作為用于hpv-陽性婦女的分類工具的對自身樣品的甲基化分析的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明人目前已經(jīng)開發(fā)出了在通過自我取樣獲得的細胞材料內(nèi)基于標記物MAL和hsa-miR124中的改變(特別是啟動子高甲基化)的檢測的(分子)診斷檢驗，用以鑒定人乳頭瘤病毒(HPV)-誘導的重度癌前期病變?nèi)缃櫺詫m頸癌的癌前宮頸病變。具體地，本發(fā)明涉及MAL基因(包含它的啟動子)和hsa-miR124基因作為用于HPV-誘導的重度癌前病變的標記物的應用，允許個體患者的早期檢測和更好的治療選擇。
【專利說明】作為用于HPV-陽性婦女的分類工具的對自身樣品的甲基 化分析

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及癌癥預防和醫(yī)學診斷學的領域；并且涉及用于人乳頭瘤病毒 (HPV)-誘導的浸潤性（侵襲性，invasive)癌癥和它的重度前期病變（precursor lesion) 的分子診斷檢驗，如浸潤性宮頸癌和癌前（惡化前，premalignant)宮頸病變。具體地，本 發(fā)明涉及對（hrHPV-陽性）自我取樣的樣本的MAL和hsa-miR124啟動子甲基化的綜合分 析在用于具有侵潤性可能（浸潤潛能）的hrHPV-誘導的癌前病變和hrHPV-誘導的浸潤性 癌癥的檢驗中的應用。

【背景技術】
[0002] 子宮頸癌癥是世界范圍內(nèi)女性第二大常見癌癥且導致一年約250000癌癥死亡。
[0003] 子宮頸鱗狀細胞癌發(fā)展的特征是一系列癌前病變，所謂的宮頸上皮肉瘤樣病變 (CIN)，將其分為1至3等級，分別指的是輕度異生（CIN1)，中度異生（CIN2)和重度異生/ 原位癌（CIN3)。也將CIN1稱為輕度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL)并且同時將CIN2和CIN3稱為 重度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL)。對于子宮頸腺癌，原位腺癌（ACIS)是已確定的前期病變。原 則上，盡管病變越嚴重，自發(fā)消退的可能性越低，但是這些癌前病變是可逆的。認為宮頸癌 是可預防性疾病，因為，可通過脫落細胞學檢測癌變前階段和在必要時，相對容易地治療， 僅具有較小的副作用。子宮頸篩查目的在于早期診斷重度癌變前的（也就是，CIN2/3和原 位腺癌）和能治療的癌病變，因此減少浸潤性宮頸癌的死亡率。通用醫(yī)療實踐包括具有形 態(tài)學上確定的CIN2、CIN3和原位腺癌的所有的女性的治療，以便避免宮頸癌的發(fā)展。
[0004] 在過去的十年里，已經(jīng)確定了，通過具有高危型人乳頭瘤病毒（hrHPV)的感染開 始子宮頸致癌作用。已經(jīng)顯示了病毒性致癌基因 E6和E7的表達對腫瘤發(fā)生的開始和惡性 表型的維持是必不可少的，E6和E7分別干擾p53和Rb腫瘤抑制路徑。因此，對hrHPV的測驗 表現(xiàn)為有吸引力的，初步的篩選裝置。然而，與致癌作用的多步過程一致，宿主細胞基因組 中的另外的變化是hr-HPV受感染細胞至浸潤性癌細胞的發(fā)展必須的。只有少部分感染高 危型HPV的女性將發(fā)展為重度癌變前宮頸病變（CIN2/3)，并且如果沒有治療，將發(fā)展為宮 頸癌。在大多數(shù)具有癌變前宮頸病變的女性中，病變自發(fā)地消退。關于參與荷蘭人口基數(shù)篩 查的女性，約5-6%具有陽性111'冊￥檢驗出1111〇1^118等人，11^1031?^12004，110:94-101)。 然而，他們中最多只有20% (參與的女性的1%)具有彡CIN2/3。因此，通過hrHPV檢驗的 初步篩選將兼有大量多余的后續(xù)程序和對女性造成不必要的焦慮，除非可將標記物應用于 子宮頸刮片，其允許為彡CIN2/3和彡原位腺癌的危險的hrHPV陽性的女性的分層。
[0005] 已經(jīng)在多個國家中建立了以醫(yī)師-采取的刮片為基礎的龐大的基于人群的篩選 方案。然而，將顯示不是所有的參與的女性都實施了子宮頸刮片檢查。由不情愿通過護士 或醫(yī)師對這些女性實施子宮頸涂片檢查的女性引起許多未顯示。研究已經(jīng)顯示，可通過向 這些女性提供用于在家里進行（子宮頸）陰道材料的自我采集的設備克服這點，可將其發(fā) 送給實驗室，用于HPV分析。同樣地，自我取樣增加非響應者在現(xiàn)有的篩選程序中的參與 (Gdk等人2010Brit. Medical J. ;340:cl040)。自我取樣是用于子宮頸篩查的便宜的和被 廣泛接受的方法。更多地，因為HPV分析用于CIN2+/3+的檢測在自我收集的樣品上可如醫(yī) 師收集樣品一樣好，自我取樣在將來可變成用于初級宮頸癌篩查的可替換的方法。因而，在 未來幾年內(nèi)，（子宮頸）陰道材料的自我取樣將變成宮頸癌的篩查的重要裝置。
[0006] 主要的挑戰(zhàn)是減少hrHPV陽性的女性占具有臨床上有意義的病變的百分比。然 而，在傳統(tǒng)的刮片上，細胞學可擔當對hrHPV陽性的女性的第二（所謂的分類）檢驗，細胞 學不是可在家里獲取的自我取樣的宮頸陰道樣本的選擇，因為這些不是子宮頸的細胞學狀 態(tài)的典型（Brink etal.，2006, J. Clin.微biol. 44:2518-2523)。因此，需要補充的或可替 換的分類裝置，以便將hrHPV陽性女性分層為具有和沒有彡CIN2/3和彡原位腺癌的那些。
[0007] 早前已經(jīng)顯示了（W02009/128714)，當應用于完全等同于細胞學執(zhí)行的醫(yī)師收集 的子宮頸刮片時，編碼T-淋巴細胞成熟相關的蛋白，也稱為T-細胞分化蛋白的基因（進 一步稱為MAL ;Genbank登錄號NM002371. 2)和編碼細胞粘附分子1 (CADM1)的基因的啟動 子甲基化的綜合檢驗出現(xiàn)有吸引力的可替換的分子分類裝置（Hesselink等人2011Clin Cancer Res. 17 (8) : 2459-65)。然而，這組檢驗不能很好地在自我取樣的子宮頸-陰道樣本 上執(zhí)行，主要因為，具有彡CIN2/3的女性的自我取樣樣品中的CADM1甲基化的信號比醫(yī)師 收集的子宮頸樣品的情況中更頻繁地在檢驗閾值之下。
[0008] 因此，仍然需要可在自我取樣樣品上實施，并且可給予發(fā)展中的宮頸病變的存在 或風險的更可靠的指示的檢驗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 現(xiàn)在已經(jīng)出人意外地發(fā)現(xiàn)了，當應用于對hrHPV檢驗呈陽性的自我取樣的樣本 時，對編碼T-淋巴細胞成熟相關的蛋白，也稱為T-細胞分化蛋白的基因（進一步稱為 MAL ;Genbank登錄號NM_002371. 2)和由3位于三個不同的基因組區(qū)域上的3個個體早 熟微RNA(microRNA)序列編碼的微RNA hsa-miR124(登錄號MIMAT0000422)的啟動子甲 基化的綜合檢驗，這3個個體早熟微RNA也就是在染色體8p23. 1上的HSA-MIR124-1 (登 錄號MI0000443)，在染色體8ql2. 3上的HSA-MIR124-2 (登錄號MI0000444)和在染色 體20ql2. 33上的HSA-MIR124-3 (登錄號MI0000445)(如在miRNA數(shù)據(jù)庫上指示登錄號， miBase (www. mirbase. orR)，曼切斯特大學，生命科學系），兩者在宮頸癌細胞中都具有腫瘤 抑制性能，提供用于診斷浸潤性宮頸癌和它的重度前期病變的有價值的檢驗。
[0010] 因此，本發(fā)明涉及檢測或預測HPV-誘導的重度癌前期病變和/或HPV-誘導的浸 潤性癌癥的發(fā)生的方法，包括檢驗宮頸-陰道自身樣品（self-sample)的T-淋巴細胞成熟 相關的蛋白（MAL)和/或hsa-miR124的甲基化的變化的存在，其中所述變化指示具有浸潤 潛能的HPV-誘導的前期病變和/或HPV-誘導的浸潤性癌的存在或未來的存在。優(yōu)選地， 在所述方法中，所述HPV-誘導的重度癌前病變或HPV-誘導的浸潤性癌是重度癌變前宮頸 病變或浸潤性宮頸癌。同樣地，在所述方法中優(yōu)選的，所述HPV-誘導的浸潤性癌是高危型 HPV-誘導的浸潤性癌。
[0011] 在所述方法的另一個實施方式中，與正常的對照樣品相比，所述變化是甲基化的 增加。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，在編碼MAL多肽及其調(diào)控區(qū)以及hsa-miR124序列的核 酸上檢驗甲基化，其中優(yōu)選地，所述核酸是DNA。在進一步優(yōu)選的實施方式中，利用限制性內(nèi) 切酶進行檢驗，優(yōu)選地，甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶并且同樣優(yōu)選的是，試劑是結合到核酸 上的核酸探針或引物，優(yōu)選地，其中所述核酸探針或引物具有可檢測的標簽。特別優(yōu)選的是 具有選自由在表1中描述的序列組成的組的核苷酸序列的核酸探針。
[0012] 同樣地，本發(fā)明的部分是用于HPV-誘導的重度癌前病變或HPV-誘導的浸潤性癌 的檢測的分子診斷標記物的應用，其中所述標記物指示MAL基因或啟動子甲基化和/或 hsa_miR124序列的甲基化。
[0013] 本發(fā)明進一步包括用于檢測在受試者的檢驗細胞中的HPV-誘導的重度癌前病變 或HPV-誘導的浸潤性癌的方法的部件的試劑盒（kit of parts)，所述試劑盒包括
[0014] -用于檢測MAL基因或啟動子甲基化的裝置（means)，其中所述裝置包括MAL特異 性的或圖1的MAL核苷酸序列特異性的探針、引物和/或甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶； 和
[0015] -用于檢測hsa_miR124甲基化的裝置（means)，其中所述裝置包括hsa_miR124特 異性的探針、引物和/或甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶，
[0016] -可選地，用于檢測HPV感染的裝置，其中所述裝置包括HPV特異性的探針和引物， 以及
[0017] -可選地，用于獲取子宮頸-陰道自身樣品的裝置，其中優(yōu)選地，所述裝 置選自 VibaBrush(Rovers Medical Devices, Oss, the Netherlands)和 Pantarhei sampler (Pantarhei Devices, Zeist, The Netherlands)的組。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1顯示MAL5'調(diào)控區(qū)，編碼序列，第一內(nèi)含子序列的CpG富集部分和轉(zhuǎn)錄的3' 非編碼序列。
[0019] 圖2顯示三個miR124基因組區(qū)域的5'調(diào)控區(qū)和編碼序列，A :hsa-miR124-l，B : hsa-miR124_2, C :hsa-miR124_3。
[0020] 斜體/粗體序列是早熟微RNAs的編碼序列。下劃線的序列包括成熟的微RNA序 列。以灰色標記CpG富集區(qū)域。顯示野生型序列（上列）和在重亞硫酸鹽處理之后的修飾 的序列（下列）。
[0021] ++代表CpG位點，：：：：指示轉(zhuǎn)換至' Τ'的非-CpG' C'。
[0022] 圖3顯示具有CIN3+的女性（具有實心正方形的虛線）和具有最大CIN2的女性 (具有十字的虛線）的自身樣品中以及具有CIN3+的女性（具有實心正方形的實線）和具 有最大CIN2(具有十字的實線）的女性的醫(yī)師獲取的子宮頸刮片中的MAL(A)和CADM1 (B) 甲基化分析的十分位數(shù)的Ct比值的比較。這個圖指示，在自我取樣的樣本中，具有CIN3+ 的女性的MAL信號等于醫(yī)師獲取的涂片中的那些，然而，與醫(yī)師獲取的涂片中的那些相比， 具有CIN3+的女性的CADM1的那些較低，且在與沒有子宮頸疾病的女性獲得的水平相同的 范圍內(nèi)大部分下降。
[0023] 圖4分別地顯示具有CIN3+的女性（CADM1 :十字；hsa-miR124-2 :菱形）和具有 彡CIN1的女性（CADM1 :三角形；hsa-miR124-2 :正方形）的自我取樣樣品中的CADM1 (虛 線）和hsa-miR124-2(實線）甲基化分析的十分位數(shù)的Ct比值的比較。這個圖指示，自我 取樣的樣本中具有CIN3+的女性的hsa-miR124-2信號比CADM1的那些更高。此外，與CADM1 比較，hsa-miR124-2甲基化顯示具有CIN3+的女性和具有彡CIN1的女性的自我取樣的樣 本之間的較好的區(qū)別。

【具體實施方式】
[0024] 宮頸癌幾乎是唯一地與人乳頭瘤病毒（HPV)感染相關。人乳頭瘤病毒構成超過 100種類型的病毒組，如由DNA序列中的變化鑒定的。各種HPV引起各種皮膚和粘膜疾病。 基于它們誘導受感染的細胞中的惡性變化的能力，將HPV大致分為低危險的和高危險的類 型。低危險的HPV類型如1、2、4、6、11、13和32主要地與良性病變或常見肉贅有關，而高危 險類型，如16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68主要地與癌變前的和惡性上 皮病變有關。與由低危險類型引起的肉贅，例如，HPV-6和HPV-11相比，這些高危險類型的 HPV引起通常扁平的和幾乎看不見的生長。
[0025] 術語"HPV-誘導的浸潤性癌"涉及由高危型HPV誘導的癌，其入侵周圍的組織。這 包含所有的HPV-誘導的癌組織型，也就是，子宮頸中的鱗狀細胞癌、腺癌、腺鱗狀細胞癌和 神經(jīng)內(nèi)分泌癌。
[0026] 術語"浸潤性宮頸癌"涉及入侵周圍組織的宮頸癌。這包含所有的癌組織型，也就 是，子宮頸中的鱗狀細胞癌、腺癌、腺鱗狀細胞癌和神經(jīng)內(nèi)分泌癌。
[0027] 術語"癌前病變"和"前期病變"涉及到具有強烈增加的向癌方面發(fā)展機會的癌癥 的多級細胞演變中的階段。利用傳統(tǒng)的形態(tài)學，病理學家不能預知個體患者中這些病變將 發(fā)展或消退?，F(xiàn)有的專利申請涉及方法，其可預知浸潤性癌或它的重度前期病變。
[0028] 術語"重度癌變前宮頸病變"涉及到具有強烈增加的向癌方面發(fā)展機會的癌癥的 多級細胞演變中的階段。重度癌變前宮頸病變等于名稱CIN2/3和更高（也就是，> CIN2)。
[0029] 術語"能夠特異性地雜交到"涉及能夠與互補的核酸序列特異性的堿基配對和能 夠結合到那里，以便形成核酸雙鏈體的核酸序列。
[0030] "互補體"或"互補序列"是根據(jù)Watson-Cr ick堿基配對原則與另一個核苷 酸序列形成氫鍵結合的雙鏈體的核苷酸序列。例如，5'-AAGGCT-3'的互補堿基序列是 3,-TTCCGA-5,。
[0031] 術語"嚴格的雜交條件"涉及影響雜交穩(wěn)定性的雜交條件，例如，溫度、鹽濃度、pH、 甲酰胺濃度等等。以經(jīng)驗為主地最佳化這些條件，以便將特異性結合最大化并且將引物或 探針到它的靶核酸序列的非特異性結合最小化。使用的術語包含對下面條件的參考，在所 述條件下，探針或引物將在比其他序列可檢測地更高的程度（例如，至少是背景的2倍）雜 交到它的靶序列上。嚴格的條件是序列依賴的且在不同的環(huán)境中將不同。較長的序列在更 高的溫度上特異性地雜交。通常，對于在確定的離子強度和pH下的特異序列，選擇的嚴格 的條件是比熱熔點（Tm)低約5°C。Tm是在所述溫度上50%的互補靶序列雜交到完全匹配 的探針或引物上的溫度（在確定的離子強度和pH下）。通常，嚴格的條件將是其中在pH7. 0 至8. 3上，鹽濃度小于約1. 0M Na離子，通常約0. 01至1. 0M Na離子濃度（或其他鹽）并且 對于短的探針或引物（例如，10至50個核苷酸）溫度至少是約30°C和對于長的探針或引物 (例如，大于50個核苷酸）至少是60°C的那些。也可能利用外加減穩(wěn)劑，如甲酰胺獲得嚴格 的條件。示例性的低嚴格條件或"減少嚴格性的條件"包括在37°C利用30%甲酰胺的緩沖 溶液，lMNaCl，1% SDS的雜交和在40°C在2XSSC中洗滌。典型的高嚴格條件包括在37°C 利用50%甲酰胺，lMNaCl，l% SDS的雜交和在60°C在0. 1XSSC中洗滌。雜交程序是本領 域熟知的并且在 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons Inc.，1994 中描述。
[0032] 術語"寡核苷酸"涉及由磷鍵（例如，磷酸二酯、烷基和芳基-磷酸鹽、硫代磷酸 酯），或非磷鍵（例如，肽、氨基磺酸酯等）連接的核苷酸單體的短序列（通常6至100個核 苷酸）。寡核苷酸可含有具有修飾的堿基（例如，5-甲基胞嘧啶）和修飾的糖基團（2'-0_甲 基核糖基、2' -0-甲氧乙基核糖基、2' -氟代核糖基、2' -氨基核糖基等）的修飾的核苷酸。 寡核苷酸可以是自然地存在的或合成的雙鏈和單鏈DNA以及雙鏈和單鏈RNA的分子，所述 DNA和RNA具有圓形、分支的或線性的形狀，并且可選地包含能夠形成穩(wěn)定的二級結構的結 構域（例如，莖-和-環(huán)（stem-and-loop)以及環(huán)-?-環(huán)（loop-stem-loop)結構）。
[0033] 此處使用的術語"引物"涉及當在其中誘導與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的合成 的條件下放置時，也就是，在核苷酸和用于聚合的試劑如DNA聚合酶的存在下和在適當?shù)?溫度和pH下，能夠退火成允許DNA聚合酶附著，因此擔當DNA合成的引發(fā)點的擴增靶的寡 核苷酸。優(yōu)選地，為了最大的擴增效率，（擴增）引物是單鏈的。優(yōu)選地，引物是寡聚脫氧 核苷酸。引物必須足夠長，以便在用于聚合的試劑的存在下引發(fā)（prime)延伸產(chǎn)物的合成。 引物的精確長度將依賴于很多因素，包括溫度和引物的來源。此處使用的"雙向引物對"涉 及通常在DNA擴增領域如聚合酶鏈式反應（PCR)擴增中使用的一個正向和一個反向引物。
[0034] 術語"探針"涉及在靶核酸序列分析物或它的cDNA衍生物中識別和與互補序列形 成氫結合的雙鏈體的單鏈寡核苷酸序列。
[0035] "微RNA (小RNA) "（miRNA或MIR)是短核糖核酸（RNA)分子，平均只有22個核苷 酸長且?guī)缀踉谒械恼婧思毎卸寄馨l(fā)現(xiàn)。MIR通過到它們的靶mRNA的3'UTR的不完全的 堿基配對，調(diào)節(jié)基因活性，導致mRNA降解或轉(zhuǎn)錄的抑制。一個單一 MIR可調(diào)節(jié)多達200個不 同的基因靶的表達，其意味著，可通過MIRs控制約三分之一的人類mRNA的表達。因此，MIR 的變異表達可分別地通過增加或減少致癌基因和腫瘤抑制基因的表達導致惡性轉(zhuǎn)化（由 Calin and Croce, Nat Rev Cancer2006, 6, 857-866 審核）。有限量的 MIR 的表達型提供非常 精確的腫瘤亞型分類器，甚至產(chǎn)生比基于全組基因 mRNA表達型的分類器更好的結果，這個 事實通常強調(diào)miRNA在致癌作用中的重要性（Lu等人，Nature2005 ;435:834-8)。有趣的 是，與正常組織相比，腫瘤中的miRNA表達水平整體上較低。如編碼腫瘤抑制基因的蛋白， 也是miRNA的沉默可產(chǎn)生于后生改變，如調(diào)控序列的DAN甲基化。
[0036] 在基因間隔區(qū)或基因的反義方向中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)微RNA基因，和含有它們自身的 miRNA基因啟動子和調(diào)控單元。
[0037] 最初，已經(jīng)將MAL(T_淋巴細胞成熟相關的蛋白）基因（Genbank登錄號 ΝΜ_002371· 2)確定為T-細胞發(fā)育期間的差異表達的基因 （Alonso andWeismanl987，Proc· Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1997-2001)。MAL編碼17kDa膜內(nèi)在蛋白且是糖脂類富集的膜微 結構域或自由基聚合的成分（Kim等人1995, J. Neurosci. Res.，42, 413-422)。MAL在極化 上皮細胞中作為用于膜和分泌蛋白的頂端運輸?shù)牡鞍讬C制的成分具有重要的作用（Cheong 等人，1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 6241-6248)。
[0038] 已經(jīng)在許多人類癌癥中檢測到了減少的MAL表達，包含食道癌、胃癌和結 腸癌（Mimori 等人，2003,0ncogene，22,3463-3471;Mimori2007 等人，Ann.Surg. Oncol.，14, 1670-1677)。
[0039] 在結腸癌中，MAL下調(diào)與啟動子高甲基化相關（Mori等人，2006, Gastroenterolog y，131，797-808 ;Lind 等人，2007Gastroenterology，132, 1631-1632)。
[0040] 通過MAL基因在食道癌細胞中的重新表達，導致運動性、侵入和致腫瘤 性的抑制，同時增強凋亡，證明MAL擔當腫瘤抑制基因的功能性作用（Mimori等 人·，2003, Oncogene, 22, 3463-3471)。
[0041] 在W02009/128714中確認了，經(jīng)常在鱗狀細胞癌、腺鱗狀細胞癌、腺癌和神經(jīng)內(nèi)分 泌癌組織型，和它們的重度前期病變的宮頸癌中觀察到MAL啟動子甲基化的變化。體外研 究顯示MAL失活在宮頸癌發(fā)展中的功能性混亂，因為含有SiHa宮頸癌細胞系的HPV16細胞 中的MAL過表達減少增殖和抑制錨著非依賴性生長（anchorage independent growth)。更 有趣的是，其中，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)示出，可在由自我取樣收集的宮頸-陰道樣本中檢測 到MAL啟動子的高甲基化，并且發(fā)現(xiàn)高甲基化與潛在的重度CIN病變或浸潤性宮頸癌的存 在相關。
[0042] 有趣的是，如在本發(fā)明的實驗部分中顯示的，通過聯(lián)合MAL的甲基化分析與微RNA miR124-2的啟動子區(qū)域的甲基化分析，實現(xiàn)> CIN2的高敏感性。
[0043] 這些結果表明，自我收集的宮頸-陰道樣本中MAL啟動子甲基化聯(lián)合hsa-miR-124 啟動子甲基化的檢測可預測重度CIN疾病或?qū)m頸癌。
[0044] 成熟hsa-miR124序列（登錄號MIMAT0000422)由位于三個不同的基因組區(qū)域 上的3個個體早熟微RNA序列編碼，也就是，在染色體8p23. 1上的HSA-MIR124-1 (登錄 號MI0000443)，在染色體8ql2. 3上的HSA-MIR124-2 (登錄號MI0000444)和在染色體 20ql2. 33上的HSA-MIR124-3 (登錄號MI0000445)(如在miRNA數(shù)據(jù)庫上指示登錄號， miBase (www. mirbase. org)，曼切斯特大學，生命科學系）。盡管成熟序列完全一樣，但 是早熟和調(diào)控序列是不同的（參考圖2)。在該申請中，如果使用術語hsa-miR124,包含 hsa_miR124的任何形式。
[0045] 已經(jīng)在多個人類癌癥，包含胃癌、結腸癌、乳腺癌和肺癌和急性淋巴細胞白血病 中描述了 hsa_miR124表達的后生下調(diào)（表觀遺傳下調(diào)epigenetic down-regulation) (Lujambio 等人，Cancer Res2007, 67，1424-1429 ;Andro IntJ Cancer2009 ; 124:2367-2374, Agirre 等人 Cancer Res2009 ;69:4443-4453)。由 Lujambio 等人和 Agirre 等人的早先研究已經(jīng)指出hsa-miR124的假定的腫瘤抑制功能。在兩個研究中，證明 hsa-miR124表達的后生沉默（表觀遺傳沉默，epigenetic silencing)調(diào)節(jié)細胞周期蛋白 D激酶6 (CDK6)，即一個預知hsa-miR124的靶的上調(diào)。已知⑶K6涉及細胞周期進程和分化 且可使成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白（pRb)，已知的腫瘤抑制基因失活，以便促進細胞生長。
[0046] 因此，本發(fā)明提供檢測或預測HPV-誘導的重度癌前期病變和HPV-誘導的浸潤 性癌的發(fā)生的方法，包括檢驗宮頸刮片的自我取樣樣品的T-淋巴細胞成熟相關的蛋白 (MAL)和/或hsa-miR124的甲基化中的變化的存在，其中所述變化指示具有浸潤潛在的和 HPV-誘導的浸潤性癌的HPV-誘導的前期病變的存在或未來的存在。通過增加的MLA基因 和特別是它的啟動子區(qū)域和hsa-miR124啟動子區(qū)域的甲基化（也稱為高甲基化）顯示重 度前期病變和/或浸潤性癌的存在或未來的存在。
[0047] 受試者的自我取樣樣品可含有粘膜細胞，如子宮頸細胞，其中檢測與HPV相關的 前期病變或癌癥。
[0048] 本發(fā)明的方法特別適合于由高危型HPV誘導的重度癌前期病變和浸潤性癌的檢 測。優(yōu)選地，對已經(jīng)被歸類為hrHPV陽性的樣品實施本發(fā)明的檢驗方法。
[0049] 圖1顯示MAL基因的CpG-富集的啟動子區(qū)域和CpG-富集的第一內(nèi)含子序列，以 及編碼序列和轉(zhuǎn)錄的3'非編碼序列。特別是啟動子區(qū)域中的CpG-富集的序列的甲基化將 導致急劇減少的轉(zhuǎn)錄或甚至完全的轉(zhuǎn)錄封鎖。相似的現(xiàn)象在hsa-miR124中起作用，在圖2 中描述它的序列。這里也指示CpG富集區(qū)域，并且這些的甲基化將導致急劇減少的轉(zhuǎn)錄或 甚至完全的hsa-miR124分子的轉(zhuǎn)錄的封鎖。優(yōu)選地，對樣品的核酸含量實施檢驗，其中試 劑通常是核酸（DNA或RNA)探針或（PCR)引物。例如，通過利用這樣的探針或引物，可檢測 基因表達產(chǎn)物，如mRNA。試劑也可能是限制性內(nèi)切核酸酶，優(yōu)選地用于樣品核酸上的甲基基 團的存在的檢測的甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶，此外，優(yōu)選地，所述樣品核酸是DNA。
[0050] 可直接地原位檢測樣品核酸，或可在接觸試劑之前，通過本領域的技術人員已知 的常見方法從其他細胞組分分離樣品核酸（參考，例如，"Current Protocols in Molecular Biology〃，Ausubel 等人，1995. 4th edition, John Wiley and Sons ;〃A Laboratoty Guide to RNA: Isolation, analysis, and synthesis"，Krieg (ed. )，1996, Wiley-Liss ;〃Molecular Cloning:A laboratory manual^, J. Sambrook, E. F. Fritsch. 1989. 3Vols, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 〇
[0051] 看起來，MAL和/或hsa-miR124的甲基化狀態(tài)預知重度前期宮頸病變或?qū)m頸浸潤 性癌的存在或傾向。尤其在稱為"CpG島"（CpG island)的胞嘧啶富集區(qū)域中出現(xiàn)高甲基 化，其主要地位于基因的5'調(diào)控區(qū)域，和其通常是未甲基化的。術語"高甲基化"包含在 MAL基因序列（例如，MAL啟動子，第一外顯子和第一內(nèi)含子序列，參考圖1)或hsa-miR124 序列（圖2)中通常未甲基化的位置上的胞嘧啶的任何一個甲基化。例如，可通過MAL和 hsa-miR124多核苷酸（基因）的限制性內(nèi)切核酸酶處理和DNA印記分析檢測高甲基化。因 此，在本發(fā)明的方法的一個實施方式中，優(yōu)選限制性內(nèi)切核酸酶分析用于檢測MAL基因或 hsa-miR124序列的高甲基化?？衫萌魏蜗拗菩詢?nèi)切核酸酶，其包含作為它的識別位點的 部分的CG并且當甲基化C時抑制所述核酸酶。單獨或結合使用的甲基化敏感限制性內(nèi)切 核酸酶如B SSHII、MspI、N〇tI或Hpall是這樣的內(nèi)切酶的實例。本領域的技術人員將熟知 其他甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶。
[0052] 用于MAL基因或hsa-miR124序列高甲基化的檢測的其他方法包含DNA的重亞硫 酸鹽修飾（bisulfite modification)，其中將未甲基化的胞啼陡轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛱涠?，而使甲基?的胞嘧啶免受化學修飾。隨后的PCR擴增和測序，包含焦磷酸測序?qū)⒔衣妒窃诩谆那?況下維持CpG島中胞嘧啶或在未甲基化的狀態(tài)的情況下通過尿嘧啶取代。另一個方法包含 利用包含作為它的識別位點的部分的CG的限制性內(nèi)切核酸酶對從重亞硫酸鹽修飾的DNA 產(chǎn)生的PCR擴增的產(chǎn)物的處理。
[0053] 對甲基化序列的檢驗的可替換的裝置是甲基化特異性的PCR，其也以DNA的重亞 硫酸鹽修飾為基礎，隨后是靶向CpG富集序列的特異性PCR反應。
[0054] 對于本發(fā)明的目的，可將MAL或hsa-miR124特異性的核酸探針用于檢測生物體液 或組織中的MAL或hsa-miR124多核苷酸的存在（利用核酸探針）?；贛AL或hsa-miR124 序列中的任何編碼序列區(qū)域和調(diào)控序列區(qū)域的寡核苷酸引物具有擴增DNA的用途，例如， 通過PCR。
[0055] 當應用PCR引物時，分析核酸探針或限制性內(nèi)切核酸酶，5'調(diào)控區(qū)，MAL序列的第 一內(nèi)含子序列和編碼序列（如圖1指示的）或hsa-miR124序列（如圖2指示的）。
[0056] 在本發(fā)明的方法的一個實施方式中，與可比較的正常的細胞相比，檢測檢測細胞 中增加的MAL基因（包含啟動子區(qū)域）和/或hsa-miR124序列的甲基化。
[0057] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明也提供用于檢測具有浸潤潛在的HPV-誘導的前期病變和 HPV-誘導的浸潤性癌的方法的部件的試劑盒。這樣的試劑盒可適當?shù)匕ㄋ⒆踊蚬蔚?，?便獲取（陰道）刮片，連同利用收集媒介填充的容器，以便收集檢驗細胞?？商鎿Q地，將包 含由沖洗器、一次性女性尿道導管和具有沖洗流體的容器組成的采樣設備，以便通過灌洗 收集子宮頸-陰道細胞。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可包括用于MAL和hsa-miR124-2甲基化的 檢測的引物和探針。在表1和表2中給出用于本發(fā)明的引物和探針。
[0058] 表1 :用于對自身樣品定量甲基化特異性PCR分析的MAL引物-探針組合：
[0059]

【權利要求】
1. 一種檢測或預測HPV-誘導的重度癌前病變和/或HPV-誘導的浸潤性癌的發(fā)生的方 法，包括檢驗宮頸-陰道自身樣品的T-淋巴細胞成熟相關的蛋白（MAL)和/或hsa-miR124 的甲基化中變化的存在，其中所述變化指示存在或?qū)泶嬖诰哂薪櫇撃艿腍PV-誘導的 前期病變和/或HPV-誘導的浸潤性癌。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述HPV-誘導的重度癌前病變或HPV-誘導的浸 潤性癌是重度癌變前宮頸病變或浸潤性宮頸癌。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中所述HPV-誘導的浸潤性癌是高危型HPV-誘 導的浸潤性癌。
4. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中與正常的對照樣品相比，所述變化是 甲基化的增加。
5. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中對編碼MAL多肽及其調(diào)控區(qū)以及 hsa-miR124序列的核酸檢驗所述甲基化。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述核酸是DNA。
7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其中利用限制性內(nèi)切核酸酶，優(yōu)選地甲基化敏感的限 制性內(nèi)切核酸酶實施所述檢驗。
8. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述試劑是結合到所述核酸上的核酸探針或引 物。
9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述核酸探針或引物具有可檢測的標簽。
10. 根據(jù)權利要求8或9所述的方法，其中所述核酸探針具有選自由在表1中描述的序 列組成的組中的核苷酸序列。
11. 分子診斷標記物用于檢測HPV-誘導的重度癌前病變或HPV-誘導的浸潤性癌的應 用，其中所述標記物指示MAL基因或啟動子甲基化和/或hsa-miR124序列的甲基化。
12. 用于在檢測受試者的檢驗細胞中HPV-誘導的重度癌前病變或HPV-誘導的浸潤性 癌的方法中使用的部件的試劑盒，所述試劑盒包括： -用于檢測MAL基因或啟動子甲基化的裝置，其中所述裝置包括MAL特異性的或圖1的 MAL核苷酸序列特異性的探針、引物和/或甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶；和 -用于檢測hsa-miR124甲基化的裝置，其中所述裝置包括hsa-miR124特異性的探針、 引物和/或甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶， -可選地，用于檢測HPV感染的裝置，其中所述裝置包括HPV特異性的探針和引物，以及 -可選地，用于獲取宮頸-陰道自身樣品的裝置，其中優(yōu)選地，所述裝置選自 VibaBrush(Rovers醫(yī)療裝置，奧斯，荷蘭）和Pantarhei取樣器（Pantarhei裝置，宰斯特， 荷蘭）的組。
【文檔編號】C12Q1/68GK104053783SQ201280055566
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2012年9月13日 優(yōu)先權日:2011年9月15日
【發(fā)明者】彼得魯斯·約瑟夫斯·費丁安杜斯·斯尼杰德爾斯, 倫斯克·丹尼拉·瑪麗亞·斯泰恩貝爾根, 丹尼勒·安妮·瑪麗·海德曼, 克里斯托弗魯斯·瓊內(nèi)斯·拉姆貝圖斯·瑪麗亞·邁耶 申請人:塞爾夫斯庫林有限公司