用于體外研究用途的工程化組織、其陣列及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于體外科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的活的三維組織構(gòu)建體、其陣列及制備所述組織和陣列的方法。
【專利說明】用于體外研究用途的工程化組織、其陣列及其制備方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0001] 本申請(qǐng)要求2011年9月12日提交的美國申請(qǐng)序列號(hào)61/533，757、2011年9月12日提交的美國申請(qǐng)序列號(hào)61/533，753和2011年9月12日提交的美國申請(qǐng)序列號(hào)61/533，761的權(quán)益，所有這些申請(qǐng)通過引用以其整體并入本文中。
【背景技術(shù)】
[0002]—種新的藥物化合物的研發(fā)成本約為18億美元。參見Paul等(2010).How toimprove R&D productivity:the pharmaceutical industry’s grand challenge，NatureReviews Drug Discovery9 (3):203_214。藥物發(fā)現(xiàn)是發(fā)現(xiàn)和/或設(shè)計(jì)藥物的過程。藥物發(fā)現(xiàn)的過程通常至少包括以下步驟:確認(rèn)候選物、合成、表征、篩選和分析治療效果。雖然在技術(shù)上和對(duì)生物系統(tǒng)的了解上具有進(jìn)展，但藥物發(fā)現(xiàn)仍舊是一個(gè)冗長(zhǎng)、昂貴且低效的過程，且新治療劑發(fā)現(xiàn)率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]存在對(duì)如下材料、工具和技術(shù)的需求:其大幅增加創(chuàng)新的、具有成本效益的新藥物的數(shù)量和質(zhì)量，而不會(huì)導(dǎo)致不可承受的研發(fā)成本。因此，本發(fā)明人在本文中描述了工程化的哺乳動(dòng)物組織和血管壁節(jié)段、其陣列及其制備方法，其在組織和器官工程、體外分析、藥物發(fā)現(xiàn)及其它領(lǐng)域是有用的。
[0004]在一個(gè)方面，本文中公開了活的三維組織構(gòu)建體，其包含:至少一種粘附細(xì)胞類型，該至少一種粘附細(xì)胞類型凝聚并融合以形成活的三維組織構(gòu)建體，該三維組織構(gòu)建體具有不是血管的多層結(jié)構(gòu)，該組織構(gòu)建體用于體外使用，條件是該組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)或者在使用時(shí)，該組織構(gòu)建體基本上不含任何預(yù)形成的支架(scaffold)。在一些實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體包含至少一個(gè)包括多種細(xì)胞類型的層，該細(xì)胞類型相對(duì)于彼此空間排列，以構(gòu)建平面幾何形狀。在一些實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體包含多個(gè)層，至少一個(gè)層在組成上或結(jié)構(gòu)上與至少一個(gè)其它層不同，以構(gòu)建層狀幾何形狀。在一些實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體進(jìn)一步包含非粘附細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體被固定到生物相容性表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面為多孔膜。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面用如下物質(zhì)中的一種或多種包被:生物相容性水凝膠、蛋白質(zhì)、化學(xué)品、肽、抗體或生長(zhǎng)因子。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織構(gòu)建體在其最小維度上為至少約25 μ m。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織構(gòu)建體在其最大維度上不大于約3cm。在一些實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體用于體外分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體用于藥物測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，該粘附細(xì)胞為分化的細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，該粘附細(xì)胞為未分化的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該粘附細(xì)胞來源于選自下組的組織:肝臟、胃腸、胰腺、腎、肺、氣管、血管、骨骼肌、心臟、皮膚、平滑肌、結(jié)締組織、角膜、泌尿生殖系統(tǒng)、乳腺、生殖、內(nèi)皮、上皮、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)、施萬(Schwann)、脂肪、骨、骨髓、軟骨、周細(xì)胞、間皮、內(nèi)分泌、間質(zhì)、淋巴、血液、內(nèi)胚層、外胚層和中胚層。在一些實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體為血管壁節(jié)段。
[0005]在另一方面，本文中公開了活的三維組織構(gòu)建體的陣列，每個(gè)組織構(gòu)建體包含:至少一種粘附細(xì)胞類型，該至少一種粘附細(xì)胞類型凝聚并融合以形成活的三維組織構(gòu)建體，每個(gè)組織構(gòu)建體具有多層結(jié)構(gòu)，每個(gè)組織構(gòu)建體用于體外使用，條件是每個(gè)組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)或者在使用時(shí)，每個(gè)組織構(gòu)建體基本上不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，該粘附細(xì)胞選自:肝細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、腎細(xì)胞、肺細(xì)胞、氣管細(xì)胞、血管細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞、角膜細(xì)胞、泌尿生殖細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、生殖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、施萬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、周細(xì)胞、間皮細(xì)胞、來源于內(nèi)分泌組織的細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞、祖細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血細(xì)胞、內(nèi)胚層來源的細(xì)胞、外胚層來源的細(xì)胞、中胚層來源的細(xì)胞及其組合。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的每個(gè)組織構(gòu)建體基本相似。在其它實(shí)施方案中，該陣列中的一個(gè)或多個(gè)組織構(gòu)建體是獨(dú)特的。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體組織代表選自下組的人體組織:血或淋巴管、肌肉、子宮、神經(jīng)、粘膜、間皮、網(wǎng)膜、角膜、皮膚、肝、腎、心臟、氣管、肺、骨、骨髓、脂肪、結(jié)締組織、膀胱、乳腺、胰腺、脾、腦、食管、胃、腸、結(jié)腸、直腸、卵巢、前列腺、內(nèi)分泌組織、內(nèi)胚層、中胚層和外胚層。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)組織構(gòu)建體存在于生物相容性多孔容器的孔中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該孔用如下物質(zhì)中的一種或多種包被:生物相容性水凝膠、蛋白質(zhì)、化學(xué)品、肽、抗體或生長(zhǎng)因子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將每個(gè)組織構(gòu)建體放置在容器的孔內(nèi)的多孔生物相容性膜上。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該容器與自動(dòng)或半自動(dòng)的藥物篩選過程相匹配。在一些實(shí) 施方案中，每個(gè)組織構(gòu)建體被固定到生物相容性表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面為多孔膜。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面用如下物質(zhì)中的一種或多種包被:生物相容性水凝膠、蛋白質(zhì)、化學(xué)品、肽、抗體或生長(zhǎng)因子。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，每個(gè)組織構(gòu)建體在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的每個(gè)組織構(gòu)建體被獨(dú)立地培養(yǎng)維持。在其它實(shí)施方案中，該陣列中的兩個(gè)或更多個(gè)個(gè)體組織構(gòu)建體交換可溶性因子。在一些實(shí)施方案中，該陣列用于體外分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該陣列用于藥物測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的至少一個(gè)組織是血管壁節(jié)段。
[0006]在另一個(gè)方面，本文中公開了活的三維組織構(gòu)建體，該三維組織構(gòu)建體包含:一個(gè)或多個(gè)層，其中每個(gè)層含有一種或多種細(xì)胞類型，該一個(gè)或多個(gè)層凝聚以形成活的三維組織構(gòu)建體，該組織構(gòu)建體的特征在于具有如下的至少一種:至少一個(gè)包含多種細(xì)胞類型的層，該細(xì)胞類型相對(duì)于彼此空間排列，以構(gòu)建平面幾何形狀；和多個(gè)層，至少一個(gè)層在組成上或結(jié)構(gòu)上與至少一個(gè)其它層不同，以構(gòu)建層狀幾何形狀。在一些實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)或者在使用時(shí)，該組織構(gòu)建體基本上不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體用于體外分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體用于藥物測(cè)試。
[0007]在另一個(gè)方面，本文中公開了用于構(gòu)建活的三維組織構(gòu)建體的方法，該方法包括如下步驟:將包含至少一種粘附細(xì)胞類型的生物墨水生物打印到形式(form)中或形式上；將生物墨水融合成活的三維組織構(gòu)建體；條件是該組織構(gòu)建體用于體外使用，并且不是血管。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)或者在使用時(shí)，該組織構(gòu)建體不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，該形式是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該形式與生物墨水基本上同時(shí)被生物打印。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括溶解該形式的步驟。
[0008]在另一個(gè)方面，本文中公開了用于構(gòu)建活的三維組織構(gòu)建體的方法，該方法包括如下步驟:制備一個(gè)或多個(gè)包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體；將所述一個(gè)或多個(gè)凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在載體上，以形成如下的至少一種:至少一個(gè)包含多種細(xì)胞類型的層，該細(xì)胞類型相對(duì)于彼此空間排列，以構(gòu)建平面幾何形狀；和多個(gè)層，至少一個(gè)層在組成上或結(jié)構(gòu)上與至少一個(gè)其它層不同，以構(gòu)建層狀幾何形狀；并孵育所述一個(gè)或多個(gè)多細(xì)胞聚集體，以使其凝聚并形成活的三維組織構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)或者在使用時(shí)，該組織構(gòu)建體不含任何預(yù)形成的支架。 [0009]在另一個(gè)方面，本文中公開了用于構(gòu)建活的三維組織構(gòu)建體的陣列的方法，該方法包括如下步驟:制備包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體；將所述凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在生物相容性載體上；其中所述集合體以適合于組織陣列的形式空間排列；并孵育所述多細(xì)胞聚集體，以使所述多細(xì)胞聚集體凝聚并形成活的三維組織構(gòu)建體的陣列。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)或者在使用時(shí)，每個(gè)組織構(gòu)建體基本上不含任何預(yù)形成的支架。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]在所附權(quán)利要求書中詳細(xì)闡明了本發(fā)明的新特征。通過參考以下闡明了說明性實(shí)施方案的發(fā)明詳述(其中利用了本發(fā)明的原理)和附圖，將獲得對(duì)本發(fā)明特征和優(yōu)點(diǎn)的更好理解，附圖中:
[0011]圖1描述了由圓柱形式的多型SMC:EC生物墨水構(gòu)建的生物打印血管壁節(jié)段的非限制性實(shí)施例。示出了各種染色條件，以指示細(xì)胞類型的分布和位置。
[0012]圖2a為描繪采用85:15比例的HASMC:HAEC的多型生物墨水圓柱體構(gòu)建的生物打印血管壁節(jié)段的非限制性實(shí)施例的宏觀圖像。
[0013]圖2b描述了采用85:15比例的HASMC:HAEC組成的生物墨水構(gòu)建的生物打印血管壁節(jié)段的非限制性實(shí)施例。HAEC針對(duì)CD31染色。
[0014]圖3描繪了生物打印的血管壁節(jié)段的非限制性實(shí)例，該生物打印的血管壁節(jié)段采用單SMC生物墨水圓柱體，隨后生物打印由EC濃縮物組成的第二層而構(gòu)建，從而創(chuàng)建層狀結(jié)構(gòu)。示出了各種染色條件，以指示細(xì)胞類型的分布和位置。
[0015]圖4a描繪了生物打印的血管壁節(jié)段的非限制性實(shí)例，該生物打印的血管壁節(jié)段通過將HASMC生物打印在第一層人類皮膚成纖維細(xì)胞(HDFa)上方且隨后層疊HAEC而構(gòu)建，從而創(chuàng)建三層層狀結(jié)構(gòu)。HASMC針對(duì)a-SMA染色。
[0016]圖4b為描繪了如下的HASMC生物墨水的非限制性實(shí)例的宏觀圖像:該墨水被生物打印在共打印的NovoGel?控制窗口中，并層疊HAEC，但在頂部沒有NovoGel?網(wǎng)格(例如，網(wǎng))的第三層。
[0017]圖5為生物打印的細(xì)胞片和暫時(shí)的或可移除的生物打印的限制網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的非限制性實(shí)例；還描繪了制造它的示例性步驟。[0018]圖6為描繪了工程化肝組織的非限制性實(shí)例的宏觀圖像，在這種情況下，是使用由包封在水溶性擠出化合物(例如，PF-127)中的多個(gè)肝臟細(xì)胞類型組成的生物墨水、并利用連續(xù)沉積機(jī)理生物打印的多層肝組織。(A)顯示了單個(gè)功能單元的示意圖，突出了通過圖案化生物墨水和負(fù)空間(negative space)構(gòu)建的平面幾何圖形；(B)棋盤格狀(tessellated)生物打印的功能單元；(C)和(D)顯示了在施加培養(yǎng)基和溶出擠出化合物之后的構(gòu)建體；記錄該平面幾何圖形隨著時(shí)間的保持度。
[0019]圖7是H&E染色的圖6的棋盤格狀構(gòu)建體的顯微照片，描繪了在棋盤格狀構(gòu)建體中的示例性〃輪輻(spoke)"。
[0020]圖8為具有層狀幾何形狀的生物打印的新組織的非限制性示意圖㈧、宏觀圖片(B)和系列顯微照片(C-E)。
[0021]圖9為一系列顯微照片(A-D)，描繪了在生物打印的組織中的細(xì)胞圖案化和層化。
[0022]圖10為具有層狀幾何形狀的生物打印的人體肺部組織構(gòu)建體的非限制性示意圖，描繪了制造步驟(A-D)。
[0023]圖11為描繪了生物打印的人肺部組織的表征的系列顯微照片(A-H)。
[0024]圖12為兩張宏觀照片，描繪了在生物打印之后立即的(A)和在培養(yǎng)基中孵育24小時(shí)之后的(B)生物打印的血管壁節(jié)段。
[0025]圖13為一系列顯微照片(A-F)，描繪了在靜態(tài)和流動(dòng)條件下對(duì)生物打印在多孔細(xì)胞培養(yǎng)插入物上的、具有層 狀幾何形狀的多層血管壁節(jié)段進(jìn)行的分析。
[0026]圖14為描繪了生物打印在多孔板(A)中或多孔細(xì)胞培養(yǎng)插入物(B)內(nèi)的組織的兩張非限制性宏觀照片。
[0027]圖15為描繪了用TGF-β I刺激生物打印的多層血管壁節(jié)段的兩張非限制性顯微照片。
[0028]圖16為描繪了用TGF-β I刺激含有肝星形細(xì)胞的生物打印的肝組織的系列顯微照片(A-H)。
[0029]圖17為描繪了共成型的功能肝組織微觀結(jié)構(gòu)的兩張宏觀照片，該微觀結(jié)構(gòu)是通過連續(xù)沉積生物打印圖案化的PF-127的6-層六邊形、將細(xì)胞漿料生物打印到每個(gè)三角形內(nèi)(A)、之后溶出PF-127邊界⑶而形成的。
[0030]圖18為平面(A-C)和層狀(D-E)幾何形狀的系列非限制性實(shí)例，包括與本文中描述的構(gòu)建方法相匹配的它們的組合(F)，并且再現(xiàn)天然組織結(jié)構(gòu)和生物學(xué)的結(jié)構(gòu)或空間元素。
發(fā)明詳述
[0031]本發(fā)明涉及再生醫(yī)學(xué)和組織和/或器官工程的領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及工程化哺乳動(dòng)物組織的陣列、工程化血管壁節(jié)段、其陣列及其制造方法。
[0032]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了活的三維組織構(gòu)建體，該三維組織構(gòu)建體包含:至少一種粘附細(xì)胞類型，該至少一種粘附細(xì)胞類型凝聚并融合以形成活的三維組織構(gòu)建體，該三維組織構(gòu)建體具有不是血管的多層結(jié)構(gòu)，該組織構(gòu)建體用于體外使用，條件是該組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。
[0033]在某些實(shí)施方案中，本文中還公開了活的三維組織構(gòu)建體的陣列，每個(gè)組織構(gòu)建體包含:至少一種粘附細(xì)胞類型，該至少一種粘附細(xì)胞類型凝聚并融合以形成活的三維組織構(gòu)建體，每個(gè)組織構(gòu)建體具有多層結(jié)構(gòu)，每個(gè)組織構(gòu)建體用于體外使用，條件是每個(gè)組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。
[0034]在某些實(shí)施方案中，本文中還公開了活的三維組織構(gòu)建體，該三維組織構(gòu)建體包含:一個(gè)或多個(gè)層，其中每個(gè)層含有一種或多種細(xì)胞類型，該一個(gè)或多個(gè)層凝聚以形成活的三維組織構(gòu)建體，該組織構(gòu)建體的特征在于具有如下的至少一種:至少一個(gè)包含多種細(xì)胞類型的層，該細(xì)胞類型相對(duì)于彼此空間排列，以構(gòu)建平面幾何形狀；和多個(gè)層，至少一個(gè)層在組成上或結(jié)構(gòu)上與至少一個(gè)其它層不同，以構(gòu)建層狀幾何形狀。
[0035]在某些實(shí)施方案中，本文中還公開了用于構(gòu)建活的三維組織構(gòu)建體的方法，該方法包括如下步驟:將包含至少一種粘附細(xì)胞類型的生物墨水生物打印到形式中或形式上；以及將生物墨水融合成活的三維組織構(gòu)建體；條件是該組織構(gòu)建體用于體外使用，并且不
是血管。
[0036]在某些實(shí)施方案中，本文中還公開了用于構(gòu)建活的三維組織構(gòu)建體的方法，該方法包括如下步驟:制備一個(gè)或多個(gè)包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體；將所述一個(gè)或多個(gè)凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在載體上，以形成如下的至少一種:至少一個(gè)包含多種細(xì)胞類型的層，該細(xì)胞類型相對(duì)于彼此空間排列，以構(gòu)建平面幾何形狀；和多個(gè)層，至少一個(gè)層在組成上或結(jié)構(gòu)上與至少一個(gè)其它層不同，以構(gòu)建層狀幾何形狀；并孵育所述一個(gè)或多個(gè)多細(xì)胞聚集體，以使所述多細(xì)胞聚集體凝聚，并形成活的三維組織構(gòu)建體。
[0037]在某些實(shí)施方案中，本文中還公開了用于構(gòu)建活的三維組織構(gòu)建體的陣列的方法，該方法包括如下步驟:制備包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體；將所述凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在生物相容性載體上；其中所述集合體以適合于組織陣列的形式空間排列；并孵育所述多細(xì)胞聚集體，以使所述多細(xì)胞聚集體凝聚，并形成活的三維組織構(gòu)建體的陣列。
某些定義
[0038]除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。
[0039]如在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)的指示物，除非上下文另有明確規(guī)定。因此，例如，提及“一種核酸”包括一種或多種核酸，和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開內(nèi)容等之后將會(huì)明白的、本文所述的類型的組合物。本文中任何提及的“或”意在包括“和/或”，除非另有說明。
[0040]如本文中使用的，“陣列”是指科學(xué)工具，包括多個(gè)空間排列的元件的關(guān)聯(lián)(association)，以允許在一個(gè)樣品上進(jìn)行多個(gè)試驗(yàn)、在多個(gè)樣品上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)或兩者。
[0041]如本文中使用的，“分析(assay) ”是指:測(cè)試或測(cè)量物質(zhì)(例如化學(xué)品、分子、生物化學(xué)品、蛋白質(zhì)、激素或藥物等)在有機(jī)或生物樣品(例如細(xì)胞聚集體、組織、器官、有機(jī)體等)中的存在或活性的程序。
[0042] 如本文中使用的，“生物相容性的(biocompatible) ”是指對(duì)細(xì)胞造成傷害或毒性的風(fēng)險(xiǎn)有限。如在說明書和權(quán)利要求書中所呈現(xiàn)的，“生物相容性多孔容器”和“生物相容性膜”對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞造成傷害或毒性的風(fēng)險(xiǎn)有限，但該定義并未延伸到隱含了這些生物相容性元件可以被植入到哺乳動(dòng)物體內(nèi)。[0043]如本文中使用的，“生物打印”是指:經(jīng)由與自動(dòng)的或半自動(dòng)的、計(jì)算機(jī)輔助的三維原型裝置(例如生物打印機(jī))相匹配的方法，利用細(xì)胞(例如細(xì)胞溶液、含細(xì)胞的凝膠、細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞濃縮物、多細(xì)胞聚集體、多細(xì)胞體等)的三維精確沉積。
[0044]如本文中使用的，“血管”意指具有包含平滑肌細(xì)胞的壁和內(nèi)襯于管腔的內(nèi)皮細(xì)胞的單個(gè)簡(jiǎn)單或分支的管狀結(jié)構(gòu)，并具有大于100 μ m的內(nèi)徑，且不作為三維組織構(gòu)建體(其包括非血管組織)的一個(gè)部分存在。
[0045]如本文中使用的，“凝聚(cohere) ”、“凝聚的(cohered) ”和“凝聚(cohesion) ”指將細(xì)胞、細(xì)胞聚集體、多細(xì)胞聚集體、多細(xì)胞體和/或它們的層結(jié)合起來的細(xì)胞-細(xì)胞粘附性質(zhì)。該術(shù)語可以與“融合(fuse) ”、“融合的(fused)”和“融合(fusion) ”互換使用。
[0046]如本文中使用的，“層狀”是指多層的、生物打印的組織，其中兩個(gè)或多個(gè)平面層組合起來以增加該組織在z平面的總厚度。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)平面層在結(jié)構(gòu)和/或組成上基本類似。在其它實(shí)施方案中，每個(gè)平面層在結(jié)構(gòu)和/或組成上是基本上獨(dú)特的。例如參見圖18A-F。
[0047]如本文中使用的，“多層的”是指由兩個(gè)或多個(gè)組織層組成，其中每個(gè)組織層是一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞層的厚度。在一些實(shí)施方案中，組織層一次沉積一個(gè)。在其它實(shí)施方案中，同時(shí)沉積多個(gè)層。任選地，每個(gè)層是由多種細(xì)胞類型組成的。進(jìn)一步地，在每個(gè)層中的多種細(xì)胞類型任選地在χ-y平面(即:水平平面)上以空間限定的結(jié)構(gòu)相對(duì)于彼此排列。此外，在某些情況下，在Z-平面(即:垂直平面)上的層增加導(dǎo)致細(xì)胞在層內(nèi)相對(duì)于彼此的受控空間定位，使得空間限定的結(jié)構(gòu)在Z-平面上繼續(xù)。
[0048]如本文中使用的，“平面的”是指生物打印的多細(xì)胞組織的層，其中在該組織層的x-y平面內(nèi)，多個(gè)生物墨水組合物和/或空隙空間相對(duì)于彼此空間布置成設(shè)定的圖案。例如參見圖18A-F。
[0049]如本文中使用的，“支架”是指:合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝膠；非合成的支架，例如預(yù)形成的細(xì)胞外基質(zhì)層、死細(xì)胞層和脫細(xì)胞的組織，以及任何其它類型的預(yù)形成支架，它對(duì)于工程化組織和/或器官的物理結(jié)構(gòu)而言是必要的，并且不能在不損壞/破壞所述組織和/或器官的情況下從該組織和/或器官除去。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，脫細(xì)胞的組織支架包括脫細(xì)胞的天然組織或以任意方式由培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的脫細(xì)胞的細(xì)胞材料；例如，使之死亡或者脫細(xì)胞的細(xì)胞層，留下它們?cè)诨钪鴷r(shí)產(chǎn)生的ECM。因此，術(shù)語“無支架(scaffoldless)”意在隱含了:在使用時(shí)，支架不是工程化組織的必要部分，或者已經(jīng)被除去或者保留作為工程化組織的惰性部分?！盁o支架(Scaffoldless)”可以與“不含支架(scaffold-free) ”和“不含預(yù)形成的支架”互換使用。
[0050]如本文中使用的，“受試者”是指為人、非人的動(dòng)物、任意哺乳動(dòng)物或任意脊椎動(dòng)物的任意個(gè)體。該術(shù)語可以與“患者”、“受體”和“供體”互換。
[0051]如本文中使用的，“組織”是指細(xì)胞的聚集體。組織的實(shí)例包括但不限于:結(jié)締組織(例如，網(wǎng)形結(jié)締組織、致密結(jié)締組織、彈性組織、網(wǎng)狀結(jié)締組織和脂肪組織)、肌肉組織(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神經(jīng)組織和上皮組織(例如，單層上皮和復(fù)層上皮)、內(nèi)胚層來源的組織、中胚層來源的組織和外胚層來源的組織。 鉬織工稈[0052]組織工程是跨學(xué)科的領(lǐng)域，其應(yīng)用并結(jié)合了工程學(xué)和生命科學(xué)的原理，指向生物替代品的發(fā)展，該生物替代品通過器官或組織的增大(augmentation)、修復(fù)或更換來恢復(fù)、保持或改善組織功能。經(jīng)典組織工程學(xué)的基本方法是將活細(xì)胞接種到生物相容且最終可生物降解的環(huán)境中(例如支架)，隨后在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)該構(gòu)建體，以便初始細(xì)胞群進(jìn)一步擴(kuò)充和成熟，以在植入后生成目標(biāo)組織。采用模擬該生物細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的適當(dāng)支架，發(fā)育中的組織在一些情況下在體外和體內(nèi)成熟之后采取了所需器官的形態(tài)和功能。然而，由于控制細(xì)胞在整個(gè)支架上的分布和空間布置的能力有限，達(dá)到足夠高的細(xì)胞密度并具有類似于天然組織的結(jié)構(gòu)是具有挑戰(zhàn)性的。這些限制經(jīng)常導(dǎo)致組織或器官具有較差的機(jī)械性能和/或不足的功能。在支架的生物降解性、殘留聚合物的夾雜和制造工藝的工業(yè)規(guī)?；矫妫嬖陬~外的挑戰(zhàn)。已經(jīng)嘗試了無支架的方法。目前的無支架方法受到一些限制:
?復(fù)雜的平面和/或?qū)訝顜缀涡螤?，例如多層結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)或多個(gè)層在組成上或結(jié)構(gòu)上與其它層不同，或者其中一個(gè)或多個(gè)層在相對(duì)于彼此空間限定的位置中包含多種細(xì)胞類型，通常需要將細(xì)胞類型在特定的結(jié)構(gòu)中進(jìn)行明確的高分辨率的放置，以再現(xiàn)性地獲得類似天然組織的結(jié)果。
?規(guī)模和/或幾何形狀受到擴(kuò)散和/或營養(yǎng)供給需要功能血管網(wǎng)絡(luò)的限制。
?在一些情況下，組織的存活力受到限制材料的損害，該限制材料限制了擴(kuò)散并限制細(xì)胞獲得營養(yǎng)物。
[0053]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了工程化的哺乳動(dòng)物組織、工程化的血管壁節(jié)段、其陣列以及制造方法。本文中公開的組織工程方法具有以下優(yōu)點(diǎn):
?它們能夠產(chǎn)生包含細(xì)胞的組織和/或器官。 ?通過重新產(chǎn)生類似于天然組織的細(xì)胞間相互作用，它們模擬在天然組織的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和/或發(fā)病中發(fā)現(xiàn)的環(huán)境條件。
?它們?nèi)芜x地獲得活的三維組織和復(fù)合組織，其具有寬范圍的復(fù)雜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和幾何形狀(例如多層結(jié)構(gòu)、節(jié)段、片、管、囊等)。
?它們與自動(dòng)或半自動(dòng)制造手段相匹配，并且是可規(guī)模化的。
[0054]生物打印使得生成微小規(guī)模組織類似物的改善方法成為可能，包括對(duì)體外分析有用的那些(參見下文)。
牛物打印
[0055]在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁節(jié)段)及其陣列的至少一個(gè)部分是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，生物打印的構(gòu)建體是采用使用了快速原型技術(shù)的方法得到的，該快速原型技術(shù)是基于通過三維遞送裝置(例如生物打印機(jī))將細(xì)胞和任選的限制材料向(例如由水凝膠和/或多孔膜組成的)生物相容性表面上進(jìn)行三維、自動(dòng)化、計(jì)算機(jī)輔助的沉積，該細(xì)胞包括細(xì)胞溶液、細(xì)胞懸浮液、包含細(xì)胞的凝膠或漿料、細(xì)胞濃縮物、多細(xì)胞體(例如圓柱體、球形體、帶形體等)。如本文中使用的，在一些實(shí)施方案中，在用于指代組織和/或器官時(shí)，術(shù)語“工程化的”是指:根據(jù)計(jì)算機(jī)腳本，通過計(jì)算機(jī)輔助的裝置(例如生物打印機(jī))，將細(xì)胞、細(xì)胞溶液、細(xì)胞懸浮液、包含細(xì)胞的凝膠或漿料、細(xì)胞濃縮物、多細(xì)胞聚集體和它們的層放置以形成三維結(jié)構(gòu)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)腳本例如是一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)程序、計(jì)算機(jī)應(yīng)用或計(jì)算機(jī)模塊。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案，通過細(xì)胞或多細(xì)胞體的打印后融合來形成三維組織結(jié)構(gòu)，在一些情況下，這類似于早期形態(tài)發(fā)生中的自組裝現(xiàn)象。
[0056]盡管有許多方法可以用來將細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體和/或它們的層布置在生物相容性表面上以產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)，包括手動(dòng)放置，但通過自動(dòng)化的、計(jì)算機(jī)輔助的機(jī)器(例如生物打印機(jī))來放置是有利的。采用這種技術(shù)遞送細(xì)胞或多細(xì)胞體的優(yōu)點(diǎn)包括:快速、精確和可再現(xiàn)地放置細(xì)胞或多細(xì)胞體以產(chǎn)生構(gòu)建體，該構(gòu)建體表現(xiàn)出具有各種組成的細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體和/或它們的層的計(jì)劃的或預(yù)先確定的取向或圖案。優(yōu)點(diǎn)還包括確定的高細(xì)胞密度，同時(shí)使細(xì)胞破壞減至最小。
[0057]在一些實(shí)施方案中，生物打印方法是連續(xù)的和/或基本連續(xù)的。連續(xù)生物打印方法的非限制性實(shí)例是:經(jīng)由連接到生物墨水儲(chǔ)存器的分配末端(例如，注射器、毛細(xì)管等)從生物打印機(jī)分配生物墨水(例如細(xì)胞，與賦形劑或擠出化合物組合的細(xì)胞，或細(xì)胞的聚集體)。在進(jìn)一步的非限制性實(shí)施方案中，連續(xù)生物打印方法是按功能單元的重復(fù)圖案(pattern)分配生物墨水。在各個(gè)實(shí)施方案中，重復(fù)功能單元具有任何適宜的幾何形狀，包括例如:圓形、正方形、矩形、三角形、多邊形和不規(guī)則的幾何形狀，從而產(chǎn)生具有通過獨(dú)特生物墨水和/或間隙空間的空間圖案化而獲得的平面幾何形狀的一個(gè)或多個(gè)組織層。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，生物打印的功能單元的一個(gè)重復(fù)圖案包括一個(gè)層，相鄰地生物打印(例如堆疊)多個(gè)層以形成具有層狀幾何形狀的工程化組織或器官。在各個(gè)實(shí)施方案中，相鄰地生物打印(例如堆疊)了 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個(gè)或更多個(gè)層，以形成工程化組織或器官。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，具有層狀幾何形狀的組織的一個(gè)或多個(gè)層也具有平面幾何形狀。
[0058]在一些實(shí)施方案中，生物打印的功能單元以棋盤格狀圖案重復(fù)。“棋盤格狀圖案”是沒有向該平面填充重疊和 空隙的圖形平面。圖6A顯示任選地重復(fù)以產(chǎn)生圖6B-D和圖7所示的棋盤格狀圖案的功能單元的實(shí)例。作為非限制性的實(shí)例，連續(xù)和/或棋盤格狀生物打印的優(yōu)點(diǎn)包括提高的生物打印組織的生產(chǎn)率。另一個(gè)非限制性的示例性優(yōu)點(diǎn)是不需要將生物打印機(jī)與先前沉積的生物墨水元件對(duì)準(zhǔn)。在一些實(shí)施方案中，連續(xù)生物打印有利于從大型生物墨水儲(chǔ)存器打印較大的組織，該打印過程中任選地使用注射器機(jī)構(gòu)。連續(xù)的生物打印也是利用擠出化合物、水凝膠、聚合物、生物墨水或能夠在打印后保持其形狀的任何可打印材料，共打印空間限定的邊界的適宜方式；其中創(chuàng)建的邊界任選地通過生物打印一種或多種生物墨水填充，從而創(chuàng)建具有空間限定的平面幾何形狀的鑲嵌組織，例如參見圖17中說明的實(shí)施方案。
[0059]在一些實(shí)施方案中，連續(xù)生物打印中的方法包括:獨(dú)立地或相對(duì)于彼此優(yōu)化和/或平衡諸如打印高度、泵速、機(jī)撲速度或其組合的參數(shù)。在一個(gè)實(shí)例中，用于沉積的生物打印機(jī)頭速度為3mm/s,第一層的分配高度為0.5mm,而后面每個(gè)層的分配高度增加0.4mm0在一些實(shí)施方案中，該分配高度與生物打印機(jī)分配末端的直徑基本相等。不受限制地，適宜的和/或最佳的分配距離不會(huì)導(dǎo)致材料變平或附著到分配針上。在各個(gè)實(shí)施方案中，生物打印機(jī)分配末端具有約 20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100(^111或更大的內(nèi)徑，包括其中的增量。在各個(gè)實(shí)施方案中，生物打印機(jī)的生物墨水儲(chǔ)存器具有約 0.05,0.1,0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、
40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100立方厘米或更大的容積，包括其中的增量。在一些情況下，當(dāng)系統(tǒng)中的殘余壓力積累較低時(shí)，該泵速是適宜的或最佳的。在一些情況下，有利的泵速取決于儲(chǔ)存器的橫截面積與分配針之間的比例，該比例越大，則需要越低的泵速。在一些實(shí)施方案中，適宜的和/或最佳的打印速度使得能夠沉積均勻的線，而不影響材料的機(jī)械完整性。
[0060]本文中公開的發(fā)明包括商業(yè)方法。在一些實(shí)施方案中，本文中公開的技術(shù)和方法的速度和可放大性用來設(shè)計(jì)、構(gòu)建和操作用于生產(chǎn)供植入使用的工程化組織和/或器官或者用于生成基于細(xì)胞的工具(用于研究和開發(fā)，例如體外分析)的工業(yè)和/或商業(yè)設(shè)施。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，工程化組織和/或器官及其陣列被生產(chǎn)、儲(chǔ)存、分發(fā)、上市、宣傳并銷售，例如作為用于生物分析和高通量藥物篩選的細(xì)胞陣列(例如微陣列或芯片)、組織陣列(例如微陣列或芯片)以及試劑盒。在其它實(shí)施方案中，工程化組織和/或器官及其陣列被制造并用來進(jìn)行作為服務(wù)的生物分析和/或藥物篩選。
工程化組織
[0061]在一些實(shí)施方案中，本文中公開了活的三維組織構(gòu)建體，該三維組織構(gòu)建體包含至少一種粘附細(xì)胞類型，其中該至少一種粘附細(xì)胞類型被凝聚和融合，以形成具有多層結(jié)構(gòu)的組織構(gòu)建體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。在一些實(shí)施方案中，該組織為血管壁節(jié)段(例如，參見實(shí)施例16和圖12和13)。因此，在一些實(shí)施方案中，本文中公開了工程化的血管壁節(jié)段，該血管壁節(jié)段包含:平滑肌細(xì)胞；和任選的成纖維細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞；其中這些細(xì)胞彼此凝聚；其中該血管壁節(jié)段是生物打印的，并且是非管狀的。在其它的實(shí)施方案中，該組織是氣道類似物(例如，參見實(shí)施例15和圖10和圖11)。在一些實(shí)施方案中，該氣道類似物包含:肺成纖維細(xì)胞和任選的平滑肌細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞，其中該組織的至少一個(gè)表面層疊有小的氣道上皮細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，該組織是肝類似物(例如，參見實(shí)施例13和19以及圖6A-D、圖7和圖17A-B)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該肝組織類似物包含:肝細(xì)胞或類似肝細(xì)胞的細(xì)胞，和任選的膽管上皮細(xì)胞，和任選的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞類型，包括但不限于:星形細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞、免疫細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞。
[0062]在某些實(shí)施方案中，本文中還公開了工程化組織，該組織包含凝聚的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并進(jìn)一步包含一層或多層哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中該組織的至少一個(gè)部分是生物打印的。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)該組織層的特征在于平面幾何圖形，其中多種細(xì)胞類型或生物墨水類型和/或空隙空間存在于x-y平面中的空間限定的位置中。在一些實(shí)施方案中，該組織是多層的，其中至少一個(gè)層在結(jié)構(gòu)或組成上與其它層不同，賦予該組織特定的層狀幾何形狀。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該層在z平面中具有相似的厚度。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該層在z平面中具有可變的厚度。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，任意的單層為一個(gè)細(xì)胞層的厚度。在一些實(shí)施方案中，該組織為血管壁節(jié)段。因此，在某些實(shí)施方案中，本文還公開了工程化的血管壁節(jié)段，該血管壁節(jié)段包含凝聚的平滑肌細(xì)胞和在一個(gè)或多個(gè)表面上的內(nèi)皮細(xì)胞層、在一個(gè)或多個(gè)表面上的成纖維細(xì)胞層，或者兩者均具備，其中所述血管壁節(jié)段的至少一個(gè)部分是生物打印的；并且，其中所述血管壁節(jié)段是非管狀的。在其它的實(shí)施方案中，該組織為氣道類似物。在一些實(shí)施方案中，該氣道類似物包含:肺成纖維細(xì)胞和任選的平滑肌細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞，其中該組織的至少一個(gè)表面層疊有小的氣道上皮細(xì)胞。在其它的實(shí)施方案中，該組織為肝類似物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該肝組織類似物包含:肝細(xì)胞或類似肝細(xì)胞的細(xì)胞，和任選的膽管上皮細(xì)胞，和任選的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞類型，包括但不限于:星形細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞、免疫細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞。
[0063]在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁節(jié)段)是生物打印的，本文中描述的方法。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該工程化組織的至少一個(gè)部分是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物打印的部分包含凝聚的平滑肌細(xì)胞。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織的另外的部分是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，另外的生物打印層包含成纖維細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，如在本文中進(jìn)一步描述的，在制造或者使用時(shí)，該組織不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，作為通過組織工程技術(shù)(包括生物打印)制造的結(jié)果，作為機(jī)體的部分，本發(fā)明的組織進(jìn)一步區(qū)別于在體內(nèi)發(fā)育的組織。在一些實(shí)施方案中，單層的工程化組織由間質(zhì)組織組成，包含多種細(xì)胞類型，例如成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該間質(zhì)組織被層疊在包含普通的或組織-特殊的內(nèi)皮或上皮細(xì)胞的第二組織類型的一個(gè)或多個(gè)表面上。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第二組織層是連續(xù)的，并作為分子到支撐的間質(zhì)組織層的通道的阻礙。
[0064]在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁節(jié)段)包括任何類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在各個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織(包括血管壁節(jié)段)包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多種細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，該組織僅包括平滑肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該組織包括平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)施例3表明由人類主動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞和人類主動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞組成的多型圓柱形生物墨水的制造，而實(shí)施例4表明該圓柱體的生物打印和融合，以形成血管壁節(jié)段(例如，參見圖1、圖2a和圖2b)。實(shí)施例7表明:由從人類脂肪抽提物的基質(zhì)血管組分培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成的多型圓柱形生物墨水的制造，而實(shí)施例8表明該圓柱體的生物打印和融合，以形成血管壁節(jié)段。在其它實(shí)施方案中，該組織包括平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。在另外的其它實(shí)施方案中，該組織包括平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。實(shí)施例5表明由人類主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、人類皮膚成纖維細(xì)胞和人類主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞組成的多型圓柱形生物墨水的制造，而實(shí)施例6表明該圓柱體的生物打印和融合，以形成血管壁節(jié)段。在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁節(jié)段)的細(xì)胞被“凝聚”或彼此“粘附”。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，“凝聚”和“粘附”指將細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體、多細(xì)胞體和/或它們的層結(jié)合的細(xì)胞-細(xì)胞粘附性質(zhì)。
[0065]在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁節(jié)段)包括在一個(gè)或多個(gè)表面上的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞層。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞層位于該凝聚的平滑肌細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)表面上。在進(jìn)一步的各個(gè)實(shí)施方案中，在該凝聚的平滑肌細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)表面上，存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)細(xì)胞層。在更進(jìn)一步的各個(gè)實(shí)施方案中，在凝聚的平滑肌細(xì)胞的1、2、3、4或更多個(gè)表面上，存在至少一個(gè)細(xì)胞層，從而構(gòu)建在該工程化組織中的層狀幾何形狀。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)該層的特征在于具有平面幾何形狀。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該工程化組織的多個(gè)層具有平面幾何形狀；其中該平面幾何形狀在層間是可變的，或者是相同的。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在制造過程中將單層中的平面幾何形狀(x-y平面)定位，以便在該復(fù)合組織的Z-平面中創(chuàng)建另外的幾何形狀(例如，參見圖18D-F代表的實(shí)施方案)。
[0066] 在一些實(shí)施方案中，組織層包含單細(xì)胞層。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該單層是匯合的(confluent)。在其它實(shí)施方案中，該單層不是匯合的。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞層包含一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞片。在各個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞片為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個(gè)細(xì)胞厚(包括其中的增量)。在其它各個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞片為約 3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500μπι 厚或更厚(包括其中的增量)。在一些實(shí)施方案中，組織層包含融合的細(xì)胞聚集體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在融合之前，作為非限制性的實(shí)例，該細(xì)胞聚集體具有限定的形狀和/或結(jié)構(gòu)，為基本上球形的、細(xì)長(zhǎng)的、基本上圓柱形的和類似帶的形狀。在各個(gè)實(shí)施方案中，融合的細(xì)胞聚集體形成大約 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、50(^111厚或更厚(包括其中的增量)的層。
[0067] 在一些實(shí)施方案中，該一個(gè)或多個(gè)層包括任何種類的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在各個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，每個(gè)層包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20
或更多種細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，該工程化組織(包括血管壁片段)包括在一個(gè)或多個(gè)表面上的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞層。實(shí)施例9表明血管壁節(jié)段的構(gòu)建，包括:生物打印包含圓柱形平滑肌細(xì)胞生物墨水的血管中膜組織層，之后在上表面施加第二層內(nèi)皮細(xì)胞，并通過直接在SMC構(gòu)建體上生物打印細(xì)胞濃縮物以形成層狀幾何形狀而獲得，其重現(xiàn)了該血管壁的中膜和內(nèi)膜。實(shí)施例10表明血管壁節(jié)段的構(gòu)建，包括:生物打印包含人類主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的圓柱形生物墨水，之后在上表面施加內(nèi)皮細(xì)胞層，通過特定定位的內(nèi)皮細(xì)胞液滴在SMC構(gòu)建體上沉積而獲得。在一些實(shí)施方案中，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)包括在一個(gè)或多個(gè)表面上的一個(gè)或多個(gè)成纖維細(xì)胞層。
[0068]在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁片段)包括在一個(gè)或多個(gè)表面上的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞層和在一個(gè)或多個(gè)表面上的一個(gè)或多個(gè)成纖維細(xì)胞層。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該一個(gè)或多個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞層與一個(gè)或多個(gè)成纖維細(xì)胞層位于相同的表面上。在其它實(shí)施方案中，該一個(gè)或多個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞層與一個(gè)或多個(gè)成纖維細(xì)胞層位于不同的表面上。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該多層結(jié)構(gòu)中的一個(gè)或多個(gè)層的特征進(jìn)一步在于具有平面幾何形狀。
[0069]實(shí)施例11表明血管壁節(jié)段的構(gòu)建，包括:將包含人類主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的圓柱形生物墨水直接生物打印到第一層成纖維細(xì)胞上，之后在上表面施加包含內(nèi)皮細(xì)胞的第三層，從而創(chuàng)建三層的層狀幾何形狀，其中每個(gè)層在組成上是不同的，并且具有可變的厚度和結(jié)構(gòu)(例如參見圖12)。通過將內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液的特定定位液滴沉積在該構(gòu)建體上，來施加該內(nèi)皮細(xì)胞層。實(shí)施例11的方法導(dǎo)致形成三層的組織，其包含凝聚的平滑肌細(xì)胞、在該平滑肌細(xì)胞一個(gè)表面上的成纖維細(xì)胞層和在該平滑肌細(xì)胞相對(duì)的表面上的成纖維細(xì)胞層。每個(gè)層中的細(xì)胞彼此凝聚，并且位于層間界面的細(xì)胞也凝聚，從而通過細(xì)胞相互作用將各個(gè)層粘合在一起(例如，參見圖4a和4b)。
[0070]在各個(gè)實(shí)施方案中，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)為任意合適的尺寸。在一些實(shí)施方案中，生物打印的組織(包括血管壁節(jié)段)的尺寸隨時(shí)間而改變。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，由于例如細(xì)胞遷移、細(xì)胞死亡、細(xì)胞間的相互作用、壓縮或其它形式的收縮，導(dǎo)致在生物打印后生物打印的組織收縮或縮小。在其它實(shí)施方案中，在生物打印后，由于例如細(xì)胞遷移、細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖、天然組織的細(xì)胞外基質(zhì)或其它產(chǎn)生細(xì)胞的部分的產(chǎn)生、細(xì)胞/組織的成熟或其它形式的擴(kuò)展，導(dǎo)致在生物打印后生物打印的組織成長(zhǎng)或擴(kuò)展。
[0071]在一些實(shí)施方案中，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)的物理尺寸受到營養(yǎng)物質(zhì)(包括氧)擴(kuò)散到該構(gòu)建體內(nèi)部的能力的限制。在各個(gè)實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)在其最小維度上為至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或 ΙΟΟΟμπι。在各個(gè)實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)在其最小維度上為至少約0.25,0.5,0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75 或 5.0mm。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)在其最小維度上為約25 μ m至約500 μ m。在其它實(shí)施方案中，在制造時(shí)，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)在其最大維度上小于3cm。
[0072]在各個(gè)實(shí)施方案中，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)為任意合適的形狀。在一些實(shí)施方案中，選擇形狀以模擬特定的天然組織或器官。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，選擇形狀以模擬特定的病理、病狀或疾病狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)具有基本上為平面的形狀。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，平面的組織具有任何適宜的平面幾何形狀，作為非限制性的示例，包括正方形、矩形、多邊形、圓形、橢圓形或不規(guī)則形狀。在一些實(shí)施方案中，在工程化組織中，通過特定細(xì)胞或生物墨水部分和/或空隙空間在x-y平面中相對(duì)于彼此的定位，來形成平面的幾何形狀。在一些實(shí)施方案中，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)具有基本上為片狀或圓盤的形狀。在一些實(shí)施方案中，該工程化血管壁節(jié)段具有非管狀的形狀，為血管壁節(jié)段、補(bǔ)片或片，而不是血管。
[0073]在一些實(shí)施方案中，通過適于在空間中相對(duì)于容納容器固定該組織的位置的方式將該工程化組織(包括血管 壁節(jié)段)固定在該容納容器中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該工程化組織被固定在表面上。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該工程化組織被固定在生物相容性表面上。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，如本文中描述的，通過固定在表面上和空間排布，將多個(gè)組織關(guān)聯(lián)以形成陣列。在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁節(jié)段)在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力(例如，參見圖13)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，施加的剪切力用來促進(jìn)組織的成熟和發(fā)育和/或促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的遷移、分化、增殖、沉積；或者促進(jìn)蛋白質(zhì)或分子進(jìn)入組織內(nèi)的細(xì)胞或從組織內(nèi)的細(xì)胞流出的轉(zhuǎn)運(yùn)。
組織幾何形狀
[0074]天然組織的特征在于:存在由組織的細(xì)胞和細(xì)胞外(即:空隙空間、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白質(zhì)物質(zhì)等)組分驅(qū)動(dòng)的空間和組成圖案。部署合成支架以獲得三維形狀的組織工程化策略的固有挑戰(zhàn)是:不能既復(fù)制天然組織的幾何形狀又復(fù)制生物屬性。迄今為止，在支架結(jié)構(gòu)內(nèi)構(gòu)建類似于天然組織的層狀或平面幾何形狀、同時(shí)也允許在模擬天然組織的密度下引入細(xì)胞的嘗試，被技術(shù)局限所妨礙。通過由細(xì)胞組成的生物墨水的空間限定沉積，根據(jù)在圖18A-F中說明的實(shí)例，生物打印克服了這兩個(gè)固有挑戰(zhàn)(平面/層狀幾何形狀和細(xì)胞密度)。在一些實(shí)施方案中，平面幾何形狀是從多生物墨水制劑創(chuàng)建的，從而根據(jù)在圖18A-C中闡明的實(shí)例，以將每個(gè)組織部分/細(xì)胞群/生物墨水制劑在X、y和/或z平面內(nèi)相對(duì)于彼此受限的位置中放置的方法，來制造兩個(gè)或更多個(gè)組織部分(即:間質(zhì)的、上皮的、血管的、骨骼、軟骨、實(shí)質(zhì)的、皮層的、骨髓的、乳頭的、小葉的(lobular)等等)。在一些實(shí)施方案中，通過生物打印來形成該平面幾何形狀。在一些實(shí)施方案中，該平面幾何形狀重現(xiàn)了腺組織、癌組織、組織界面(骨:例如軟骨)、血管化組織、椎體組織、帶狀組織或分葉狀組織中的至少一個(gè)空間元件。在一些實(shí)施方案中，該平面幾何形狀引入空隙空間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在平面幾何形狀中的空隙空間容納模擬體液的至少一個(gè)部分的流體，例如血液、淋巴、膽汁、尿、分泌物等。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該空隙空間任選地含有非粘附細(xì)胞類型或體液衍生的部分(例如，血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、免疫細(xì)胞、癌細(xì)胞、血小板、蛋白質(zhì)等等)。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，體液衍生部分的非粘附細(xì)胞類型任選地作為非空隙空間部分存在，該非空隙空間部分在制造之前、期間或之后已經(jīng)被引入到該平面幾何形狀的包含細(xì)胞的部分中。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，非粘附細(xì)胞部分或體液衍生部分從空隙空間補(bǔ)充進(jìn)入平面幾何形狀中包含細(xì)胞的空間中，作為細(xì)胞間相互作用或?qū)Ψ置谝蛩胤磻?yīng)的結(jié)果O
[0075]在一些實(shí)施方案中，任選地通過在幾何形狀內(nèi)部的空隙空間來啟動(dòng)流體流動(dòng)或灌注。在一些實(shí)施方案中，平面幾何形狀允許產(chǎn)生組織-組織或組織-液體界面，如在圖18B中突出的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在容器中制造該組織，該容器是光學(xué)透明的，以允許實(shí)時(shí)觀察在按幾何形狀創(chuàng)建的界面處的細(xì)胞。
[0076]在一些實(shí)施方案中，組織包含多個(gè)層，其中這些層中的至少一個(gè)在結(jié)構(gòu)或組成上與該構(gòu)建體中的其它層不同，從而在Z-平面中創(chuàng)建層狀結(jié)構(gòu)。層狀結(jié)構(gòu)的實(shí)例包括屏障組織，其擁有到底層間質(zhì)組織的內(nèi)皮或上皮屏障，如由在圖18D-F中所示的實(shí)例中所描繪的。在一些實(shí)施方案中，層狀組織表示管腔或管狀結(jié)構(gòu)(例如，腸、血管、淋巴管、腎小管、輸尿管、膀胱、氣管、食管、氣道、輸卵管、尿道、導(dǎo)管結(jié)構(gòu)等等)。在其它實(shí)施方案中，層狀組織表示組織(例如，粘膜組織、皮膚組織、腎組織、心肌組織等等)的多個(gè)帶或?qū)?例如，參見圖8-11)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，組織的一個(gè)或多個(gè)層合并了血管或微血管部分。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，血管或微血管部分的合并導(dǎo)致在該工程化組織的一個(gè)或多個(gè)部分中形成了微血管或假血管網(wǎng)。在一些實(shí)施方案中，具有層狀幾何形狀的該組織的一個(gè)或多個(gè)部分是生物打印的。在一些實(shí)施方案中，彼此鄰近地制造具有層狀幾何形狀的一個(gè)或多個(gè)組織，從而產(chǎn)生組織界面，例如在圖18E中繪制的粘膜皮膚連接。
[0077]在一些實(shí)施方案中，根據(jù)在圖18F中闡明的非限制性實(shí)例，具有層狀幾何形狀的多層工程化組織的一個(gè)或多個(gè)層也包括平面的幾何形狀。在一些實(shí)施方案中，在每個(gè)層中延續(xù)同樣的平面幾何形狀，導(dǎo)致形成在X、y和z平面中具有連續(xù)結(jié)構(gòu)的三維組織。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)在圖18F中說明的腎小管的非限制性實(shí)例，一個(gè)或多個(gè)層狀層的組成或平面幾何形狀是變化的，使得所產(chǎn)生的三維組織在X、y和z平面中均具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。
MM
[0078]在一些實(shí)施方案中，本文中公開了包含一種或多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型的工程化組織。在一些實(shí)施方案中，本文中還公開了工程化的血管壁節(jié)段，該血管壁節(jié)段包含平滑肌細(xì)胞和任選的成纖維細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，該組織為氣道類似物。在一些實(shí)施方案中，該氣道類似物包含:肺成纖維細(xì)胞和任選的平滑肌細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞，其中該組織的至少一個(gè)表面層疊有小氣道上皮細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，該組織為肝類似物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案 中，該肝組織類似物包含:肝細(xì)胞或類似肝細(xì)胞的細(xì)胞，和任選的膽管上皮細(xì)胞，和任選的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞類型，包括但不限于:星形細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞、免疫細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞。
[0079]在一些實(shí)施方案中，任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞適合于包括在該工程化組織及其陣列中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該工程化組織的至少一個(gè)部分是粘附細(xì)胞類型。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，作為非限制性的實(shí)例，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞是:收縮或肌肉細(xì)胞(例如，骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成肌細(xì)胞)、結(jié)締組織細(xì)胞(例如，骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或淋巴組織的細(xì)胞)、骨髓細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、上皮細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、血管細(xì)胞、血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、許旺細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰細(xì)胞、肺細(xì)胞、氣管細(xì)胞、角膜細(xì)胞、泌尿生殖細(xì)胞、腎細(xì)胞、生殖細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、間皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、未分化的細(xì)胞(如胚細(xì)胞、干細(xì)胞和祖細(xì)胞)、內(nèi)胚層來源的細(xì)胞、中胚層來源的細(xì)胞、外胚層來源的細(xì)胞、癌來源的細(xì)胞和它們的組合。
[0080]在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。在再一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。在包括超過一種細(xì)胞類型的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞類型以多種合適的比例存在，其實(shí)例如本文所述。
[0081]在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是成體的、分化的細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，“分化的細(xì)胞”是在分離時(shí)具有與例如平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞一致的組織特異性表型的細(xì)胞，其中從分離時(shí)到使用時(shí)都保持著組織特異性表型(或顯示該表型的潛能)。在其它實(shí)施方案中，該細(xì)胞是成體的、未分化的細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，“未分化的細(xì)胞”是不具有或已經(jīng)喪失例如平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的明確組織特異性性狀的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，未分化的細(xì)胞包括干細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，“干細(xì)胞”是表現(xiàn)出潛能和自我更新的細(xì)胞。干細(xì)胞包括但不限于:全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、多潛能細(xì)胞、寡能細(xì)胞、單能細(xì)胞和祖細(xì)胞。在各個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、羊膜干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。在另外其它的實(shí)施方案中，該細(xì)胞是成體的分化細(xì)胞與成體的未分化細(xì)胞的混合物。
[0082]在一些實(shí)施方案中，該平滑肌細(xì)胞是人類平滑肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，作為非限制性的實(shí)例，合適的平滑肌細(xì)胞來源于包括以下組織的組織:血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、骨髓和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞為人類內(nèi)皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，作為非限制性的實(shí)例，適宜的內(nèi)皮細(xì)胞來源于包括以下的組織:血液、血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、骨髓和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞為人類成纖維細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，適宜的成纖維細(xì)胞為非血管的成纖維細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，適宜的成纖維細(xì)胞來源于血管外膜。在一些實(shí)施方案中，一些或所有的細(xì)胞來源于哺乳動(dòng)物脂肪抽吸物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，一些或所有的細(xì)胞是由哺乳動(dòng)物脂肪抽吸物的基質(zhì)血管組分培養(yǎng)的。參見實(shí)施例1。
[0083]在各個(gè)實(shí)施方案中，基于特定的研究目的或目標(biāo)來選擇、配置、處理或調(diào)整細(xì)胞的細(xì)胞類型和/或來源。在一些實(shí)施方案中，選擇、配置、處理或調(diào)整一種或多種特定的細(xì)胞類型，以促進(jìn)對(duì)特定疾病或狀況的研究。在一些實(shí)施方案中，選擇、配置、處理或調(diào)整一種或多種特定的細(xì)胞類型，以促進(jìn)對(duì)特定受試者的疾病或狀況的研究。在一些實(shí)施方案中，一種或多種特定的細(xì)胞類型來源于兩個(gè)或更多個(gè)不同的人類供體。在一些實(shí)施方案中，一種或多種特定的細(xì)胞類型來源于特定的脊椎動(dòng)物受試者。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，一種或多種特定的細(xì)胞類型來源于特定的哺乳動(dòng)物受試者。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，一種或多種特定的細(xì)胞類型來源于特定的人類受試者。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，一種或多種特定的細(xì)胞類型來源于具有與疾病或組織功能有關(guān)的特定表型的特定受試者。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，受試者特異性的細(xì)胞通過活檢或組織采樣的方式，從所關(guān)注的目標(biāo)組織中分離出來。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，受試者特異性的細(xì)胞在分離之后立即用來制造組織。在其它實(shí)施方案中，在用于制造三維組織之前，將受試者特異性的細(xì)胞在體外操作；其中該操作包括如下的一種或多種:擴(kuò)充、分化、定向分化、增殖、暴露于蛋白質(zhì)或核酸、引入遺傳載體、引入遺傳或非遺傳的細(xì)胞示蹤部分、去分化(即:生成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或等效物)、冷凍保存。在一些實(shí)施方案中，從不同于目標(biāo)組織的組織來分離受試者特異性的細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該受試者特異性的細(xì)胞需要在目標(biāo)組織內(nèi)部分化成所關(guān)注的細(xì)胞類型。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，需要分化的受試者特異性的細(xì)胞在制造成三維結(jié)構(gòu)之前、期間或之后分化。
培養(yǎng)細(xì)胞的方法
[0084]在本發(fā)明的工程化組織中使用的細(xì)胞類型以本領(lǐng)域已知的任何方式適當(dāng)?shù)嘏囵B(yǎng)。細(xì)胞和組織培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域已知的，并且例如描述在Freshney, R.，Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Techniques, Wiley (1987)中，為了這些信息通過引用將其內(nèi)容并入本文。在 Doyle, A.，Griffiths, J.B.，Newell, D.G.，(編)Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures, Wiley (1998)中也描述了適合與本發(fā)明一起使用的普通哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，為了這些信息通過引用將其內(nèi)容并入本文。
[0085]適合于培養(yǎng)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)條件是本領(lǐng)域公知的。例如參見實(shí)施例1。細(xì)胞培養(yǎng)基通常包括必需營養(yǎng)物和任選的附加成分，例如生長(zhǎng)因子、鹽、礦物質(zhì)、維生素、富含血小板的血漿等，它們是任選地根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞類型而選擇的。在一些實(shí)施方案中，選擇特定的成分來加強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和特異性蛋白質(zhì)的分泌等。通常，標(biāo)準(zhǔn)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)或低葡萄糖及110mg/L丙酮酸鹽和谷氨酰胺，補(bǔ)充1-20%的胎牛血清(FBS)、牛血清或人血清、100U/mL青霉素和0.lmg/mL鏈霉素是適當(dāng)?shù)模缤绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種其它標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。優(yōu)選地，細(xì)胞在無菌條件下、在1-21% O2和優(yōu)選3-5% CO2的氣氛中、在接近或達(dá)到細(xì)胞來源動(dòng)物體溫的溫度下培養(yǎng)。例如，人類細(xì)胞優(yōu)選在約37 °C下培養(yǎng)。
[0086] 細(xì)胞任選地與細(xì)胞分化劑一起培養(yǎng)，以誘導(dǎo)細(xì)胞沿著期望的路線分化。例如，細(xì)胞任選地與生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等一起培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“生長(zhǎng)因子”指蛋白質(zhì)、多肽或多肽的復(fù)合物，包括細(xì)胞因子，它們是由細(xì)胞產(chǎn)生的，并且影響其自身和/或多種相鄰的或遠(yuǎn)處的其它細(xì)胞。一般而言，生長(zhǎng)因子或者發(fā)育性地或者響應(yīng)于眾多生理學(xué)或環(huán)境刺激影響特定類型的細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或分化。一些但不是全部生長(zhǎng)因子是激素。示例性的生長(zhǎng)因子是胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs，包括堿性FGF(bFGF))、血小板衍生生長(zhǎng)因子O3DGFs,包括TOGF-AA和TOGF-AB)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α (TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β，包括TGFβ I和TGFP 3)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、IL-8 等。除了其它地方外，在Molecular Cell Biology, Scientific AmericanBooks, Darnell 等人編，1986 !Principles of Tissue Engineering,第二版，Lanza 等人編，Academic Press, 2000中討論了生長(zhǎng)因子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解:在本文描述的條件培養(yǎng)基中的任何及所有培養(yǎng)物衍生的生長(zhǎng)因子都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
生物墨水和多細(xì)胞聚集體
[0087]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了包含生物打印的細(xì)胞的三維活組織(包括血管壁節(jié)段)、其陣列和方法。在一些實(shí)施方案中，通過從生物打印機(jī)沉積或擠出生物墨水來生物打印細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，“生物墨水”包括包含多個(gè)細(xì)胞的液體、半固體或固體組合物。在一些實(shí)施方案中，生物墨水包含液體或半固體的細(xì)胞溶液、細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞濃縮物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞溶液、懸浮液或濃縮物包含液體或半固體(例如粘性的)載體和多個(gè)細(xì)胞。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該載體是合適的細(xì)胞營養(yǎng)培養(yǎng)基，例如本文中描述的那些。在一些實(shí)施方案中，在生物打印之前，生物墨水包含多個(gè)細(xì)胞，這些細(xì)胞任選地凝聚成多細(xì)胞聚集體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，生物墨水包含多個(gè)細(xì)胞，并被生物打印以產(chǎn)生特定的平面和/或?qū)訝顜缀涡螤?；其中在生物打印之前、期間和/或之后，生物墨水中的個(gè)體細(xì)胞發(fā)生凝聚。在一些實(shí)施方案中，該生物墨水是通過如下方法產(chǎn)生的:1)在固定的體積中收集多個(gè)細(xì)胞；其中細(xì)胞組分占總體積的至少約30%且至多100%。在一些實(shí)施方案中，生物墨水包含半固體或固體的多細(xì)胞聚集體或多細(xì)胞體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過如下步驟產(chǎn)生生物墨水:1)以 預(yù)先確定的比例，將多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞聚集體與生物相容性液體或凝膠混合，以形成生物墨水；和2)使該生物墨水致密化，以產(chǎn)生具有期望的細(xì)胞密度和粘度的生物墨水。在一些實(shí)施方案中，通過離心作用、切向流過濾(“TFF”)或其組合來實(shí)現(xiàn)生物墨水的致密化。在一些實(shí)施方案中，生物墨水的致密化產(chǎn)生了可擠出的組合物，從而允許形成多細(xì)胞聚集體或多細(xì)胞體。在一些實(shí)施方案中，“可擠出的”是指能夠通過被迫(例如在壓力下)穿過噴嘴或孔口(例如，一個(gè)或多個(gè)洞或管)而成形。在一些實(shí)施方案中，生物墨水的致密化是由細(xì)胞生長(zhǎng)到合適的密度而引起的。該生物墨水所需的細(xì)胞密度會(huì)隨著所使用的細(xì)胞和要產(chǎn)生的組織或器官而改變。在一些實(shí)施方案中，該生物墨水的細(xì)胞是凝聚和/或粘附的。在一些實(shí)施方案中，“凝聚(cohere) ”、“凝聚的(Cohered)IP“凝聚(cohesion) ”指將細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體、多細(xì)胞體和/或它們的層結(jié)合起來的細(xì)胞-細(xì)胞粘附性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該術(shù)語可以與“融合(fuse) ”、“融合的(fused)”和“融合(fusion)”互換使用。在一些實(shí)施方案中，該生物墨水另外包含支持材料、細(xì)胞培養(yǎng)基(或其補(bǔ)充物)、細(xì)胞外基質(zhì)(或其組分)、細(xì)胞粘著劑、細(xì)胞死亡抑制劑、抗凋亡劑、抗氧化劑、擠出化合物和它們的組合。
[0088]在各個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞是任何合適的細(xì)胞。在進(jìn)一步的各個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、人類細(xì)胞或它們的組合。在一些實(shí)施方案中，在本文公開的方法中使用的細(xì)胞類型取決于要產(chǎn)生的構(gòu)建體或組織的類型。在一些實(shí)施方案中，該生物墨水包含一種類型的細(xì)胞(也被稱為“均質(zhì)”或“單型”生物墨水)。在一些實(shí)施方案中，該生物墨水包含超過一種類型的細(xì)胞(也被稱為“異質(zhì)”或“多型”生物墨水)。
細(xì)胞培養(yǎng)基
[0089]在一些實(shí)施方案中，該生物墨水包含細(xì)胞培養(yǎng)基。該細(xì)胞培養(yǎng)基是任何合適的培養(yǎng)基。在各個(gè)實(shí)施方案中，作為非限制性的實(shí)例，合適的細(xì)胞培養(yǎng)基包括=Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水、Earle平衡鹽、Hanks平衡鹽、Tyrode鹽、Alsever溶液、Gey平衡鹽溶液、Kreb' s-Henseleit改良緩沖系、Kreb’ s-Ringer碳酸氫鹽緩沖系、Puck鹽水、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基/營養(yǎng)F_12Ham、營養(yǎng)混合物F_10Ham(Ham’ sF-10)、培養(yǎng)基199、基本必需培養(yǎng)基Eagle、RPM1-1640培養(yǎng)基、Ames培養(yǎng)基、BGJb培養(yǎng)基(Fitton-Jackson 改良)、Click 培養(yǎng)基、CMRL-1066 培養(yǎng)基、Fischer 培養(yǎng)基、Glascow 基本必需培養(yǎng)基(GMEM)、Iscove 改良 Dulbecco 培養(yǎng)基(IMDM)、L-15 培養(yǎng)基(Leibovitz)、McCoy5A改良培養(yǎng)基、NCTC培養(yǎng)基、Swim S-77培養(yǎng)基、Waymouth培養(yǎng)基、WiIIiam培養(yǎng)基E或它們的組合。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)基得到改良或補(bǔ)充。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含白蛋白、硒、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胎球蛋白、糖、氨基酸、維生素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素、抗生素、脂質(zhì)、脂質(zhì)載體、環(huán)糊精、富血小板血漿或它們的組合。
細(xì)胞外基質(zhì)
[0090]在一些實(shí)施方案中，該生物墨水進(jìn)一步包含細(xì)胞外基質(zhì)或其衍生物的一種或多種組分。在一些實(shí)施方案中，“細(xì)胞外基質(zhì)”包括由細(xì)胞產(chǎn)生并從細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外隙內(nèi)的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞外隙中它們作為支持物將組織保持在一起、提供拉伸強(qiáng)度和/或促進(jìn)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。細(xì)胞外基質(zhì)組分的實(shí)例包括但不限于:膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸鹽、彈性蛋白和蛋白聚糖。例如，在一些實(shí)施方案中，該多細(xì)胞聚集體含有多種ECM蛋白質(zhì)(例如，明膠、纖維蛋白原、纖維蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖)。任選地將ECM組分或ECM組分的衍生物加入到用于形成多細(xì)胞聚集體的細(xì)胞漿料中。加入到細(xì)胞衆(zhòng)料中的ECM組分或ECM組分的衍生物任選地從人類或動(dòng)物源純化,或者通過本領(lǐng)域已知的重組方法產(chǎn)生?；蛘撸揈CM組分或ECM組分的衍生物是由細(xì)長(zhǎng)細(xì)胞體內(nèi)的細(xì)胞自然分泌的，或者用于形成該細(xì)長(zhǎng)細(xì)胞體的細(xì)胞任選地通過任何本領(lǐng)域已知的合適方法進(jìn)行遺傳操作，以改變一種或多種ECM組分或ECM組分的衍生物和/或一種或多種細(xì)胞粘附分子或細(xì)胞- 基底粘附分子(例如，選擇素、整合素、免疫球蛋白和粘附素)的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，ECM組分或ECM組分的衍生物促進(jìn)細(xì)胞在多細(xì)胞聚集體中的凝聚。例如，將明膠和/或纖維蛋白原適當(dāng)?shù)丶尤氲郊?xì)胞漿料中，該漿料用于形成多細(xì)胞聚集體。通過加入凝血酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。
[0091]在一些實(shí)施方案中，該生物墨水進(jìn)一步包含促進(jìn)細(xì)胞粘附的試劑。
[0092]在一些實(shí)施方案中，該生物墨水進(jìn)一步包含抑制細(xì)胞死亡(例如，壞死、凋亡或自體吞噬)的試劑。在一些實(shí)施方案中，該生物墨水進(jìn)一步包含抗凋亡劑。抑制細(xì)胞死亡的試劑包括但不限于:小分子、抗體、肽、肽體或它們的組合。在一些實(shí)施方案中，抑制細(xì)胞死亡的試劑選自:抗-TNF試劑、抑制白細(xì)胞介素活性的試劑、抑制干擾素活性的試劑、抑制GCSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)活性的試劑、抑制巨噬細(xì)胞炎性蛋白活性的試劑、抑制TGF-B (轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B)活性的試劑(例如，參見圖15和16)、抑制MMP (基質(zhì)金屬蛋白酶)活性的試劑、抑制胱天蛋白酶活性的試劑、抑制MAPK/JNK信號(hào)級(jí)聯(lián)活性的試劑、抑制Src激酶活性的試劑、抑制JAKCJanus激酶)活性的試劑或它們的組合。在一些實(shí)施方案中，該生物墨水包含抗氧化劑。在一些實(shí)施方案中，該生物墨水包含氧攜帶者或其它的細(xì)胞特異性營養(yǎng)物。
擠出化合物[0093]在一些實(shí)施方案中，該生物墨水進(jìn)一步包含擠出化合物(即，改變生物墨水的擠出性質(zhì)的化合物)。擠出化合物的實(shí)例包括但不限于:凝膠、水凝膠、肽水凝膠、基于氨基酸的凝膠、表面活性劑多元醇(例如Pluronic F-127或PF-127)、熱響應(yīng)性聚合物、透明質(zhì)酸鹽、藻酸鹽、細(xì)胞外基質(zhì)組分(及其衍生物)、膠原、其它生物相容性天然或合成聚合物、納米纖維和自組裝的納米纖維。在一些實(shí)施方案中，在生物打印之后，通過物理、化學(xué)或酶的方式將擠出化合物除去。
[0094]已經(jīng)以各種方式定義了凝膠，有時(shí)被稱作膠狀物。例如，《美國藥典》將凝膠定義為由小無機(jī)粒子組成的懸浮液或被液體互相滲透的大有機(jī)分子組成的半固體體系。凝膠包括單相或兩相體系。單相凝膠由均勻分布在整個(gè)液體中的有機(jī)大分子組成，其分布方式使得在分散的大分子和液體之間不存在明顯的邊界。某些單相凝膠是由合成大分子(例如卡波姆)或由天然樹膠(例如西黃蓍膠)制備的。在一些實(shí)施方案中，單相凝膠通常是水性的，但是也可以利用醇和油來制備。兩相凝膠由小離散微粒的網(wǎng)絡(luò)組成。
[0095]在某些情況下，凝膠被分類為親水的或疏水的。在某些實(shí)施方案中，疏水凝膠的基質(zhì)由液體石蠟與聚乙烯，或用膠態(tài)二氧化硅，或鋁或鋅皂膠凝的脂肪油組成。相反，親水凝膠的基質(zhì)一般由用合適的膠凝劑(例如，西黃蓍膠、淀粉、纖維素衍生物、羧乙烯基聚合物和硅酸鎂鋁)膠凝的水、甘油或丙二醇組成。在某些實(shí)施方案中，本文中公開的組合物或裝置的流變學(xué)是假塑性、塑性、觸變性或膨脹性的。
[0096]適宜的水凝膠包括衍生自膠原、透明質(zhì)酸鹽、纖維蛋白、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖及其組合的水凝膠。在其它實(shí)施方案中，適宜的水凝膠是合成聚合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，適宜的水凝膠包括衍生自聚(丙烯酸)或其衍生物、聚(環(huán)氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其組合的水凝膠。在各個(gè)具體實(shí)施方案中，限制材料選自:水凝膠、NovoGel?、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、Matrigel?、透明質(zhì)酸、泊洛沙姆、肽水凝膠、聚(異丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羥乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、絲或它們的組合。
[0097]在一些實(shí)施方案中，基于水凝膠的擠出化合物是熱可逆凝膠(也稱為熱響應(yīng)性凝膠或熱凝膠)。在一些實(shí)施方案中，合適的熱可逆水凝膠在室溫下不是液體。在具體實(shí)施方案中，合適的水凝膠的膠凝溫度(Tgel)為約10°C、1TC、12°C、13°C、14°C、15°C、16°C、17 °C ,18 °C >19 °C >20 °C >21 °C >22 °C >23 °C >24 °C >25 °C >26 °C >27 °C >28 °C、29 °C、30 °C、31 °C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、37°C、38°C、39°C、40°C，包括其中的增量。在某些實(shí)施方案中，合適的水凝膠的Tgel為約10°C至約40°C。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，合適的水凝膠的Tgel為約20°C至約30°C。在一些實(shí)施方案中，本文所述的生物墨水(例如，包含水凝膠、一種或多種細(xì)胞類型和其它添加劑等)在室溫下不是液體。在一些實(shí)施方案中，合適的熱可逆水凝膠在哺乳動(dòng)物的體溫下不是液體。在具體的實(shí)施方案中，合適的水凝膠的膠凝溫度(Tgel)為約 22°C、23°C、24t:、25t:、26t:、27t:、28t:、29t:、3(rCt:、3rC、32t:、33t:、34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C >41 °C >41 °C >43 °C >44 °C >45 °C >46 °C >47 °C >48 V、49°C、50°C、51°C、52°C，包括其中的增量。在某些實(shí)施方案中，合適的水凝膠的Tgel為約22°C至約52 °C。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，合適的水凝膠的Tgel為約32°C至約42 °C。在一些實(shí)施方案中，本文所述的生物墨水(例如，包含水凝膠、一種或多種細(xì)胞類型和其它添加劑等)在哺乳動(dòng)物的體溫下不是液體。在具體的實(shí)施方案中，本文所述的生物墨水的膠凝溫度(Tgel)為約 10°C、約 151:、約201:、約251:、約301:、約351:、約401:、約451:、約501:、約55°C，包括其中的增量。在具體實(shí)施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約10°C至約15°C。在另一具體實(shí)施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約15°C至約20°C。在另一具體實(shí)施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約20°C至約25°C。在另一具體實(shí)施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約25°C至約30°C。在另一具體實(shí)施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約30°C至約35°C。在另一具體實(shí)施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約35°C至約40°C。在另一具體實(shí)施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約40°C至約45°C。在另一具體實(shí)施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是約45°C至約50°C。
[0098]當(dāng)并入水溶液中時(shí)，由聚氧化丙烯和聚氧化乙烯組成的聚合物形成熱可逆的凝膠。在生物打印機(jī)裝置中可以保持的溫度下，這些聚合物具有從液態(tài)變?yōu)槟z態(tài)的能力。該液態(tài)至凝膠態(tài)的相變?nèi)Q于聚合物的濃度和溶液中的成分。
[0099]泊洛沙姆407 (Pluronic F-127或PF-127)是由聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物組成的非離子表面活性劑。其它泊洛沙姆包括188 (F-68級(jí))、237 (F-87級(jí))、338 (F-108級(jí))。泊洛沙姆的水溶液在酸、堿和金屬離子的存在下是穩(wěn)定的。PF-127是通式E106P70E106的可商購的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物，具有13000的平均摩爾質(zhì)量。該聚合物任選地采用增強(qiáng)聚合物的膠凝性質(zhì)的合適的方法進(jìn)一步純化。它含有大約70%的氧化乙烯，這解釋了它的親水性。它是泊洛沙姆ABA嵌段共聚物系列中的一種。PF-127具有良好的增溶能力、低毒性，因此被認(rèn)為是合適的擠出化合物。
[0100]在一些實(shí)施方案中，通過任何所述的手段來測(cè)量本文中提出的水凝膠和生物墨水的粘度。例如，在一些實(shí)施方案中，采用LVDV-1I+CP Cone Plate粘度計(jì)和Cone SpindleCPE-40來計(jì)算水凝膠和生物墨水的粘度。在其它實(shí)施方案中，采用Brookfield(軸和杯)粘度計(jì)來計(jì)算水凝膠和生物墨水的粘度。在一些實(shí)施方案中，本文中中提及的粘度范圍是在室溫下測(cè)量的。在其它實(shí)施方案中，本文中提及的粘度范圍是在體溫下(例如，在健康人的平均體溫下)測(cè)量的。
[0101]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該水凝膠和/或生物墨水的特征在于具有約500至I, 000，000 厘泊、約 750 至 I, 000，000 厘泊、約 1000 至 I, 000，000 厘泊、約 1000 至 400，000厘泊、約2000至100，000厘泊、約3000至50，000厘泊、約4000至25，000厘泊、約5000至20，000厘泊或約6000至15，000厘泊的粘度。
[0102]在一些實(shí)施方案中，該生物墨水包含細(xì)胞和適合于連續(xù)生物打印的擠出化合物。在具體實(shí)施方案中，該生物墨水具有約1500mPa.s的粘度。在一些實(shí)施方案中，PluronicF-127和細(xì)胞材料的混合物適合于連續(xù)生物打印。這樣的生物墨水適當(dāng)?shù)赝ㄟ^以下步驟制備:通過在冷(4°C )磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中連續(xù)混合48小時(shí)溶解Pluronic F-127粉末至30% (w/v)。Pluronic F-127也適當(dāng)?shù)厝芙庠谒小Ｔ谝恍?shí)施方案中,采用標(biāo)準(zhǔn)無菌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)充。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，例如將該細(xì)胞在200g下沉淀，并重懸浮在30% Plu ronic F-127中，并抽吸到附著在生物打印機(jī)上的儲(chǔ)存器中，在一些實(shí)施方案中，這使之在約10°C至約25°C的膠凝溫度下固化。在生物打印之前生物墨水的膠凝是任選的。生物墨水，包括包含Pluronic F-127的生物墨水，任選地作為液體分配。
[0103]在各個(gè)實(shí)施方案中，Pluronic F-127的濃度是具有合適的粘度和/或細(xì)胞毒性的任意值。在一些實(shí)施方案中，Pluronic F-127的合適的濃度能夠在生物打印時(shí)支撐重量同時(shí)保持其形狀。在一些實(shí)施方案中，Pluronic F-127的濃度為約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%或約50%。在一些實(shí)施方案中，Pluronic F-127的濃度為約30%至約40%，或者約30%至約35%。
[0104] 在一些實(shí)施方案中，在使用之前除去生物墨水的非細(xì)胞組分(例如，擠出化合物等)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，非細(xì)胞組分例如是:水凝膠、肽水凝膠、基于氨基酸的凝膠、表面活性劑多元醇、熱響應(yīng)性聚合物、透明質(zhì)酸鹽、藻酸鹽、膠原或其它生物相容性天然或合成聚合物。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過物理、化學(xué)或酶手段除去非細(xì)胞組分。在一些實(shí)施方案中，在使用時(shí)，一部分非細(xì)胞組分仍與細(xì)胞組分相關(guān)聯(lián)。
[0105]在一些實(shí)施方案中，預(yù)處理細(xì)胞，以增加細(xì)胞相互作用。例如，為了在生物墨水成形之前增強(qiáng)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，適當(dāng)?shù)卦陔x心之后在離心管內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。
示例性的細(xì)胞比例
[0106]在一些實(shí)施方案中，生物墨水包含多細(xì)胞體，該多細(xì)胞體進(jìn)一步包含平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例為任何合適的比例。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約90:10至約60:40。在具體的實(shí)施方案中，該多細(xì)胞體包含平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并且平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約85:15。在另一具體實(shí)施方案中，該多細(xì)胞體包含平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并且平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約70:30。
[0107]在一些實(shí)施方案中，生物墨水包含多細(xì)胞體，該多細(xì)胞體進(jìn)一步包含平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的比例為任何合適的比例。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的比例為約90:10至約60:40。
[0108]在一些實(shí)施方案中，生物墨水包含多細(xì)胞體，該多細(xì)胞體進(jìn)一步包含平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的比例為任何合適的比例。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約70:25:5。
細(xì)胞的自分選(self-sorting)
[0109]在一些實(shí)施方案中，用于形成構(gòu)建體或組織的多細(xì)胞聚集體包含將要包括在工程化組織中的所有細(xì)胞類型(例如，內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)；在這樣的實(shí)例中，每個(gè)細(xì)胞類型遷移到合適的位置(例如，在成熟期間)，以形成工程化組織，如血管壁節(jié)段。在其它實(shí)施方案中，用于形成結(jié)構(gòu)的多細(xì)胞聚集體包括比將要包括在工程化組織中的所有細(xì)胞類型要少的細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)類型的細(xì)胞均勻分布在多細(xì)胞聚集體中，或組織的區(qū)域或?qū)又小Ｔ谄渌鼘?shí)施方案中，每個(gè)類型的細(xì)胞定位在多細(xì)胞聚集體內(nèi)的特定區(qū)域或組織的區(qū)域或?qū)又小?br> [0110]例如，在以合適的比例(例如，85:15、70:30等)包含平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的工程化血管壁節(jié)段(例如血管組織片)的情況下，相鄰的、生物打印的凝聚多型圓柱形生物墨水單元融合在一起。在成熟期間，內(nèi)皮細(xì)胞在某種程度上定位在構(gòu)建體的外圍，并形成膠原。例如，參見圖1、3和4a。進(jìn)一步舉例來說，在以合適的比例(例如，70:25:5等)包含平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生物打印的血管壁節(jié)段的情況下，生物打印的多型圓柱形生物墨水單元融合在一起，并且內(nèi)皮細(xì)胞在某種程度上定位在構(gòu)建體的外圍。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞類型在構(gòu)建體內(nèi)的定位模擬了體內(nèi)或離體哺乳動(dòng)物組織的分層結(jié)構(gòu)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，例如在工程化的血管壁節(jié)段中，細(xì)胞類型在構(gòu)建體中的定位形成了假定的內(nèi)膜、中膜和外膜。
[0111]在一些實(shí)施方案中，通過應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞層加速、增強(qiáng)或增加了細(xì)胞的分選或自分選。例如，在一些實(shí)施方案中，用包含平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的多細(xì)胞聚集體生物打印的構(gòu)建體，進(jìn)一步在該構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)表面上施加一層內(nèi)皮細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，結(jié)果是增加了由內(nèi)皮細(xì)胞向該構(gòu)建體外圍的定位所產(chǎn)生的層。
預(yù)形成的支架
[0112]在一些實(shí)施方案中，本文公開了工程化的可植入組織和器官，其不含或基本不含任何預(yù)形成的支架。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，“支架”是指合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝膠；非合成的支架，例如預(yù)形成的細(xì)胞外基質(zhì)層、死細(xì)胞層和脫細(xì)胞的組織；以及任何其它類型的預(yù)形成支架，它對(duì)于工程化組織和/或器官的物理結(jié)構(gòu)而言是必要的，并且不從該組織和/或器官除去。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，脫細(xì)胞的組織支架包括脫細(xì)胞的天然組織或以任意方式由培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的脫細(xì)胞的細(xì)胞材料；例如，使之死亡或者脫細(xì)胞的細(xì)胞層，留下它們?cè)诨钪鴷r(shí)產(chǎn)生的ECM。
[0113]在一些實(shí)施方案中，該工程化的組織(包括血管壁節(jié)段)及其陣列，不利用任何預(yù)形成的支架，例如，來形成該組織、該組織的任何層或者形成該組織的形狀。作為非限制性的實(shí)例，在制造時(shí)或使用時(shí)，本發(fā)明的工程化組織不利用任何預(yù)形成的合成支架(例如聚合支架)、預(yù)形成的細(xì)胞外基質(zhì)層或任何其它類型的預(yù)形成支架。在一些實(shí)施方案中，該工程化的組織基本不含任何預(yù)形成的支架。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織的細(xì)胞組分含有可檢測(cè)到的但是痕量或微量的支架，例如，小于總組合物的2.0%、小于1.0%或小于 0.5%。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，痕量或微量的支架不足以影響該組織或其陣列的長(zhǎng)期行為或者妨礙其主要生物功能。在另外的實(shí)施方案中，在打印之后，通過物理、化學(xué)或酶方法除去支架組分，從而產(chǎn)生不含或基本不含支架組分的工程化組織。
[0114]在一些實(shí)施方案中，本文公開的不含或基本不含預(yù)形成支架的工程化組織，與用某些其它組織工程方法開發(fā)的那些形成鮮明對(duì)比，后者中首先形成支架材料，然后將細(xì)胞接種到支架上，隨后細(xì)胞增殖，以填充并呈現(xiàn)支架的形狀。在一個(gè)方面，本文中描述的生物打印方法允許產(chǎn)生活的且有用的組織，其不含或基本不含預(yù)形成的支架。在另一方面，在一些實(shí)施方案中，利用限制材料將本發(fā)明的細(xì)胞保持在期望的三維形狀中。該限制材料至少在以下事實(shí)上與支架是不同的:限制材料是暫時(shí)的和/或可以從細(xì)胞和/或組織除去。
麵
[0115]在一些實(shí)施方案中，本文中公開了工程化組織的陣列，包括血管壁節(jié)段。在一些實(shí)施方案中，“陣列”意指包括多個(gè)元件的關(guān)聯(lián)的科學(xué)工具，其中多個(gè)元件被空間布置以允許在一個(gè)樣品上進(jìn)行多個(gè)試驗(yàn)、在多個(gè)樣品上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)或兩者。在一些實(shí)施方案中，該陣列適于篩選方法和裝置，或者與篩選方法和裝置(包括與中或高通量篩選有關(guān)的那些)相匹配。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，陣列允許同時(shí)進(jìn)行多個(gè)試驗(yàn)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，陣列允許同時(shí)測(cè)試多個(gè)樣品。在一些實(shí)施方案中，該陣列為細(xì)胞的微陣列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞的微陣列為允許對(duì)固體載體表面上的活細(xì)胞多路訊問的實(shí)驗(yàn)室工具。在其它的實(shí)施方案中，該陣列為組織微陣列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，組織微陣列包括組裝成一個(gè)陣列的多個(gè)分離的組織或組織樣品，以允許進(jìn)行多個(gè)生物化學(xué)的、代謝的、分子的或組織學(xué)的分析。
[0116]在一些實(shí)施方案中，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)各自存在于生物相容性多孔容器的孔中(例如，參見圖14)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)組織被放入孔中。在其它的實(shí)施方案中，每個(gè)組織被生物打印入孔中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該孔被包被。在各個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該孔用如下物質(zhì)中的一種或多種包被:生物相容性水凝膠、一種或多種蛋白質(zhì)、一種或多種化學(xué)品、一種或多種肽、一種或多種抗體和一種或多種生長(zhǎng)因子，包括它們的組合。在一些實(shí)施方案中，該孔用NovoGel?包被。在其它的實(shí)施方案中，該孔用瓊脂糖包被。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)組織存在于生物相容性多孔容器的孔內(nèi)的多孔生物相容性膜上。在一些實(shí)施方案中，多孔容器的每個(gè)孔含有兩個(gè)或更多個(gè)組織。
[0117]在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁節(jié)段)被固定在生物相容性表面的一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上。許多方法適于將組織固定到生物相容性表面。在各個(gè)實(shí)施方案中，組織被適當(dāng)?shù)毓潭ㄔ谏锵嗳菪员砻?，例如，沿著一個(gè)或多個(gè)整體側(cè)面、只在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面的邊緣或只在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面的中心。在各個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將組織適當(dāng)?shù)毓潭ㄔ诰哂?整合到表面中的或者與表面相關(guān)聯(lián)的)支持物或載體的生物相容性表面。在各個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將組織適當(dāng)?shù)毓潭ㄔ诰哂?整合到表面中的或者與表面相關(guān)聯(lián)的)一個(gè)或多個(gè)夾持夾或塑料補(bǔ)片的生物相容性表面。在一些實(shí)施方案中，通過細(xì)胞到多孔膜的附著，將組織適當(dāng)?shù)毓潭ㄔ谏锵嗳菪员砻?。在一些?shí)施方案中，通過固定在生物相容性表面的一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上，將工程化組織(包括血管壁節(jié)段)保持在陣列結(jié)構(gòu)中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織在1、2、3、4或更多個(gè)側(cè)面上被附著到生物相容性表面。在一些實(shí)施方案中，該生物相容性表面為任何對(duì)該組織或與該組織接觸的有機(jī)體不產(chǎn)生顯著傷害或毒性風(fēng)險(xiǎn)的表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面為任何適合于傳統(tǒng)組織培養(yǎng)方法的表面。作為非限制性的實(shí)例，合適的生物相容性表面包括:已處理的塑料、膜、多孔膜、涂覆的膜、涂覆的塑料、金屬、涂覆的金屬、玻璃、已處理的玻璃和涂覆的玻璃，其中合適的涂層包括水凝膠、ECM成分、化學(xué)品、蛋白質(zhì)等，并且涂覆或處理提供了刺激或防止細(xì)胞和組織粘附到該生物相容性表面的手段。
[0118]在一些實(shí)施方案中，將工程化組織固定到生物相容性表面的一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上，有利于使該組織經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在各個(gè)實(shí)施方案中，該工程化組織在
1、2、3、4或更多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受剪切力(例如，參見圖13)。
[0119]在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁節(jié)段)的陣列包括兩種或多種元件的結(jié)合。在各個(gè)實(shí)施方案中，該陣列包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475 或 500 種元件(包括其中的增量)的結(jié)合。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，每個(gè)元件包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體、組織、器官或它們的組合。
[0120] 在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁節(jié)段)的陣列包括以預(yù)先確定的圖案空間布置的多個(gè)元件。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該圖案為元件的任何合適的空間布置。在各個(gè)實(shí)施方案中，作為非限制性的實(shí)例，布置的圖案包括二維網(wǎng)格、三維網(wǎng)格、一個(gè)或多個(gè)線、弧或圓、一系列的行或列等等。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，選擇該圖案，以與高通量生物學(xué)分析或篩選方法或裝置具有相容性。
[0121]在各個(gè)實(shí)施方案中，基于特定的研究目的或目標(biāo)，選擇用于制造在陣列中的一個(gè)或多個(gè)組織的細(xì)胞的細(xì)胞類型和/或來源。在進(jìn)一步的各個(gè)實(shí)施方案中，基于特定的研究目的或目標(biāo)，選擇陣列中的特定組織。在一些實(shí)施方案中，在陣列中包括一種或多種特定的工程化組織，以促進(jìn)特定疾病或狀況的研究。在一些實(shí)施方案中，在陣列中包括一種或多種特定的工程化組織，以促進(jìn)對(duì)特定受試者的疾病或狀況的研究。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，用來源于兩個(gè)或更多個(gè)不同人類供體的一種或多種細(xì)胞類型來產(chǎn)生該陣列中的一種或多種特定的工程化組織。在一些實(shí)施方案中，陣列中的每個(gè)組織在細(xì)胞類型、細(xì)胞來源、細(xì)胞層、細(xì)胞比例、構(gòu)建方法、尺寸、形狀等方面是基本相似的。在其它的實(shí)施方案中，陣列中的一種或多種組織在細(xì)胞類型、細(xì)胞來源、細(xì)胞層、細(xì)胞比例、構(gòu)建方法、尺寸、形狀等方面是獨(dú)特的。在各個(gè)實(shí)施方案中，陣列中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300 或更多個(gè)(包括其中的增量)組織是獨(dú)特的。在其它各個(gè)實(shí)施方案中，陣列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 %(包括其中的增量)的組織是獨(dú)特的。
[0122]在一些實(shí)施方案中，陣列中的一個(gè)或多個(gè)組織代表在人體內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)特定的組織。在進(jìn)一步的實(shí)施方 案中，作為非限制性的實(shí)例，陣列中的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體組織代表包括如下的人體組織:血或淋巴管、肌肉、子宮、神經(jīng)、粘膜、間皮、網(wǎng)膜、角膜、皮膚、肝、腎、心臟、氣管、肺、骨、骨髓、脂肪、結(jié)締組織、膀胱、乳腺、胰腺、脾、腦、食管、胃、腸、結(jié)腸、直腸、卵巢、前列腺、瘤、內(nèi)胚層、中胚層和外胚層。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇陣列中的組織，以代表受試者中的所有重要的組織類型。
[0123]在一些實(shí)施方案中，陣列中的每個(gè)組織被獨(dú)立地培養(yǎng)維持。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，陣列中每個(gè)組織的培養(yǎng)條件為使得它們與其它組織分離，并且不能交換培養(yǎng)基或溶解于培養(yǎng)基中的因子。在其它實(shí)施方案中，該陣列中的兩個(gè)或更多個(gè)個(gè)體組織交換可溶性因子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，陣列中的兩個(gè)或更多個(gè)個(gè)體組織的培養(yǎng)條件為使得它們與其它組織交換培養(yǎng)基或溶解于培養(yǎng)基中的因子。在各個(gè)實(shí)施方案中，陣列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300或更多個(gè)(包括其中的增量)組織，交換培養(yǎng)基和/或可溶性因子。在其它各個(gè)實(shí)施方案中，陣列中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100% (包括其中的增量)的組織，交換培養(yǎng)基和/或可溶性因子。
體外分析
[0124]在一些實(shí)施方案中，本文中公開的工程化組織(包括血管壁節(jié)段)和及陣列用于體外分析。在一些實(shí)施方案中，“分析”是指測(cè)試或測(cè)量物質(zhì)(例如化學(xué)品、分子、生物化學(xué)品、藥物等)在有機(jī)或生物樣品(例如細(xì)胞聚集體、組織、器官、有機(jī)體等)中的存在或活性的過程。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，分析包括定性分析和定量分析。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，定量分析測(cè)量樣品中物質(zhì)的量。
[0125]在各個(gè)實(shí)施方案中，作為非限制性的實(shí)例，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)和陣列用于基于圖像的分析、分泌的蛋白質(zhì)的測(cè)量、標(biāo)記物的表達(dá)和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。在各個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該工程化組織(包括血管壁節(jié)段)和陣列用于分析以檢測(cè)或測(cè)量如下的一種或多種:分子結(jié)合(包括放射性配體結(jié)合)、分子吸收、活性(例如，酶活性和受體活性等)、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)、受體激動(dòng)作用、受體拮抗、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、化學(xué)敏感性、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞遷移、趨化性、細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖、安全性、有效性、代謝、毒性和濫用傾向。
[0126]在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁節(jié)段)和陣列用于免疫測(cè)定中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，免疫測(cè)定是競(jìng)爭(zhēng)性的免疫測(cè)定或非競(jìng)爭(zhēng)性的免疫測(cè)定。在競(jìng)爭(zhēng)性的免疫測(cè)定中，例如樣品中的抗原與和抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)，隨后測(cè)量結(jié)合到抗體位點(diǎn)的標(biāo)記抗原的數(shù)量。在非競(jìng)爭(zhēng)性的免疫測(cè)定(也稱作"夾心法分析")中，例如將樣品中的抗原結(jié)合到抗體位點(diǎn)；接著，將標(biāo)記抗體結(jié)合到該抗原，并且隨后測(cè)量在該位點(diǎn)上的標(biāo)記抗體的數(shù)量。
[0127]在一些實(shí)施方案中，工程化組織(包括血管壁節(jié)段)和陣列用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，ELISA是用于檢測(cè)抗體或抗原在樣品中的存在的生物化學(xué)技術(shù)。在ELISA中，例如，使用了至少一種對(duì)特定抗原具有特異性的抗體。進(jìn)一步舉例來說，將具有未知量的抗原的樣品非特異性地(通過吸附到表面)或特異性地(在“夾心ILISA中，通過對(duì)同樣抗原具有特異性的另外的抗體進(jìn)行捕獲)固定在固體載體(例如，聚苯乙烯微孔板)上。再進(jìn)一步舉例來說，在抗原固定之后，加入檢測(cè)抗體，形成與抗原的復(fù)合物。該檢測(cè)抗體例如被共價(jià)連接到酶，或者通過經(jīng)生物偶聯(lián)連接到酶的第二抗體進(jìn)行自身檢測(cè)。[0128]例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體或組織的陣列、微陣列或芯片用于藥物篩選或藥物發(fā)現(xiàn)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，組織的陣列、微陣列或芯片用作用于藥物篩選或藥物發(fā)現(xiàn)的試劑盒的一部分。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)血管壁節(jié)段存在于生物相容性多孔容器的孔中，其中容器適合于一個(gè)或多個(gè)自動(dòng)藥物篩選程序和/或裝置。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，自動(dòng)藥物篩選程序和/或裝置包括計(jì)算機(jī)或自動(dòng)機(jī)械輔助的任何合適的步驟或裝置。
[0129]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，用于藥物篩選分析或藥物發(fā)現(xiàn)分析的陣列用于研究或開發(fā)潛在可用于任何治療領(lǐng)域的藥物的藥物。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，作為非限制性的實(shí)例，合適的治療領(lǐng)域包括:傳染病、血液病、腫瘤J L科、心臟病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)病、腸胃病、肝臟病、泌尿科、不育癥、眼科、腎臟、矯形外科、疼痛控制、精神病、肺、疫苗、傷口愈合、生理學(xué)、藥理學(xué)、皮膚病、基因治療、毒作用和免疫。
述
[0130]在一些實(shí)施方案中，本文中公開了用于構(gòu)建活的、三維組織構(gòu)建體的方法，該方法包括將包含至少一種粘附細(xì)胞類型的生物墨水生物打印到形式中或形式上，并將生物墨水融合成活的、三維組織構(gòu)建體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體用于體外使用。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織構(gòu)建體不是血管。
[0131]在一些實(shí)施方案中，本文中還公開了用于構(gòu)建組織(包括血管壁節(jié)段)的方法，該方法包括如下步驟:制備包含平滑肌細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體；將所述凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在載體上；并孵育所述多細(xì)胞聚集體，以使所述多細(xì)胞聚集體凝聚并形成組織(例如血管壁節(jié)段)；其中所述孵育持續(xù)約2小時(shí)至約10天。在一些實(shí)施方案中，該方法使用生物打印。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法產(chǎn)生不含或基本上不含預(yù)形成的支架的工程化組織(包括血管壁節(jié)段)。
[0132]在一些實(shí)施方案中，本文中還公開了用于構(gòu)建活的三維組織(包括血管壁節(jié)段)的方法，該方法包括如下步驟:制備一個(gè)或多個(gè)包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體；將所述一個(gè)或多個(gè)凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在載體上；將如下的一種或多種施加到所述一個(gè)或多個(gè)凝聚的多細(xì)胞聚集體:在一個(gè)或多個(gè)外表面上的第一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞層；在一個(gè)或多個(gè)外表面上的第二種哺乳動(dòng)物細(xì)胞層；以及孵育所述一個(gè)或多個(gè)多細(xì)胞聚集體，以使多細(xì)胞聚集體凝聚并形成組織；其中所述孵育持續(xù)約2小時(shí)至約10天。在一些實(shí)施方案中，該方法使用生物打印。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法產(chǎn)生不含或基本上不含預(yù)形成的支架的工程化組織(包括血管壁節(jié)段)。 [0133]在一些實(shí)施方案中，本文中還公開了用于構(gòu)建活的三維組織構(gòu)建體的方法，該方法包括如下步驟:制備一個(gè)或多個(gè)包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體；將所述一個(gè)或多個(gè)凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在載體上，以形成如下的至少一種:至少一個(gè)包含多種細(xì)胞類型的層，該細(xì)胞類型相對(duì)于彼此空間排列，以構(gòu)建平面幾何形狀，和多個(gè)層，至少一個(gè)層在組成上或結(jié)構(gòu)上與至少一個(gè)其它層不同，以構(gòu)建層狀幾何形狀；以及孵育所述一個(gè)或多個(gè)多細(xì)胞聚集體，以使多細(xì)胞聚集體凝聚并形成活的三維組織構(gòu)建體。
制備凝聚的多細(xì)胞聚集體
[0134]在一些實(shí)施方案中，該方法包括制備包含一種或多種類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體。在一些實(shí)施方案中，該方法包括制備包含平滑肌細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體。在一些實(shí)施方案中，該方法包括制備進(jìn)一步包含內(nèi)皮細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體。例如，參見實(shí)施例3、4和7。在一些實(shí)施方案中，該方法包括制備進(jìn)一步包含成纖維細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體。例如，參見實(shí)施例5和6。
[0135]存在多種制備具有本文所述特性的多細(xì)胞聚集體的方式。在一些實(shí)施方案中，從含有多個(gè)活細(xì)胞或具有所需細(xì)胞密度和粘性的細(xì)胞漿料制造多細(xì)胞聚集體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將該細(xì)胞漿料成形為所需的形狀和通過成熟(例如孵育)形成的多細(xì)胞體。在一些實(shí)施方案中，該多細(xì)胞聚集體基本上是圓柱形的。在一些實(shí)施方案中，該多細(xì)胞聚集體基本上是帶形的。在一些實(shí)施方案中，該多細(xì)胞聚集體基本上是球形的。在其它實(shí)施方案中，該工程化組織是由具有一系列形狀的多細(xì)胞聚集體構(gòu)建的。在具體實(shí)施方案中，通過將包括多個(gè)活細(xì)胞的細(xì)胞漿料成形為細(xì)長(zhǎng)形狀(例如圓柱體、帶狀體等)來產(chǎn)生細(xì)長(zhǎng)的多細(xì)胞體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將細(xì)胞漿料在受控環(huán)境中孵育，以使細(xì)胞彼此粘附和/或凝聚，以形成細(xì)長(zhǎng)的多細(xì)胞體。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過在將細(xì)胞保持為三維形狀的裝置中，將包括多個(gè)活細(xì)胞的細(xì)胞漿料成形來制備多細(xì)胞體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將細(xì)胞漿料在受控環(huán)境中孵育，同時(shí)將其保持為三維形狀充分的時(shí)間，以在平表面上產(chǎn)生具有足以支撐其自身的凝聚力的多細(xì)胞體。
[0136]在各個(gè)實(shí)施方案中，通過如下步驟來提供細(xì)胞漿料:1)收集(一種或多種細(xì)胞類型的)細(xì)胞或細(xì)胞聚集體與生物相容性凝膠或液體，例如細(xì)胞培養(yǎng)基(例如，以預(yù)先確定的比例)，以產(chǎn)生細(xì)胞懸浮液；和2)將該細(xì)胞懸浮液致密化，以產(chǎn)生具有所需細(xì)胞密度和粘度的細(xì)胞漿料。在各個(gè)實(shí)施方案中，通過多種方法來實(shí)現(xiàn)致密化，例如通過將由細(xì)胞培養(yǎng)獲得的特定細(xì)胞懸浮液濃縮，以獲得所需的細(xì)胞濃度(密度)、粘度和細(xì)胞漿料所需的稠度。在具體的實(shí)施方案中，將來自細(xì)胞培養(yǎng)的相對(duì)較稀的細(xì)胞懸浮液離心設(shè)定的時(shí)間，以獲得在能夠在模具中成形的沉淀物中的細(xì)胞濃度。切向流過濾(“TFF”)是細(xì)胞濃縮或致密化的另一個(gè)合適的方法。在一些實(shí)施方案中，將化合物與細(xì)胞懸浮液合并，以提供所需的擠出性質(zhì)。作為非限制的實(shí)例，合適的化合物包括:表面活性劑多元醇、膠原、水凝膠、肽水凝膠、基于氨基酸的凝膠、Matrigel?、納米纖維、自組裝納米纖維、明膠、纖維蛋白原等。
[0137]在一些實(shí)施方案中，通過將多個(gè)活細(xì)胞與組織培養(yǎng)基混合并使活細(xì)胞致密化(例如通過離心)來產(chǎn)生細(xì)胞漿料。任選地通過如下步驟來包括一種或多種ECM組分(或ECM組分的衍生物):將細(xì)胞沉淀物重懸浮在一種或多種含有ECM組分(或ECM組分的衍生物)的生理學(xué)可接受的緩沖液中，并將所得細(xì)胞懸浮液再次離心以形成細(xì)胞漿料。
[0138]在一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步加工所需的細(xì)胞漿料的細(xì)胞密度隨著細(xì)胞類型而改變。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞之間的相互作用決定了細(xì)胞漿料的性質(zhì)，并且不同的細(xì)胞類型在細(xì)胞密度與細(xì)胞-細(xì)胞相互作用之間將具有不同的關(guān)系。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在細(xì)胞漿料成形之前預(yù)處理該細(xì)胞，以增加細(xì)胞相互作用。例如，在一些情況下，為了在細(xì)胞漿料成形之前增強(qiáng)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，在離心之后在離心管內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞漿料伴隨著生物打印而成形；其中在生物打印期間或之后，個(gè)體細(xì)胞彼此凝聚以形成生物墨水。
[0139]在各個(gè)實(shí)施方案中，采用多種方法來使細(xì)胞漿料成形。例如，在特定實(shí)施方案中，將細(xì)胞漿料手工模塑或壓制(例如，在濃縮/致密化之后)，以獲得所需的形狀。進(jìn)一步舉例來說，將細(xì)胞漿料吸收(例如，抽吸)到儀器如微量吸液管(例如，毛細(xì)吸管)中，這使細(xì)胞漿料成形，以符合該儀器的內(nèi)表面。微量吸液管(例如毛細(xì)吸管)的橫截面形狀備選地是圓形的、正方形的、矩形的、三角形的或其它非圓形的橫截面形狀。在一些實(shí)施方案中，通過沉積，使細(xì)胞漿料在 預(yù)形成的模具如塑料模具、金屬模具或凝膠模具中成形。在一些實(shí)施方案中，采用離心澆鑄或連續(xù)澆鑄來使細(xì)胞漿料成形。在一些實(shí)施方案中，該生物墨水的成形伴隨著生物打印而發(fā)生，或者在生物打印之后發(fā)生。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，作為共打印模具的結(jié)果發(fā)生生物墨水的成形；其中該模具任選地通過生物打印而沉積；其中該模具包含如下的一種或多種:凝膠、水凝膠、合成聚合物、碳水化合物、蛋白質(zhì)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該共打印的模具的一個(gè)或多個(gè)部分在生物打印后被去除；其中去除方法選自如下的一種:物理手段，用水性介質(zhì)增溶；化學(xué)處理；酶處理；調(diào)整溫度。
[0140]在一些實(shí)施方案中，限定形狀的多細(xì)胞聚集體也適于建造本文中所述的組織，包括血管壁節(jié)段。任選通過多種方法形成球形多細(xì)胞聚集體，該方法包括但不限于:細(xì)胞自組裝、使用模具和懸滴法。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，產(chǎn)生基本為球形的多細(xì)胞聚集體的方法包括以下步驟:1)提供具有所需細(xì)胞密度和粘度的、含有多個(gè)預(yù)先選擇的細(xì)胞或細(xì)胞聚集體的細(xì)胞漿料；2)將該細(xì)胞漿料處理成圓柱形狀；3)將圓柱體切割成相等的片段；4)任選地將該片段在旋轉(zhuǎn)搖床上放置過夜；和5)通過成熟形成基本為球形的多細(xì)胞聚集體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過聲波聚焦工藝來形成細(xì)胞聚集體。
[0141]在一些實(shí)施方案中，部分粘附和/或凝聚的細(xì)胞漿料用于生物打?。黄渲心酆蜕锬纬芍饕l(fā)生在打印后。在其它實(shí)施方案中，在生物打印之前的第一步驟中，使細(xì)胞漿料成形。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將細(xì)胞漿料從第一成形裝置(例如，毛細(xì)吸管)轉(zhuǎn)移到允許向細(xì)胞供應(yīng)營養(yǎng)物和/或氧的第二成形裝置(例如，模具)，同時(shí)它們?cè)诘诙尚窝b置中保持額外的成熟時(shí)間。允許向細(xì)胞供應(yīng)營養(yǎng)物和氧的合適的成形裝置的一個(gè)例子是用于制造多個(gè)多細(xì)胞聚集體(例如，基本相同的多細(xì)胞聚集體)的模具。進(jìn)一步舉例來說，這樣的模具包括由抵抗細(xì)胞向基質(zhì)中的遷移或向內(nèi)生長(zhǎng)并且抵抗細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的粘著的材料
制成的生物相容性基質(zhì)。在各個(gè)實(shí)施方案中，該基質(zhì)適當(dāng)?shù)赜蒚eflon? (PTFE)、不銹鋼、
NovoGel?、瓊脂糖、聚乙二醇、玻璃、金屬、塑料或凝膠材料(例如瓊脂糖或其它水凝膠)和類似的材料制成。在一些實(shí)施方案中，還適當(dāng)?shù)嘏渲媚＞撸栽试S向細(xì)胞漿料供應(yīng)組織培養(yǎng)基(例如通過將組織培養(yǎng)基分配到模具的頂部上)。
[0142]因此，在使用第二成形裝置的實(shí)施方案中，將部分粘附和/或凝聚的細(xì)胞漿料從第一成形裝置(例如，毛細(xì)吸管)轉(zhuǎn)移到第二成形裝置(例如，模具)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將部分粘附和/或凝聚的細(xì)胞漿料由第一成形裝置(例如，毛細(xì)吸管)轉(zhuǎn)移到模具的凹槽中。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在成熟期(其中模具與保留于其中的細(xì)胞漿料一起在受控環(huán)境中孵育，以使細(xì)胞漿料中的細(xì)胞進(jìn)一步彼此粘附和/或凝聚，以形成多細(xì)胞聚集體)之后，細(xì)胞的凝聚力將足夠強(qiáng)大，從而允許用工具(例如，毛細(xì)吸管)拾取所得的多細(xì)胞聚集體。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該毛細(xì)吸管適宜地是生物打印機(jī)或類似裝置的打印頭的一部分，其可以操作，以自動(dòng)地將多細(xì)胞聚集體放置在三維構(gòu)建體中。
[0143]在一些實(shí)施方案中，多細(xì)胞聚集體的橫截面形狀和尺寸基本對(duì)應(yīng)于第一成形裝置和任選的用于制備該多細(xì)胞聚集體的第二成形裝置的橫截面形狀和尺寸，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇具有適當(dāng)橫截面形狀、橫截面積、直徑和長(zhǎng)度的適當(dāng)?shù)某尚窝b置，其適合于產(chǎn)生具有以上討論的橫截面形狀、橫截面積、直徑和長(zhǎng)度的多細(xì)胞聚集體。
將凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在載體上
[0144]許多方法適合于將多細(xì)胞聚集體放置在載體上，以生產(chǎn)所需的三維結(jié)構(gòu)。例如，在一些實(shí)施方案中，將該多細(xì)胞聚集體人工放置而使其彼此接觸，通過從移液管、噴嘴或噴針擠出而沉積在適當(dāng)?shù)奈恢茫蛘咄ㄟ^自動(dòng)的計(jì)算機(jī)輔助裝置(例如生物打印機(jī))來安置。
[0145]如本文所述，在各個(gè)實(shí)施方案中，多細(xì)胞聚集體具有許多合適的形狀和尺寸。在一些實(shí)施方案中，多細(xì)胞聚集體是細(xì)長(zhǎng)的，具有數(shù)種合適的橫截面形狀中的任一種，作為非限制性的實(shí)例，包括圓形、橢圓形、正方形、三角形、多邊形和不規(guī)則形狀。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，多細(xì)胞聚集體是細(xì)長(zhǎng)的，并且是圓柱體的形式。在一些實(shí)施方案中，細(xì)長(zhǎng)的多細(xì)胞聚集體具有類似的長(zhǎng)度和/或直徑。在其它實(shí)施方案中，細(xì)長(zhǎng)的多細(xì)胞聚集體具有不同的長(zhǎng)度和/或直徑。在一些實(shí)施方案中，多細(xì)胞聚集體基本上是球形的。在一些實(shí)施方案中，工程化的組織(例如，血管壁節(jié)段等)包括基本為球形的多細(xì)胞聚集體，其尺寸基本上是類似的。在其它實(shí)施方案中，工程化的組織(例如，血管壁節(jié)段等)包括基本為球形的多細(xì)胞聚集體，其具有不同的尺寸。在一些實(shí)施方案中，不同形狀和尺寸的工程化組織(例如，血管壁節(jié)段等)是通過布置各種形狀和尺寸的多細(xì)胞體而形成的。
[0146]在一些實(shí)施方案中，將凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在載體上。在各個(gè)實(shí)施方案中，該載體是任何合適的生物相容性表面。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，作為非限制性的實(shí)例，合適的生物相容性表面包括聚合材料、多孔膜、塑料、玻璃、金屬、水凝膠及其組合。在一些實(shí)施方案中，該載體用生物相容性物質(zhì)涂覆，作為非限制性的實(shí)例，該生物相容性物質(zhì)包括水凝膠、蛋白質(zhì)、化學(xué)品、肽、抗體、生長(zhǎng)因子或它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體涂覆有NovoGel?.在另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體涂覆有瓊脂糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，該凝聚的多細(xì)胞聚集體被放置在生物相容性多孔容器的孔中。[0147]在一些實(shí)施方案中，一旦完成對(duì)凝聚的多細(xì)胞聚集體的放置，就將組織培養(yǎng)基倒在該構(gòu)建體的頂部。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，組織培養(yǎng)基進(jìn)入多細(xì)胞體之間的空間，以支持多細(xì)胞體中的細(xì)胞。
施加第一細(xì)胞類型的層和/或第二細(xì)胞類型的層
[0148]許多方法適合于將一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞層施加到該凝聚的哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)外表面上。例如，在一些實(shí)施方案中，施加細(xì)胞層包括:用細(xì)胞的懸浮液、片、單層或融合的聚集體來涂覆所述凝聚的多細(xì)胞集合體的一個(gè)或多個(gè)表面。在各個(gè)實(shí)施方案中，涂覆該凝聚的哺乳動(dòng)物細(xì)胞構(gòu)建體的1、2、3、4或更多個(gè)表面。
[0149]在一些實(shí)施方案中，施加細(xì)胞層包括:生物打印融合的多細(xì)胞聚集體的附加層。在其它實(shí)施方案中，施加細(xì)胞層包括:生物打印、噴霧或墨水噴射細(xì)胞的溶液、懸浮液或液態(tài)濃縮物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，合適的細(xì)胞懸浮液包含約IxlO4至約IxlO6個(gè)細(xì)胞/μ I。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，合適的細(xì)胞懸浮液包含約IxlO5至約1.5χ105個(gè)細(xì)胞/μ I。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，施加細(xì)胞層包括:將細(xì)胞的懸浮液以空間分布小滴的形式直接分配到該凝聚的哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)表面上。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，施加細(xì)胞層包括:將細(xì)胞的懸浮液以噴霧的形式直接分配到該凝聚的哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)表面上。在各個(gè)實(shí)施方案中，在構(gòu)建過程中的任何合適的時(shí)間施加細(xì)胞層。在一些實(shí)施方案中，在生物打印之后立即(例如，最多10分鐘)將一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞層施加到凝聚的哺乳動(dòng)物細(xì)胞構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)外表面上。在其它實(shí)施方案中，在生物打印之后(例如，10分鐘之后)，施加一個(gè)或多個(gè)層。在另外的其它實(shí)施方案中，在該結(jié)構(gòu)成熟期間，施加一個(gè)或多個(gè)層。
[0150]任何類型的細(xì)胞適合于用作以生物墨水形式生物打印的層。此外，任何類型的細(xì)胞適合以通過懸浮液、溶 液或濃縮物的小滴沉積的形式或者以懸浮液、溶液或濃縮物形式噴霧的形式來施加層。在一些實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞被用作該凝聚的哺乳動(dòng)物細(xì)胞構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)外表面上的一個(gè)或多個(gè)層。在其它的實(shí)施方案中，內(nèi)皮細(xì)胞被用作該凝聚的哺乳動(dòng)物細(xì)胞構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)外表面上的一個(gè)或多個(gè)層。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將內(nèi)皮細(xì)胞層施加到該凝聚的哺乳動(dòng)物細(xì)胞構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)外表面，并將成纖維細(xì)胞層施加到該構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)不同的表面。
[0151]實(shí)施例9顯示了用凝聚的平滑肌細(xì)胞聚集體生物打印的血管壁構(gòu)建體，其進(jìn)一步涂覆有內(nèi)皮細(xì)胞濃縮物(例如，1-1.5χ105個(gè)細(xì)胞/μ I)。實(shí)施例9的技術(shù)導(dǎo)致形成了由SMC和EC覆蓋層(例如，假定的中膜和內(nèi)膜)組成的血管壁構(gòu)建體。例如，參見圖3、圖4Β。
[0152]實(shí)施例10顯示了用凝聚的人類主動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞聚集體生物打印的血管壁構(gòu)建體。進(jìn)一步地，在平滑肌圓柱形生物墨水頂端，以2.5 μ L小滴的形式，從生物打印機(jī)分配懸浮液中的人類主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。
[0153]在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在載體上培養(yǎng)細(xì)胞層的步驟。在這樣的實(shí)施方案中，在某些情況下，施加細(xì)胞層包括:將凝聚的平滑肌細(xì)胞構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)表面放置為與制備的細(xì)胞培養(yǎng)基直接接觸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該構(gòu)建體被直接生物打印在細(xì)胞的培養(yǎng)層上或細(xì)胞單層上。在生物相容性載體上的任何類型的培養(yǎng)細(xì)胞層是合適的。在一些實(shí)施方案中，將多細(xì)胞聚集體生物打印到內(nèi)皮細(xì)胞層上。在其它的實(shí)施方案中，將多細(xì)胞聚集體生物打印到成纖維細(xì)胞層上。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，細(xì)胞層與該生物打印構(gòu)建體的多細(xì)胞聚集體粘附和/或凝聚。在一些實(shí)施方案中，多層結(jié)構(gòu)的每個(gè)層都是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，個(gè)體層包括可變形式的生物墨水，包括但不限于:凝聚的細(xì)胞聚集體、細(xì)胞漿料、與擠出化合物或其它添加劑組合的細(xì)胞漿料、細(xì)胞單層和細(xì)胞片。
[0154]實(shí)施例11顯示了與實(shí)施例10的構(gòu)建體相同的構(gòu)建；然而，該構(gòu)建體被生物打印到載體上，在載體上已經(jīng)預(yù)先培養(yǎng)了匯合的單層人類皮膚成纖維細(xì)胞。實(shí)施例11的技術(shù)導(dǎo)致形成了由SMC與EC和Fb覆蓋層(例如，假定的中膜、內(nèi)膜和外膜)組成的血管壁構(gòu)建體。例如，參見圖4a和圖4b。
孵育多細(xì)胞聚集體
[0155]在一些實(shí)施方案中，孵育多細(xì)胞聚集體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，孵育允許多細(xì)胞聚集體粘附和/或凝聚以形成組織，例如血管壁節(jié)段。在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境(例如，培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、生物反應(yīng)器等)中，多細(xì)胞聚集體凝聚以形成組織。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在具有適合于促進(jìn)包括在多細(xì)胞聚集體中的細(xì)胞類型生長(zhǎng)的條件的環(huán)境中，多細(xì)胞聚集體凝聚以形成組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，在約37°C下，在含有約5% CO2的濕潤氣氛中，在含有促進(jìn)粘附和/或凝聚的因子和/或離子的細(xì)胞培養(yǎng)基的存在下，孵育多細(xì)胞聚集體。 在其它實(shí)施方案中，將該多細(xì)胞聚集體保持在含有0.1 %至21% O2的環(huán)境中。
[0156]在各個(gè)實(shí)施方案中，孵育具有任何合適的持續(xù)時(shí)間。在進(jìn)一步的各個(gè)實(shí)施方案中，孵育具有約 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180 或更多分鐘的持續(xù)時(shí)間，包括其中的增量。在進(jìn)一步的各個(gè)實(shí)施方案中，孵育具有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48 或更多小時(shí)的持續(xù)時(shí)間，包括其中的增量。在進(jìn)一步的各個(gè)實(shí)施方案中，孵育具有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天的持續(xù)時(shí)間，包括其中的增量。有幾種因素影響多細(xì)胞聚集體凝聚以形成組織所需的時(shí)間，作為非限制性的實(shí)例，包括細(xì)胞類型、細(xì)胞類型的比例、培養(yǎng)條件和添加劑如生長(zhǎng)因子的存在。
用于增加工程化組織存活力的額外步驟
[0157]在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括增加工程化組織的存活力的步驟。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，這些步驟包括:通過限制材料的暫時(shí)或半永久性的網(wǎng)格，提供該組織與營養(yǎng)培養(yǎng)基之間的直接接觸。在一些實(shí)施方案中，該組織被束縛在多孔或間隙材料中。該工程化組織的至少一些細(xì)胞直接接近營養(yǎng)物增加了該工程化組織的存活力。
[0158]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，用于增加工程化組織的存活力的額外和任選的步驟包括:1)任選地在放置凝聚的多細(xì)胞聚集體之前，分配限制材料的基底層；2)任選地分配限制材料的周界；3)在限定的幾何形狀內(nèi)生物打印該組織的細(xì)胞；和4)分配限制材料的細(xì)長(zhǎng)體(例如，圓柱體、帶狀體等)，按照?qǐng)D案覆蓋初生組織，該圖案在限制材料中引入間隙，例如網(wǎng)格、網(wǎng)孔或格子。例如，參見實(shí)施例12和圖5。
[0159]許多限制材料適合用于本文描述的方法中。在一些實(shí)施方案中，水凝膠是示例性的限制材料，其具有一種或多種有利的性質(zhì)，包括:非附著的、生物相容的、可擠出的、可生物打印的、非細(xì)胞的、具有合適的強(qiáng)度以及不溶于水性條件。在一些實(shí)施方案中，適宜的水凝膠是天然聚合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該限制材料由NovoGel?組成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，合適的水凝膠包括衍生自表面活性劑多元醇的水凝膠如Pluronic F-127、膠原、透明質(zhì)酸鹽、纖維蛋白、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和它們的衍生物或組合。在其它實(shí)施方案中，合適的水凝膠是合成聚合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，合適的水凝膠包括衍生自聚(丙烯酸)或其衍生物、聚(環(huán)氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其組合的那些水凝膠。在各個(gè)具體實(shí)施方案中，該限制材料選自:水凝膠、NovoGel?、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、Matrigel?、透明質(zhì)酸、泊洛沙姆、肽水凝膠、聚(異丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羥乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、絲和它們的組合。
[0160]在一些實(shí)施方案中，覆蓋圖案的間隙均勻地或基本均勻地圍繞組織的表面分布。在其它實(shí)施方案中，該間隙不均勻地分布，從而使組織的細(xì)胞不均勻地暴露于營養(yǎng)物。在不均勻的實(shí)施方案中，任選地利用對(duì)營養(yǎng)物的差異獲取來影響組織的一種或多種性質(zhì)。例如，在某些情況下，理想的是在生物打印的組織的一個(gè)表面上的細(xì)胞比在該生物打印的組織的另一表面上的細(xì)胞增殖更快。在一些實(shí)施方案中，任選地在不同的時(shí)間改變?cè)摻M織的各個(gè)部分對(duì)營養(yǎng)物的暴露，以影響該組織向期望的終點(diǎn)的發(fā)育。
[0161]在一些實(shí)施方案中，覆蓋圖案的間隙均勻地或基本均勻地圍繞組織的表面分布。在其它實(shí)施方案中，該間隙不均勻地分布，從而使組織的細(xì)胞不均勻地暴露于營養(yǎng)物。在不均勻的實(shí)施方案中，利用對(duì)營養(yǎng)物的差異獲取來影響組織的一種或多種性質(zhì)。例如，在某些情況下，理想的是在生物打印的組織的一個(gè)表面上的細(xì)胞比在該生物打印的組織的另一表面上的細(xì)胞增殖更快。在一些實(shí)施方案中，任選地在不同的時(shí)間改變?cè)摻M織的各個(gè)部分對(duì)營養(yǎng)物的暴露，以影響該組織向期望的終點(diǎn)的發(fā)育。
[0162]在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使工程化組織(例如，血管壁節(jié)段等)在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力的步驟。
具體的示例性實(shí)施方案
[0163]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了活的三維組織，其中所述組織的至少一個(gè)部分是生物打印的；并且其中所述組織不是血管。在一些實(shí)施方案中，該組織基本上不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織基本上不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，在使用時(shí)，該組織基本上不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，該組織的至少一個(gè)部分包括層狀或平面幾何形狀。在一些實(shí)施方案中，該組織在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上被固定到生物相容性表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面為多孔膜。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使該組織在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約25 μ m。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約100 μ m。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約250 μ m。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約500 μ m。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最大維度上為小于3.0cm。在一些實(shí)施方案中，該組織包含平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，其中平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約90:10至約60:40。在一些實(shí)施方案中，該組織包含平滑肌細(xì)胞 和內(nèi)皮細(xì)胞，其中平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約85:15。在一些實(shí)施方案中，該組織包含平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，其中平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約70:30。在一些實(shí)施方案中，該組織包含平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，其中平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的比例為約90:10至約60:40。在一些實(shí)施方案中，該組織包含平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，其中平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約70:25:5。在一些實(shí)施方案中，該組織用于體外分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織用于藥物測(cè)試。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織用于心血管藥物測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為成熟的分化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為成熟的未分化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該平滑肌細(xì)胞為人類平滑肌細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該平滑肌細(xì)胞來源于選自下組的組織:血液、血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、中胚層來源的組織、骨髓和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞是人類內(nèi)皮細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞來源于選自下組的組織:血液、血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、中胚層來源的組織、骨髓和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞為非血管的成纖維細(xì)胞。在其它的實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞來源于血管外膜。在一些實(shí)施方案中，一種或多種所述細(xì)胞類型來源于特定的脊椎動(dòng)物受試者。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該細(xì)胞來源于具有影響心血管系統(tǒng)的疾病或狀況的脊椎動(dòng)物受試者。在一些實(shí)施方案中，選擇該細(xì)胞，以模擬特定的疾病狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞配置為模擬特定的疾病狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，以模擬特定的疾病狀態(tài)的方式，處理或調(diào)整該細(xì)胞。
[0164]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了活的三維組織的陣列，其中每個(gè)所述組織包含一種或多種類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；其中所述細(xì)胞彼此凝聚；其中每個(gè)所述組織的至少一個(gè)部分是生物打印的；并且其中每個(gè)所述組織被培養(yǎng)維持。在一些實(shí)施方案中，在使用時(shí)，該陣列中的每個(gè)組織不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自:肝細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、腎細(xì)胞、肺細(xì)胞、氣管細(xì)胞、血管細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、結(jié) 締組織細(xì)胞、角膜細(xì)胞、泌尿生殖細(xì)胞、生殖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、施萬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、周細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、間皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞、祖細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血細(xì)胞、腫瘤來源的細(xì)胞及其組合。在一些實(shí)施方案中，陣列中的每個(gè)組織基本相似。在其它的實(shí)施方案中，該陣列中的一個(gè)或多個(gè)組織是獨(dú)特的。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的個(gè)體組織代表在人體中的一種或多種特定組織。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該陣列中的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體組織代表選自下組的人體組織:血或淋巴管、肌肉、子宮、神經(jīng)、粘膜、間皮、網(wǎng)膜、角膜、皮膚、肝、腎、心臟、氣管、肺、骨、骨髓、脂肪、結(jié)締組織、膀胱、乳腺、胰腺、脾、腦、食管、胃、腸、結(jié)腸、直腸、卵巢和前列腺；其中每個(gè)組織任選地包括特定疾病狀態(tài)(例如，纖維化、癌、炎癥等等)的組成或結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)組織存在于生物相容性多孔容器的孔中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該孔用如下物質(zhì)中的一種或多種包被:生物相容性水凝膠、蛋白質(zhì)、化學(xué)品、肽、抗體或生長(zhǎng)因子。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該孔用瓊脂糖包被。在一些實(shí)施方案中，將每個(gè)組織放在所述容器的所述孔內(nèi)的多孔生物相容性膜上。在一些實(shí)施方案中，該容器與自動(dòng)藥物篩選相匹配。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)組織在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上被固定到生物相容性表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面為多孔膜。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使每個(gè)組織在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在一些實(shí)施方案中，采用來源于兩個(gè)或更多個(gè)不同人類供體的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞類型來產(chǎn)生該陣列中的組織。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的每個(gè)組織被獨(dú)立地培養(yǎng)維持。在其它的實(shí)施方案中，該陣列中的兩個(gè)或更多個(gè)個(gè)體組織交換可溶性因子。在一些實(shí)施方案中，該陣列用于體外分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該陣列用于藥物測(cè)試。
[0165] 在一些實(shí)施方案中，本文中公開了用于構(gòu)建活的三維哺乳動(dòng)物組織的陣列的方法，該方法包括如下步驟:制備包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體；將所述凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在生物相容性載體上；其中所述集合體以適合于組織陣列的形式空間排列；并孵育所述多細(xì)胞聚集體，以使所述多細(xì)胞聚集體凝聚并形成三維組織的陣列；其中所述孵育具有約2小時(shí)至約10天的持續(xù)時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，該陣列中每個(gè)組織的至少一個(gè)部分是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在使用時(shí)，該陣列中的每個(gè)組織基本上不含任何預(yù)形成的支架。在各個(gè)實(shí)施方案中，該陣列包含2至500個(gè)不同的組織。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織以限定的圖案空間布置。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織被布置在行和列的格子中。在一些實(shí)施方案中，該凝聚的多細(xì)胞聚集體包含一種細(xì)胞類型。在其它實(shí)施方案中，該凝聚的多細(xì)胞聚集體包含超過一種細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，該凝聚的多細(xì)胞聚集體基本上是球形的和/或基本上是圓柱形的。在一些實(shí)施方案中，該生物相容性載體由以下物質(zhì)組成:聚合物材料、多孔膜、塑料、玻璃、金屬或水凝膠。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該陣列中的每個(gè)組織在其最小維度上為至少約25μπι。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，每個(gè)組織在其最小維度上為至少約150 μ m。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，每個(gè)組織在其最小維度上為至少約250 μ m。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，每個(gè)組織在其最小維度上為至少約500 μ m。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的每個(gè)組織被培養(yǎng)維持。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括以下步驟:使每個(gè)所述組織在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。
[0166]在某些實(shí)施方案中，本文公開了活的三維血管壁節(jié)段，該三維血管壁節(jié)段包含:平滑肌細(xì)胞；和任選的，一種或多種選自成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞類型；其中所述細(xì)胞彼此凝聚；其中所述血管壁節(jié)段的至少一個(gè)部分是生物打印的；并且，其中所述血管壁節(jié)段是非管狀的。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段基本上為平面。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上被固定到生物相容性表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面為多孔膜。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使該血管壁節(jié)段在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約25 μ m。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約150 μ m。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約250 μ m。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約500 μ m。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段包含平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，其中平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約90:10至約60:40。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段包含平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、其中平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約85:15。在其它的實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段包含平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、其中平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約70:30。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段包含平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，其中平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的比例為約90:10至約60:40。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段包含平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，其中平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的比例為約70:25:5。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段用于體外分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段用于藥物測(cè)試。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段用于心血管藥物測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為成熟的分化細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為成熟的未分化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該平滑肌細(xì)胞為人類平滑肌細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該平滑肌細(xì)胞來源于選自下組的組織:血液、血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、骨髓和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞為人類內(nèi)皮細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞來源于選自下組的組織:血液、血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、骨髓和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞為非血管的成纖維細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞來源于血管外膜。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞來源于特定的脊椎動(dòng)物受試者。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，一種或多種細(xì)胞類型來源于具有影響心血管系統(tǒng)的疾病或狀況的脊椎動(dòng)物受試者。在一些實(shí)施方案中，選擇該細(xì)胞，以模擬特定的疾病狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞被配置為模擬特定的疾病狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，以模擬特定的疾病狀態(tài)的方式，處理或調(diào)整該細(xì)胞。
[0167]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了活的三維血管壁節(jié)段的陣列，其中每個(gè)所述血管壁節(jié)段包含平滑肌細(xì)胞和任選的選自成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的一種或多種細(xì)胞類型；其中所述細(xì)胞彼此凝聚；其中每個(gè)所述血管壁節(jié)段被工程化。在一些實(shí)施方案中，該陣列中每個(gè)血管壁節(jié)段的至少一個(gè)部分是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在使用時(shí)，該陣列中的每個(gè)血管壁節(jié)段不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)血管壁節(jié)段存在于生物相容性多孔容器的孔內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該孔用如下物質(zhì)中的一種或多種包被:生物相容性水凝膠、蛋白質(zhì)、化學(xué)品、肽、抗體或生長(zhǎng)因子。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該孔用NovoGel?包被。在其它的實(shí)施方案中，該孔用瓊脂糖包被。在一些實(shí)施方案中，將每個(gè)血管壁節(jié)段放在所述容器的所述孔內(nèi)的多孔生物相容性膜上。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該容器與自動(dòng)藥物篩選相匹配。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)血管壁節(jié)段在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上被固定到生物相容性表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面為多孔膜。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使每個(gè)血管壁節(jié)段在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在一些實(shí)施方案中，陣列中的每個(gè)血管壁節(jié)段基本相似。在其它的實(shí)施方案中，陣列中的一個(gè)或多個(gè)血管壁節(jié)段是獨(dú)特的。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的血管壁節(jié)段代表人體中的一種或多種不同的血管組織。在一些實(shí)施方案中，采用來源于兩個(gè)或更多個(gè)不同的人類供體的一種或多種細(xì)胞類型，來產(chǎn)生該陣列中的血管壁節(jié)段。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的每個(gè)血管壁節(jié)段被獨(dú)立地培養(yǎng)維持。在其它的實(shí)施方案中，該陣列中的兩個(gè)或更多個(gè)個(gè)體血管壁節(jié)段交換可溶性因子。在一些實(shí)施方案中，該陣列用于體外分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該陣列用于藥物測(cè)試。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該陣列用于心血管藥物測(cè)試。
[0168] 在某些實(shí)施方案中，本文中公開了用于構(gòu)建活的三維血管壁節(jié)段的方法，該方法包括如下步驟:制備包含平滑肌細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體；將所述凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在載體上；并孵育所述多細(xì)胞聚集體，以使所述多細(xì)胞聚集體凝聚并形成血管壁節(jié)段；其中所述孵育具有約2小時(shí)至約10天的持續(xù)時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段的至少一個(gè)部分是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在使用時(shí)，該血管壁節(jié)段用于體外分析，并且不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，該凝聚的多細(xì)胞聚集體進(jìn)一步包含內(nèi)皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該凝聚的多細(xì)胞聚集體進(jìn)一步包含成纖維細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該凝聚的多細(xì)胞聚集體基本上是球形的和/或基本上是圓柱形的。在一些實(shí)施方案中，將該凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在生物相容性表面上。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面由以下物質(zhì)組成:聚合物材料、多孔膜、塑料、玻璃、金屬或水凝膠。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約50 μ m。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約150 μ m。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約266 μ m。在其他實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約500 μ m。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括:使所述血管壁節(jié)段在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。
[0169]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了活的三維組織，該三維組織包含:平滑肌細(xì)胞和選自以下的一種或多種:在一個(gè)或多個(gè)表面上的內(nèi)皮細(xì)胞層；在一個(gè)或多個(gè)表面上的成纖維細(xì)胞層。其中所述平滑肌細(xì)胞彼此凝聚；其中所述組織的至少一個(gè)部分是生物打印的；并且，其中所述組織是非管狀的。在一些實(shí)施方案中，該組織基本上不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，在生物打印的時(shí)候，該組織基本上不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，在使用時(shí)，該組織基本上不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，該組織基本上為平面。在一些實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞層包含內(nèi)皮細(xì)胞的單層、一個(gè)或多個(gè)片或融合的聚集體。在一些實(shí)施方案中，該組織包含在所述組織的一個(gè)或多個(gè)表面上的內(nèi)皮細(xì)胞層。在一些實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞層包含成纖維細(xì)胞的單層、一個(gè)或多個(gè)片或融合的聚集體。在一些實(shí)施方案中，該組織包含在所述組織的一個(gè)或多個(gè)表面上的成纖維細(xì)胞層。在一些實(shí)施方案中，該組織包含內(nèi)皮細(xì)胞層和成纖維細(xì)胞層；其中所述內(nèi)皮細(xì)胞層在所述組織的一個(gè)或多個(gè)外表面上，并且所述成纖維細(xì)胞層在所述組織的一個(gè)或多個(gè)不同的表面上。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約50 μ m。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約150 μ m。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約250 μ m。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約500 μ m。在一些實(shí)施方案中，該組織在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上被固 定到生物相容性表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面為多孔膜。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使該組織在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在一些實(shí)施方案中，該組織用于體外分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織用于藥物測(cè)試。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織用于心血管藥物測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為成熟的分化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為成熟的未分化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該平滑肌細(xì)胞為人類平滑肌細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該平滑肌細(xì)胞來源于選自下組的組織:血液、血管組織、血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、骨髓、肌肉組織、結(jié)締組織、中胚層來源的組織和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞為人類內(nèi)皮細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞來源于選自下組的組織:血管組織、血液、血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、中胚層來源的組織、骨髓和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞為非血管的成纖維細(xì)胞。在其它的實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞來源于血管外膜。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞來源于特定的脊椎動(dòng)物受試者。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該細(xì)胞來源于具有影響心血管系統(tǒng)的疾病或狀況的脊椎動(dòng)物受試者。在一些實(shí)施方案中，選擇該細(xì)胞，以模擬特定的疾病狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞被配置為模擬特定的疾病狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，以模擬特定的疾病狀態(tài)的方式，處理或調(diào)整該細(xì)胞。
[0170]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了活的三維組織的陣列，其中每個(gè)所述組織包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞和選自以下的一種或多種:在一個(gè)或多個(gè)表面上的第一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞層；在一個(gè)或多個(gè)表面上的第二種哺乳動(dòng)物細(xì)胞層。其中所述細(xì)胞彼此凝聚；其中每個(gè)所述組織的至少一個(gè)部分是生物打印的；其中每個(gè)所述組織被培養(yǎng)維持。在一些實(shí)施方案中，在使用時(shí)，該陣列中的每個(gè)組織不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含來源于選自下組的組織的平滑肌細(xì)胞:血管組織、血液、血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、骨髓、肌肉組織、間葉組織、結(jié)締組織、中胚層來源的組織和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括來源于選自下組的組織的內(nèi)皮細(xì)胞:血管組織、血液、血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、中胚層來源的組織、骨髓和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括非血管的成纖維細(xì)胞。在其它的實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括血管的成纖維細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該血管的成纖維細(xì)胞來源于血管外膜。在一些實(shí)施方案中，陣列中的每個(gè)組織基本相似。在其它的實(shí)施方案中，該陣列中的一個(gè)或多個(gè)組織是獨(dú)特的。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的個(gè)體組織代表在人體中的一種或多種特定的組織。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該陣列中的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體組織代表選自下組的人體組織:血或淋巴管、肌肉、子宮、神經(jīng)、粘膜、間皮、網(wǎng)膜、角膜、皮膚、肝、腎、心臟、氣管、肺、骨、骨髓、脂肪、結(jié)締組織、膀胱、乳腺、胰腺、脾、腦、食管、胃、腸、結(jié)腸、直腸、卵巢和前列腺。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)組織存在于生物相容性多孔容器的孔中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該孔用如下物質(zhì)中的一種或多種包被:生物相容性水凝膠、蛋白質(zhì)、化學(xué)品、肽、抗體或生長(zhǎng)因子。在一些實(shí)施方案中，該孔用NovoGel?包被。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該孔用瓊脂糖包被。在一些實(shí)施方案中，將每個(gè)組織放置在容器的孔內(nèi)的多孔生物相容性膜上。在一些實(shí)施方案中，該容器與自動(dòng)藥物篩選相匹配。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的每個(gè)組織在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上被固定到生物相容性表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面為多孔膜。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使每個(gè)組織在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在一些實(shí)施方案中，采用來源于兩個(gè)或更多個(gè)不同人類供體的細(xì)胞類型，來產(chǎn)生該陣列中的組織。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的每個(gè)組織被獨(dú)立地培養(yǎng)維持。在其它的實(shí)施方案中，該陣列中的兩個(gè)或更多個(gè)個(gè)體組織交換可溶性因子。在一些實(shí)施方案中，該陣列用于體外分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該陣列用于藥物測(cè)試。
[0171]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了用于構(gòu)建活的三維組織的方法，該方法包括如下步驟:制備一個(gè)或多個(gè)包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體；將所述一個(gè)或多個(gè)凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在載體上；將如下的一種或多種施加到所述一個(gè)或多個(gè)凝聚的多細(xì)胞聚集體:在一個(gè)或多個(gè)外表面上的第一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞層；在一個(gè)或多個(gè)外表面上的第二種哺乳動(dòng)物細(xì)胞層；以及孵育所述一個(gè)或多個(gè)多細(xì)胞聚集體，以使該多細(xì)胞聚集體凝聚并形成組織；其中所述孵育具有約2小時(shí)至約10天的持續(xù)時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，所述組織的至少一個(gè)部分是生物打印的。在一些實(shí)施方案中，在制造時(shí)，該組織不含任何預(yù)形成的支架。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在制造時(shí)，該組織基本上不含任何預(yù)形成的支架。在其它的實(shí)施方案中，使用時(shí)，該組織基本上不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約50 μ m。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約150μπι。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約250 μ m。在其它的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該組織在其最小維度上為至少約500 μ m。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織在最小維度上具有約50 μ m至約600 μ m的長(zhǎng)度、寬度或高度或厚度。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組織的長(zhǎng)度、寬度、高度或厚度大于約1mm。在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞類型的凝聚的多細(xì)胞聚集體包含間質(zhì)細(xì)胞、結(jié)締組織來源的細(xì)胞、中胚層來源的細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該凝聚的多細(xì)胞聚集體另外包含第二細(xì)胞類型。在另外的實(shí)施方案中，第二細(xì)胞類型來源于上皮組織、內(nèi)皮組織、間葉組織或外胚層組織。在一些實(shí)施方案中，施加哺乳動(dòng)物細(xì)胞層包括:采用細(xì)胞的懸浮液、單層、一片或多片、多個(gè)層或融合的聚集體來涂覆該凝聚的多細(xì)胞集合體的至少一個(gè)表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該懸浮液包含約IxlO4至約IxlO6個(gè)細(xì)胞/μ I。在更進(jìn)一 步的實(shí)施方案中，細(xì)胞懸浮液包含約IxlO5至約1.5χ105個(gè)細(xì)胞/μ I。在一些實(shí)施方案中，施加哺乳動(dòng)物細(xì)胞層包括:將細(xì)胞懸浮液以空間分布小滴的形式直接分配到所述凝聚的多細(xì)胞聚集體的一個(gè)表面上。在一些實(shí)施方案中，施加哺乳動(dòng)物細(xì)胞層包括:將細(xì)胞懸浮液以噴霧的形式直接分配到所述凝聚的多細(xì)胞聚集體的一個(gè)表面上。在一些實(shí)施方案中，施加哺乳動(dòng)物細(xì)胞層包括:將所述凝聚的多細(xì)胞聚集體的一個(gè)或多個(gè)表面放置為與建立的細(xì)胞層直接接觸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該建立的細(xì)胞層包括細(xì)胞的單層、多層、一個(gè)或多個(gè)片或融合的聚集體。在一些實(shí)施方案中，將第一類型的細(xì)胞層施加到所述凝聚的多細(xì)胞聚集體的一個(gè)或多個(gè)表面上，并將第二類型的細(xì)胞層施加到所述凝聚的多細(xì)胞聚集體的一個(gè)或多個(gè)不同的表面上。在一些實(shí)施方案中，該孵育具有約2小時(shí)至約10天的持續(xù)時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，在放置一種或多種凝聚的多細(xì)胞聚集體時(shí)進(jìn)行施加以下的一種或多種的步驟:在一個(gè)或多個(gè)表面上的第一類型的細(xì)胞層；在一個(gè)或多個(gè)表面上的第二類型的細(xì)胞層。在其它實(shí)施方案中，在所述孵育過程中進(jìn)行施加以下的一種或多種的步驟:在一個(gè)或多個(gè)外表面上的第一類型的細(xì)胞層；在一個(gè)或多個(gè)外表面上的第二類型的細(xì)胞層。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括以下步驟:使該組織在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。
[0172]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了活的三維血管壁節(jié)段，該三維血管壁節(jié)段包含:平滑肌細(xì)胞和選自以下的一種或多種:在一個(gè)或多個(gè)表面上的內(nèi)皮細(xì)胞層；在一個(gè)或多個(gè)表面上的成纖維細(xì)胞層，其中所述平滑肌細(xì)胞彼此凝聚；其中所述血管壁節(jié)段的至少一個(gè)部分是生物打印的；并且，其中所述血管壁節(jié)段是非管狀的。在一些實(shí)施方案中，在制造時(shí)，該血管壁節(jié)段基本上不含任何預(yù)形成的支架。在其它的實(shí)施方案中，在使用時(shí)，該血管壁節(jié)段基本上不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段基本上為平面。在一些實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞層包括內(nèi)皮細(xì)胞的單層、一個(gè)或多個(gè)層、一個(gè)或多個(gè)片或融合的聚集體。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段包括在一個(gè)或多個(gè)表面上的內(nèi)皮細(xì)胞層。在一些實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞層包括成纖維細(xì)胞的單層、一個(gè)或多個(gè)層、一個(gè)或多個(gè)片或融合的聚集體。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段包括在所述血管壁節(jié)段的一個(gè)或多個(gè)表面上的成纖維細(xì)胞層。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段包括內(nèi)皮細(xì)胞層和所述成纖維細(xì)胞層；其中所述內(nèi)皮細(xì)胞層在所述血管壁節(jié)段的一個(gè)或多個(gè)外表面上，并且所述成纖維細(xì)胞層在所述血管壁節(jié)段的一個(gè)或多個(gè)不同的表面上。在一些實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約50 μ m。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約150 μ m。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約250 μ m。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在生物打印時(shí)，該血管壁節(jié)段在其最小維度上為至少約500 μ m。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上被固定到生物相容性表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面為多孔膜。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使該血管壁節(jié)段在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在一些實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段用于體外分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段用于藥物測(cè)試。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該血管壁節(jié)段用于心血管藥物測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為成熟的分化細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為成熟的未分化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該平滑肌細(xì)胞為人類平滑肌細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該平滑肌細(xì)胞來源于選自下組的組織:血管組織、血液、血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、骨髓、肌肉組織、結(jié)締組織和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞為人類內(nèi)皮細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該內(nèi)皮細(xì)胞來源于選自下組的組織:血管組織、血液、血管、淋巴管、消化道的組織、泌尿生殖道的組織、脂肪組織、呼吸道的組織、生殖系統(tǒng)的組織、骨髓和臍帶組織。在一些實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞為非血管的成纖維細(xì)胞。在其它的實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞為血管的成纖維細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該成纖維細(xì)胞來源于血管外膜。在一些實(shí)施方案中，一種或多種該細(xì)胞組分來源于特定的脊椎動(dòng)物受試者。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，一種或多種該細(xì)胞組分來源于具有影響心血管系統(tǒng)的疾病或狀況的脊椎動(dòng)物受試者。在一些實(shí)施方案中，選擇和/或配置一種或多種該細(xì)胞組分，以模擬特定的疾病狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，以模擬特定的疾病狀態(tài)的方式，處理和/或調(diào)整一種或多種該細(xì)胞組分。[0173]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了活的三維血管壁節(jié)段的陣列，其中每個(gè)所述血管壁節(jié)段包含平滑肌細(xì)胞和選自以下的一種或多種:在一個(gè)或多個(gè)表面上的內(nèi)皮細(xì)胞層；在一個(gè)或多個(gè)表面上的成纖維細(xì)胞層；其中所述平滑肌細(xì)胞彼此凝聚；其中每個(gè)所述血管壁節(jié)段被工程化；其中每個(gè)所述血管壁節(jié)段被培養(yǎng)維持。在一些實(shí)施方案中，該陣列中每個(gè)血管壁節(jié)段的至少一個(gè)部分是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在制造時(shí)，在該陣列中的每個(gè)血管壁節(jié)段基本上不含任何預(yù)形成的支架。在其它的實(shí)施方案中，在使用時(shí)，該陣列中的每個(gè)血管壁節(jié)段基本上不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)血管壁節(jié)段存在于生物相容性多孔容器的孔內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該孔用如下物質(zhì)中的一種或多種包被:生物相容性水凝膠、蛋白質(zhì)、化學(xué)品、肽、抗體或生長(zhǎng)因子。在一些實(shí)施方案中，該用NovoGel?包被。在其它實(shí)施方案中，該孔用瓊脂糖包被。在一些實(shí)施方案中，將每個(gè)血管壁節(jié)段放在所述容器的所述孔內(nèi)的多孔生物相容性膜上。在一些實(shí)施方案中，該容器與自動(dòng)藥物篩選相匹配。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的每個(gè)血管壁節(jié)段在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上被固定到生物相容性表面。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該生物相容性表面為多孔膜。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使每個(gè)血管壁節(jié)段在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。在一些實(shí)施方案中，陣列中的每個(gè)血管壁節(jié)段基本相似。在其它的實(shí)施方案中，該陣列中的一個(gè)或多個(gè)血管壁節(jié)段是獨(dú)特的。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的血管壁節(jié)段代表人體中的一種或多種不同的血管組織。在一些實(shí)施方案中，采用來源于兩個(gè)或更多個(gè)不同的人類供體的細(xì)胞類型，來產(chǎn)生該陣列中的血管壁節(jié)段。在一些實(shí)施方案中，該陣列中的每個(gè)血管壁節(jié)段被獨(dú)立地培養(yǎng)維持。在其它的實(shí)施方案中，該陣列中的兩個(gè)或更多個(gè)個(gè)體血管壁節(jié)段交換可溶性因子。在一些實(shí)施方案中，該陣列用于體外分析。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該陣列用于藥物測(cè)試。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該陣列用于心血管藥物測(cè)試。
[0174]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了用于構(gòu)建活的三維血管壁節(jié)段的方法，該方法包括如下步驟:在生物相容性載體上，培養(yǎng)成纖維細(xì)胞層；制備一個(gè)或多個(gè)包含平滑肌細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體，其中所述聚集體基本上為球形或基本上為圓柱形；將一個(gè)或多個(gè)凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在所述載體上；在一個(gè)或多個(gè)表面上，向所述一個(gè)或多個(gè)凝聚的多細(xì)胞聚集體施加內(nèi)皮細(xì)胞層；并孵育所述多細(xì)胞聚集體，以使所述多細(xì)胞聚集體凝聚以形成組織。
[0175]在一些實(shí)施方案中，本文中公開了工程化的組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其包含基于細(xì)胞的三維元件和暫時(shí)的或可移除的限制材料，其中該限制材料允許細(xì)胞與培養(yǎng)基之間直接接觸。在一些實(shí)施方案中，該工程化的、基于細(xì)胞的三維元件是生物打印的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該工程化的、基于細(xì)胞的三維元件不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，該限制材料具有至少一個(gè)以下特征:基本上不粘附于細(xì)胞；是生物相容的；是可擠出的；是非細(xì)胞的；具有足夠的強(qiáng)度，以提供對(duì)細(xì)胞的支持；和不溶于水性條件。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該限制材料不是塑料，不是玻璃，且不是陶瓷。在一些實(shí)施方案中，該限制材料是水凝膠。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該限制材料是NovoGel?。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該限制材料包括如下的一種或多種:瓊 脂糖、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、透明質(zhì)酸、明膠、泊洛沙姆、甲基丙烯酸羥乙酯、肽水凝膠、Matrigel?、聚二甲硅氧烷、硅、絲、聚丙烯酰胺、聚乳酸、表面活性劑多元醇和藻酸鹽。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞和/或限制材料的至少一種從生物打印機(jī)擠出。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在限制材料中存在間隙，并且其中營養(yǎng)培養(yǎng)基能夠通過該間隙接觸細(xì)胞。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該間隙為約IOOym至約30mm寬。在一些實(shí)施方案中，該間隙圍繞該結(jié)構(gòu)不均勻地分布，從而使該組織的細(xì)胞不均勻地暴露于營養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，其中該組織至少約10%的表面積暴露于適合于與營養(yǎng)培養(yǎng)基接觸的間隙。在一些實(shí)施方案中，該限制材料覆蓋在細(xì)胞上，作為至少一個(gè)細(xì)長(zhǎng)的元件。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，限制材料的細(xì)長(zhǎng)元件具有約100 μ m至約Imm的橫截面厚度。在一些實(shí)施方案中，在限制材料的細(xì)長(zhǎng)元件之間存在間隙。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)從生物打印機(jī)擠出該限制材料時(shí)，在細(xì)長(zhǎng)元件之間留下間隙。在其它實(shí)施方案中，將至少一些限制材料從系統(tǒng)中除去，以提供間隙。在一些實(shí)施方案中，限制材料的細(xì)長(zhǎng)材料是基本上平行的，并且該間隙是細(xì)長(zhǎng)的。在一些實(shí)施方案中，限制材料的細(xì)長(zhǎng)元件被布置在網(wǎng)格中。在一些實(shí)施方案中，限制材料的細(xì)長(zhǎng)元件將該結(jié)構(gòu)附著在支承面上。在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)適合于運(yùn)送。在一些實(shí)施方案中，生物打印的細(xì)胞包含以下中的至少一種:平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該營養(yǎng)培養(yǎng)基包含以下中的至少一種:氧(O2)、碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、鹽、礦物質(zhì)、維生素、血清、抗生素、化學(xué)品、蛋白質(zhì)、核酸、藥物化合物和抗體。
[0176]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了工程化的活組織，其包含三維的包含細(xì)胞的元件，通過水凝膠固定在合適的位置，其中該水凝膠作為圓柱體或帶狀體被分配到所述包含細(xì)胞的元件上，在該圓柱體或帶狀體之間存在間隙，細(xì)胞通過該間隙接近營養(yǎng)物，并且其中該水凝膠可從該組織移除。[0177]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了用于增加工程化組織的存活力的方法，包括:通過暫時(shí)的或半永久性的網(wǎng)格，在該組織與營養(yǎng)培養(yǎng)基之間提供直接接觸，其中該組織不含任何預(yù)形成的支架。在一些實(shí)施方案中，通過暫時(shí)的或半永久性的網(wǎng)格在該組織與培養(yǎng)基之間提供直接接觸的步驟包括:將所述組織束縛在多孔或間隙材料中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該孔或間隙為約100 μ m至約30_寬。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該多孔或間隙材料是水凝膠。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該多孔或間隙材料是瓊脂糖。在一些實(shí)施方案中，工程化組織的存活力在體外增加。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)成工程化組織的至少部分細(xì)胞的存活力得到延長(zhǎng)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案，該細(xì)胞的存活力延長(zhǎng)I天或以上。在一些實(shí)施方案中，該至少一種營養(yǎng)物選自:碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、鹽、礦物質(zhì)、維生素、血清、抗生素、蛋白質(zhì)、核酸、藥物化合物和抗體。在一些實(shí)施方案中，至少一種營養(yǎng)物是氧(O2)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該多孔或間隙水凝膠限制材料旨在提供在一個(gè)或多個(gè)表面上對(duì)營養(yǎng)物的暴露具有差異的生物打印的細(xì)胞。
[0178]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了制備組織培養(yǎng)系統(tǒng)的方法，包括如下步驟:在生物相容性基質(zhì)上建立包含細(xì)胞的三維元件；并分配限制材料以覆蓋該包含細(xì)胞的三維元件，其中該覆蓋的限制材料允許該細(xì)胞的至少一部分與生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。
[0179]在某些實(shí)施方案中，本文中公開了制備組織培養(yǎng)系統(tǒng)的方法，包括如下步驟:在表面上分配限制材料的周界；在該周界內(nèi)分配細(xì)胞；并分配限制材料以覆蓋該細(xì)胞，其中該覆蓋的限制材料允許該細(xì)胞的至少一部分與生長(zhǎng)培養(yǎng)基接觸。在一些實(shí)施方案中，限制材料的分配是通過生物打印完成的。在一些實(shí)施方案中，該方法包括或進(jìn)一步包括將該系統(tǒng)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 以使生物打印的細(xì)胞構(gòu)建體成熟。 實(shí)施例
[0180]下述具體實(shí)施例應(yīng)理解為僅是說明性的，而不以任何方式對(duì)公開內(nèi)容的其他部分進(jìn)行限制。
實(shí)施例1-細(xì)胞培養(yǎng)
[0181]平滑肌細(xì)朐
[0182]將原代人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC；GIBCO/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)在補(bǔ)充有10 %胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、0.lmg/mL鏈霉素、0.25 μ g/mL兩性霉素B、0.01M HEPES(均來自 Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)、50mg/L 腦氛酸、50mg/L 甘氛酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗壞血酸和3 μ g/L CuSO4(全部來自Sigma, St.Louis, MO)的低葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM ；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中，在 37°C和5% CO2下維持并擴(kuò)充。在所有的研究中使用傳代4-8代的HASMC的鋪滿培養(yǎng)物。
[0183]內(nèi)皮細(xì)胞
[0184]將原代人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC;GIBC0/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)在補(bǔ)充有10%FBS、ly g/mL氫化可的松、10ng/mL人表皮生長(zhǎng)因子、3ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10 μ g/mL肝素、100U/mL青霉素、0.lmg/mL鏈霉素和0.25 μ g/mL兩性霉素B (均來自Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)的培養(yǎng)基 I" (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中維持并擴(kuò)充。細(xì)胞在37°C和5% CO2下，在明膠(來自豬血清，Sigma, St.Louis, MO)包被的、組織培養(yǎng)物處理的燒瓶中生長(zhǎng)。在所有的研究中使用傳代4-8代的HAEC的鋪滿培養(yǎng)物。[0185]成纖維細(xì)朐
[0186]將原代人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF；GIBCO/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)在補(bǔ)充有2 % FBS、1 μ g/mL氫化可的松、lOng/mL人表皮生長(zhǎng)因子、3ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10 μ g/mL肝素、100U/mL青霉素和0.lmg/mL鏈霉素(均來自InvitrogenCorp., Carlsbad, CA)的培養(yǎng)基 106 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中，在 37°C和 5% CO2下維持并擴(kuò)充。在所有的研究中使用傳代4-8代的HDF的鋪滿培養(yǎng)物。
_7] 來自人脂肪抽吸物的SVF的SMC樣細(xì)胞
[0188]從膠原酶消化脂肪抽提物后分離的細(xì)胞的附著部分產(chǎn)生SMC樣細(xì)胞。此消化產(chǎn)生了被稱作基質(zhì)血管組分(SVF)的一群細(xì)胞。將SVF的細(xì)胞接種到標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)塑料上，并用合適的培養(yǎng)條件進(jìn)一步選擇貼壁細(xì)胞。將來自脂肪組織抽吸物的SVF的SMC樣細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、0.lmg/mL鏈霉素、0.25 μ g/mL兩性霉素B、0.01MHEPES(均來自 Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)、50mg/L腦氛酸、50mg/L甘氛酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗壞血酸和3 μ g/L CuS04(均來自Sigma, St.Louis, MO)的高葡萄糖Dulbecco改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM ；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中，在 37°C和 5% CO2 下維持并擴(kuò)充。在所有的研究中使用傳代3-8代的SVF-SMC的鋪滿培養(yǎng)物。
[0189]來自人脂肪抽吸物的SVF的EC
[0190]將來自基質(zhì)血管組分(SVF)的內(nèi)皮細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中維持并擴(kuò)充，該培養(yǎng)基通常用于生長(zhǎng)真正(bona fide)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的原代分離物。具體而言，將SVF-EC維持在補(bǔ)充有10%FBS、ly g/mL氫化可的松、10ng/mL人表皮生長(zhǎng)因子、3ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、1(^8/11^肝素、10(^/1^青霉素和0.lmg/mL鏈霉素的M199中。使細(xì)胞在37°C和5%CO2下，在組織培養(yǎng)基處理 的燒瓶中生長(zhǎng)。在所有的研究中使用傳代3-8代的SVF-EC的鋪滿培養(yǎng)物。
[0191]肺來源的細(xì)朐
[0192]正常人類肺成纖維細(xì)胞從LifeLine technologies或Lonza來獲得,并根據(jù)制造商的說明書，利用來自各個(gè)供應(yīng)商的培養(yǎng)基來增殖。小的氣道上皮細(xì)胞購自Lonza，并根據(jù)制造商的說明書在供應(yīng)商提供的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。肺氣道和肺血管平滑肌細(xì)胞從LifeLineTechnologies獲得,并根據(jù)制造商的說明書在供應(yīng)商提供的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
實(shí)施例2-NovoGel?溶液和模具
[0193]2%矛口 4% (w/v)NovoGeI11 溶液的吿l|備
[0194]將Ig 或 2g(分別對(duì)應(yīng) 2%或 4% )的 NovoGeI?(Organovo, San Diego, CA)溶于5OmL Dulbecco 憐酸鹽緩沖鹽水(DPBS ;Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中。簡(jiǎn)言之，將DPBS和NovoGel?在恒定攪拌下在加熱板上加熱到85°C,直至NovoGel?完全溶解。通過蒸汽滅菌法將NovoGel?溶液在125°C下滅菌25分鐘。NovoGel?溶液保持于液相，只要溫度維持在65.5°C以上。低于這個(gè)溫度會(huì)發(fā)生相變，NovoGel?溶液的粘度增加，并且NovoGel?形成固體凝膠。
[0195]NovoGel?模具的制備
[0196]采用適配IOcm培養(yǎng)皿的Tci'luni模具,制造用于孵育圓柱形生物墨水的NovoGel?模具。簡(jiǎn)言之，將Teflon?:模具使用70 %乙醇溶液預(yù)滅菌，并使該模具經(jīng)受45分鐘紫外線照射。將滅菌的模具放在IOcm培養(yǎng)皿(VWR International LLC, WestChester, PA)的上方，并牢固地附接。將這個(gè)組裝體(Teflonit模具+培養(yǎng)皿)垂直保持，并將45mL預(yù)加溫的無菌2% NovoGel?溶液倒入Teflon?模具與培養(yǎng)皿之間的間隙。隨后，將該組裝體在室溫下水平放置I小時(shí)，以使NovoGel?完全膠凝。在膠凝以后，取出Teflon?印制物，并用DPBS沖洗兩次NovoGel?模具。然后，向NovoGel?模具加入17.5mL的HASMC培養(yǎng)基，用于孵育多型圓柱形生物墨水。
實(shí)施例3-HASMC-HAEC多型圓柱形生物墨水的制造
[0197]為了制備多型圓柱形生物墨水，單獨(dú)收集HASMC和HAEC，隨后以預(yù)先確定的比例混合。簡(jiǎn)言之，從鋪滿的培養(yǎng)瓶中除去培養(yǎng)基，并用DPBS(lml/15cm2生長(zhǎng)面積)沖洗細(xì)胞。通過在胰蛋白酶(lml/15cm2生長(zhǎng)面積；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)存在下孵育10分鐘，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶的表面上脫離。采用0.15%胰蛋白酶來分離HASMC，而采用0.1%胰蛋白酶來分離HAEC。在孵育后,將合適的培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中(2X體積,相對(duì)于胰蛋白酶體積)。將細(xì)胞懸浮液在200g下離心6分鐘，隨后完全除去上清液。將細(xì)胞沉淀物重懸浮于各自的培養(yǎng)基中，并利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。將適當(dāng)體積的HASMC和HAEC合并，以產(chǎn)生含有15% HAEC和其余85% HASMC (基于總細(xì)胞群的％)的多型細(xì)胞懸浮液。將該多型細(xì)胞懸浮液在200g下離心5分鐘，隨后完全除去上清液。將多型細(xì)胞沉淀物重懸浮于6mL的HASMC培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移到20mL玻璃小瓶(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在定軌搖床上以150rpm在37°C和5% CO2下孵育60分鐘。這使得細(xì)胞彼此聚集，并開始細(xì)胞-細(xì)胞粘附。在孵育后，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，并在200g下離心5分鐘。在除去上清液培養(yǎng)基之后，將該細(xì)胞沉淀物重懸浮于400 μ I的HASMC培養(yǎng)基中，并用移液管上下吸取幾次，以確保所有的細(xì)胞簇被打破。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到放置在15mL離心管中白勺 0.5mL 微量離心管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在 2000g 下離心4分鐘，以形成高度致密并壓緊的細(xì)胞沉淀物。將上清液培養(yǎng)基吸出，并通過抽吸將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管(0D1.5mm, ID0.5mm, L75mm ;Drummond Scientific C0., BroomalI, PA)中，以產(chǎn)生50mm長(zhǎng)的圓柱形生物墨水。在37°C和5% CO2下，將毛細(xì)管中的細(xì)胞漿料在HASMC培養(yǎng)基中孵育20分鐘。隨后，使用隨毛細(xì)管提供的柱塞，將圓柱形生物墨水從毛細(xì)管中擠出到NovoGel?模具(例如，參見實(shí)施例2)(覆蓋有HASMC培養(yǎng)基)的凹槽中。將圓柱形生物墨水在37°C和5% CO2下孵育24小時(shí)。
實(shí)施例4-生物打印包含HASMC和HAEC多型圓柱形生物墨水的血管壁節(jié)段
[0198]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),在 NovoGel?底板(100毫米培養(yǎng)皿尺寸)上、在NovoGel?包被的孔內(nèi)，或者直接向多孔板(例如6-孔板)
中的C orning ^ Tmnswel18插入物上生物打印血管壁模擬節(jié)段。該過程包括以下三個(gè)階
段:
[0199]HASMC-HAEC多型牛物墨水的制各
[0200]對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)和人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)的培養(yǎng)物進(jìn)行胰蛋白酶化、計(jì)數(shù)并以適當(dāng)?shù)牧炕旌?，以生產(chǎn)以85:15或70:30的比例包含HASMC =HAEC的生物墨水。將該多型細(xì)胞懸浮液在旋轉(zhuǎn)震蕩器上搖動(dòng)60分鐘，收集并離心。將細(xì)胞吸入266或500 ym(ID)玻璃微細(xì)管中，然后擠出到培養(yǎng)基覆蓋的NovoGel?板內(nèi)，并孵育最少6小時(shí)。
[0201] 補(bǔ)片/三維細(xì)胞片的生物打印[0202]在多孔板的孔內(nèi)或NovoGel?底板(100mm培養(yǎng)皿尺寸)上的NovoGel?床上打印的情況下，生物打印第一層NovoGel?圓柱體。然后，在NovoGel?圓柱體的上方,利用NovoGel?棒來生物打印箱盒(box),使得內(nèi)部空間為8mm長(zhǎng)xl.25mm寬。將成熟的圓柱形生物墨水裝載到生物打印機(jī)上，用于在該箱盒內(nèi)打印。最后，將第三層NovoGel?圓柱體打印在第二層的上方，其或者覆蓋細(xì)胞的整個(gè)長(zhǎng)度或者在頂部創(chuàng)建網(wǎng)格/網(wǎng)孔型結(jié)構(gòu)。在該
板的孔內(nèi)的丁Hinsvve丨11!插入物上打印的情況下，去除前面描述的第一層NovoGel?棒。隨后，用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋該生物打印的構(gòu)建體，并孵育，在孵育期間，鄰接生物墨水區(qū)段融合，以形成三維細(xì)胞補(bǔ)片。
[0203]生物打印的構(gòu)建體的成熟
[0204]將包含HASMC-HAEC生物墨水的生物打印的構(gòu)建體孵育I至7天，以使該構(gòu)建體成熟，并給HAEC提供充足的時(shí)間來分選至該構(gòu)建體的外圍，從而模擬血管壁的一段。在一些實(shí)驗(yàn)中，使該三維細(xì)胞補(bǔ)片經(jīng)受剪切力(即脈動(dòng)流)，以有助于HAEC分選的過程。
實(shí)施例5-HASMC-HDF-HAEC多型圓柱形生物墨水的制造
[0205]為了制備多型圓柱形生物墨水，單獨(dú)收集HASMC、HDF和HAEC，隨后以預(yù)先確定的比例(例如，70:25:5的HASMC:HDF:HAEC比例)混合。簡(jiǎn)言之，從鋪滿的培養(yǎng)瓶中除去培養(yǎng)基，并用DPBS(lmL/10cm2生長(zhǎng)面積)沖洗細(xì)胞。通過在胰蛋白酶(lmL/15cm2生長(zhǎng)面積；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)存在下孵育10分鐘,使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶的表面上脫離。采用0.15%胰蛋白酶來分離HASMC和HDF，而采用0.1 %胰蛋白酶來分離HAEC。在孵育后，將合適的培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶(2X體積,相對(duì)于胰蛋白酶體積)中。將細(xì)胞懸浮液在200g下離心6分鐘，隨后完全除去上清液。將細(xì)胞沉淀物重懸浮于各自的培養(yǎng)基中，并利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。將適當(dāng)體積的HASMC、HDF和HAEC合并，以產(chǎn)生多型細(xì)胞懸浮液。將該多型細(xì)胞懸浮液在200g下離心5分鐘，隨后吸出上清液。將多型細(xì)胞沉淀物重懸浮于6mL的HASMC培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移到20mL玻璃小管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在定軌搖床上以150rpm在37°C和5% CO2下孵育60分鐘。這使得細(xì)胞彼此聚集，并開始細(xì)胞-細(xì)胞粘附。在孵育后，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，并在200g下離心5分鐘。在除去上清液培養(yǎng)基之后，將細(xì)胞沉淀物重懸浮于400 μ I的HASMC培養(yǎng)基中，并用移液管上下吸取幾次，以確保所有的細(xì)胞簇被打破。將該細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到放置在15mL離心管中的 0.5mL 微量離心管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在 2000g 下離心4分鐘，以形成高度致密并壓緊的細(xì)胞沉淀物。將上清液培養(yǎng)基吸出，并通過抽吸將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管(0D1.5mm, ID0.266mm, L75mm ;Drummond Scientific C0., BroomalI, PA)中，以產(chǎn)生50mm長(zhǎng)的圓柱形生物墨水聚集體。在37°C和5% CO2下，將毛細(xì)管中的細(xì)胞漿料在HASMC培養(yǎng)基中孵育20分鐘。隨后，使用隨毛細(xì)管提供的柱塞，將圓柱形生物墨水從毛細(xì)管中擠出到NovoGel?模具(參見，例如，實(shí)施例2)(覆蓋有HASMC培養(yǎng)基)的凹槽中。將圓柱形生物墨水在37°C和5% CO2下孵育6至24小時(shí)。
實(shí)施例6-生物打印包含多型HASMC、HAEC和HDFa生物墨水的血管壁節(jié)段
[0206]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),在 NovoGel?底板(100毫米培養(yǎng)皿尺寸)上、在NovoGel?包被的孔內(nèi)，或者直接向多孔板(例如6-孔板)
中的(_':(^丨丨)^':1_丨\1仍\\.丄‘丨丨@插入物上生物打印血管壁模擬節(jié)段。該過程包括以下三個(gè)階段:
[0207]HASMC-HDFa-HAEC牛物墨水的制各
[0208]對(duì)HASMC、HAEC和HDFa的培養(yǎng)物進(jìn)行胰蛋白酶化、計(jì)數(shù)并以適當(dāng)?shù)牧炕旌希援a(chǎn)生以70:15:15的比例包含HASMC =HDPa =HAEC的生物墨水。將該多型細(xì)胞懸浮液在旋轉(zhuǎn)震蕩器上搖動(dòng)60分鐘，收集并離心。將細(xì)胞吸入266或500 μ m(ID)玻璃微細(xì)管中，然后擠出到培養(yǎng)基覆蓋的NovoGel?板，并培養(yǎng)最少6小時(shí)。
[0209]補(bǔ)片/三維細(xì)胞片的生物打印
[0210]在多孔板的孔內(nèi)或NovoGel?底板(100mm培養(yǎng)皿尺寸)上的NovoGel?床上打印的情況下，生物打印第一層NovoGel?圓柱體。然后，在NovoGel?圓柱體的上方,利用NovoGel?棒來生物打印箱盒,使得內(nèi)部空間為8mm長(zhǎng)xl.25mm寬。將成熟的圓柱形生物墨水 凝聚體裝載到生物打印機(jī)上，用于在箱盒內(nèi)打印。最后，將第三層NovoGel?圓柱體打印在第二層的上方，其或者覆蓋細(xì)胞的整個(gè)長(zhǎng)度或者在頂部創(chuàng)建網(wǎng)格/網(wǎng)孔類型的結(jié)構(gòu)。在該板的孔內(nèi)的Trans\veli+R'.插入物上打印的情況下，去除前前描述的第一層NovoGel?棒。隨后，用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋該生物打印的構(gòu)建體，并孵育，在孵育期間，鄰接的生物墨水區(qū)段融合，以形成三維細(xì)胞塊。
[0211]生物打印的構(gòu)建體的成熟
[0212]將包含多型HASMC-HDFa-HAEC生物墨水的生物打印的構(gòu)建體孵育I至7天，以使該構(gòu)建體成熟，并為HAEC提供充足的時(shí)間來分選至該構(gòu)建體的外圍,從而模擬血管壁的一段。在一些實(shí)驗(yàn)中，使該三維細(xì)胞補(bǔ)片經(jīng)受剪切力(即脈動(dòng)流)，以有助于HAEC分選的過程。
實(shí)施例7-SVF-SMC-SVF-EC多型圓梓形牛物墨水的制誥
[0213]為了制備多型圓柱形生物墨水，單獨(dú)收集SVF-SMC和SVF-EC，隨后以預(yù)先確定的比例混合。簡(jiǎn)言之，從鋪滿的培養(yǎng)瓶中除去培養(yǎng)基，并用DPBS(lmL/5cm2生長(zhǎng)面積)沖洗細(xì)胞。通過在TrypLE (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)存在下孵育5-10分鐘,使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶的表面上脫離。在孵育后，將合適的培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中來猝滅酶活性。將細(xì)胞懸浮液在200g下離心6分鐘，隨后完全除去上清液。將細(xì)胞沉淀物重懸浮于各自的培養(yǎng)基中，并利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。將適當(dāng)體積的SVF-SMC和SVF-EC合并，以產(chǎn)生含有15% SVF-EC和其余85% SVF-SMC (基于總細(xì)胞群的％ )的多型細(xì)胞懸浮液。將多型細(xì)胞懸浮液在200g下離心5分鐘，隨后完全除去上清液。將多型細(xì)胞沉淀物重懸浮于6mL的SVF-SMC培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移到20mL玻璃小管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在定軌搖床上以150印111在371:和5%0)2下孵育60分鐘。這使得細(xì)胞彼此聚集，并開始細(xì)胞-細(xì)胞粘附。在孵育后，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，并在200g下離心5分鐘。在除去上清液培養(yǎng)基之后，將細(xì)胞沉淀物重懸浮于400 μ I的SVF-SMC培養(yǎng)基中，并用移液管上下吸取幾次，以確保所有的細(xì)胞簇被打破。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到放置在15mL離心管中的0.5mL微量離心管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，隨后在 2000g 下離心 4 分鐘,以形成高度致密并壓緊的細(xì)胞沉淀物。將上清液培養(yǎng)基吸出，并通過抽吸將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管(0D1.25mm, ID0.266mm, T,75mm ；Drummond Scientific C0., BroomalI, PA)中，以產(chǎn)生50mm長(zhǎng)的圓柱形生物墨水聚集體。在37°C和5% CO2下，將毛細(xì)管中的細(xì)胞漿料在SVF-SMC培養(yǎng)基中孵育20分鐘。隨后，使用隨毛細(xì)管提供的柱塞，將圓柱形生物墨水從毛細(xì)管中擠出到NovoGel?模具(參見，例如，實(shí)施例2)(覆蓋有SVF-SMC培養(yǎng)基)的凹槽中。將圓柱形生物墨水在37°C和5% CO2下孵育6至12小時(shí)。實(shí)施例8-生物打印包含血管SMC和EC混合物的血管壁節(jié)段
[0214]利用NovoGen MMX Bioprinter? (Organovo, Inc.San Diego, CA),將血管壁構(gòu)建體生物打印到預(yù)先用1.5mL2% (w/v)NovoGel?包被的6孔培養(yǎng)板的孔中。用人血管平滑肌細(xì)胞(SMC)和人內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的混合物(SMC:EC比例為85:15或70:30)制備圓柱形生物墨水。通過將細(xì)胞沉淀物(SMC = EC)吸至內(nèi)徑(ID)SOOym或266μπι的玻璃微毛細(xì)管中，來產(chǎn)生生物墨水。隨后，將生物墨水圓柱體擠出到覆蓋有合適培養(yǎng)基的NovoGel?模具中。在生物打印之前，將生物墨水保持6至18小時(shí)。使用含有SMC和EC混合物的多型生物墨水。在這些實(shí)驗(yàn)中，將生物墨水內(nèi)的EC分選到生物墨水聚集體的外圍，導(dǎo)致形成由EC覆蓋并含有富SMC構(gòu)建體壁的構(gòu)建體。該過程導(dǎo)致形成含有由SMC和EC覆蓋物(例如，假定的中膜和內(nèi)膜)組成的壁的血管壁構(gòu)建體。使用生物打印方案將該構(gòu)建體生物打印在培養(yǎng)孔的中心，并且向培養(yǎng)孔填充合適的培養(yǎng)基，并將構(gòu)建體返回到培養(yǎng)箱中以供成熟和評(píng)價(jià)。生物打印后，用適量的培養(yǎng)基(例如，對(duì)于6孔板的I個(gè)孔是4mL)覆蓋該構(gòu)建體?？傊緦?shí)施例描述了血管SMC和EC用于在標(biāo)準(zhǔn)尺寸多孔組織培養(yǎng)板中生物打印血管壁節(jié)段或模擬物的用途。所得血管壁節(jié)段或模擬物的特征在于一個(gè)或多個(gè)EC外層和主要包含或僅包含SMC的內(nèi)壁。
實(shí)施例9-生物打印包含人血管SMC與EC覆蓋物的血管壁節(jié)段
[0215]利用NovoGen MMX Bioprinter? (Organovo, Inc.San Diego, CA),將血管壁構(gòu)建體生物打印到預(yù)先用1.5mL2% (w/v)NovoGel?所覆蓋的6孔培養(yǎng)板的孔中。用人血管平滑肌細(xì)胞(SMC)制備細(xì)胞生物墨水。通過將細(xì)胞沉淀物(SMC)吸至內(nèi)徑(ID)為500μπι或266 μ m的玻璃微毛細(xì)管中來產(chǎn)生生物墨水。隨后，將圓柱形生物墨水聚集體擠出到覆蓋有合適培養(yǎng)基的NovoGel?模具中。在生物打印之前，將該生物墨水保持6至18小時(shí)。將EC-濃縮物(1-1.5χ105個(gè)細(xì)胞/μ I)直接生物打印到之前生物打印的SMC結(jié)構(gòu)的上方，以形成該構(gòu)建體的第二層。該過程導(dǎo)致形成含有由SMC和EC覆蓋物(例如，假定的中膜和內(nèi)膜)組成的壁的血管壁構(gòu)建體。使用生物打印方案將該構(gòu)建體生物打印在培養(yǎng)孔的中心。生物打印后，用適量的培養(yǎng)基(例如，對(duì)于6孔板的I個(gè)孔是4mL)覆蓋該構(gòu)建體，并將其返回到培養(yǎng)箱中用于成熟和評(píng)價(jià)?？傊?，本實(shí)施例描述了血管SMC和EC用于在標(biāo)準(zhǔn)尺寸多孔組織培養(yǎng)板塊中生物打印血管壁節(jié)段或模擬物的用途。所得血管壁節(jié)段或模擬物的特征在于EC的外層和主要包含或僅包含SMC的內(nèi)壁。。
實(shí)施例10-利用NovoGel?容納生物打印包含層疊HAEC的HASMC的血管壁節(jié)段
[0216]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),在 NovoGel?包
被的孔內(nèi)或者直接向多孔板(例如6孔板)的Corning" i ransuell:"插入物上，生物打
印血管壁模擬節(jié)段。該過程包括下面三個(gè)階段:
[0217]HASMC牛物墨水的制各
[0218]對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)的培養(yǎng)物進(jìn)行胰蛋白酶化，之后在旋轉(zhuǎn)震蕩器上搖動(dòng)60分鐘。在搖動(dòng)之后，將細(xì)胞收集、離心并吸至266或500 μ m (ID)的玻璃微毛細(xì)管中。最后，將細(xì)胞擠出到培養(yǎng)基覆蓋的NovoGel?板內(nèi)，并孵育至少6小時(shí)。[0219]層疊HAEC的HASMC補(bǔ)片的牛物打印
[0220]就在生物打印補(bǔ)片(例如，節(jié)段)之前，對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)培養(yǎng)物進(jìn)行胰蛋白酶化、計(jì)數(shù)，之后以IxlO6個(gè)細(xì)胞/10 μ L培養(yǎng)基的工作濃度重懸浮于HAEC培養(yǎng)基中。將HAEC懸浮液置于將要用于對(duì)生物打印的補(bǔ)片進(jìn)行層化的生物打印機(jī)中。在打印到多孔板的孔內(nèi)的NovoGel?床上的情況下，生物打印第一層NovoGel?圓柱體。然后,在它的上方，利用NovoGel?棒來生物打印箱盒，使得內(nèi)部空間為8mm長(zhǎng)xl.25毫米寬。將成熟的圓柱形HASMC生物墨水裝載到生物打印機(jī)上用于在該箱盒內(nèi)打印。然后，通過生物打印機(jī)將懸浮液中的HAEC吸入干凈的微毛細(xì)管中，并分配到打印的HASMC層的上方4次，接近所打印的補(bǔ)片的四個(gè)角。每滴的體積為2.5 μ L。在繼續(xù)打印第三層之前，將該構(gòu)建體孵育15-30分鐘。最后，將第三層NovoGel?圓柱體打印在第二層的上方，以在頂部創(chuàng)建網(wǎng)格/網(wǎng)孔型結(jié)構(gòu)。在打印到培養(yǎng)板的孔內(nèi)部的TransweHg插入物上的情況下，除去前面描述的第一層NovoGel?棒。隨后，用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋生物打印的構(gòu)建體并進(jìn)行孵育。
[0221]生物打印的構(gòu)建體的成熟
[0222]將生物打印 的構(gòu)建體孵育I至7天，以使該構(gòu)建體成熟，并為HAEC提供充足的時(shí)間，以在HASMC補(bǔ)片的上方形成均勻的薄單層。在某些實(shí)驗(yàn)中，使該三維細(xì)胞補(bǔ)片經(jīng)受剪切力(即脈動(dòng)流)。
實(shí)施例11-利用NovoGel?容納向HDFa單層上生物打印包含層疊HAEC的HASMC的血
管壁節(jié)段
[0223]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),直接向多孔板(例如6孔板)的Corning# Transwell?插入物上生物打印血管壁模擬節(jié)段。該過程包括以下四個(gè)階段:
[0224]HDFa’ s 向Transwell*膜上的培養(yǎng)
[0225]以20000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度，將人成體皮膚成纖維細(xì)胞(HDFa)接種到Transwcl1:|?'!旲上,并培養(yǎng)至少6天。這使細(xì)胞附著、生長(zhǎng)并變成在rJYgug胃ei1.1吳上鋪滿的層。
[0226]HASMC牛物墨水的制各
[0227]對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)的培養(yǎng)物進(jìn)行胰蛋白酶化，并在旋轉(zhuǎn)震蕩器上搖動(dòng)60分鐘。在搖動(dòng)之后，將細(xì)胞收集、離心并吸到266或500 μ m(ID)玻璃微毛細(xì)管中。隨后，將細(xì)胞擠出到培養(yǎng)基覆蓋的NovoGel?板中，并孵育至少6小時(shí)。
[0228]層疊HAEC的HASMC補(bǔ)片的牛物打印
[0229]就在生物打印補(bǔ)片(例如，節(jié)段)之前，對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)培養(yǎng)物進(jìn)行胰蛋白酶化、計(jì)數(shù)，之后以IxlO6個(gè)細(xì)胞/10 μ L培養(yǎng)基的工作濃度重懸浮于HAEC培養(yǎng)基中。將HAEC懸浮液置于將要用于對(duì)生物打印的補(bǔ)片進(jìn)行層化的生物打印機(jī)中。完全吸出具有生長(zhǎng)在Tmnswcll^膜上的HDFa’s的多孔板中的培養(yǎng)基，并將該板轉(zhuǎn)移到生物打印機(jī)上。直接在該膜上的HDFa’ s的上方，利用NovoGel?棒來生物打印箱盒，使得限定的空間為8mm長(zhǎng)xl.25mm寬。將成熟的HASMC生物墨水圓柱體裝載到生物打印機(jī)上用于在該箱盒內(nèi)打印。然后，通過生物打印機(jī)將懸浮液中的HAEC吸到干凈的微毛細(xì)管中，并分配到打印的HASMC層的上方4次，接近所打印的補(bǔ)片的四個(gè)角。每滴的體積為2.5 μ L。在繼續(xù)打印頂部NovoGel?棒層之前,將該構(gòu)建體孵育15-30分鐘。最后，打印NovoGel?圓柱體的頂層，以創(chuàng)建網(wǎng)格/網(wǎng)孔型結(jié)構(gòu)。隨后，用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋該生物打印的構(gòu)建體并孵育。
[0230]生物打印的構(gòu)建體的成熟
[0231]將生物打印的構(gòu)建體孵育I至7天，以使該構(gòu)建體成熟，并為HAEC提供充足的時(shí)間，以在HASMC補(bǔ)片的上方形成均勻的薄單層。實(shí)施例12-用于空間限制構(gòu)建體同時(shí)允許與培養(yǎng)基直接接觸的水凝膠網(wǎng)格
[0232]利用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),穿過三維細(xì)胞片的頂面的一部分來生物打印圓柱形水凝膠元件。該網(wǎng)格向該片提供空間限制，并允許該片與周圍培養(yǎng)基之間直接接觸。首先，生物打印水凝膠基底層。其次，生物打印限定出8mm長(zhǎng)xl.25mm寬的空間的水凝膠窗口。第三，在該水凝膠窗口內(nèi)生物打印細(xì)胞生物墨水，以形成三維細(xì)胞片。并且，第四，生物打印水凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。在各個(gè)試驗(yàn)中，水凝膠元件的尺寸為直徑約100 μ m至Imm,并且兀件之間的間距為大約100 μ m至10mm。
[0233]在一些試驗(yàn)中，將水凝膠元件沿著一個(gè)方向打印，以在細(xì)胞片的上方創(chuàng)建長(zhǎng)的開放通道。在其它實(shí)驗(yàn)中，將水凝膠元件在多個(gè)方向上打印，以在片的上方創(chuàng)建開放區(qū)域的網(wǎng)格狀圖案。水凝膠由NovoGel?組成。任選地將該網(wǎng)格結(jié)構(gòu)延長(zhǎng)通過該結(jié)構(gòu)，并延長(zhǎng)到打印表面上，以允許施加額外的材料，從而將該結(jié)構(gòu)附著到打印表面上。所得網(wǎng)格用來空間限制該構(gòu)建體，但允許一些細(xì)胞構(gòu)建體與周圍的營養(yǎng)培養(yǎng)基直接接觸。 實(shí)施例13-利用連續(xù)沉積和棋盤格狀功能單元結(jié)構(gòu)生物打印的肝組織
[0234]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),利用連續(xù)沉積機(jī)理來生物打印工程化的肝組織。該肝組織的三維結(jié)構(gòu)是基于重復(fù)功能單元，在這種情況下是六邊形。該生物墨水由包封在擠出化合物(表面活性劑多元醇-PF-127)中的肝星形細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成。
[0235]30% PF-127 的制各
[0236]利用PBS制備30%PF_127溶液(w/w)。利用保持在4°C下的磁力攪拌板，將PF-127粉末與冷卻的PBS混合。完全溶解發(fā)生在大約48小時(shí)內(nèi)。
[0237]細(xì)朐制各和牛物打印
[0238]將由82%肝星形細(xì)胞(SC)和18%人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人成體皮膚成纖維細(xì)胞(HDFa)組成的細(xì)胞懸浮液分到15mL管中，以便獲得三個(gè)細(xì)胞濃度:50xl06個(gè)細(xì)胞/ml、100xl06個(gè)細(xì)胞/mL和200xl06個(gè)細(xì)胞/ml，接著進(jìn)行離心。將每個(gè)細(xì)胞沉淀物重懸浮于30% PF-127中，并抽吸到生物打印機(jī)使用的3cc儲(chǔ)存器中。采用510 μ m分配末端，將包封的細(xì)胞生物打印到PDMS底板上成為單一六邊形(參見圖6A)或六邊形棋盤格狀結(jié)構(gòu)(參見圖6B)。每個(gè)構(gòu)建體接納大約200 μ L的培養(yǎng)基，并在室溫下孵育20分鐘，以評(píng)價(jià)構(gòu)建體的完整性。
[0239]多層牛物打印
[0240]對(duì)于六邊形棋盤格狀實(shí)驗(yàn)，生物打印高達(dá)(4個(gè))連續(xù)層，結(jié)果形成具有更多細(xì)胞材料存在的更高結(jié)構(gòu)。制作后，每個(gè)構(gòu)建體最初接納大約200 μ L的完全培養(yǎng)基，以評(píng)價(jià)構(gòu)建體的完整性。將構(gòu)建體在室溫下孵育20分鐘，之后浸入到20mL的完全培養(yǎng)基中。[0241]結(jié)果
[0242] 在含有10%胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(它溶解PF127)中培養(yǎng)18小時(shí)后，在生物打印的幾何形狀內(nèi)含有的細(xì)胞彼此凝聚，足以產(chǎn)生組織的完整的組織鄰接片，其保持了原始設(shè)計(jì)的幾何圖案(參見圖6D)。圖7中所示的是:在10%中性緩沖福爾馬林中固定后，棋盤格狀構(gòu)建體的單個(gè)節(jié)段的H&E染色。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞是活的、完整的，并且局限于它們?cè)即蛴〉膸缀涡螤睢?br> 實(shí)施例14-強(qiáng)制層化
[0243]以圓柱形生物墨水或細(xì)胞懸浮液的形式在Pluronic F-127 (Lutrol，BASF)中制備用于生物打印的細(xì)胞群(均質(zhì)的或異質(zhì)的)。簡(jiǎn)言之，對(duì)于生物墨水的制備，利用重組人類胰蛋白酶(75 μ g/mL, Roche)或0.05%胰蛋白酶(Invitrogen),從標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)塑料中釋放出細(xì)胞。在酶釋放之后，將細(xì)胞清洗、收集、計(jì)數(shù)并以期望的比例(例如，50:50的肝星形細(xì)胞(hSC):內(nèi)皮細(xì)胞(EC))組合，并通過離心進(jìn)行沉淀。然后，從細(xì)胞沉淀物中除去上清液，并將細(xì)胞混合物吸入至所需直徑(內(nèi)徑一般為500 μ m或250 μ m)的玻璃微毛細(xì)管中。隨后將這個(gè)圓柱形細(xì)胞制備物擠出至模具中，該模具由具有用于生物墨水成熟的孔道的非細(xì)胞粘著水凝膠材料形成。隨后，將所得生物墨水圓柱體在完全細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)憑經(jīng)驗(yàn)確定的時(shí)間，一般為2至24小時(shí)。
[0244]簡(jiǎn)言之，對(duì)于水凝膠細(xì)胞懸浮液的制備，利用本文中描述的任何一種酶介導(dǎo)的方案，將細(xì)胞從標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)容器中釋放出來。隨后，將釋放的細(xì)胞用含有血清的培養(yǎng)基清洗、收集、計(jì)數(shù)并離心，以形成致密的細(xì)胞沉淀物。從所得細(xì)胞顆粒中除去上清液，隨后以50至200xl06個(gè)細(xì)胞/mL的濃度(10_300χ106個(gè)細(xì)胞/mL的范圍)，將細(xì)胞再懸浮于冷的PF-127 (4 °C )中。然后，使用 NovoGen MMX Bioprinter? 生物打印機(jī)(Organovo, Inc.，SanDiego, CA)，將該細(xì)胞懸浮液吸入注射器中。
[0245]隨后，利用生物打印機(jī)來完成具有強(qiáng)制的細(xì)胞圖案化、層化或取向的組織構(gòu)建體的制作。用圓柱形生物墨水、在水溶性凝膠中的細(xì)胞懸浮液或它們的組合，來進(jìn)行三維組織構(gòu)建體的生物打印。為了獲得限定的細(xì)胞圖案或?qū)踊?，相關(guān)細(xì)胞群的組合被包含在生物墨水或細(xì)胞懸浮液制備中，然后以使負(fù)載細(xì)胞溶液的凝膠材料溶解的方式，來進(jìn)行生物打印，在沉積的生物墨水周圍產(chǎn)生限定的細(xì)胞層化(參見圖8)。也可以通過利用和并入限定的、離散的細(xì)胞群(例如，hSC和EC)來獲得細(xì)胞圖案、組織或?qū)踊@導(dǎo)致在生物打印的組織內(nèi)形成細(xì)胞和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的可預(yù)測(cè)且可重復(fù)的組織(參見圖9)。
[0246]在一些試驗(yàn)中，在成熟或培養(yǎng)期之后，觀察在生物打印的新組織中最終的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)。將構(gòu)建體維持在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱中(37°C，補(bǔ)充有5% CO2的加濕室)，并隨著時(shí)間變化來評(píng)價(jià)。
[0247]結(jié)果
[0248]利用生物打印實(shí)現(xiàn)細(xì)胞圖案化、層化或布置。通過含有異質(zhì)的(即:多型的)細(xì)胞群的生物墨水的生物打印，或者通過將生物墨水(均質(zhì)的或異質(zhì)的細(xì)胞群)與高密度細(xì)胞凝膠或細(xì)胞懸浮液結(jié)合，觀察不同的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)。這些新組織構(gòu)建體在加濕室(培養(yǎng)箱)中的成熟，導(dǎo)致進(jìn)一步在這些生物打印的新組織中建立不同的細(xì)胞布置、結(jié)構(gòu)和/或分離。
[0249]例如，裝載了包括H印G2細(xì)胞的生物打印的生物墨水頂部的PF-127的EC:hSC生物打印，導(dǎo)致具有不同細(xì)胞群和離散組織形態(tài)的構(gòu)建體的不同層的建立。在含有hSC和EC的生物墨水構(gòu)建體的情況下，在完全培養(yǎng)基中成長(zhǎng)超過3天的生物打印構(gòu)建體，被發(fā)現(xiàn)在該構(gòu)建體核心中的外圍和組織微管網(wǎng)絡(luò)含有不同的EC層。用包括血管平滑肌細(xì)胞的均質(zhì)(SP，單型的)群的生物墨水制造的生物打印構(gòu)建體(高濃度EC溶液被生物打印在它上面)，被發(fā)現(xiàn)在該構(gòu)建體外圍含有不同的EC層。
實(shí)施例15-層化的非血管構(gòu)建體(氣道類似物)
[0250]用正常的人肺成纖維細(xì)胞(NHLF)、小氣道上皮細(xì)胞(SAEC)和人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(EC)制備圓柱形生物墨水。使細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下增殖，并將細(xì)胞在以下培養(yǎng)基中培養(yǎng):從與細(xì)胞相同的供應(yīng)商處購買的培養(yǎng)基，或者包括在原始文獻(xiàn)中一般發(fā)現(xiàn)的對(duì)那些特殊細(xì)胞類型的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)踐有利的組分的培養(yǎng)基。簡(jiǎn)言之，通過采用無陽離子的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗，將細(xì)胞從標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)塑料制品中釋放，然后將細(xì)胞暴露于0.1-0.05%的胰蛋白酶(InvitiOgen)。然后，將釋放的細(xì)胞用含有血清的培養(yǎng)基清洗、收集、計(jì)數(shù)并以合適的比例合并，通過離心進(jìn)行沉淀。典型地，以NHLF = EC為90:10至50:50的比例將NHLF和EC混合。然后，除去上清液，并將細(xì)胞顆粒吸入玻璃微細(xì)管中，隨后將其浸入完全培養(yǎng)基中大約15至20分鐘。隨后，將該圓柱形生物墨水結(jié)構(gòu)擠壓入非細(xì)胞粘著的水凝膠模具中(含有線性通道)，并保持2至18小時(shí)。
[0251]隨后，在高濃度細(xì)胞懸浮液中制備SAEC。簡(jiǎn)言之，如本文中所述的將SAEC釋放、收集、計(jì)數(shù)并通過離心進(jìn)行沉淀。除去上清液，并將細(xì)胞沉淀物再懸浮于小體積的完全培養(yǎng)基中，生產(chǎn)IxlO5個(gè)細(xì)胞/μ L的高濃度細(xì)胞團(tuán)。隨后，將該細(xì)胞懸浮液在4°C下儲(chǔ)存，直至使用。
[0252]然后，將人肺部構(gòu)建體生物打印到多孔板的孔中，或者生物打印到細(xì)胞培養(yǎng)孔插入物(Transwel 1，BD)的膜上。使用多細(xì)胞NHLF或NHLF = EC生物墨水來生物打印代表小氣道壁的組織層。制造具有1.25mm x8mm x0.25mm(ff x L x H)初始尺寸的人氣道組織片段。用NHLF或NHLF = EC生物墨水生物打印該壁層后，接著將SAEC的濃縮細(xì)胞懸浮液生物打印在該壁的上表面，在假定的氣道間隙頂部形成包括氣道上皮的第二層。
[0253]然后，將人氣道組織片段浸入含有血清的完全細(xì)胞培養(yǎng)基中，并放在補(bǔ)充有5%CO2的標(biāo)準(zhǔn)加濕室中成熟。然后，將該生物打印的人氣道片段在靜態(tài)條件下培養(yǎng)，或者通過添加細(xì)胞因子或生物力學(xué)信號(hào)(例如，流動(dòng)、剪切應(yīng)力等)來刺激。隨后，將生物打印的人肺部組織構(gòu)建體培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)7天，并評(píng)價(jià)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、細(xì)胞活力和構(gòu)建體完整性(參見圖11)。
[0254]結(jié)果
[0255]具有包含NHLF壁(其含有EC-襯里的微管輪廓的組織化網(wǎng)絡(luò)和包括小氣道上皮細(xì)胞的頂部表面)的層化細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物打印的人肺部組織構(gòu)建體被成功制造，并培養(yǎng)維持。利用具有NHLF或NHLF = EC生物墨水圓柱體的多層途徑和SAEC的生物打印層，來形成生物打印的構(gòu)建體。一旦采用被認(rèn)為在肺的疾病過程中很重要的細(xì)胞因子刺激后，觀察包括組織增厚和NHLF活化的形態(tài)變化。
實(shí)施例16-層化的血管壁構(gòu)建體
[0256] 用血管平滑肌細(xì)胞(SMC)和(在一些試驗(yàn)中)皮膚成纖維細(xì)胞(Fb)來制備圓柱形生物墨水。簡(jiǎn)言之，通過采用無陽離子的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗，將細(xì)胞從標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)塑料制品中釋放，然后暴露于0.05%的胰蛋白酶(Invitrogen)。然后，將釋放的細(xì)胞用含有血清的培養(yǎng)基清洗、收集、計(jì)數(shù)并(對(duì)于包括Fb的實(shí)驗(yàn))以合適的比例合并，以及通過離心進(jìn)行沉淀。然后，除去上清液，并將細(xì)胞沉淀物吸入玻璃微細(xì)管中，隨后將其浸入完全培養(yǎng)基中大約15至20分鐘。隨后，將該圓柱形生物墨水結(jié)構(gòu)擠出入非細(xì)胞粘著的水凝膠模具中(含有線性通道)，并保持2至18小時(shí)。
[0257]隨后，在高濃度細(xì)胞懸浮液中制備內(nèi)皮細(xì)胞(EC)。簡(jiǎn)言之，如上所述，將EC釋放、收集、計(jì)數(shù)并通過離心進(jìn)行沉淀。除去上清液，并將細(xì)胞沉淀物再懸浮于小體積的完全培養(yǎng)基中，生產(chǎn)IxlO5個(gè)細(xì)胞/μ L的高濃度細(xì)胞團(tuán)。隨后，將該細(xì)胞懸浮液在4°C下儲(chǔ)存，直至使用。
[0258]然后，將血管壁構(gòu)建體生物打印到多孔板的孔中，或者生物打印到細(xì)胞培養(yǎng)孔插入物(Transwel 1，BD)的膜上。使用圓柱形SMC或SMC = Fb生物墨水來生物打印血管壁節(jié)段的中膜。制造具有1.25mmx8mm x0.25mm(W x L x H)初始尺寸的血管壁節(jié)段。在采用SMC或SMC = Fb生物墨水生物打印假定的中膜(以形成組織的第一層)之后，接著將EC的濃縮細(xì)胞懸浮液生物打印在第一層的上表面，以形成血管內(nèi)皮的第二層(作為假定的內(nèi)膜)(參見圖12)。
[0259]然后，將生物打印的血管壁節(jié)段浸入含有血清的完全細(xì)胞培養(yǎng)基中，并放在補(bǔ)充有5% CO2的標(biāo)準(zhǔn)加濕室中來成熟。然后，將該生物打印的血管壁節(jié)段在靜態(tài)條件下培養(yǎng)，或者通過添加細(xì)胞因子或生物力學(xué)信號(hào)(例如，流動(dòng)、剪切應(yīng)力等)來刺激。將血管壁節(jié)段培養(yǎng)高達(dá)7天，并評(píng)價(jià)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、細(xì)胞活力和構(gòu)建體完整性(參見圖13)。[0260]益果
[0261]具有包括富含SMC的培養(yǎng)基和EC襯里內(nèi)膜的層化細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物打印的血管壁節(jié)段被成功制造，并培養(yǎng)維持。利用具有SMC或SMC = Fb生物墨水圓柱體的多層途徑和EC的生物打印層，來形成生物打印的構(gòu)建體。
實(shí)施例17-多孔板
[0262]制備用于使用多種生物墨水形式的生物打印的細(xì)胞群(均質(zhì)的或異質(zhì)的)，包括圓柱形生物墨水聚集體、細(xì)胞聚集體的懸浮液或細(xì)胞懸浮液/漿料，任選含有擠出化合物。簡(jiǎn)言之，為制備圓柱形生物墨水，利用重組人胰蛋白酶(75 μ g/mL,Roche)或0.05%胰蛋白酶(InvitiOgen)將細(xì)胞從標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)塑料制品釋放，在酶釋放之后，接著將細(xì)胞清洗、收集、計(jì)數(shù)并以需要的比例(即:50:50的肝星形細(xì)胞(hSC):內(nèi)皮細(xì)胞(EC))結(jié)合，并通過離心進(jìn)行沉淀。隨后，從細(xì)胞沉淀物除去上清液，并將細(xì)胞混合物吸入所需直徑(內(nèi)徑一般為500 μ m或250 μ m)的玻璃微細(xì)管中。隨后將這個(gè)圓柱形細(xì)胞制備物擠入模具中，該模具由具有用于生物墨水成熟的孔道的非細(xì)胞粘著水凝膠材料形成。隨后，將所得生物墨水圓柱體在完全細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)憑經(jīng)驗(yàn)確定的時(shí)間，一般為2至24小時(shí)。
[0263]為了制備細(xì)胞聚集體的細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞漿料，遵循了本文中描述的細(xì)胞細(xì)殖和釋放方案。在產(chǎn)生細(xì)胞沉淀物時(shí)，從沉淀物除去上清液，并將沉淀物轉(zhuǎn)移到常規(guī)的沉積注射器。然后，將這個(gè)注射器安裝到用于將細(xì)胞聚集體溶液或漿料直接生物打印到多孔板中的生物打印機(jī)沉積頭上。
[0264]然后，將復(fù)制組織構(gòu)建體生物打印到多孔組織培養(yǎng)板(例如，6孔或24孔)的孔中或多孔細(xì)胞培養(yǎng)插入物(即:Transwell，BD)中，然后被放進(jìn)合適的多孔板。在生物打印后，使三維構(gòu)建體與相關(guān)的培養(yǎng)基成熟/老化(conditioned) —段時(shí)間,一般為3至14天。在成熟后，構(gòu)建體被獲得、固定并進(jìn)行用于常規(guī)組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的處理。
[0265] [0266]在多孔培養(yǎng)板或多孔培養(yǎng)插入物(隨后被插入到多孔板)中，成功制造了生物打印的組織。這個(gè)方法允許生成復(fù)制生物打印組織，其任選地被培養(yǎng)和處理，以形成相同或獨(dú)特的培養(yǎng)條件。這個(gè)方法導(dǎo)致在生物打印過程的處理能力和樣品形成中的顯著增加(參見圖14)。實(shí)施例18-生物打印的新組織的刺激
[0267]制備包括相關(guān)的異質(zhì)(即，多型)細(xì)胞群的圓柱形生物墨水。以特定的比例將細(xì)胞生理上相關(guān)的群(例如，正常人肺成纖維細(xì)胞(NHLF)和小氣道上皮細(xì)胞(SAEC)或血管平滑肌細(xì)胞(SMC)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC))結(jié)合，以產(chǎn)生恰當(dāng)?shù)纳锬Ｔ诹硗獾膶?shí)驗(yàn)中，將肝星形細(xì)胞(hSC)與EC結(jié)合，以形成肝組織。在另外的實(shí)驗(yàn)中，將肝星形細(xì)胞(hSC)與EC結(jié)合，以形成肝組織。將細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下保持并細(xì)殖，并將細(xì)胞在以下培養(yǎng)基中培養(yǎng):從與細(xì)胞相同的供應(yīng)商處購買的培養(yǎng)基，或者包括在原始文獻(xiàn)中一般發(fā)現(xiàn)的對(duì)那些特殊細(xì)胞類型的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)踐有利的組分的培養(yǎng)基。用于生物墨水制備的細(xì)胞處理如下:簡(jiǎn)言之，通過無陽離子的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗，將細(xì)胞從標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)塑料制品中釋放，然后將細(xì)胞暴露于0.1-0.05%的胰蛋白酶(Invitrogen)。然后，將釋放的細(xì)胞用含有血清的培養(yǎng)基清洗、收集、計(jì)數(shù)并(對(duì)于刺激分析或正在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn))以合適的比例合并，通過離心進(jìn)行沉淀。然后，除去上清液，并將細(xì)胞沉淀物吸入玻璃微細(xì)管中，隨后將其浸入完全培養(yǎng)基中大約15至20分鐘。隨后，將該圓柱形生物墨水結(jié)構(gòu)擠入非細(xì)胞粘著的水凝膠模具中(含有線性通道)，并保持2至18小時(shí)。
[0268]對(duì)于需要均質(zhì)(即，單型)細(xì)胞層的組織構(gòu)建體，受限于上表面，利用含有相關(guān)細(xì)胞類型來進(jìn)行第二細(xì)胞制備。典型地，在高濃度細(xì)胞懸浮液中，制備血管內(nèi)皮細(xì)胞或小氣道上皮細(xì)胞(分別對(duì)于血管壁和人肺組織模型)。簡(jiǎn)言之，如上所述，將細(xì)胞釋放、收集、計(jì)數(shù)并通過離心進(jìn)行沉淀。除去上清液,并將細(xì)胞沉淀物再懸浮于小體積的完全培養(yǎng)基中，生產(chǎn)IxlO5個(gè)細(xì)胞/μ L的高濃度細(xì)胞團(tuán)。隨后，將該細(xì)胞懸浮液在4°C下儲(chǔ)存，直至使用。
[0269]然后，將生物打印的組織構(gòu)建體制造到多孔板的孔中，或者制造到細(xì)胞培養(yǎng)孔插入物(Transwel 1，BD)的膜上。產(chǎn)生多種細(xì)胞類型。采用多細(xì)胞的NHLF或NHLF = EC生物墨水來生物打印厚的間質(zhì)組織，以概括(recapitulate)小氣道的壁,接著與SAEC層化，以提供同源的上皮隔離層。采用血管的SMC或SMC:成纖維細(xì)胞生物墨水來生物打印厚的間質(zhì)組織，以概括血管壁，接著與EC層化，以提供同源的內(nèi)皮隔離層。將hSC生物墨水與EC —起生物打印成補(bǔ)片，該補(bǔ)片含有點(diǎn)綴的(interspersed)內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)或內(nèi)皮層。制造具有1.25mmx8mm x0.25mm(ff x L x H)初始尺寸的組織片段。在肺構(gòu)建體或血管壁節(jié)段的生物打印之后，接著在之前分配的生物墨水層的頂部上生物打印濃縮的細(xì)胞懸浮液，從而在第一層的表面上形成額外的限定層。
[0270]然后，將生物打印的新組織浸入含有血清的完全細(xì)胞培養(yǎng)基中，并放在補(bǔ)充有5%CO2的標(biāo)準(zhǔn)加濕室中來成熟。隨后，將該生物打印的新組織采用相關(guān)的細(xì)胞因子培養(yǎng)并刺激預(yù)定的時(shí)間，并進(jìn)行福爾馬林-固定、收獲，以及進(jìn)行用于常規(guī)組織性和免疫組織化學(xué)的處理。評(píng)價(jià)生物打印的組織的以下特征，例如但不限于:組織形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力和構(gòu)建體完整性。
[0271]通過直接向培養(yǎng)基添加細(xì)胞因子，并采用添加的蛋白質(zhì)培養(yǎng)生物打印的組織，來進(jìn)行細(xì)胞因子刺激以提供細(xì)胞向合適刺激的直接且延長(zhǎng)的通道。一般在0.1至lOOng/mL的劑量下(取決于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞因子的ED50)來進(jìn)行劑量-反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于其中實(shí)施時(shí)間超過48小時(shí)的細(xì)胞因子刺激的實(shí)驗(yàn)，改變培養(yǎng)基，且每48小時(shí)加入新鮮的細(xì)胞因子。
[0272]結(jié)果
[0273]用先前已經(jīng)說明的細(xì)胞因子成功刺激含有生理上相關(guān)的細(xì)胞群的生物打印的新組織，以在二維的體外系統(tǒng)中引起細(xì)胞反應(yīng)。在生物打印的三維組織構(gòu)建體中觀察的反應(yīng)，被觀察到依賴于劑量，并且只有該生物打印的構(gòu)建體內(nèi)的細(xì)胞才有此現(xiàn)象(參見，例如，圖11,15 和 16)。
實(shí)施例19-用連續(xù)沉積來生物打印共成型的功能性肝組織微觀結(jié)構(gòu)
[0274]30% PF-127 的制各
[0275]利用PBS制備30% PF-127溶液(w/w)。利用維持在4°C的磁力攪拌板，將PF-127粉末與冷的PBS混合。完全溶解發(fā)生在大約48小時(shí)內(nèi)。
[0276]細(xì)胞制備和模具的共打印及填充
[0277]利用生物打印機(jī)將PF-127溶液吸入3cc儲(chǔ)存器中，采用510 μ m的分配末端，將30%的PF-127溶液生物打印到6孔的Transwell中，并形成單個(gè)六邊形及依次層化6次。
[0278]在1000g下將由7.8xl07個(gè)肝細(xì)胞0fepG2)組成的細(xì)胞懸浮液離心6分鐘，以產(chǎn)生細(xì)胞漿料。通過510 μ m 噴針，擠出5 μ L的細(xì)胞漿料，以填入每個(gè)三角形模具(參見圖17Α)。將六邊形模具在室溫下孵育15分鐘。將3mL培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10% FBS和IX青霉素、鏈霉素和兩性霉素B的DMEM)與負(fù)載的Transwell加入到孔中，之后在37°C和5% CO2下孵育。在45分鐘內(nèi)，將PF-127模具溶解在培養(yǎng)基中，留下完整成型的肝生物墨水，以形成細(xì)胞和間隙的平面幾何圖形(參見圖17B)。為從培養(yǎng)基中除去殘留的PF-127，將Transwell轉(zhuǎn)移到含有3mL培養(yǎng)基的新孔中，并孵育兩個(gè)小時(shí)。對(duì)于總共9mL的培養(yǎng)基交換，用超過6小時(shí)將這個(gè)操作額外重復(fù)兩次。
[0279]6小時(shí)后，將Transwe 11轉(zhuǎn)移到?jīng)]有培養(yǎng)基的新孔中，并以90 %人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和10%肝星形細(xì)胞的比例，將2xl06個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液分配，以填入由FP-127模具溶解形成的空穴中。將肝的構(gòu)建體在室溫下孵育15分鐘。在孵育15分鐘后，4mL培養(yǎng)基含有85%比例的培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10% FBS和IX青霉素、鏈霉素和兩性霉素B的DMEM，以負(fù)載肝細(xì)胞和肝星形細(xì)胞；和15%補(bǔ)充有2% LSGSUO% FBS、HEPES和IX青霉素、鏈霉素和兩性霉素B的M199，以負(fù)載人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞)。將該構(gòu)建體在37°C和5% CO2下孵育48小時(shí)，以形成連續(xù)的構(gòu)建體，該構(gòu)建體具有包括插入包括內(nèi)皮細(xì)胞的組織的肝實(shí)質(zhì)的小葉片(三角形)結(jié)構(gòu)的平面幾何形狀。
[0280]盡管本文中已經(jīng)示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是:這些實(shí)施方案僅僅是以示例的方式提供的。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不偏離本發(fā)明下，現(xiàn)在將想到多種變化、改變和替代。應(yīng)當(dāng)理解，本文中描述的本發(fā)明實(shí)施方案的各種替代方案任選地用于實(shí)施本發(fā)明。
【權(quán)利要求】
1. 一種活的三維組織構(gòu)建體，其包含:至少一種粘附細(xì)胞類型，所述至少一種粘附細(xì)胞類型凝聚并融合以形成活的三維組織構(gòu)建體，所述三維組織構(gòu)建體具有不是血管的多層結(jié)構(gòu)，所述組織構(gòu)建體用于體外使用，條件是所述組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織構(gòu)建體，其中在生物打印時(shí)或者在使用時(shí)，所述組織構(gòu)建體基本上不含任何預(yù)形成的支架。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織構(gòu)建體，其中所述組織構(gòu)建體包含至少一個(gè)包含多種細(xì)胞類型的層，所述細(xì)胞類型相對(duì)于彼此空間排列，以構(gòu)建平面幾何形狀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織構(gòu)建體，其中所述組織構(gòu)建體包含多個(gè)層，至少一個(gè)層在組成上或結(jié)構(gòu)上與至少一個(gè)其它層不同，以構(gòu)建層狀幾何形狀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織構(gòu)建體，進(jìn)一步包含非粘附細(xì)胞類型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織構(gòu)建體，其中所述組織構(gòu)建體被固定到生物相容性表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組織構(gòu)建體，其中所述生物相容性表面為多孔膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組織構(gòu)建體，其中所述生物相容性表面涂覆有下列物質(zhì)中的一種或多種:生物相容性水凝膠、蛋白質(zhì)、化學(xué)品、肽、抗體或生長(zhǎng)因子。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組織構(gòu)建體，其中所述組織構(gòu)建體在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面上經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織構(gòu)建體，其中在生物打印時(shí)，所述組織構(gòu)建體在其最小維度上為至少約25 μ m。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組織構(gòu)建體，其中在生物打印時(shí)，所述組織構(gòu)建體在其最大維度上不大于約3cm。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織構(gòu)建體，其用于體外分析。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組織構(gòu)建體，其用于藥物測(cè)試。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織構(gòu)建體，其中所述粘附細(xì)胞為分化的細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織構(gòu)建體，其中所述粘附細(xì)胞為未分化的細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織構(gòu)建體，其中所述粘附細(xì)胞來源于選自下組的組織:肝臟、胃腸、胰腺、腎、肺、氣管、血管、骨骼肌、心臟、皮膚、平滑肌、結(jié)締組織、角膜、泌尿生殖系統(tǒng)、乳腺、生殖、內(nèi)皮、上皮、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)、施萬、脂肪、骨、骨髓、軟骨、周細(xì)胞、間皮、內(nèi)分泌、間質(zhì)、淋巴、血液、內(nèi)胚層、外胚層和中胚層。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織構(gòu)建體，其中所述組織構(gòu)建體為血管壁節(jié)段。
18.一種活的三維組織構(gòu)建體的陣列，每個(gè)組織構(gòu)建體包含:至少一種粘附細(xì)胞類型，所述至少一種粘附細(xì)胞類型凝聚并融合以形成活的三維組織構(gòu)建體，每個(gè)組織構(gòu)建體具有多層結(jié)構(gòu)，每個(gè)組織構(gòu)建體用于體外使用，條件是每個(gè)組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的陣列，其中在生物打印時(shí)或在使用時(shí)，每個(gè)組織構(gòu)建體基本上不含任何預(yù)形成的支架。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的陣列，其中所述粘附細(xì)胞選自:肝細(xì)胞、胃腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、腎細(xì)胞、肺細(xì)胞、氣管細(xì)胞、血管細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞、角膜細(xì)胞、泌尿生殖細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、生殖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、施萬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、周細(xì)胞、間皮細(xì)胞、來源于內(nèi)分泌組織的細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞、祖細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血細(xì)胞、內(nèi)胚層來源的細(xì)胞、外胚層來源的細(xì)胞、中胚層來源的細(xì)胞及其組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的陣列，其中所述陣列中的每個(gè)組織構(gòu)建體基本相似。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的陣列，其中所述陣列中的一個(gè)或多個(gè)組織構(gòu)建體是獨(dú)特的。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的陣列，其中所述陣列中的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體組織代表選自下組的人體組織:血或淋巴管、肌肉、子宮、神經(jīng)、粘膜、間皮、網(wǎng)膜、角膜、皮膚、肝、腎、心臟、氣管、肺、骨、骨髓、脂肪、結(jié)締組織、膀胱、乳腺、胰腺、脾、腦、食管、胃、腸、結(jié)腸、直腸、卵巢、前列腺、內(nèi)分泌組織、內(nèi)胚層、中胚層和外胚層。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的陣列，其中每個(gè)組織構(gòu)建體存在于生物相容性多孔容器的孔中。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的陣列，其中所述孔用如下物質(zhì)中的一種或多種包被:生物相容性水凝膠、蛋白質(zhì)、化學(xué)品、肽、抗體或生長(zhǎng)因子。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的陣列，其中將每個(gè)組織構(gòu)建體放置在所述容器的孔內(nèi)的多孔生物相容性膜上。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的陣列，其中所述容器與自動(dòng)或半自動(dòng)的藥物篩選過程相匹配。
28.根據(jù)權(quán)利要求18所述的陣列，其中每個(gè)組織構(gòu)建體被固定到生物相容性表面。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的陣列，其中所述生物相容性表面為多孔膜。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的陣列，其中所述生物相容性表面用如下物質(zhì)中的一種或多種包被:生物相容性水凝膠、蛋白質(zhì)、化學(xué)品、肽、抗體或生長(zhǎng)因子。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的陣列，其中每個(gè)組織構(gòu)建體在一個(gè)或多個(gè)側(cè)面經(jīng)受由流體流動(dòng)引起的剪切力。
32.根據(jù)權(quán)利要求18所述的陣列，其中所述陣列中的每個(gè)組織構(gòu)建體被獨(dú)立地培養(yǎng)維持。
33.根據(jù)權(quán)利要求18所述的陣列，其中所述陣列中的兩個(gè)或更多個(gè)個(gè)體組織構(gòu)建體交換可溶性因子。
34.根據(jù)權(quán)利要求18所述的陣列，其用于體外分析。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的陣列，其用于藥物測(cè)試。
36.根據(jù)權(quán)利要求18所述的陣列，其中所述陣列中的至少一個(gè)組織是血管壁節(jié)段。
37.一種活的三維組織構(gòu)建體，其包含:一個(gè)或多個(gè)層，其中每個(gè)層含有一種或多種細(xì)胞類型，所述一個(gè)或多個(gè)層凝聚以形成活的三維組織構(gòu)建體，所述組織構(gòu)建體的特征在于具有如下的至少一種: a.至少一個(gè)包含多種細(xì)胞類型的層，所述細(xì)胞類型相對(duì)于彼此空間排列，以構(gòu)建平面幾何形狀；和 b.多個(gè)層，至少一個(gè)層在組成上或結(jié)構(gòu)上與至少一個(gè)其它層不同，以構(gòu)建層狀幾何形狀。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組織構(gòu)建體，其中所述組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組織構(gòu)建體，其中在生物打印時(shí)或者在使用時(shí)，所述組織構(gòu)建體基本上不含任何預(yù)形成的支架。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的組織構(gòu)建體，其用于體外分析。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的組織構(gòu)建體，其用于藥物測(cè)試。
42.一種用于構(gòu)建活的三維組織構(gòu)建體的方法，包括如下步驟: a.將包含至少一種粘附細(xì)胞類型的生物墨水生物打印到形式中或形式上；以及 b.將所述生物墨水融合成活的三維組織構(gòu)建體； 條件是所述組織構(gòu)建體用于體外使用，并且不是血管。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中在生物打印時(shí)或者在使用時(shí)，所述組織構(gòu)建體不含任何預(yù)形成的支架。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述形式是生物打印的。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述形式與生物墨水基本上同時(shí)被生物打印。
46.根據(jù)權(quán)利要求42所 述的方法，進(jìn)一步包括溶解所述形式的步驟。
47.一種用于構(gòu)建活的三維組織構(gòu)建體的方法，包括如下步驟: a.制備一個(gè)或多個(gè)包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體； b.將所述一個(gè)或多個(gè)凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在載體上，以形成如下的至少一種: 1.至少一個(gè)包含多種細(xì)胞類型的層，所述細(xì)胞類型相對(duì)于彼此空間排列，以構(gòu)建平面幾何形狀；和 ?.多個(gè)層，至少一個(gè)層在組成上或結(jié)構(gòu)上與至少一個(gè)其它層不同，以構(gòu)建層狀幾何形狀； c.孵育所述一個(gè)或多個(gè)多細(xì)胞聚集體，以使其凝聚并形成活的三維組織構(gòu)建體。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中在生物打印時(shí)或者在使用時(shí)，所述組織構(gòu)建體不含任何預(yù)形成的支架。
50.一種用于構(gòu)建活的三維組織構(gòu)建體的陣列的方法，包括如下步驟: a.制備包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凝聚的多細(xì)胞聚集體； b.將所述凝聚的多細(xì)胞聚集體放置在生物相容性載體上，其中所述聚集體以適合于組織陣列的形式空間排列；以及 c.孵育所述多細(xì)胞聚集體，以使其凝聚并形成活的三維組織構(gòu)建體的陣列。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中每個(gè)組織構(gòu)建體的至少一個(gè)部分是生物打印的。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中在生物打印時(shí)或者在使用時(shí)，每個(gè)組織構(gòu)建體基本上不含任何預(yù)形成的支架。
【文檔編號(hào)】C12N5/07GK103946374SQ201280055564
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月12日
【發(fā)明者】基思·墨菲, 奇拉格·卡蒂瓦拉, 斯科特·多爾夫曼, 本杰明·謝佛德, 莎倫·普雷斯內(nèi)爾, 賈斯汀·羅賓斯 申請(qǐng)人:奧加諾沃公司