunaseelan,1997，Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview,BiomassandBioenergy,Vol.13(1-2),83-114。M可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度、蒸餾或提取。例如，通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的甘蔗渣分離并純化醇?？梢垣@得純度高達(dá)約96vol.%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇(即，可飲用的中性含酒精飲料)，或工業(yè)乙醇。水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時(shí)，包括但不限于，分離的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)、分離的水解和共發(fā)酵(SHCF)、混合的水解和共發(fā)酵(HHCF)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。SHF使用分離的處理步驟以首先將纖維素材料酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖，纖維三糖，和戊糖，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，纖維素材料的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵在一個(gè)步驟中組合(Philippidis,G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanol!ProductionandUtilization,Wyman,C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)qSSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan和Himmel,1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy’sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步驟之外，還涉及單獨(dú)的水解步驟，所述步驟可以在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度，即，高溫酶法糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進(jìn)行SSF。DMC在一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))步驟中組合了所有三個(gè)過程(酶產(chǎn)生、水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將纖維素材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的酶(Lynd等，2002，Microbialcelluloseutilization!Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，任何本領(lǐng)域中已知的方法，包括預(yù)處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。常規(guī)設(shè)備包括補(bǔ)料批式攪拌反應(yīng)器、批式攪拌反應(yīng)器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器和/或連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(FernandadeCastilhosCorazza等，2003，Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33-38；Gusakov和Sinitsyn,1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反應(yīng)器(Ryu,S.K.和Lee,J.M.,1983,Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65),或者具有由電磁場引起的強(qiáng)烈攪拌的反應(yīng)器(Gusakov等，1996，Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反應(yīng)器類型包括:流化床、升流層(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或發(fā)酵的擠出機(jī)型的反應(yīng)器。核酸構(gòu)建體編碼多肽，如編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，纖維素分解酶，半纖維素分解酶等的分離的多核苷酸，可以以多種方式操作以提供所述多肽的表達(dá)，即構(gòu)建核酸構(gòu)建體，其包含編碼所述多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸插入載體之前對其序列進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可為啟動(dòng)子序列，其由用于表達(dá)編碼多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞所識(shí)別的多核苷酸。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子:解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖鹿糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)和原核內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:21-25)。另外的啟動(dòng)子在"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于Gilbert等,1980,ScientificAmerican,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,見上文中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明中的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子:構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β_葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動(dòng)子(一種修飾的啟動(dòng)子，其來自在曲霉屬中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在曲霉屬中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代；非限制性實(shí)例包括修飾的啟動(dòng)子，其來自在黑曲霉中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在構(gòu)巢曲霉或米曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從如下的基因獲得:釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動(dòng)子由Romanos等，1992，Yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄。所述終止子序列與編碼所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地連接。在本發(fā)明中，可使用在所選的宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得:構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得:釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)，為對于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的多核苷酸的5’-末端?？墒褂迷谒x的宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)桌曲霉丙糖憐Ife異構(gòu)酶。對于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得:釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與多核苷酸的3’末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識(shí)別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)?？墒褂迷谒x的宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的N端相連的信號(hào)肽，并指導(dǎo)所述多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。多核苷酸的編碼序列5’端可固有地包含信號(hào)肽編碼序列，其與編碼所述多肽的編碼序列的區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?；蛘?，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列外源的信號(hào)肽編碼序列。外源信號(hào)肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號(hào)肽編碼序列時(shí)可為必需的?；蛘?，外源信號(hào)肽編碼序列可簡單地取代天然信號(hào)肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，可使用指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選的宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)妝編碼序列。對于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列:芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號(hào)肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號(hào)肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽N端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母α因子的基因獲得前肽編碼序列。當(dāng)信號(hào)肽和前肽序列二者均存在于多肽N端時(shí)，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽的N端，并且將信號(hào)肽序列置于緊接著前肽序列的N端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、米曲霉TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體上述的多種核苷酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的多核苷酸，例如編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，纖維素分解酶，半纖維素分解酶等的多核苷酸。或者，可以通過在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的核酸構(gòu)建體或多核苷酸來表達(dá)所述多核苷酸。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列可操作地連接以供表達(dá)。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如,質(zhì)粒或病毒)，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘撸d體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。所述載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))選擇性標(biāo)記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來自地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPI和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-憐酸脫羧酶)(orotidine_5’-phosphatedecarboxylase)>sC(硫酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。所述載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的多核苷酸，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，400至10，000堿基對，和800至10，000堿基對，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度序列同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可為任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可為非編碼或編碼的多核苷酸。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator),其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒PBR322、pUC19、pACYC177和PACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβI的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARSI，ARS4,ARSI和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsRes.15:9163-9175;W000/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)粒或載體能夠根據(jù)公開于W000/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得:將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等,1989,見上文)。宿主細(xì)胞包含編碼多肽，例如編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，纖維素分解酶，半纖維素分解酶等的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞可有利地用于所述多肽的重組產(chǎn)生。將包含此種多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入宿主細(xì)胞，使所述載體如前所述作為染色體整合體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括親本細(xì)胞的任何后代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細(xì)胞可以是在多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、地芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬和脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞:例如，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，通過使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，通過電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)或通過接合(參見，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞:例如，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127-6145)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞:例如，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，F(xiàn)oliaMicrobiol.(Praha)49:399-405),通過接合(參見，例如，Mazodier等，1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或通過轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Nat1.Acad.Sc1.USA98:6289-6294)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞:例如，電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或通過接合(參見，例如，Pinedo和Smets,2005，Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞:例如，天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Tmmun.32:1295-1297)，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，通過電穿孔(參見，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或通過接合(參見，例如，Clewell,1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可使用本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的任何方法。宿主細(xì)胞還可為真核生物，如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為真菌細(xì)胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T:子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisbyjsDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如引用于Hawksworth等，1995，見上文，171頁)和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995,見上文)。真菌宿主細(xì)胞可為酵母細(xì)胞。“酵母”用在本文包括產(chǎn)子囊酵母(ascospOTogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(SkinnerF.A.,PassmoreS.M.,和DavenportR.R.,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesN0.9，1980)中所述。酵母宿主細(xì)胞可為假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞，如乳酸克魯維酵母(KluyveromycesIactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)細(xì)胞。真菌宿主細(xì)胞可為絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。絲狀真菌宿主細(xì)胞可為枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂裙菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可為泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬臘菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬錯(cuò)菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium、租金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、熱帶金抱子菌、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、剌序側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、長域毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞?？梢詫⒄婢?xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474以及Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419-1422中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和W096/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母:Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.1.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volumel94,ppl82-187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983，J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1920。產(chǎn)生方法用于產(chǎn)生多肽，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，纖維素分解酶，半纖維素分解酶等的方法，包括:(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個(gè)方面，所述細(xì)胞是曲霉屬的細(xì)胞。在另一個(gè)方面，所述細(xì)胞是煙曲霉?；蛘撸糜诋a(chǎn)生多肽，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽，纖維素分解酶，半纖維素分解酶等的方法，包括:(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。在產(chǎn)生方法中，將所述細(xì)胞使用本領(lǐng)域公知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細(xì)胞裂解物(lysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶測定法(enzymeassay)可用于確定多肽的活性。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽使用本文中所述的方法檢測。所得的培養(yǎng)液可照原樣使用，或多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J._C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。在另一個(gè)方面，不回收多肽，而是使用表達(dá)多肽的宿主細(xì)胞作為所述多肽的來源。本發(fā)明進(jìn)一步通過下述實(shí)施例描述，其不應(yīng)視作對本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例1:玉米秸桿的預(yù)處理將玉米稻桿在U.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory(美國能源部國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室)(NREL)使用1.4%(w/v)硫酸在165°C和107psi預(yù)處理8分鐘。預(yù)處理的玉米秸桿中的不溶于水的固體含有57.5%纖維素，4.6%半纖維素和28.4%木質(zhì)素。通過兩階段硫酸水解,接著通過使用NRELStandardAnalyticalProcedure#002的高效液相色譜分析糖來確定纖維素和半纖維素。木質(zhì)素在用硫酸水解纖維素和半纖維素級分之后使用NRELStandardAnalyticalProcedure#003以重量分析法確定。將經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)(干重量32.35%)在CosmosICMG40濕式多用途研磨機(jī)(EssEmmCorporation,TamilNadu,India)中磨制,然后通過以數(shù)毫升的等分試樣反復(fù)添加IONNaOH來調(diào)整至pH5.0，接著在室溫充分混合和溫育大約I小時(shí)。在4°C過夜溫育之后確認(rèn)pH，并將經(jīng)pH調(diào)整的玉米秸桿在大約120°C蒸汽滅菌20分鐘，然后在4°C儲(chǔ)藏以使得微生物污染風(fēng)險(xiǎn)最小化。經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿的干重量是33%TS(總固形物)，這在每次使用之前確認(rèn)。實(shí)施例2:具有纖維素分解增強(qiáng)活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽的制備桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽根據(jù)W02005/074656在米曲霉JaL250中重組產(chǎn)生。將重組產(chǎn)生的桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽首先通過使用IOkDa膜的超濾來濃縮，緩沖液交換至2OmMTris-HClpH8.0，然后使用2OmLMONOQ丨<柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)以20mMTris-HClpH8.0中的500ml0-600mMNaCl線性梯度來純化?；赟DS-PAGE收集和匯集級分。將匯集的級分通過使用IOkDa膜的超濾濃縮，并使用320mLSUPERDEX?75SEC柱(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)以大約1.3升的150mMNaCl-20mMTris-HClpH8.0的等度洗脫來層析?；赟DS-PAGE收集和匯集級分。將匯集的級分使用VIVASPIN?2010kDaMWCO離心濃縮濾器(GEHealthcareUKlimited,LittleChalfont,Buckinghamshire,UK)濃縮并脫鹽入20mMTris-HClρΗ8.5。蛋白濃度使用MicroplateBCA?ProteinAssayKit(ThermoFisherScientificInc.，Rockford,IL,USA)確定,其中牛血清白蛋白用作蛋白標(biāo)樣。實(shí)施例3:連二亞硫酸鹽對里氏木霉纖維素酶組合物水解PCS的作用連二亞硫酸鈉對經(jīng)預(yù)處理的纖維素制備物的纖維素分解活性根據(jù)下文所述步驟進(jìn)行評價(jià)?？傻米訬ovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark的含有米曲霉β_葡糖苷酶融合蛋白(W02008/057637)和桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽(W02005/074656)的里氏木霉纖維素酶制備物在本文中在實(shí)施例中命名為“里氏木霉纖維素酶組合物”。PCS的分批水解使用50mLNalgene聚碳酸酯離心管(ThermoScientific,Pittsburgh,PA)以20g的總樣品重量來進(jìn)行。每次水解用15%總固體加載的PCS在50mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)中進(jìn)行，所述緩沖液含有4mg蛋白質(zhì)每克纖維素的里氏木霉纖維素酶組合物，指定劑量的連二亞硫酸鈉(O~10%，基于PCS重量)，和用以阻止微生物生長的青霉素(2.5g/L)。將連二亞硫酸鈉用PCS漿料在60°C預(yù)溫育12小時(shí)，然后進(jìn)行酶水解，接著添加里氏木霉纖維素酶組合物，并在定規(guī)搖床溫育箱(Comb1-D24hybridizationincubator,F[NEI)CR?，Yang-Chung,Seoul,Korea)中在50°C在攪拌下進(jìn)行192小時(shí)。為了監(jiān)測水解的進(jìn)展，在底物溫育72、120和192小時(shí)之后對水解物進(jìn)行了三次取樣。將每個(gè)500μL的水解物樣品轉(zhuǎn)移至CostarSpin-X離心過濾管(CoIe-Parmer，VernonHills,IL),并通過離心(14，OOOrpm,5min)經(jīng)由0.2μm尼龍濾器過濾。將所得的上清用5μL40%硫酸酸化以將剩余的酶活性滅活，并通過HPLC分析。HPLC系統(tǒng)(1200SeriesLCSystem,AgilentTechnologiesInc.,PaloAlto,CA)配置有RezexROA-OrganicacidH+(8%)(7.8X300mm)(PhenomenexInc.,Torrance,CA),0.2ym在線(inline)濾器，自動(dòng)取樣器，梯度泵，和折射率檢測器(RID)。使用的流動(dòng)相是5mM硫酸，其流速為0.9mL/分鐘。使用濃度為0，0.3,0.75，3.75，7.5，和15g/L的單糖作為標(biāo)樣。葡聚糖/木聚糖轉(zhuǎn)化基于酶水解上清中的糖和原料中的生物質(zhì)組成使用Zhu等，2010,BioresourceTechnologyl02(3):2897-2930發(fā)表的方法進(jìn)行計(jì)算。連二亞硫酸鈉的存在顯著地增強(qiáng)了里氏木霉纖維素酶組合物對PCS的水解(見圖1)。在這些條件下，水解的最大增強(qiáng)顯示于2%連二亞硫酸鹽存在下大約192小時(shí)的溫育之后。實(shí)施例4:不同GH61A濃度對連二亞硫酸鹽存在下里氏木霉纖維素酶組合物水解PCS的作用根據(jù)上文實(shí)施例3中所述的步驟評價(jià)了不同水平的桔橙嗜熱子囊菌GH61A與連二亞硫酸鈉對里氏木霉纖維素酶組合物的纖維素分解活性的作用。如實(shí)施例3中所見，里氏木霉纖維素酶組合物對PCS水解的增強(qiáng)隨著水解時(shí)間的增加而增加(見圖2)。在這些條件下，水解的最大增強(qiáng)顯示于5%GH61A存在下大約192小時(shí)的溫育之后。實(shí)施例5:連二亞硫酸鹽對發(fā)酵的作用連二亞硫酸鈉對改善經(jīng)水解、預(yù)處理的纖維素的木素纖維素發(fā)酵的作用可根據(jù)如下所述的步驟來評價(jià)。將經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(見上文)在不存在連二亞硫酸鹽下使用里氏木霉纖維素酶組合物在類似于上文中所述的步驟中水解，或者，在不存在連二亞硫酸鹽下使用棘孢曲霉GHlO木聚糖酶(W094/021785)和可得自NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark的包含煙曲霉β-葡糖苷酶(W02005/047499)和桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽(W02005/074656)的里氏木霉纖維素酶制備物的共混物，例如在20%TS加載量在ρΗ5.0水解5日。在水解之后，將所得的水解物混合物通過添加NaOH進(jìn)行pH調(diào)整(例如至pH5.5)，稀釋至15%TS,并以50mL工作體積加載于125mlErlenmeyer瓶。在發(fā)酵過程中添加連二亞硫酸鈉(例如0-3%(w/w))和氮源(例如，lg/L的尿素)。然后將瓶用合適的經(jīng)繁殖的酵母培養(yǎng)物(例如lg/U接種過夜，并在氣動(dòng)振打器(airshaker)中以150rpm在32°C維持3曰。將以不同量的連二亞硫酸鹽進(jìn)行的發(fā)酵所得的乙醇效價(jià)與缺乏連二亞硫酸鹽的對照進(jìn)行比較以說明增加的乙醇產(chǎn)量/產(chǎn)率。亦監(jiān)測了發(fā)酵過程中連二亞硫酸鹽對木糖消耗的作用。所有的測試一式兩次進(jìn)行。實(shí)施例6調(diào)查了連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)對改善木素纖維素發(fā)酵的作用。用于本研究的底物是NREL稀釋的酸預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)水解物。將該P(yáng)CS以20%TS加載量用可得自NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark的里氏木霉纖維素酶制備物在ρΗ5.0水解5日，所述制備物含有煙曲霉β_葡糖苷酶(W02005/047499)和桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽(W02005/074656)和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中公開的XylII)。在水解之后，將pH以添加NaOH增加至5.5，并添加lg/L尿素作為氮源以供發(fā)酵。將水解物稀釋至15%TS并以50ml工作體積加載入125mlErlenmeyer瓶。將不同劑量的Na2S2O4,0-3%Na2S204/TS(w/w)添加至每個(gè)瓶。然后將瓶用2g/L的經(jīng)繁殖的釀酒酵母C5酵母培養(yǎng)物接種過夜。發(fā)酵在32°C氣動(dòng)振打器以150rpm進(jìn)行3日。所有測試進(jìn)行一式兩次。在添加1%Na2S2O4下，乙醇效價(jià)在50小時(shí)發(fā)酵之后增加4.34g/L(圖3)。木糖消耗率通過添加Na2S2O4急劇增加(圖4)。總體而言，總乙醇產(chǎn)量/產(chǎn)率在50小時(shí)發(fā)酵之后增加10.7%(圖5)。亦發(fā)現(xiàn)對于增強(qiáng)作用存在Na2S2O4的最適劑量。在此情況下，I%劑量性能最佳。本發(fā)明在下述段落中描述:[0001].一種降解經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料的方法，其包括:(a)用連二亞硫酸鹽溫育經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料；和(b)用包含一種或多種纖維素酶的酶組合物糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料。[0002].段[I]的方法，其中所述經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料是經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)。[0003].段[I]或[2]的方法，其中用連二亞硫酸鹽溫育經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料在糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料之前開始。[0004].段[3]的方法，其中在糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料之前，用連二亞硫酸鹽溫育經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料進(jìn)行至少30分鐘，例如至少I小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，或24小時(shí)。[0005].段[1]-[4]任一項(xiàng)的方法，其中當(dāng)糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料時(shí)存在連二亞硫酸鹽。[0006].段[1]-[4]任一項(xiàng)的方法，其中在糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料之前，從經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料去除大部分連二亞硫酸鹽。[0007].段[1]-[6]任一項(xiàng)的方法，其中用連二亞硫酸鹽溫育經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料在約25°C至約85°C，例如35°C至80°C，45°C至75°C，50°C至70°C，55°C至65°C，或約60°C的溫度進(jìn)行。[0008].段[1]_[7]任一項(xiàng)的方法，其中在溫育步驟中，連二亞硫酸鹽的濃度為約0.1%至約5%，例如0.5%至4%，I%至3%，或約2%(w/w)，基于經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料的干重量。[0009].段[1]-[8]任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種纖維素酶是真核纖維素酶。[0010].段[1]-[9]任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種纖維素酶包括一種或多種來自木霉屬(例如里氏木霉)的纖維素酶。[0011].段[1]-[10]任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種纖維素酶選自內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，和β-葡糖苷酶(例如煙曲霉或米曲霉β-葡糖苷酶)。[0012].段[1]_[11]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(例如桔橙嗜熱子囊菌纖維素分解增強(qiáng)多肽)。[0013].段[1]_[12]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是GH61多肽，如來源于嗜熱子囊菌屬，如桔橙嗜熱子囊菌的菌株的多肽，如作為SEQIDN0:2描述于W02005/074656的多肽；或如來源于梭孢殼屬，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如作為SEQIDN0:7和SEQIDNO:8描述于W02005/074647的多肽；或如來源于曲霉屬，如煙曲霉的菌株的多肽，如作為SEQIDNO:1和SEQIDNO:2描述于W02010/138754的多肽；或如來源于青霉屬，如埃默森青霉(Penicilliumemersonii)的菌株的多肽,如公開于TO2011/041397的多肽。[0014].段[1]_[13]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含葡糖苷酶，如來源于曲霉屬，如米曲霉的菌株的葡糖苷酶，如公開于W02002/095014的β-葡糖苷酶或公開于W02008/057637的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或煙曲霉，如公開于W02005/047499的β-葡糖苷酶或公開于W02012/044915的煙曲霉β-葡糖苷酶變體；或青霉屬的菌株的β-葡糖苷酶，如公開于W02007/019442的巴西青霉的菌株的β_葡糖苷酶，或木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株的葡糖苷酶。[0015].段[1]_[14]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含木聚糖酶，優(yōu)選GHlO木聚糖酶,如來源于曲霉屬的菌株的，如來源于煙曲霉的菌株的木聚糖酶,如作為XylIII公開在W02006/078256中的木聚糖酶，或棘孢曲霉木聚糖酶，如作為SEQIDNO:5公開于W094/21785的木聚糖酶(XylII)。[0016].段[1]_[14]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含木糖苷酶，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的β_木糖苷酶，如公開于共同未決的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/526833中的β-木糖苷酶，或來源于木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株的β-木糖苷酶，如TO2011/057140中的SEQIDNO:58的成熟多肽。[0017].段[1]_[16]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含纖維二糖水解酶I(CBHI)，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的纖維二糖水解酶I，如公開于W02011/057140中的SEQIDΝ0:2的Cel7aCBHI，或木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株的纖維二糖水解酶I。[0018].段[1]_[17]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含纖維二糖水解酶II(CBHII)，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的纖維二糖水解酶II;或木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株的纖維二糖水解酶II，或梭孢殼屬的菌株，如土生梭孢霉的菌株的纖維二糖水解酶II，如來自土生梭孢霉的纖維二糖水解酶IICEL6A。[0019].段[1]_[18]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，而所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是桔橙嗜熱子囊菌GH6IA(W02005/074656中的SEQIDNO:2)。[0020].段[19]的方法，進(jìn)一步其中存在或添加葡糖苷酶，如米曲霉葡糖苷酶融合蛋白(W02008/057637)。[0021].段[1]_[20]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，且所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是W02011/041397中公開的埃默森青霉GH61A多肽。[0022].段[21]的方法，進(jìn)一步其中存在或添加葡糖苷酶，如煙曲霉葡糖苷酶(W02005/047499的SEQIDNO:2)或其具有下述取代的變體:F100D，S283G,N456E,F512Y(W02012/044915)。[0023].段[1]_[22]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，且其中存在或添加一種或多種下述組分:(i)煙曲霉纖維二糖水解酶I;(?)煙曲霉纖維二糖水解酶II；(iii)煙曲霉β_葡糖苷酶或其具有一種或多種下述取代的變體:F100D，S283G，N456E,F512Y(W02012/044915);和(iv)具有纖維素分解增強(qiáng)活性的青霉屬菌種GH61多肽，或其同源物。[0024].段[1]_[23]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，且其中存在或添加一種或多種下述組分:⑴煙曲霉葡糖苷酶；和(?)具有纖維素分解增強(qiáng)活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽；或其同源物。[0025].段[1]_[24]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656中的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(W02008/057637)，和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中的XylII)。[0026].段[1]_[25]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，進(jìn)一步包含GH61具有纖維素分解增強(qiáng)活性的桔橙嗜熱子囊菌多肽(W02005/074656中的SEQIDΝ0:2)，煙曲霉β-葡糖苷酶(W02005/047499的SEQIDNO:2)和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中公開的XylII)。[0027].段[1]_[26]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的埃默森青霉GH61多肽(W02011/04139中的SEQIDΝ0:2)，煙曲霉β-葡糖苷酶變體(在美國臨時(shí)申請?zhí)?1/388，997中公開)和煙曲霉木聚糖酶(在W02006/078256中公開的XylIII)和來源于煙曲霉菌株的木糖苷酶。[0028].段[1]_[27]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物以約0.01至約50.0mg，例如約I至約25mg,如約2-10mg,如約4至約8mg蛋白質(zhì)每g/DS纖維素材料的量添加。[0029].段[1]_[28]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自下組的酶:半纖維素酶，棒曲霉素，酯酶，漆酶，木質(zhì)素分解酶，果膠酶，過氧化物酶，蛋白酶，和膨脹素。[0030].段[29]的方法，其中所述半纖維素酶選自木聚糖酶(例如棘孢曲霉木聚糖酶)，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，和葡糖醛酸糖苷酶。[0031].段[1]_[30]任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括回收經(jīng)降解的纖維素材料。[0032].段[31]的方法，其中所述經(jīng)降解的纖維素材料是糖。[0033].段[32]的方法，其中所述糖選自葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖，和阿拉伯糖。[0034].段[1]_[33]任一項(xiàng)的方法，其中所述連二亞硫酸鹽是連二亞硫酸鈉。[0035].段[12]_[34]任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，如GH61多肽，構(gòu)成酶組合物的0.1-15%，優(yōu)選0.5-10%，更優(yōu)選0.5-7%。[0036].一種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:(a)用包含一種或多種纖維素酶的酶組合物糖化纖維素材料；(b)在連二亞硫酸鹽存在下用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料；和(C)從(b)回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。[0037].段[36]的方法，其中所述纖維素材料是經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料。[0038].段[37]的方法，其中所述經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料是經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)。[0039].段[36]-[38]任一項(xiàng)的方法，其中在發(fā)酵過程中，連二亞硫酸鹽的濃度為約0.1%至約3%，例如0.5%至2%，0.75%至1.5%，或約1%(w/w)，基于經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料的干重量。[0040].段[36]_[39]任一項(xiàng)的方法，其中在糖化纖維素材料之前，將連二亞硫酸鹽與纖維素材料進(jìn)一步溫育。[0041].段[36]_[40]任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種纖維素酶是真核纖維素酶。[0042].段[36]-[41]任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種纖維素酶包含一種或多種來自木霉屬(例如里氏木霉)的纖維素酶。[0043].段[36]-[42]任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種纖維素酶選自內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，和葡糖苷酶(例如煙曲霉或米曲霉β-葡糖苷酶)。[0044].段[36]-[43]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(例如桔橙嗜熱子囊菌纖維素分解增強(qiáng)多肽)。[0045].段[36]_[44]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是GH61多肽，如來源于嗜熱子囊菌屬，如桔橙嗜熱子囊菌的菌株的多肽，如作為SEQID勵(lì):2描述于冊2005/074656的多肽；或如來源于梭孢殼屬，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如作為SEQIDΝ0:7和SEQIDNO:8描述于W02005/074647的多肽；或如來源于曲霉屬，如煙曲霉的菌株的多肽，如作為SEQIDNO:1和SEQIDNO:2描述于W02010/138754的多肽；或如來源于青霉屬，如埃默森青霉的菌株的多肽，如W02011/041397中公開的多肽。[0046].段[36]_[45]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含葡糖苷酶，優(yōu)選來源于曲霉屬，如米曲霉的菌株的β-葡糖苷酶，如公開于W02002/095014的β-葡糖苷酶或公開于W02008/057637的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或煙曲霉的葡糖苷酶，如公開于TO2005/047499的β-葡糖苷酶或公開于W02012/044915的煙曲霉β-葡糖苷酶變體；或青霉屬的菌株的葡糖苷酶，如公開于W02007/019442的巴西青霉的菌株的β-葡糖苷酶，或木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株的β-葡糖苷酶。[0047].段[36]_[46]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含木聚糖酶，優(yōu)選GHlO木聚糖酶，如來源于曲霉屬的菌株，如來源于煙曲霉的菌株的木聚糖酶，如作為XylIII公開在W02006/078256中的木聚糖酶，或棘孢曲霉的木聚糖酶，如作為SEQIDΝ0:5公開于W094/21785的木聚糖酶(XylII)。[0048].段[36]_[47]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含木糖苷酶，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的木糖苷酶，如在共同未決的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/526833中公開的β_木糖苷酶，或來源于木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株的β_木糖苷酶，如W02011/057140中的SEQIDNO:58的成熟多肽。[0049].段[36]-[48]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含纖維二糖水解酶I(CBHI)，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的纖維二糖水解酶I，如公開于W02011/057140中的SEQIDΝ0:2的Cel7aCBHI，或木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株纖維二糖水解酶I。[0050].段[36]_[49]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含纖維二糖水解酶II(CBHII)，如來源于曲霉屬的菌株，如煙曲霉的菌株的纖維二糖水解酶II;或木霉屬的菌株，如里氏木霉的菌株的纖維二糖水解酶II，或梭孢殼屬的菌株，如土生梭孢霉的菌株的纖維二糖水解酶II，如來自土生梭孢霉的纖維二糖水解酶IICEL6A。[0051].段[36]-[50]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，而所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是桔橙嗜熱子囊菌GH6IA(W02005/074656中的SEQIDNO:2)。[0052].段[51]的方法，進(jìn)一步其中存在或添加葡糖苷酶，如米曲霉葡糖苷酶融合蛋白(W02008/057637)。[0053].段[36]_[52]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，且所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是W02011/041397中公開的埃默森青霉GH61A多肽。[0054].段[53]的方法，進(jìn)一步其中存在或添加葡糖苷酶，如煙曲霉葡糖苷酶(W02005/047499的SEQIDNO:2)或其具有下述取代的變體:F100D，S283G,N456E,F512Y(W02012/044915)。[0055].段[44]_[54]的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，如GH61多肽，構(gòu)成酶組合物的0.1-15%,優(yōu)選0.5-10%，更優(yōu)選0.5-7%。[0056].段[36]_[55]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，且其中存在或添加一種或多種下述組分:(i)煙曲霉纖維二糖水解酶I;(?)煙曲霉纖維二糖水解酶II；(iii)煙曲霉葡糖苷酶或其具有一種或多種下述取代的變體:F100D，S283G，Ν456Ε,F512Y(W02012/044915);和(iv)具有纖維素分解增強(qiáng)活性的青霉屬菌種GH61多肽；或其同源物。[0057].段[36]_[56]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，且其中存在或添加一種或多種下述組分:(i)煙曲霉葡糖苷酶；和(?)具有纖維素分解增強(qiáng)活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽；或其同源物。[0058].段[36]_[57]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656中的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(W02008/057637)，和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中的XylII)。[0059].段[36]-[58]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61多肽(W02005/074656中的SEQIDNO:2)，煙曲霉β-葡糖苷酶(W02005/047499的SEQIDNO:2)和棘孢曲霉木聚糖酶(W094/21785中公開的XylII)。[0060].段[36]_[59]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物是里氏木霉纖維素酶組合物，進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的埃默森青霉GH61多肽(W02011/04139中的SEQIDNO:2)，煙曲霉β-葡糖苷酶變體(在美國臨時(shí)申請?zhí)?1/388，997中公開)和煙曲霉木聚糖酶(在W02006/078256中公開的XylIII)和來源于煙曲霉菌株的木糖苷酶。[0061].段[36]-[60]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物以約0.01至約50.0mg，例如約I至約25mg,如約2-10mg,如約4至約8mg蛋白質(zhì)每g/DS纖維素材料的量添加。[0062].段[36]-[61]任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自下組的酶:半纖維素酶，棒曲霉素，酯酶，漆酶，木質(zhì)素分解酶，果膠酶，過氧化物酶，蛋白酶，和膨脹素。[0063].段[62]的方法，其中所述半纖維素酶選自木聚糖酶(例如棘孢曲霉木聚糖酶)，乙酰木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木糖苷酶，和葡糖醛酸糖苷酶。[0064].段[36]-[63]任一項(xiàng)的方法，其中纖維素材料的糖化與糖化的材料的發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行。[0065].段[36]_[64]任一項(xiàng)的方法,其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇,有機(jī)酸,酮,氨基酸,或氣體。[0066].段[36]-[65]任一項(xiàng)的方法，其中所述連二亞硫酸鹽是連二亞硫酸鈉。[0067].段[36]_[66]任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵微生物是細(xì)菌或真菌生物體。[0068].段[36]-[67]任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物可為己糖和/或戊糖發(fā)酵生物體，或其組合。[0069].段[36]_[68]任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物是酵母屬菌種，優(yōu)選釀酒酵母的菌株。[0070].段[36]-[69]任一項(xiàng)的方法,其中所述發(fā)酵生物是畢赤酵母屬(Pichia)的菌株，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株,如樹干畢赤酵母CBS5773的菌株；假絲酵母屬(Candida)的菌株,優(yōu)選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、蕓薹假絲酵母(C.brassicae)、休哈塔假絲酵母(C.scehatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)的菌株。[0071].段[36]-[70]任一項(xiàng)的方法,其中所述發(fā)酵生物是發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas),如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的菌株；漢遜酵母屬(Hansenula),如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克魯維酵母屬(Kluyveromyces),如馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)、乳酸克魯維酵母(K.1actis)、K.thermotoIerans和脆壁克魯維酵母的菌株(K.fragilis);裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)的菌株；大腸桿菌(E.coli),梭菌屬(Clostridium),如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、熱纖維梭菌(Chlostridiumthermocellum)和Clostridiumphytofermentans的菌株；地芽抱桿菌屬菌種(Geobacillussp.)的菌株；熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter),如解糖熱厭氧桿菌(ThermoanaerobactersaccharoIyticum)的菌株；和芽抱桿菌屬(Bacillus),如凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)的菌株。[0072].段[36]_[71]任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵微生物經(jīng)遺傳修飾提供發(fā)酵戊糖的能力，如木糖利用微生物，阿拉伯糖利用微生物，和木糖和阿拉伯糖共利用微生物。[0073].段[36]-[72]任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵微生物是酵母屬菌種，如釀酒酵母的菌株，其能夠有效地共發(fā)酵葡萄糖和木糖。[0074].段[36]_[73]任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵微生物表達(dá)木糖異構(gòu)酶。本文描述和要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于本文公開的具體方面的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些方面旨在作為本發(fā)明幾個(gè)方面的說明。旨在將任何等同的方面包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改也旨在落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準(zhǔn)?！緳?quán)利要求】1.一種降解經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料的方法，其包括:(a)用連二亞硫酸鹽溫育經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料；和(b)用包含一種或多種纖維素酶的酶組合物糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料。2.權(quán)利要求1的方法，其中用連二亞硫酸鹽溫育經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料在糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料之前開始。3.權(quán)利要求2的方法，其中在糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料之前，用連二亞硫酸鹽溫育經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料進(jìn)行至少30分鐘，例如至少I小時(shí)，2消失，4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，或24小時(shí)。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中當(dāng)糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料時(shí)存在連二亞硫酸鹽。5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中在糖化經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料之前，從經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料去除大部分連二亞硫酸鹽。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中用連二亞硫酸鹽溫育經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料在約25°C至約85°C，例如35°C至80°C，45°C至75°C，50°C至70°C，55°C至65°C，或約60V的溫度進(jìn)行。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中在溫育步驟過程中，連二亞硫酸鹽的濃度為約0.1%至約5%,例如0.5%至4%,1%至3%,或約2%(w/w),基于經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料的干重量。8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種纖維素酶包含一種或多種來自木霉屬(例如里氏木霉)的纖維素酶。9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(例如桔橙嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)纖維素分解增強(qiáng)多肽)。10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自如下的酶:半纖維素酶，棒曲霉素，酯酶，漆酶，木質(zhì)素分解酶，果膠酶，過氧化物酶，蛋白酶，和膨脹素。11.一種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括:(a)用包含一種或多種纖維素酶的酶組合物糖化纖維素材料；(b)在連二亞硫酸鹽存在下用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵所述糖化的纖維素材料；和(C)從(b)回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述纖維素材料是經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料。13.權(quán)利要求11或12的方法，其中在發(fā)酵過程中，連二亞硫酸鹽的濃度為約0.1%至約3%，例如0.5%至2%，0.75%至1.5%，或約I%(w/w)，基于經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料的干重量。14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法，其中在糖化纖維素材料之前，將連二亞硫酸鹽與纖維素材料進(jìn)一步溫育。15.權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)的方法,其中所述一種或多種纖維素酶包含一種或多種來自木霉屬(例如里氏木霉)的纖維素酶。16.權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(例如桔橙嗜熱子囊菌纖維素分解增強(qiáng)多肽)。17.權(quán)利要求11-16任一項(xiàng)的方法,其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自如下的酶:半纖維素酶，棒曲霉素，酯酶，漆酶，木質(zhì)素分解酶，果膠酶，過氧化物酶，蛋白酶，和膨脹素。18.權(quán)利要求11-17任一項(xiàng)的方法，其中纖維素材料的糖化與糖化的材料的發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行。19.權(quán)利要求11-18任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇，有機(jī)酸，酮，氨基酸，或氣體。20.權(quán)利要求11-19任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵生物體是己糖和/或戊糖發(fā)酵生物體，或其組合。【文檔編號(hào)】C12P19/14GK103930555SQ201280055679【公開日】2014年7月16日申請日期:2012年9月7日優(yōu)先權(quán)日:2011年9月13日【發(fā)明者】徐輝,陳曄,李鑫,M.斯蒂文斯,康正芳申請人:諾維信北美公司