療法性核糖核酸(RNA)分子代表新興的藥物種類?；赗NA的療法包括作為疫苗使用的編碼抗原的mRNA分子(Fotin-Mleczek等2012.J.GeneMed.14(6)：428-439)。此外，設(shè)想使用RNA分子進(jìn)行補(bǔ)充療法，例如向患者提供缺少的蛋白質(zhì)比如生長因子或酶(Karikó等，2012.Mol.Ther.20(5)：948-953；Kormann等，2012.Nat.Biotechnol.29(2)：154-157)。另外，考慮非編碼的免疫刺激RNA分子(WO2009/095226)和其它非編碼RNA比如微小RNA和長非編碼RNA(Esteller，2011.Nat.Rev.Genet.12(12)：861-74)的治療用途。自轉(zhuǎn)染的RNA的成功蛋白質(zhì)表達(dá)取決于轉(zhuǎn)染效率、RNA穩(wěn)定性和翻譯效率。5′帽結(jié)構(gòu)和3′poly(A)尾是在真核細(xì)胞中mRNA有效翻譯和蛋白質(zhì)合成的重要特征。當(dāng)轉(zhuǎn)錄物達(dá)到20至30個核苷酸的長度時，新合成的mRNA用帽結(jié)構(gòu)修飾。首先，5′末端核苷酸pppN通過包含RNA5′-三磷酸酶和鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶活性二者的雙功能加帽酶轉(zhuǎn)換為5′GpppN。然后，GpppN部分通過具有(鳥嘌呤-7)-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的第二種酶甲基化以形成單甲基化的m7GpppNO型帽結(jié)構(gòu)。然后，0型帽通過2′-O-甲基化在細(xì)胞核中被轉(zhuǎn)換為m7GpppN1型結(jié)構(gòu)(Tcherepanova等，2008.BMCMol.Biol.9：90)。短RNA分子可以通過化學(xué)方法合成，而長RNA通常通過體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生，所述體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)包含具有噬菌體源啟動子的合適的DNA模板，RNA聚合酶例如噬菌體SP6、T3或T7RNA聚合酶，和核糖核苷三磷酸(NTP)。主要地，5′帽結(jié)構(gòu)可以通過兩種方案引入體外轉(zhuǎn)錄的RNA。在第一種方案中，加帽與轉(zhuǎn)錄的起始同時發(fā)生(共轉(zhuǎn)錄加帽)。在此途徑中，二核苷酸帽類似物比如m7G(5′)ppp(5′)G(m7G)被添加至反應(yīng)混合物。通常以這樣的方式設(shè)計DNA模板：轉(zhuǎn)錄的第一個核苷酸是鳥苷。帽類似物與GTP直接競爭作為起始核苷酸(initialnucleotide)(開始核苷酸)并入，并且與任何其它核苷酸一樣容易并入(WO2006/004648)。為了有利于并入帽類似物，通常使用相對于GTP摩爾過量的帽類似物(例如以4∶1的比率)并且GTP濃度與其它核糖核苷三磷酸ATP、CTP和UTP相比減少。在這些條件下，GTP通常成為合成RNA分子的限制因素。結(jié)果，高比例的其它NTP(通常在40至70％之間)沒有被用于RNA合成而被浪費(fèi)。利用此途徑，RNA產(chǎn)量通常限制于大約1mg/ml(WO2006/004648)。在第二種方案中，加帽在體外轉(zhuǎn)錄后單獨(dú)的酶促反應(yīng)中完成(轉(zhuǎn)錄后加帽或酶促加帽)。牛痘病毒加帽酶(VCE)具備對合成m7G帽結(jié)構(gòu)必需的所有三種酶促活性(RNA5′-三磷酸酶、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶和鳥嘌呤-7-甲基轉(zhuǎn)移酶)。使用GTP作為底物，VCE反應(yīng)在正確的方位中生成RNA帽。此外，可以通過添加第二種牛痘酶——2′O甲基轉(zhuǎn)移酶——至加帽反應(yīng)產(chǎn)生1型帽(Tcherepanova等，2008.BMCMol.Biol.9：90)。已經(jīng)報道，通過噬菌體聚合酶體外轉(zhuǎn)錄的RNA可包含多種污染物，其包括通過自身互補(bǔ)的(self-complementary)3′延伸生成的雙鏈RNA分子和由無效轉(zhuǎn)錄起始事件產(chǎn)生的短RNA分子。在線性化DNA模板的失控轉(zhuǎn)錄期間由T7RNA聚合酶合成的RNA分子可以比編碼的RNA長(Triana-Alonso等，1995，JBC；270(11)：6298-6307)。在離開DNA模板后，如果3′-端不是穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)的一部分(自身互補(bǔ)的3′延伸)，則RNA聚合酶可以將轉(zhuǎn)錄物結(jié)合至模板位點(diǎn)，且將轉(zhuǎn)錄物的3′-端結(jié)合至產(chǎn)物位點(diǎn)并且使其延伸。該效應(yīng)似乎對UTP濃度尤其敏感并且僅僅減小UTP濃度導(dǎo)致如實(shí)的(faithful)轉(zhuǎn)錄。然而，降低UTP濃度還可以影響RNA產(chǎn)量。尤其是如果RNA包含poly(A)尾——如在RNA比如mRNA中常見的，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中過量的未并入的UTP可以導(dǎo)致與poly-A-序列相反的尿苷核苷酸的RNA-模板依賴性并入，其導(dǎo)致可以激活先天免疫應(yīng)答并且減少蛋白質(zhì)合成的雙鏈RNA分子(Kariko等，2011，NucleicAcidsRes.；39(21)：e142)。除期望的全長RNA分子之外，體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)還可以生成較小的寡核糖核苷酸，這是無效轉(zhuǎn)錄起始事件的結(jié)果(Milligan等，1987.NucleicAcidRes.15(21)：8783-8798)。這些無效(過早)轉(zhuǎn)錄物是從由RNA聚合酶、DNA模板和新生RNA鏈組成的三元復(fù)合物過早釋放的短RNA分子。通常地，大多數(shù)無效轉(zhuǎn)錄物的長度是二至八個核苷酸并且由于起始期間的無效循環(huán)形成。有趣地，當(dāng)NTP濃度低于大約2mM時，觀察到無效轉(zhuǎn)錄的增加(Kern等，1999.Biotechnol.Prog.15，174-184)。無效轉(zhuǎn)錄物是不期望的，因?yàn)樗鼈兊暮铣上挠袃r值的NTP并且減少全長產(chǎn)物的產(chǎn)量。對于成功的RNA療法的開發(fā)，作為活性藥物成分的RNA分子的生產(chǎn)在產(chǎn)量、質(zhì)量、安全和成本方面必須是高效的，尤其是當(dāng)RNA以大規(guī)模生產(chǎn)并且需要全長RNA分子或全長加帽的RNA分子時。描述了通過體外轉(zhuǎn)錄增加RNA分子的生產(chǎn)的數(shù)種途徑。高NTP濃度的使用預(yù)期增加RNA分子的產(chǎn)量。可選地，對于加帽的RNA分子的高效合成，已經(jīng)建議調(diào)節(jié)帽類似物與GTP的比率。用于體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸濃度通常在1.5至16mM的范圍內(nèi)(Milligan等，1987.NucleicAcidRes.15(21)：8783-8798；Sampson&Uhlenbeck，1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(4)：1033-7；Cunningham&Ofengand1990.Biotechniques9(6)：713-4；Weitzmann等1990，NucleicAcidsRes.18(12)：3515-20；Gurevich等，1991.Anal.Biochem.195(2)：207-13)。高至40mM的NTP濃度已經(jīng)被報道是可能的——如果Mg++濃度被相應(yīng)地調(diào)節(jié)，其導(dǎo)致增加的RNA產(chǎn)量(US5256555)。數(shù)種高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒是商業(yè)上可獲得的，例如T7高產(chǎn)量RNA合成試劑盒(NewEnglandBiolabs，Ipswich，MA，USA)、TranscriptAidTMT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒(ThermoScientific，Waltham，MA，USA)、高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)或AmpliCap-MaxTMT7高信使制造者(HighMessageMaker)試劑盒(Epicentre，Madison，WI，USA)。對于所有試劑盒，建議30至40mM的高的總NTP工作濃度用于標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。對于加帽mRNA的合成，GTP濃度在1.5mM和2mMGTP之間的范圍內(nèi)。雖然為了最大化體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的RNA產(chǎn)量，一般地推薦高核苷酸濃度，但是使用高NTP濃度還可能具有劣勢。例如，利用高初始NTP濃度和足夠高的Mg++濃度(例如Mg(OAc)2)，可以獲得高RNA產(chǎn)量。然而，在這些高濃度下，較高分?jǐn)?shù)的NTP可以被并入短的無效轉(zhuǎn)錄物(Kern等，1997.Biotechnol.Prog.13，747-756)。為了在存在帽類似物的情況下共轉(zhuǎn)錄地產(chǎn)生加帽的mRNA，經(jīng)濟(jì)原因需要較低的NTP工作濃度，因?yàn)楸仨毾鄬τ贕TP過量地使用帽類似物并且帽類似物是主要的成本因素。更高的帽類似物與GTP的比率將導(dǎo)致更高比例的加帽的RNA，但是出于產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)原因，通常建議4∶1的比率(NewEnglandBiolabs，CappedRNAsynthesis(E2040)，https：//www.neb.com/protocols/1/01/01/capped-rna-synthesis-e2040)。例如，對于加帽的RNA的轉(zhuǎn)錄，T7高產(chǎn)量RNA合成試劑盒的制造商的說明書建議使用2mMGTP與相對于GTP4∶1過量的帽類似物。每20μl反應(yīng)的產(chǎn)量指示為40-50μgRNA，對應(yīng)于2-2.5mg/ml，具有大約80％加帽的RNA轉(zhuǎn)錄物(NewEnglandBiolabs，CappedRNAsynthesis(E2040)，https：//www.neb.com/protocols/1/01/01/capped-rna-synthesis-e2040)。為了補(bǔ)償由低GTP濃度造成的受限的產(chǎn)量，已經(jīng)通過用競爭核苷酸(GTP或ATP——假如A-帽被使用)補(bǔ)充反應(yīng)以這樣的方式——維持1∶1和1∶50之間的GTP與帽類似物的比率——增加加帽的RNA的產(chǎn)量。利用此途徑，每個反應(yīng)產(chǎn)生的加帽的RNA的量可以加倍(WO2006/004648)。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)通常作為分批反應(yīng)進(jìn)行，其中所有組分被結(jié)合并且然后培育以允許合成RNA分子，直到反應(yīng)終止。此外，開發(fā)補(bǔ)料分批反應(yīng)以增加體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率(Kern等，1997.Biotechnol.Prog.13.747-756；Kern等，1999.Biotechnol.Prog.15，174-184)。在補(bǔ)料分批系統(tǒng)中，所有組分被結(jié)合，但是然后隨時間添加額外量的一些試劑(例如NTP和鎂)以維持恒定的反應(yīng)條件。補(bǔ)料分批策略生成每單位的RNA聚合酶或DNA模板——對于非常短的38個堿基對的DNA模板——的100％的RNA提高。此方法僅用于合成在5′末端處具有三磷酸的非加帽的RNA分子。已經(jīng)報道了通過體外轉(zhuǎn)錄合成RNA分子的生物反應(yīng)器(轉(zhuǎn)錄反應(yīng)器)的使用(WO1995/08626)。配置生物反應(yīng)器，以便反應(yīng)物經(jīng)由進(jìn)料管線被遞送至反應(yīng)器核心并且RNA產(chǎn)物通過穿過超濾膜被移出(具有標(biāo)稱分子量截留，例如，100,000道爾頓)至出口流?？傊?，來自體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的加帽的RNA分子的產(chǎn)量主要地取決于兩個因素，可用于并入RNA分子的總NTP濃度和帽類似物：GTP比率。對于共轉(zhuǎn)錄加帽，GTP濃度與其它NTP相比通常減少。此事實(shí)限制可能的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量，尤其是對于具有高GC含量的模板。鑒于上述，對RNA生產(chǎn)尤其是可以翻譯為蛋白質(zhì)的全長加帽RNA分子生產(chǎn)的改進(jìn)的和經(jīng)濟(jì)的工具和方法存在持續(xù)的需要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明尤其涉及用于合成給定序列的RNA分子的方法，其包括下列步驟：a)測定四種核苷酸G、A、C和U中的每種在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)，和b)通過體外轉(zhuǎn)錄在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中合成所述RNA分子，其中所述序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物包括四種核糖核苷酸GTP、ATP、CTP和UTP，緩沖液，DNA模板和RNA聚合酶，其中四種核糖核苷酸中的每種在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的分?jǐn)?shù)(2)對應(yīng)于各種核苷酸在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)。本發(fā)明還涉及用于合成給定序列的RNA分子的生物反應(yīng)器，該生物反應(yīng)器具有反應(yīng)模塊——用于在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中實(shí)施體外RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、捕捉模塊——用于暫時地捕捉轉(zhuǎn)錄的RNA分子、和控制模塊——用于控制序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的組分橫向進(jìn)給(infeed)進(jìn)入反應(yīng)模塊，其中反應(yīng)模塊包括用于從序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物分離核苷酸的濾膜，并且控制模塊對序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的組分橫向進(jìn)給的控制基于分離的核苷酸的測量濃度。定義為了清楚和易讀性的目的，提供了下列定義。針對這些定義提及的任何技術(shù)特征可以在本發(fā)明的每一個實(shí)施方式上讀出?？梢栽谌缭谙旅孢M(jìn)一步討論和說明的這些實(shí)施方式的背景下具體地提供額外的定義和說明。5′-帽結(jié)構(gòu)：5′帽通常是被添加至RNA分子的5′端的修飾的核苷酸，具體地鳥嘌呤核苷酸。優(yōu)選地，使用5′-5′-三磷酸鍵添加5′帽。5′帽可以是甲基化的，例如m7GpppN，其中N是攜帶5′帽的核酸的末端5′核苷酸，通常是RNA的5′-端。天然存在的5′帽是m7GpppN。5′帽結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步的實(shí)例包括甘油基、反向脫氧脫堿基殘基(inverteddeoxyabasicresidue)(部分)、4′，5′亞甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基(erythrofuranosyl))核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳環(huán)核苷酸、1，5-失水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修飾堿基核苷酸、蘇-呋喃戊糖基(pentofuranosyl)核苷酸、無環(huán)3′，4′-斷裂核苷酸(seconucleotide)、無環(huán)3，4-二羥丁基核苷酸、無環(huán)3，5二羥戊基核苷酸、3′-3′-反向核苷酸部分、3′-3′-反向脫堿基部分、3′-2′-反向核苷酸部分、3′-2′-反向脫堿基部分、1，4-丁二醇磷酸、3′-氨基磷酸、己基磷酸、氨基己基磷酸、3′-磷酸、3′硫代磷酸、二硫代磷酸、或橋接或非橋接甲基膦酸部分。特別優(yōu)選的5′帽結(jié)構(gòu)是CAP1(m7G的相鄰核苷酸的核糖的甲基化產(chǎn)物)、CAP2(m7G下游的第二個核苷酸的核糖的甲基化產(chǎn)物)、CAP3(m7G下游的第三個核苷酸的核糖的甲基化產(chǎn)物)、CAP4(m7G下游的第四個核苷酸的核糖的甲基化產(chǎn)物)。5′帽結(jié)構(gòu)可以由帽類似物形成。帽類似物：帽類似物指的是具有帽功能的不可延長的二核苷酸，所述帽功能的意思是它促進(jìn)翻譯或定位，和/或當(dāng)在RNA分子的5′端處并入時阻止RNA分子的降解。不可延長的意思是帽類似物將只在5′末端處并入，因?yàn)樗痪哂?′三磷酸并且因此不能通過模板-依賴性RNA聚合酶在3′方向中延伸。帽類似物包括但不限于選自m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化的帽類似物(例如，GpppG)；二甲基化的帽類似物(例如，m2，7GpppG)、三甲基化的帽類似物(例如，m2，2，7GpppG)、二甲基化的對稱帽類似物(例如，m7Gpppm7G)、或抗反向(antireverse)帽類似物(例如，ARCA；m7，2′OmeGpppG、m7，2′dGpppG、m7，3′OmeGpppG、m7，3′dGpppG和它們的四磷酸衍生物)的化學(xué)結(jié)構(gòu)(Stepinski等，2001.RNA7(10)：1486-95)。帽類似物的實(shí)例顯示在表1中。表1：帽類似物(D1和D2表示對應(yīng)物非對映異構(gòu)體)三磷酸帽類似物四磷酸帽類似物m7Gp3Gm7Gp4Gm27，3′-OGp3Gb7Gp4Gb7Gp3Gb7m3′-OGp4Ge7Gp3Gm22，7Gp4Gm22，7Gp3Gm32，2，7Gp4Gm32，2，7Gp3Gb7m2Gp4Gm7Gp32′dGm7Gp4m7Gm7Gp3m2′-OGm7Gp3m7Gm27，2′-OGp3Gm27，2′-OGpppsG(D1)m27，2′-OGpppsG(D2)m27，2′-OGppspG(D1)m27，2′-OGppspG(D2)m27，2′-OGpsppG(D1)m27，2′-OGpsppG(D2)先前已經(jīng)描述了進(jìn)一步的帽類似物(US7074596、WO2008/016473、WO2008/157688、WO2009/149253、WO2011/015347和WO2013/059475)。近來已經(jīng)描述了N7-(4-氯苯氧乙基)取代的二核苷酸帽類似物的合成(Kore等，2013.Bioorg.Med.Chem.21(15)：4570-4)。特別優(yōu)選的帽類似物是G[5′]PPP[5′]G、m7G[5′]PPP[5′]G、m32，2，7G[5′]ppp[5′]G、m27，3′-OG[5′]ppp[5′]G(3’-ARCA)、m27，2′-OGpppG(2′-ARCA)、m27，2′-OGppspGD1(β-S-ARCAD1)和m27，2′-OGppspGD2(β-S-ARCAD2)。核酸：術(shù)語核酸的意思是任何DNA或RNA分子并且與多核苷酸同義使用。另外，如本文限定的核酸的修飾或衍生物明確地包括在一般術(shù)語“核酸”中。例如，肽核酸(PNA)也包括在術(shù)語“核酸”中。單順反子RNA：單順反子RNA通?？梢允前▋H一個開放閱讀框的RNA，優(yōu)選地mRNA。此背景下的開放閱讀框是可以被翻譯為肽或蛋白質(zhì)的數(shù)個核苷酸三聯(lián)體(密碼子)的序列。雙/多順反子RNA：通常可以具有兩個(雙順反子)或更多個(多順反子)開放閱讀框(ORF)的RNA，優(yōu)選地mRNA。此背景下的開放閱讀框是可以被翻譯為肽或蛋白質(zhì)的數(shù)個核苷酸三聯(lián)體(密碼子)的序列。免疫刺激RNA：本發(fā)明背景下的免疫刺激RNA(isRNA)通?？梢允悄軌蛘T導(dǎo)先天免疫應(yīng)答的RNA。isRNA通常不具有開放閱讀框并且因而不提供肽-抗原但是引起先天免疫應(yīng)答，例如通過結(jié)合至病原-相關(guān)分子模式(PAMP)受體(例如Toll樣受體(TLR)或其它細(xì)胞內(nèi)RNA傳感器(例如RIG-I、MDA-5或PKR)。核苷酸類似物：核苷酸類似物是與天然存在的核苷酸在結(jié)構(gòu)上相似(類似)的核苷酸，其包括磷酸主鏈修飾、糖修飾或核堿基(nucleobase)的修飾。核酸合成：可以使用本領(lǐng)域中已知的任何方法制備如本文限定的根據(jù)本發(fā)明使用的核酸分子，所述方法包括合成方法比如例如固相合成、體內(nèi)增殖(例如病毒的體內(nèi)增殖)，以及體外方法，比如體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，RNA分子通過體外轉(zhuǎn)錄對應(yīng)的DNA分子制備。此DNA模板優(yōu)選地包括合適的啟動子——例如T7或SP6啟動子——用于體外轉(zhuǎn)錄，其后是編碼待制備的RNA分子的期望的核苷酸序列和用于體外轉(zhuǎn)錄的終止信號。DNA分子——其形成感興趣的至少一種RNA的模板——可以通過發(fā)酵增殖制備并且隨后分離為可以在細(xì)菌中復(fù)制的質(zhì)粒的一部分。可能被提到作為適于本發(fā)明的質(zhì)粒例是例如質(zhì)粒pUC18、pUC19、pBR322、pT7T(GenBank登錄號U26404；Lai等，Development1995，121：2349至2360)、系列，例如(GenBank登錄號X65300；來自Promega)和pSP64(GenBank登錄號X65327)；還參閱Griffin和Griffin(ed.)，PCRTechnology：CurrentInnovation，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)L，2001中的MezeiandStorts，PurificationofPCRProducts。RNA：RNA是核糖核酸的常用縮寫。它是核酸分子，即由核苷酸組成的聚合物。這些核苷酸通常是沿著所謂的主鏈彼此連接的腺苷-一磷酸、尿苷-一磷酸、鳥苷-一磷酸和胞苷-一磷酸單體。主鏈由第一單體的糖即核糖和第二相鄰單體的磷酸部分之間的磷酸二酯鍵形成。具體連續(xù)的單體被稱為RNA-序列。信使RNA(mRNA)：在真核細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄通常在細(xì)胞核或線粒體內(nèi)進(jìn)行。在體內(nèi)，DNA的轉(zhuǎn)錄通常導(dǎo)致所謂的未成熟RNA，其必須被加工為所謂的信使RNA，通常簡寫為mRNA。未成熟RNA的加工——例如在真核生物體中——包括各種不同的轉(zhuǎn)錄后修飾比如剪接、5′-加帽、多腺苷酸化、從細(xì)胞核或線粒體輸出等。這些加工的總和也稱為mRNA的成熟。成熟信使RNA通常提供可以被翻譯為特定的肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列的核苷酸序列。通常地，成熟mRNA包括5′帽、5′UTR、開放閱讀框、3′UTR和poly(A)序列。在本發(fā)明的背景下，mRNA還可以是人工分子，即在自然界中不存在的分子。這意味著本發(fā)明背景下的mRNA可以例如包括5′UTR、開放閱讀框、3′UTR和poly(A)序列的組合，其在自然界中不以此組合存在。自我復(fù)制RNA(復(fù)制子)：自我復(fù)制RNA是基于α病毒的遞送載體，其已經(jīng)從塞姆利基森林病毒(SemlikiForestVirus)(SFV)、辛德比斯(SIN)病毒和委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)病毒研發(fā)出。α病毒是單鏈RNA病毒，其中感興趣的異源基因可以替換α病毒的結(jié)構(gòu)基因。通過提供反式(intrans)結(jié)構(gòu)基因，復(fù)制子RNA被包裝入復(fù)制子顆粒(RP)，其可以用于基因治療目的或基因疫苗接種(參見例如VanderVeen等，2012.Alphavirusrepliconvaccines.AnimalHealthResearchReviews，p.1-9)。在進(jìn)入宿主細(xì)胞后，基因組病毒RNA最初充當(dāng)用于翻譯病毒RNA擴(kuò)增的起始所需的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(nsP)的mRNA。RNA復(fù)制經(jīng)由全長負(fù)鏈中間體的合成從內(nèi)部啟動子發(fā)生，所述全長負(fù)鏈中間體被用作用于合成額外的基因組-長度RNA和用于轉(zhuǎn)錄正鏈次基因組RNA的模板。這樣的RNA然后可以被認(rèn)為是自我復(fù)制RNA，這是因?yàn)樨?fù)責(zé)復(fù)制(和異源基因的轉(zhuǎn)錄)的非結(jié)構(gòu)蛋白仍存在于這樣的復(fù)制子中。這樣的α病毒載體被稱為“復(fù)制子”。核酸分子的序列：核酸分子的序列通常理解為特定和單獨(dú)的順序，即連續(xù)的其核苷酸。開放閱讀框：本發(fā)明背景下的開放閱讀框(ORF)通?？梢允强梢员环g為肽或蛋白質(zhì)的數(shù)個核苷酸三聯(lián)體的序列。開放閱讀框優(yōu)選地包含在其5′-端的起始密碼子——即通常用于編碼氨基酸甲硫氨酸的三個后繼核苷酸的組合(ATG或AUG)，和后繼區(qū)域，其通常展示3個核苷酸倍數(shù)的長度。ORF優(yōu)選地被終止密碼子(例如，TAA、TAG、TGA)終止。通常地，這是開放閱讀框的唯一終止密碼子。因而，本發(fā)明背景下的開放閱讀框優(yōu)選地是由可以被三整除的許多核苷酸組成的核苷酸序列，其開始于起始密碼子(例如ATG或AUG)并且其優(yōu)選地終止于終止密碼子(例如，分別地TAA、TGA、或TAG或UAA、UAG、UGA)。開放閱讀框可以被分離或其可以被并入更長的核酸序列，例如載體或mRNA中。開放閱讀框也被叫做“蛋白質(zhì)編碼區(qū)”或“編碼區(qū)”。序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物：用于給定序列的RNA分子的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)混合物包括四種核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP，緩沖液，DNA模板和RNA聚合酶，其中四種核苷三磷酸(NTP)中的每種在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的分?jǐn)?shù)(2)對應(yīng)于各種核苷酸在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)。如果核糖核苷酸不存在于所述RNA分子中，則對應(yīng)的核苷三磷酸也不存在于序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中。序列優(yōu)化的核苷三磷酸(NTP)混合物：用于給定序列的RNA分子的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的核苷三磷酸(NTP)的混合物包括四種核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP，其中四種核苷三磷酸(NTP)中的每種在序列優(yōu)化的核苷三磷酸(NTP)混合物中的分?jǐn)?shù)(2)對應(yīng)于各種核苷酸在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)。如果核糖核苷酸不存在于RNA分子中，則對應(yīng)的核苷三磷酸也不存在于序列優(yōu)化的核苷三磷酸(NTP)混合物中。修飾的核苷三磷酸：如本文使用的術(shù)語“修飾的核苷三磷酸”指的是包括主鏈修飾以及糖修飾或堿基修飾的化學(xué)修飾。這些修飾的核苷三磷酸在本文也稱為(核苷酸)類似物。在此背景下，如本文限定的修飾的核苷三磷酸是核苷酸類似物/修飾，例如主鏈修飾、糖修飾或堿基修飾。與本發(fā)明相關(guān)的主鏈修飾是其中核苷酸的主鏈的磷酸被化學(xué)地修飾的修飾。與本發(fā)明相關(guān)的糖修飾是核苷酸的糖的化學(xué)修飾。另外，與本發(fā)明相關(guān)的堿基修飾是核苷酸的堿基部分的化學(xué)修飾。在此背景下，核苷酸類似物或修飾優(yōu)選地選自適用于轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核苷酸類似物。糖修飾可以在被發(fā)明的背景下使用的修飾的核苷和核苷酸可以在糖部分中被修飾。例如，2′羥基(OH)可以被修飾或被許多不同的“含氧(oxy)”或“脫氧”取代基取代。“含氧”-2′羥基修飾的實(shí)例包括但不限于烷氧基或芳氧基(-OR，例如，R＝H、烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“鎖定”核酸(LNA)，其中2′羥基——例如通過亞甲基橋接——被連接至相同核糖的4′碳；和氨基(-O-氨基，其中氨基，例如，NRR，可以是烷基氨基、二烷基氨基、雜環(huán)基、芳基氨基、二芳基氨基、雜芳基氨基、或二雜芳基氨基、乙二胺、聚氨基)或氨基烷氧基?！懊撗酢毙揎棸洹被?例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、雜環(huán)基、芳基氨基、二芳基氨基、雜芳基氨基、二雜芳基氨基或氨基酸)；或氨基可以通過連接體附連至糖，其中連接體包括原子C、N和O中的一種或多種。糖基團(tuán)還可以包含一個或多個碳，其具備與核糖中相應(yīng)的碳相反的立體化學(xué)構(gòu)型。因而，修飾的核苷酸可以包括包含例如阿拉伯糖作為糖的核苷酸。主鏈修飾磷酸主鏈在修飾的核苷和核苷酸中可以被進(jìn)一步修飾?？梢酝ㄟ^利用不同的取代基取代一個或多個氧原子來修飾主鏈的磷酸基團(tuán)。進(jìn)一步，修飾的核苷和核苷酸可以包括利用如本文描述的修飾的磷酸完全取代未修飾的磷酸部分。修飾的磷酸基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于硫代磷酸、硒酸磷酸(phosphoroselenate)、硼烷磷酸(boranophosphate)、硼烷磷酸酯、氫膦酸(hydrogenphosphonate)、氨基磷酸、烷基或芳基膦酸和磷酸三酯。二硫代磷酸具有均被硫取代的兩個非連接的氧。磷酸連接體還可以通過利用氮(橋接的氨基磷酸)、硫(橋接的硫代磷酸)和碳(橋接的亞甲基-膦酸)取代連接的氧而進(jìn)行修飾。堿基修飾可以用于本發(fā)明的修飾的核苷和核苷酸在核堿基部分中可以被進(jìn)一步修飾。在RNA中發(fā)現(xiàn)的核堿基的實(shí)例包括但不限于腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。例如，本文描述的核苷和核苷酸可以在大溝面上被化學(xué)修飾。在一些實(shí)施方式中，大溝化學(xué)修飾可以包括氨基、硫醇基、烷基或鹵素基團(tuán)。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，核苷酸類似物/修飾選自堿基修飾，其優(yōu)選地選自2-氨基-6-氯嘌呤核糖核苷-5′-三磷酸、2-氨基嘌呤-核糖核苷-5′-三磷酸；2-氨基腺苷-5′-三磷酸、2′-氨基-2′-脫氧胞苷-三磷酸、2-硫代胞苷-5′-三磷酸、2-硫代尿苷-5′-三磷酸、2′-氟胸苷-5′-三磷酸、2′-O-甲基肌苷-5′-三磷酸、4-硫代尿苷-5′-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷-5′-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷-5′-三磷酸、5-溴胞苷-5′-三磷酸、5-溴尿苷-5′-三磷酸、5-溴-2′-脫氧胞苷-5′-三磷酸、5-溴-2′-脫氧尿苷-5′-三磷酸、5-碘胞苷-5′-三磷酸、5-碘-2′-脫氧胞苷-5′-三磷酸、5-碘尿苷-5′-三磷酸、5-碘-2′-脫氧尿苷-5′-三磷酸、5-甲基胞苷-5′-三磷酸、5-甲基尿苷-5′-三磷酸、5-丙炔基-2′-脫氧胞苷-5′-三磷酸、5-丙炔基-2′-脫氧尿苷-5′-三磷酸、6-氮雜胞苷-5′-三磷酸、6-氮雜尿苷-5′-三磷酸、6-氯嘌呤核糖核苷-5′-三磷酸、7-去氮雜腺苷(deazaadenosine)-5′-三磷酸、7-去氮雜鳥苷-5′-三磷酸、8-氮雜腺苷-5′-三磷酸、8-疊氮基腺苷-5′-三磷酸、苯并咪唑-核糖核苷-5′-三磷酸、N1-甲基腺苷-5′-三磷酸、N1-甲基鳥苷-5′-三磷酸、N6-甲基腺苷-5′-三磷酸、O6-甲基鳥苷-5′-三磷酸、假尿苷-5′-三磷酸、或嘌呤霉素-5′-三磷酸、黃苷-5′-三磷酸。給予核苷酸選自由5-甲基胞苷-5′-三磷酸、7-去氮雜鳥苷-5′-三磷酸、5-溴胞苷-5′-三磷酸和假尿苷-5′-三磷酸組成的堿基-修飾的核苷酸的堿基修飾的特別的偏好。在一些實(shí)施方式中，修飾的核苷包括吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-?；撬峒谆蜍?taurinomethyluridine)、1-?；撬峒谆?假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-?；撬峒谆?4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。在一些實(shí)施方式中，修飾的核苷包括5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-假異胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、1-甲基-1-去氮雜-假異胞苷、zebularine、5-氮雜-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮雜-2-硫代-zebularine、2-硫代-zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷。在其它實(shí)施方式中，修飾的核苷包括2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、7-去氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮雜-2-氨基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2-氨基嘌呤、7-去氮雜-2，6-二氨基嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲?；佘?glycinylcarbamoyladenosine)、N6-蘇氨酰氨基甲酰基腺苷(threonylcarbamoyladenosine)、2-甲基硫代-N6-蘇氨酰氨基甲酰基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。在其它實(shí)施方式中，修飾的核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷、懷丁苷、7-去氮雜-鳥苷、7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、6-硫代-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-鳥苷、6-硫代-7-去氮雜-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫代-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2，N2-二甲基鳥苷、8-氧代-鳥苷、7-甲基-8-氧代-鳥苷、1-甲基-6-硫代-鳥苷、N2-甲基-6-硫代-鳥苷和N2，N2-二甲基-6-硫代-鳥苷。在一些實(shí)施方式中，核苷酸在大溝面上可以被修飾并且可以包括利用甲基或鹵素基團(tuán)取代尿嘧啶的C-5上的氫。在具體的實(shí)施方式中，修飾的核苷是5′-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-胞苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-鳥苷、5′-O-(1-硫代磷酸)-尿苷或5′-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方式中，修飾的核苷酸包括選自6-氮雜-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-異-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5，6-二氫尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮雜-尿苷、5-羥基-尿苷、脫氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫代-鳥苷、6-甲基-鳥苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鳥苷、7-去氮雜-鳥苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-異-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-疊氮基-腺苷、7-去氮雜-腺苷的核苷修飾。先前已經(jīng)描述了進(jìn)一步修飾的核苷酸(WO2013052523)。產(chǎn)量：產(chǎn)量，也稱為反應(yīng)產(chǎn)量，是在化學(xué)或酶促反應(yīng)中獲得的產(chǎn)物量。絕對產(chǎn)量可以作為以克或以摩爾(摩爾產(chǎn)量)為單位的重量給出。相對產(chǎn)量、分?jǐn)?shù)產(chǎn)量(fractionalyield)或產(chǎn)量百分?jǐn)?shù)——其用來測量合成過程的效力——通過使獲得的產(chǎn)物的量除以理論產(chǎn)量來計算(二者的計量單位必須是相同的)。相對產(chǎn)量＝(實(shí)際產(chǎn)量)/(理論產(chǎn)量)實(shí)際產(chǎn)量：實(shí)際產(chǎn)量指的是在化學(xué)反應(yīng)中獲得的產(chǎn)物的量。理論產(chǎn)量：理論產(chǎn)量是可以在完美高效的化學(xué)或酶促反應(yīng)中產(chǎn)生的產(chǎn)物的最大量?，F(xiàn)實(shí)中，大多數(shù)反應(yīng)不是極其高效的——反應(yīng)的實(shí)際產(chǎn)量通常小于理論產(chǎn)量。考慮反應(yīng)的化學(xué)計量學(xué)，基于限制反應(yīng)物的摩爾量計算理論產(chǎn)量。對于計算，通常假設(shè)僅涉及一個反應(yīng)。RNA產(chǎn)量：RNA產(chǎn)量是在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中獲得的RNA產(chǎn)物的量。RNA產(chǎn)量可以表達(dá)為RNA濃度(g/ml或mol/1)。RNA濃度乘以反應(yīng)體積得出RNA的絕對量(以克或摩爾為單位)。實(shí)際RNA產(chǎn)量：實(shí)際RNA產(chǎn)量是在限定的時間點(diǎn)在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中RNA產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)測定的量，例如反應(yīng)完成后的產(chǎn)量。例如，可以使用分光光度計經(jīng)由260nm下的吸光度測量測定RNA濃度(Kolitz等，2013.MethodsEnzymol.530：331-6)。260nm下的一個吸光度單位對應(yīng)于40ng/μl的RNA(1A260＝40ng/μlRNA)。理論RNA產(chǎn)量：理論RNA產(chǎn)量是基于體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中可用的NTP的最大可能的RNA產(chǎn)量。在具有相等濃度的四種NTP(ATP、GTP、CTP、UTP)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，對應(yīng)于RNA序列中最常見的核苷酸的核苷酸通常成為限制因素。在使用感興趣的RNA序列的序列優(yōu)化的NTP混合物的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，單獨(dú)核苷酸均不成為限制因素。為了計算轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的理論RNA產(chǎn)量，在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)開始時存在的每種NTP的量(以mol為單位)除以在RNA分子的序列中存在的各種核苷酸的數(shù)目(以mol為單位)，產(chǎn)生可以合成的可能數(shù)目的RNA分子。乘以RNA的分子量生成以質(zhì)量單位(克)的理論RNA產(chǎn)量。在使用相等濃度的每種NTP的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，對應(yīng)于RNA序列中最常見的核苷酸的NTP通常成為限制因素。相比之下，在序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，沒有NTP將稱為限制因素，因?yàn)樗蓄愋偷腘TP以與RNA分子的序列中對應(yīng)的核苷酸相同的比率存在。相對RNA產(chǎn)量：相對RNA產(chǎn)量、分?jǐn)?shù)RNA產(chǎn)量或RNA產(chǎn)量百分?jǐn)?shù)——其用來測量體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率——通過使獲得的RNA產(chǎn)物的量(實(shí)際RNA產(chǎn)量)除以理論RNA產(chǎn)量進(jìn)行計算(二者的計量單位必須是相同的)：相對RNA產(chǎn)量＝(實(shí)際RNA產(chǎn)量)/(理論RNA產(chǎn)量)為了表達(dá)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率，可以計算RNA產(chǎn)量百分?jǐn)?shù)：％RNA產(chǎn)量＝(實(shí)際RNA產(chǎn)量)/(理論RNA產(chǎn)量)×100具體實(shí)施方式在第一方面，本發(fā)明涉及用于合成給定序列的RNA分子的方法，其包括下列步驟：a)測定四種核苷酸G、A、C和U中的每種在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)，和b)通過體外轉(zhuǎn)錄在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中合成所述RNA分子，其中所述序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物包括四種核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP，緩沖液，DNA模板和RNA聚合酶，其中四種核糖核苷三磷酸(NTP)中的每種在反應(yīng)混合物中的分?jǐn)?shù)(2)對應(yīng)于各種核苷酸在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)。在本發(fā)明的背景下并且如實(shí)施例1和圖5與6中顯示的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用包含四種核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP的序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物用于通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有給定序列的RNA分子與具有等摩爾的初始濃度的所有四種NTP的非優(yōu)化的反應(yīng)混合物相比導(dǎo)致更高的RNA產(chǎn)物產(chǎn)量和更少的未并入的并因此更少浪費(fèi)的NTP。當(dāng)難以合成并且因此使用昂貴的修飾的核苷酸時，此方面是尤其有價值的。在序列優(yōu)化的NTP混合物中，GTP、ATP、CTP和UTP以以下分?jǐn)?shù)出現(xiàn)：該分?jǐn)?shù)對應(yīng)于在所述RNA序列中出現(xiàn)的所述核苷酸G、A、C和U的分?jǐn)?shù)。在序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，設(shè)想四種NTP消耗至相同的程度并且轉(zhuǎn)錄繼續(xù)直到NTP被用盡，因而浪費(fèi)更少的材料。另外，預(yù)期當(dāng)使用序列優(yōu)化的NTP混合物時，避免上述的合成比編碼的RNA長的RNA分子——例如由于自身互補(bǔ)的3′延伸(Triana-Alonso等，1995，JBC；270(11)：6298-6307)——的可能性，這是因?yàn)樵诜磻?yīng)結(jié)束時不保留過量的UTP。尤其是如果RNA包含poly(A)尾——如在RNA比如mRNA中常見的，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中過量的未并入的UTP可以導(dǎo)致與poly-A-序列相反的尿苷核苷酸的RNA-模板依賴性并入，其導(dǎo)致可以激活先天免疫應(yīng)答并且減少蛋白質(zhì)合成的雙鏈RNA分子(Kariko等，2011，NucleicAcidsRes.；39(21)：e142)。如下面將詳細(xì)說明的，使用體外轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)RNA分子的方法是本領(lǐng)域中已知的。使用核苷酸類似物提高例如RNA分子的穩(wěn)定性也是已知的。本發(fā)明關(guān)注核糖核苷三磷酸(NTP)在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)混合物中的濃度。結(jié)果，在本發(fā)明的方法的第一步驟中，測定四種核苷酸G、A、C和U中的每種在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)。這可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法進(jìn)行，例如通過對核苷酸的數(shù)目進(jìn)行簡單計數(shù)或通過使用基于計算機(jī)的方法。每種核苷酸的分?jǐn)?shù)(1)然后可以由任何合適的術(shù)語——包括數(shù)目、百分比、摩爾分?jǐn)?shù)或摩爾百分?jǐn)?shù)——表達(dá)。摩爾分?jǐn)?shù)(molefraction)或克分子分?jǐn)?shù)(molarfraction)(xi)被定義為組分的量(以摩爾為單位表達(dá))ni除以混合物中所有組分的總量ntot。所有摩爾分?jǐn)?shù)的和等于1。以100的分母表達(dá)的相同的概念是摩爾百分?jǐn)?shù)或摩爾百分比(mol％)。基于核苷酸中的每種在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)的測量，在本發(fā)明方法的進(jìn)一步步驟中，所述RNA分子通過體外轉(zhuǎn)錄在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中合成，其中所述序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物包括四種核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP或其類似物，并且其中四種核糖核苷三磷酸(NTP)中的每種在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的分?jǐn)?shù)(2)對應(yīng)于各種核苷酸在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法的步驟b)包括以下步驟b1)制備包括四種核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP的序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物，其中四種核糖核苷三磷酸(NTP)中的每種在序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物中的分?jǐn)?shù)(2)對應(yīng)于各種核苷酸在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)，和b2)通過體外轉(zhuǎn)錄在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中合成所述RNA分子，所述序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物包括步驟(b1)的序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物、緩沖液、DNA模板和RNA聚合酶。結(jié)果，在此優(yōu)選的實(shí)施方式中，基于分?jǐn)?shù)(1)的測定制備序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物，其然后被添加至反應(yīng)混合物。上面關(guān)于序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物指示的所有定義，并且尤其是關(guān)于問題“分?jǐn)?shù)(1)對應(yīng)于分?jǐn)?shù)(2)”做出的那些定義也適用于序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物。在此背景下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解如果所述RNA分子不分別包含所有核苷酸G、A、C和U，其也將適用于序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物和序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物。根據(jù)本發(fā)明，“分?jǐn)?shù)(1)對應(yīng)于分?jǐn)?shù)(2)”的意思是核糖核苷三磷酸(NTP)在序列優(yōu)化的NTP混合物或在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的分?jǐn)?shù)已經(jīng)適應(yīng)于核苷酸在RNA分子中的分?jǐn)?shù)。技術(shù)員人將理解沒有必要使分?jǐn)?shù)(2)精確反映分?jǐn)?shù)(1)，但是需要各種核糖核苷三磷酸在序列優(yōu)化的NTP混合物或在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的單獨(dú)分?jǐn)?shù)(2)反映對應(yīng)的核苷酸在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)。為了更詳細(xì)地評價分?jǐn)?shù)(1)和分?jǐn)?shù)(2)之間的關(guān)系，針對術(shù)語“分?jǐn)?shù)(1)對應(yīng)于分?jǐn)?shù)(2)”的定義，可以考慮下列內(nèi)容：a)關(guān)于核糖核苷三磷酸在序列優(yōu)化的NTP混合物或在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的分?jǐn)?shù)，其對應(yīng)于待合成的RNA分子第一個核苷酸，根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方式，可能分?jǐn)?shù)(2)在分?jǐn)?shù)(1)的范圍中，例如分?jǐn)?shù)(1)和分?jǐn)?shù)(2)相差不超過25％、20％、15％、10％、7％、5％或相差0.1％和5％之間的值。b)關(guān)于在序列優(yōu)化的NTP混合物或在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中存在的其它核糖核苷三磷酸，其不對應(yīng)于所述RNA分子的第一個核苷酸，分?jǐn)?shù)(2)優(yōu)選地在分?jǐn)?shù)(1)的范圍中，例如分?jǐn)?shù)(1)和分?jǐn)?shù)(2)相差不超過25％、20％、15％、10％、7％、5％或相差0.1％和5％之間的值。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，在體外轉(zhuǎn)錄開始前起始核苷酸被添加至序列優(yōu)化的NTP混合物或序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物。起始核苷酸是對應(yīng)于所述RNA分子的第一個核苷酸(+1位置)的核苷酸?？梢杂绕涮砑悠鹗己塑账嵋栽黾覴NA聚合酶的起始速率。所述起始核苷酸也是本領(lǐng)域中已知的并且包括核苷一磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸。起始核苷酸可以是單核苷酸、二核苷酸或三核苷酸。在所述RNA分子的第一個核苷酸是G的情況下，起始核苷酸優(yōu)選地是GTP或GMP。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述起始核苷酸是二核苷酸。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，起始核苷酸是帽類似物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，帽類似物選自G[5′]PPP[5′]G、m7G[5′]ppp[5′]G、m32，2，7G[5′]ppp[5′]G、m27，3′-OG[5′]ppp[5′]G(3′-ARCA)、m27，2′-OGpppG(2′-ARCA)、m27，2′-OGppspGD1(β-S-ARCAD1)和m27，2′-OGppspGD2(β-S-ARCAD2)。然而，根據(jù)另一個優(yōu)選的實(shí)施方式，在序列優(yōu)化的NTP混合物或在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中，對應(yīng)于所述RNA分子的第一個核苷酸的起始核苷酸與在所述RNA分子的第一個位置處發(fā)現(xiàn)的所述RNA分子中該核苷酸的分?jǐn)?shù)相比過量地添加。優(yōu)選地，以大約1至20mM、1至17.5mM、1至15mM、1至12.5mM、1至10mM、1至7.5mM、1至5mM或1至2.5mM的范圍內(nèi)的初始濃度添加起始核苷酸。甚至更優(yōu)選地，以大約5至20mM或7.5至17.5mM的初始濃度添加起始核苷酸。在上面的優(yōu)選的示例性實(shí)施方式中，RNA分子的第一個核苷酸是G，起始核苷酸是G的帽類似物并且對應(yīng)的核糖核苷三磷酸是GTP。在此實(shí)施方式中，帽類似物與GTP相比過量地存在于反應(yīng)混合物中。優(yōu)選地，以大約1至20mM、1至17.5mM、1至15mM、1至12.5mM、1至10mM、1至7.5mM、1至5mM或1至2.5mM的范圍內(nèi)的初始濃度添加帽類似物。甚至更優(yōu)選地，以大約5至20mM、7.5至20mM、10至20mM或12.5至20mM的初始濃度添加帽類似物。用于體外轉(zhuǎn)錄的方法是本領(lǐng)域中已知的(Geall等，2013.Semin.Immunol.25(2)：152-159；Brunelle等，2013.MethodsEnzymol.530：101-14)。在所述方法中使用的試劑通常包括：1)具有啟動子序列的線性化DNA模板，其對其各自的RNA聚合酶比如噬菌體-編碼的RNA聚合酶具有高的結(jié)合親和力，2)四種堿基(腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶)的核糖核苷三磷酸(NTP)；3)如上面限定的帽類似物(例如m7G(5′)ppp(5′)G(m7G))；4)DNA-依賴性RNA聚合酶(例如T7、T3或SP6RNA聚合酶)；5)核糖核酸酶(RNase)抑制劑，以使任何污染RNase失活；6)焦磷酸酶，以降解焦磷酸鹽，其可以抑制轉(zhuǎn)錄；7)MgCl2，其供應(yīng)Mg2+作為聚合酶的輔助因子；8)緩沖液，以維持合適的pH值，其還可以包含最佳濃度下的抗氧化劑和聚胺比如亞精胺。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，用于本發(fā)明的方法的合成給定序列的RNA分子的序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物包括緩沖液，其選自4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)。優(yōu)選地，緩沖液在10至100mM、10至75mM、10至50mM、10至40mM、10至30mM或10至20mM的濃度下使用?？梢岳美鏝aOH、KOH或HCl調(diào)節(jié)緩沖液的pH值。優(yōu)選地，緩沖液具有6至8.5、6.5至8.0、7.0至7.5、甚至更優(yōu)選的7.5的pH值。最優(yōu)選的是選自80mMHEPES/KOH，pH7.5和40mMTris/HCl，pH7.5的緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，包括在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的RNA聚合酶選自T3、T7和SP6RNA聚合酶。優(yōu)選地，RNA聚合酶的濃度是大約1至100nM、1至90nM、1至80nM、1至70nM、1至60nM、1至50nM、1至40nM、1至30nM、1至20nM或大約1至10nM。甚至更優(yōu)選地，RNA聚合酶的濃度是大約10至50nM、20至50nM或30至50nM。最優(yōu)選的是大約40nM的RNA聚合酶濃度。在此背景下，500至10000U/ml的濃度的RNA聚合酶是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是1000至7500U/ml的濃度并且最優(yōu)選的是2500至5000單位/ml的濃度的RNA聚合酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解RNA聚合酶濃度的選擇受DNA模板濃度影響。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，包括在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的DNA模板的濃度在大約1至50nM、1至40nM、1至30nM、1至20nM或大約1至10nM的范圍內(nèi)。甚至更優(yōu)選地，DNA模板的濃度是大約10至30nM。最優(yōu)選地，DNA模板的濃度是大約20nM。在此背景下，具有大約1至200μg/ml的DNA模板的濃度是特別優(yōu)選的，并且更優(yōu)選地大約10至100μg/ml，并且最優(yōu)選地大約20至50μg/ml(例如25或50μg/ml)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物包括焦磷酸酶。優(yōu)選地，焦磷酸酶的濃度是大約1至20單位/ml、1至15單位/ml、1至10單位/ml、1至5單位/ml或1至2.5單位/ml。甚至更優(yōu)選地，焦磷酸酶的濃度是大約1單位/ml或是大約5單位/ml。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物包括Mg++離子。優(yōu)選地，Mg++離子以MgCl2或Mg(OAc)2的形式提供。優(yōu)選地，初始的游離Mg++濃度是大約1至100mM、1至75mM、1至50mM、1至25mM或1至10mM。甚至更優(yōu)選地，初始的游離Mg++濃度是大約10至30mM或大約15至25mM。最優(yōu)選的是大約24mM的初始的游離Mg++濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解Mg++濃度的選擇受初始的總NTP濃度影響。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物包括還原劑以保持RNA聚合酶處于其活化狀態(tài)。優(yōu)選地，還原劑選自二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)和β-巰基乙醇。優(yōu)選地，還原試劑的濃度是大約1至50mM、1至40mM、1至30mM、或1至20mM、或1至10mM。甚至更優(yōu)選地，還原試劑的濃度是10至50mM或20至40mM。最優(yōu)選的是包括40mM的DTF的序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物包括聚胺。優(yōu)選地，聚胺選自精胺和亞精胺。優(yōu)選地，聚胺的濃度是大約1至25mM、1至20mM、1至15mM、1至10mM、1至5mM或大約1至2.5mM。甚至更優(yōu)選地，聚胺的濃度是大約2mM。最優(yōu)選的是包括2mM的亞精胺的序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物包括核糖核酸酶抑制劑。優(yōu)選地，核糖核酸酶抑制劑的濃度是大約1至500單位/ml、1至400單位/ml、1至300單位/ml、1至200單位/ml或1至100單位/ml。甚至更優(yōu)選地，核糖核酸酶抑制劑的濃度是大約200單位/ml。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，在序列優(yōu)化的NTP混合物或序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的初始的總NTP濃度小于20mM、小于15mM、小于10mM、小于7.5mM、小于5.0mM或小于2.5mM。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語初始的總核苷酸濃度的意思是當(dāng)序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的各種組分已經(jīng)以最終體積集合用于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時，在序列優(yōu)化的NTP混合物或序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中初始地存在的NTP的總濃度，例如ATP、GTP、CTP和/或UTP的濃度的和。自然地，隨著反應(yīng)進(jìn)行，核苷酸將并入RNA分子，并且結(jié)果，總核苷酸的濃度將從其初始值漸進(jìn)地減小。本發(fā)明的一個重要的方面是使用序列優(yōu)化的NTP混合物或序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物導(dǎo)致甚至在低的初始的總核苷酸濃度(例如2mM)下RNA合成的效率增加。相比之下，先前已經(jīng)建議對于增加的RNA產(chǎn)量，高濃度的總核苷酸——大約12mM至40mM——是必要的(US6586218)。另外，當(dāng)使用序列優(yōu)化的NTP混合物或序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中低的初始的總核苷酸濃度(例如2.5mM)時，預(yù)期短的無效RNA分子的合成降低。相比之下，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)的等摩爾NTP混合物的NTP濃度降低低于大約2mM時，觀察到無效轉(zhuǎn)錄的增加(Kern等，1999.Biotechnol.Prog.15，174-184)。本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式涉及NTP被添加至序列優(yōu)化的NTP混合物或序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的形式。核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP或其類似物可以被提供有一價或二價陽離子作為平衡離子。優(yōu)選地，一價陽離子選自Li+、Na+、K+、NH4+或三(羥甲基)-氨基甲烷(Tris)。優(yōu)選地，二價陽離子選自Mg++、Ba++和Mn++。根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施方式，NTP平衡離子是三(羥甲基)-氨基甲烷(Tris)。噬菌體RNA聚合酶已知對鹽抑制敏感。已經(jīng)描述了高NaCl濃度對RNA產(chǎn)量的負(fù)面影響(例如Kern&Davis，1997.Biotechnol.Prog.，13，747-756；US6,586,218B2)。高濃度的Na-NTP——尤其是作為當(dāng)遵循NTP補(bǔ)料策略時的結(jié)果——可能因此導(dǎo)致減少的RNA產(chǎn)量?？梢酝ㄟ^使用Tris-核苷酸規(guī)避此限制，這是因?yàn)榕c高Na濃度相比，RNA聚合酶活性更少受高Tris濃度影響。如實(shí)施例5和圖12中顯示的，與Tris相比，RNA產(chǎn)量對添加Na更敏感。本領(lǐng)域中已知分別地取代核糖核苷三磷酸GTP、ATP、GTP和UTP，修飾的核苷三磷酸(類似物)也可以用于體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，例如以增強(qiáng)RNA的穩(wěn)定性。如實(shí)施例3和圖8中顯示的，序列優(yōu)化的NTP混合物或序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的部分或全部UTP可以被假-UTP替換。結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，序列優(yōu)化的NTP混合物或序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的至少一種核糖核苷三磷酸的部分或全部可以被修飾的核苷三磷酸替換。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述修飾的核苷三磷酸選自假尿苷-5′-三磷酸、1-甲基假尿苷-5′-三磷酸、2-硫代尿苷-5′-三磷酸、4-硫代尿苷-5′-三磷酸和5-甲基胞苷-5′-三磷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解只可能在體外轉(zhuǎn)錄開始前精確地建立序列優(yōu)化的NTP混合物或序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的單個組分的濃度。結(jié)果，在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，如上面限定的數(shù)目或分?jǐn)?shù)反映轉(zhuǎn)錄開始前在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物或在序列優(yōu)化的NTP混合物中存在的初始條件。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方式，在體外轉(zhuǎn)錄的過程中，序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物補(bǔ)充有如本文限定的序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物。在本發(fā)明的背景下，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過供給額外量的序列優(yōu)化的NTP混合物進(jìn)入體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(NTP補(bǔ)料)進(jìn)一步增加RNA產(chǎn)量。如實(shí)施例1和圖6中顯示的，添加額外的序列優(yōu)化的NTP混合物顯著地增加RNA產(chǎn)量。新鮮的序列優(yōu)化的NTP混合物以這樣的方式添加：維持帽類似物與對應(yīng)的核苷酸例如GTP的期望的比率(例如4∶1)。優(yōu)選地，新鮮的序列優(yōu)化的NTP混合物在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束時添加，此時序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中所有的核苷酸被消耗。保留的帽類似物與新添加的對應(yīng)的核苷酸例如GTP的比率(例如4∶1)可以被近似地維持，因?yàn)榻咏?00％的帽類似物轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束時保留，這是因?yàn)槊總€RNA分子僅可以并入一個帽類似物。此策略導(dǎo)致相同的加帽效率，增加的產(chǎn)量(＞4.5-倍，取決于RNA序列)和顯著降低的成本。此外，增加的NTP含量防止RNA分子在轉(zhuǎn)錄期間沉淀，如對于標(biāo)準(zhǔn)的NTP濃度常見的(在標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)和序列優(yōu)化的反應(yīng)二者中)。NTP的序列-依賴性并入還允許監(jiān)測體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)展。如實(shí)施例6和圖13中顯示的，可以通過從體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分離未并入的核苷酸和測量260m下的吸光度監(jiān)測體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)展。原因是所有四種NTP的總濃度的減少與合成的RNA的量直接相關(guān)聯(lián)。如果使用具有相同比率的核苷三磷酸的標(biāo)準(zhǔn)的NTP混合物，此途徑將不可能如此直接。260nm下的吸光度的降低可以直接地翻譯為產(chǎn)生的RNA分子，如果從RNA和DNA分離NTP以避免干擾的話——例如通過具有低分子量截留的膜過濾。用于定量核酸和核苷酸的方法是本領(lǐng)域中已知的。用于核酸定量的光譜法包括傳統(tǒng)的吸光度測量(Kolitz等，2013.MethodsEnzymol.530：331-6)以及使用熒光染料比如溴化乙錠和具有合適的激發(fā)波長(例如302或546nm)的熒光計的更敏感的熒光技術(shù)(Gallagher，2011.CurrentProtocolsinMolecularBiology.93：A.3D.1-A.3D.14)。結(jié)果，在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過體外轉(zhuǎn)錄合成所述RNA分子之后分離和定量未并入的NTP。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，所述RNA分子選自非編碼和編碼RNA分子。非編碼RNA(ncRNA)分子是不被翻譯為肽或蛋白質(zhì)的功能性RNA分子。非編碼RNA分子包括高豐度和功能重要的RNA比如轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)，以及RNA比如snoRNA、微小RNA、siRNA、snRNA、exRNA和piRNA，和包括實(shí)例比如Xist和HOTAIR的長ncRNA(Esteller，2011.Nat.Rev.Genet.12(12)：861-74)。另外，非編碼RNA分子包括免疫刺激RNA(isRNA)分子。優(yōu)選地，免疫刺激RNA可以是線性單鏈RNA。甚至更優(yōu)選地，免疫刺激RNA可以是長的線性單鏈非編碼RNA。在此背景下，isRNA在其5′-端處攜帶三磷酸是特別優(yōu)選的。免疫刺激RNA(isRNA)可以包括已知為具有免疫刺激性的任何RNA序列，其包括但不限于代表和/或編碼TLR的配體、RNA的細(xì)胞內(nèi)受體的配體(比如RIG-I、MDA-5或PKR)(Meylan和Tschopp，2006.Mol.Cell22，561-569)的RNA序列、或任何其它免疫刺激RNA序列，所述TLR優(yōu)選地選自人家族成員TLR1至TLR10或鼠家族成員TLR1至TLR13，更優(yōu)選地選自人家族成員TLR1至TLR10，甚至更優(yōu)選地選自TLR7和TLR8。另外，免疫刺激RNA分子可以包括能夠引起先天免疫應(yīng)答的任何其它RNA。不限制于此，這樣的免疫刺激RNA可以包括核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)和病毒RNA(vRNA)。優(yōu)選地，免疫刺激RNA是非編碼RNA。這樣的免疫刺激RNA可以包括1000至5000、500至5000、5至5000、或5至1000、5至500、5至250、5至100、5至50或5至30個核苷酸的長度。根據(jù)進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方式，這樣的免疫刺激RNA分子由式(I)的RNA組成或包括式(I)的RNA：(NuGlXmGnNv)a，(式(I))其中：G是鳥苷(鳥嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)或鳥苷(鳥嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)的類似物，優(yōu)選地鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物；X是鳥苷(鳥嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或這些核苷酸(核苷)的類似物，優(yōu)選地尿苷(尿嘧啶)或其類似物；N是具有大約4至50，優(yōu)選地大約4至40，更優(yōu)選地大約4至30或4至20個核酸的長度的核酸序列，每個N獨(dú)立地選自鳥苷(鳥嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或這些核苷酸(核苷)的類似物；a是1至20，優(yōu)選地1至15，最優(yōu)選地1至10的整數(shù)；l是1至40的整數(shù)，其中當(dāng)1＝1時，G是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物，當(dāng)1＞1時，這些核苷酸(核苷)的至少50％是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物；m是整數(shù)并且至少是3；其中當(dāng)m＝3時，X是尿苷(尿嘧啶)或其類似物，并且當(dāng)m＞3時，出現(xiàn)至少3個連續(xù)的尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的類似物；n是1至40的整數(shù)，其中當(dāng)n＝1時，G是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物，當(dāng)n＞1時，這些核苷酸(核苷)的至少50％是鳥苷(鳥嘌呤)或其類似物；u、v可以相互獨(dú)立地是0至50的整數(shù)，優(yōu)選地，其中當(dāng)u＝0時，v≥1，或當(dāng)v＝0時，u≥1；其中式(I)的核酸分子的長度為至少50個核苷酸，優(yōu)選地至少100個核苷酸，更優(yōu)選地至少150個核苷酸，甚至更優(yōu)選地至少200個核苷酸和最優(yōu)選地至少250個核苷酸。根據(jù)最優(yōu)選的實(shí)施方式，根據(jù)式(I)的RNA分子可以選自例如下列序列：GGGAGAAAGCUCAAGCUUAUCCAAGUAGGCUGGUCACCUGUACAACGUAGCCGGUAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGACCGUCUCAAGGUCCAAGUUAGUCUGCCUAUAAAGGUGCGGAUCCACAGCUGAUGAAAGACUUGUGCGGUACGGUUAAUCUCCCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAGUAAAUGCGUCUACUGAAUCCAGCGAUGAUGCUGGCCCAGAUCUUCGACCACAAGUGCAUAUAGUAGUCAUCGAGGGUCGCCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGCCCAGUUCUGAGACUUCGCUAGAGACUACAGUUACAGCUGCAGUAGUAACCACUGCGGCUAUUGCAGGAAAUCCCGUUCAGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUCCGCUCACUAUGAUUAAGAACCAGGUGGAGUGUCACUGCUCUCGAGGUCUCACGAGAGCGCUCGAUACAGUCCUUGGAAGAAUCUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGUGCGACGAUCACAGAGAACUUCUAUUCAUGCAGGUCUGCUCUAG(R2025；SEQIDNO：4)編碼RNA是可以被翻譯為肽或蛋白質(zhì)的功能性RNA分子。優(yōu)選地，編碼RNA分子包括編碼至少一個肽或蛋白質(zhì)的至少一個開放閱讀框。在此背景下，編碼RNA分子可以包括一個(單順反子的)、兩個(雙順反子的)或更多個(多順反子的)開放閱讀框(ORF)。編碼RNA分子可以是信使RNA(mRNA)分子、病毒RNA分子或自我復(fù)制RNA分子(復(fù)制子)。優(yōu)選地，RNA分子是mRNA。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，所述RNA分子長于100個核苷酸。具有100和15.000個核苷酸、100和12.500個核苷酸、100和10.000個核苷酸、100和7.500個核苷酸、100和5.000個核苷酸、100和2.500個核苷酸、100和1.500個核苷酸或100和1.000個核苷酸之間的長度的RNA是同等優(yōu)選的。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，給定序列的RNA分子的所述合成作為大規(guī)模合成進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“大規(guī)?！敝傅氖谴蠹s毫克數(shù)量，優(yōu)選地至少一克的所述RNA分子的反應(yīng)產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在用于大規(guī)模合成RNA的生物反應(yīng)器中實(shí)施，所述生物反應(yīng)器也稱為轉(zhuǎn)錄反應(yīng)器或RNA反應(yīng)器。因此，生物反應(yīng)器可以適于進(jìn)行上面描述的本發(fā)明的方法。根據(jù)本發(fā)明，用于合成給定序列的RNA分子的這類生物反應(yīng)器——優(yōu)選地以大規(guī)?！悄K化設(shè)計的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)器系統(tǒng)，其包括反應(yīng)模塊——用于在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中實(shí)施體外RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、捕捉模塊——用于暫時地捕捉轉(zhuǎn)錄的RNA分子、和控制模塊——用于控制序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的組分橫向進(jìn)給進(jìn)入反應(yīng)模塊。在此，反應(yīng)模塊包括用于從反應(yīng)混合物分離核苷酸的濾膜，并且控制模塊對序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的組分橫向進(jìn)給的控制基于分離的核苷酸的測量濃度。如本文使用的術(shù)語生物反應(yīng)器或轉(zhuǎn)錄反應(yīng)器指的是室或試管或柱，其中體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在規(guī)定條件下實(shí)施。生物反應(yīng)器可以被熱調(diào)節(jié)以精確地維持特定的溫度，通常在4和40℃之間。生物反應(yīng)器可以配置有流入或進(jìn)料管線和出口。生物反應(yīng)器可以是具備可變的攪拌速率的攪拌杯。根據(jù)本發(fā)明，生物反應(yīng)器包括用于從反應(yīng)混合物分離核苷酸的濾膜，特別地用于從序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物分離核苷酸和其它低分子量組分。在這樣的流動系統(tǒng)中引入濾膜，例如超濾膜，用于將高分子量組分比如例如蛋白質(zhì)和/或多核苷酸與低分子量組分比如核苷酸分離。濾膜用于在反應(yīng)模塊的反應(yīng)器核心中選擇性地保留固定化的DNA模板、RNA聚合酶和合成的RNA分子，而較小的分子比如核苷酸(NTP)可以穿過濾膜進(jìn)入反應(yīng)模塊的單獨(dú)的較小的隔室，即過濾隔室。然后例如通過包含低分子量組分的分離流體中的光譜分析，可以測量核苷酸濃度?？蛇x地，核苷酸濃度可以通過在線HPLC系統(tǒng)測量。在該反應(yīng)器系統(tǒng)中應(yīng)用序列優(yōu)化的NTP混合物允許在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)期間實(shí)時測量核苷酸濃度以監(jiān)測體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)展。合適的濾膜可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種材料組成(vandeMerbel，1999.J.Chromatogr.A856(1-2)：55-82)。例如，膜可以由再生的或改性的纖維素或由合成材料組成。后者包括聚砜(PSU)、聚丙烯腈(PAN)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚芳醚-砜的混合物、聚乙烯吡咯烷酮和聚酰胺(Polyamix.RTM.)。例如，聚砜包括聚醚砜[聚(氧代-1，4-苯磺酰基-1，4-苯基)，縮寫PES]。在一些示例性實(shí)施方式中，針對根據(jù)本公開內(nèi)容的用途，聚醚砜可以被利用為半透膜。在一些情況下，PES膜包括與PSU膜相比增加的親水性(和/或提高的膜利用水的濕潤性)。在一些實(shí)施方式中，例如，PES膜的濕潤性可以通過包含水溶性聚合物聚乙烯吡咯烷酮進(jìn)一步增加。影響分子穿過濾膜的通量的重要參數(shù)是孔徑或孔徑分布。濾膜通常表征為其分子量截留(MWCO)值，即保留大于90％的特定的大小限制，其定義為最小復(fù)合物的分子質(zhì)量。對于每個應(yīng)用，需要選擇適當(dāng)?shù)腗WCO值，以便充分地保留高分子量復(fù)合物，但是同時確保分析物的快速輸送。本發(fā)明的生物反應(yīng)器的濾膜可以具有10至100kDa、10至75kDa、10至50kDa、10至25kDA或10至15kDa的范圍內(nèi)的MWCO。甚至更優(yōu)選地，濾膜具有大約10至50kDa的范圍內(nèi)的MWCO。優(yōu)選地，濾膜選自再生的纖維素、改性的纖維素、聚砜(PSU)、聚丙烯腈(PAN)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)和聚芳醚砜(PAES)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，生物反應(yīng)器包括固定在固相支持體上作為RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的基礎(chǔ)的DNA模板。DNA模板的固定允許重復(fù)使用模板并且減少殘留DNA對RNA產(chǎn)物的污染。此外，固定使得使用DNAse對從最終RNA產(chǎn)物去除DNA模板非必要。DNA模板——其優(yōu)選地固定在反應(yīng)模塊的反應(yīng)核心中的固相支持體上——可以代表化學(xué)合成的DNA分子、分離的DNA限制片段、質(zhì)?；驍U(kuò)增的DNA分子，例如通過擴(kuò)增過程比如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。DNA模板可以是雙鏈體或包括單鏈RNA編碼區(qū)上游的雙鏈啟動子區(qū)的單元。DNA模板可以用配體修飾，以便在DNA鏈的5′端、3′端或內(nèi)部核苷酸處固定至固相支持體。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“固相支持體”涉及能夠?qū)NA分子固定在其表面上的每一種不溶解的支持體。固相支持體可以選自瓊脂糖、改性的瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、聚苯乙烯、乳膠、纖維素、和鐵磁顆?；騺嗚F磁顆粒。用于選擇合適的固相支持體和用于將DNA分子連接至所述固相支持體的方法和策略是本領(lǐng)域中已知的(參見例如Arndt-Jovin等，1975.Eur.J.Biochem.54(2)：411-8；Kerrigan等，2001.CurrentProtocolsinMolecularBiology.24：12.10.1-12.10.18；WO1995/08626)。DNA模板在固相支持體上的固定可以經(jīng)由共價鍵或非共價鍵。優(yōu)選地，DNA模板的固定通過非共價鍵發(fā)生。例如，DNA模板至固相支持體的固定可以通過非共價生物素-鏈親和素相互作用發(fā)生。DNA模板的非編碼鏈可以修飾有5′-末端生物素基團(tuán)，其用于將DNA鏈固定至包括鏈親和素蛋白的固相支持體基體。DNA模板的互補(bǔ)的RNA-編碼鏈可以保持非固定的。通過其它類型的非共價鍵——例如，poly(A)-poly(T)和poly(G)-poly(C)相互作用——將DNA模板固定至固相支持體也是可能的。同等優(yōu)選地，DNA模板的固定通過共價鍵發(fā)生，例如，酯鍵或其衍生物。一般而言，在連接前，固相支持體可以包含活性基團(tuán)比如NHS、碳二亞胺等以使得與DNA分子的連接反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)。DNA分子可以通過直接連接(例如使用官能團(tuán)比如氨基-、巰基-、羧基-、羥基-、醛-、和酮基團(tuán))被連接至固相支持體。與固相支持體材料的鍵可以包含間隔區(qū)以優(yōu)化DNA模板與支持體的空間分離?？梢酝ㄟ^在DNA模板的5′端處插入額外的核苷酸提供間隔區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，生物反應(yīng)器的捕捉模塊包括樹脂/固相以捕捉轉(zhuǎn)錄的RNA分子和將轉(zhuǎn)錄的RNA分子與序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物的其它可溶性組分分離。優(yōu)選地，捕捉模塊包括用于純化捕捉的轉(zhuǎn)錄的RNA分子——例如通過洗滌過程等——的工具。進(jìn)一步優(yōu)選地，捕捉模塊包括用于洗脫捕捉的轉(zhuǎn)錄的RNA分子——優(yōu)選地借助洗脫緩沖液——的工具。根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，生物反應(yīng)器進(jìn)一步包括回流模塊，用于在捕捉轉(zhuǎn)錄的RNA分子后將殘留的過濾的序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物——即除轉(zhuǎn)錄的RNA分子之外的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物的其它可溶性組分——從捕捉模塊返回至反應(yīng)模塊，優(yōu)選地，其中用于返回殘留的過濾的序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的工具是泵。在此，回流模塊優(yōu)選地包括固定化酶比如焦磷酸酶或樹脂以捕捉破壞性(disruptive)組分，比如磷酸鹽。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器包括至少一個離子選擇性電極。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語‘離子選擇性電極’涉及將溶解于溶液的特定離子的活性轉(zhuǎn)換為電勢的換能器(例如傳感器)，其中例如通過使用電壓計或pH計可以測量電勢。具體而言，如本文使用的術(shù)語‘離子選擇性電極’包括系統(tǒng)，其包括具有選擇通透性的膜或由具有選擇通透性的膜組成，其中膜通常分隔兩種電解質(zhì)。如本文使用的離子選擇性電極通常包括感測部分，其優(yōu)選地包括具有選擇通透性的膜和參比電極。膜通常是離子選擇性膜，其表征為對不同類型離子的不同通透性。優(yōu)選地，生物反應(yīng)器的至少一個離子選擇性電極包括選自玻璃膜、固態(tài)膜、基于液體的膜和復(fù)合膜的膜。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的生物反應(yīng)器包括至少一個離子選擇性電極，其中至少一個離子選擇性電極包括含有膜的系統(tǒng)或由含有膜的系統(tǒng)組成，優(yōu)選地如本文描述的膜，更優(yōu)選地電化學(xué)膜，其對不同類型的離子具有不同的通透性，其中膜，優(yōu)選地如本文描述的膜，更優(yōu)選地電化學(xué)膜，優(yōu)選地分隔兩種電解質(zhì)。在一個實(shí)施方式中，膜包括固體電解質(zhì)層或不與水混溶的溶劑中的電解質(zhì)溶液或由固體電解質(zhì)層或不與水混溶的溶劑中的電解質(zhì)溶液組成。膜優(yōu)選地在一側(cè)或兩側(cè)與電解質(zhì)溶液接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，離子選擇性電極包括內(nèi)部參比電極。在一些實(shí)施方式中，例如，這樣的內(nèi)部參比電極可以被替換為金屬接觸物或被替換為絕緣體和半導(dǎo)體層。離子選擇性電極允許不同介質(zhì)中離子活性或離子濃度的高靈敏度的、快速的、準(zhǔn)確的和非破壞性的測量。除直接測量離子活性或離子濃度之外，其還可以用來——具體地通過使用校正曲線——連續(xù)地監(jiān)測濃度變化，作為控制試劑的劑量的元件或作為電位滴定中非常準(zhǔn)確的指示電極。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器包括至少一個離子選擇性電極，優(yōu)選地如本文描述的，用于測量生物反應(yīng)器的至少一個隔室中一種或多種類型的離子的濃度。例如，至少一個離子選擇性電極可以用于測量生物反應(yīng)器的反應(yīng)模塊、控制模塊或回流模塊中一種或多種類型的離子的濃度。優(yōu)選地，至少一個離子選擇性電極被用于測量反應(yīng)模塊，更優(yōu)選地反應(yīng)核心或過濾隔室中一種或多種類型的離子的濃度。另外，至少一個離子選擇性電極可以包括在生物反應(yīng)器的傳感器單元中，優(yōu)選地如本文描述的。離子選擇性電極可以位于生物反應(yīng)器自身中、生物反應(yīng)器上或生物反應(yīng)器外(例如通過旁路連接至生物反應(yīng)器)。在本發(fā)明的背景下，短語‘生物反應(yīng)器包括至少一個離子選擇性電極’因而可以指的是一種情況，其中至少一個離子選擇性電極是生物反應(yīng)器的一部分，或另一種情況，其中至少一個離子選擇性電極是關(guān)于生物反應(yīng)器獨(dú)立的物理實(shí)體，但是其與生物反應(yīng)器關(guān)聯(lián)使用。根據(jù)一些實(shí)施方式，生物反應(yīng)器包括至少一個離子選擇性電極，優(yōu)選地如本文描述的，用于測量包含在生物反應(yīng)器的至少一個隔室中的液體中的一種或多種類型的離子的濃度，其中離子優(yōu)選地選自H+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-和PO43-。根據(jù)一些實(shí)施方式，生物反應(yīng)器包括至少一個離子選擇性電極，優(yōu)選地如本文描述的，其被連接至電勢計，優(yōu)選地多通道電勢計(例如，6通道、高分辨率CITSensIon電勢計；C-CITSensorsAG，瑞士)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器包括至少一個離子選擇性電極，其中至少一個離子選擇性電極優(yōu)選地是管形電極(tubeelectrode)，更優(yōu)選地選自Mg2+選擇性管形電極、Na+選擇性管形電極、Cl-選擇性管形電極、PO43-選擇性管形電極、pH-選擇性管形電極和Ca2+選擇性管形電極，其優(yōu)選地與電勢計關(guān)聯(lián)使用。甚至更優(yōu)選地，生物反應(yīng)器包括至少一個離子選擇性電極，其中至少一個離子選擇性電極優(yōu)選地選自CITSensIonMg2+選擇性微管形電極、CITSensIonNa+選擇性微管形電極、CITSensIonCl-選擇性微管形電極、CITSensIonPO43-選擇性微管形電極、CITSensIonpH-選擇性微管形電極和CITSensIonCa2+選擇性微管形電極(均來自C-CITSensorsAG，瑞士)，優(yōu)選地與電勢計關(guān)聯(lián)使用，更優(yōu)選地與多通道電勢計，比如6通道、高分辨率CITSensIon電勢計(C-CITSensorsAG，瑞士)關(guān)聯(lián)使用。離子選擇性電極具有用于實(shí)際用途的眾多優(yōu)勢。例如，它們不影響測試溶液，因而允許非破壞性測量。另外，離子選擇性電極是可移動的，適于直接測定以及滴定傳感器，并且是成本有效的。在生物反應(yīng)器(例如轉(zhuǎn)錄反應(yīng)器)中使用離子選擇性電極的主要優(yōu)勢是原位測量——不需要樣品收集——和以非破壞性方式測量的可能性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，生物反應(yīng)器或更準(zhǔn)確地生物反應(yīng)器的控制模塊包括用于分析序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物中的關(guān)鍵工藝參數(shù)——比如pH值、傳導(dǎo)性和核苷酸濃度——的傳感器單元。優(yōu)選地，生物反應(yīng)器的傳感器單元包括傳感器，比如UV260/280nm的UV流動池，用于在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)期間實(shí)時測量核苷酸濃度。優(yōu)選地，傳感器單元的傳感器通過光度分析測量作為工藝參數(shù)的核苷酸濃度。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，生物反應(yīng)器包括控制模塊。通過控制模塊的數(shù)據(jù)收集和分析允許控制集成的泵系統(tǒng)(致動器)，用于反復(fù)供給序列優(yōu)化的NTP混合物的組分或序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的組分，例如緩沖液組分、RNA聚合酶或核苷酸。嚴(yán)格控制和調(diào)節(jié)允許在導(dǎo)致高產(chǎn)物產(chǎn)量的最佳穩(wěn)態(tài)條件下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。優(yōu)選地，控制模塊控制序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物至序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的添加，優(yōu)選地，其中所述生物反應(yīng)器包括用于將序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物添加至序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的致動器。進(jìn)一步，致動器還可以添加序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物的其它反應(yīng)組分——比如緩沖液組分或Mg++——至體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，生物反應(yīng)器以半分批(semi-batch)模式或以連續(xù)模式操作。如本文使用的術(shù)語半分批指的是體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作為重復(fù)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系列。例如，反應(yīng)允許進(jìn)行有限的時間，在該時間點(diǎn)處移出產(chǎn)物，添加新反應(yīng)物，并且重復(fù)整個反應(yīng)。如本文使用的術(shù)語連續(xù)流動指的是在生物反應(yīng)器核心中連續(xù)地實(shí)施的反應(yīng)，其中補(bǔ)充的反應(yīng)物通過輸入進(jìn)料管線恒定地添加并且產(chǎn)物通過出口恒定地移出。連續(xù)流動反應(yīng)器通過受控的裝置流速控制試劑遞送和產(chǎn)物移出，這對具有試劑限制和抑制產(chǎn)物的反應(yīng)是有利的。在另一個方面，本發(fā)明涉及通過如本文公開的本發(fā)明的方法可獲得的RNA分子。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法獲得的RNA表征為與通過現(xiàn)有技術(shù)方法獲得的RNA相比，具體地如與通過體外轉(zhuǎn)錄方法——其中NTP混合物未關(guān)于轉(zhuǎn)錄序列優(yōu)化——比如使用標(biāo)準(zhǔn)的等摩爾NTP混合物的方法獲得的RNA相比減小的免疫刺激活性。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明還涉及針對給定序列的RNA分子優(yōu)化的序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物用于合成所述RNA分子的用途。在上面關(guān)于本發(fā)明的方法做出的與序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物相關(guān)的所有定義和具體實(shí)施方式也適用于本發(fā)明的所述用途。尤其地，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，序列優(yōu)化的NTP混合物已經(jīng)通過包括以下步驟的方法優(yōu)化：a)測定四種核苷酸G、A、C和U中的每種在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)，和b)制備包括四種核糖核苷三磷酸(NTP)GTP、ATP、CTP和UTP的序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物，其中四種核糖核苷三磷酸中的每種在序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物中的分?jǐn)?shù)(2)對應(yīng)于各種核苷酸在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明還涉及用于合成給定序列的RNA分子的序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物，其包括四種核苷三磷酸GTP、ATP、CTP和UTP，其中四種核苷三磷酸中的每種在序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物中的分?jǐn)?shù)(2)對應(yīng)于各種核苷酸在所述RNA分子中的分?jǐn)?shù)(1)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明還涉及試劑盒，其包括如上面限定的針對給定序列的RNA分子優(yōu)化的序列優(yōu)化的核糖核苷三磷酸(NTP)混合物。序列優(yōu)化的NTP混合物可以提供在包含四種類型的NTP(GTP、ATP、CTP和UTP)的一個管中或每種NTP在單獨(dú)的管中。在上面關(guān)于本發(fā)明的方法做出的所有定義或具體實(shí)施方式也適用于本發(fā)明的所述試劑盒。附圖說明下列顯示的圖僅是說明性的并且應(yīng)當(dāng)以進(jìn)一步的方式描述本發(fā)明。這些圖不應(yīng)當(dāng)解釋為將本發(fā)明限制于此。圖1：編碼智人(Homosapiens)前列腺干細(xì)胞抗原(HsPSCA)的R1871的G/C優(yōu)化的mRNA序列，其對應(yīng)于SEQIDNO：1。圖2：編碼螢火蟲(Photinuspyralis)熒光素酶(PpLuc)的R2988的G/C優(yōu)化的mRNA序列，其對應(yīng)于SEQIDNO：2。圖3：編碼智人Mucin-1(黏蛋白-1)信號肽/表皮生長因子受體/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1)的R1626的G/C優(yōu)化的mRNA序列，其對應(yīng)于SEQIDNO：3。圖4：R2025的非編碼免疫刺激RNA序列，其對應(yīng)于SEQIDNO：4。圖5：編碼HsPSCA(R1871)和EGFR/Mucin-1(R1626)的mRNA隨時間的RNA產(chǎn)量。mRNA通過如實(shí)施例1中顯示的體外轉(zhuǎn)錄合成。(A)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的RNA產(chǎn)量在大約30分鐘后達(dá)到大約1.4mg/mlRNA(對于編碼EGFR/Mucin-1(R1626)的5337個核苷酸長的RNA)和大約1.8mg/mlRNA(對于編碼HsPSCA(R1871)的589個核苷酸長的RNA)的平臺。(B)序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的RNA產(chǎn)量與標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相比顯著地更高。在60分鐘(R1626)和120分鐘(R1871)后，兩種RNA均達(dá)到大約3.9mg/mlRNA的類似的平臺。顯示一式三份的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖6：對于編碼HsPSCA(R1871)、熒光素酶(PpLuc，R2988)和EGFR/Mucin-1(R1626)的mRNA，使用標(biāo)準(zhǔn)的和序列優(yōu)化的核苷酸(CapNTP)混合物獲得的RNA產(chǎn)量的比較。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例1中描述的進(jìn)行(反應(yīng)時間5小時)。不同長度的三種不同的RNA分子的RNA產(chǎn)量對于每種類型的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是粗略地相同的。然而，取決于用于體外轉(zhuǎn)錄的核苷酸混合物獲得不同的產(chǎn)量。標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄(每種NTP相等的NTP濃度)產(chǎn)生大約1.5mg/mlRNA，利用兩倍濃縮的Cap-NTP混合物(2×CapNTP)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大約3.0mg/mlRNA，序列優(yōu)化的(seq-opt)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大約3.9mg/mlRNA并且具有NTP進(jìn)料的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大約6.75mg/mlRNA。顯示一式三份的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖7：通過螢火蟲熒光素酶(PpLuc)mRNA的標(biāo)準(zhǔn)的和序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄取得的加帽效率的分析。利用如實(shí)施例2中描述的錘頭核酶HHNUH2d裂解RNA并且通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(dPAGE)分離得到的RNA片段。非加帽的(沒有帽)和酶促加帽的(E-cap)RNA充當(dāng)對照。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)的和序列優(yōu)化的NTP混合物用于合成編碼螢火蟲熒光素酶(PpLuc)的mRNA時，取得可比較的加帽效率。圖8：對于Mucin-1信號肽/表皮生長因子受體/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1)mRNA(R1626)和前列腺干細(xì)胞抗原(HsPSCA)mRNA(R1871)在序列優(yōu)化的CapNTP混合物中使用UTP和假-UTP的RNA產(chǎn)量的比較。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例3中描述的進(jìn)行。在混合物中，UTP替換為如指示的0％、10％或100％假-UTP(psU)。顯示一式三份的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖9：在存在額外的核苷酸(13.45mM總NTP濃度；對于相等的混合物(相對于GTP4倍過量)13.45mM帽或GTP；對于序列優(yōu)化的NTP混合物(相對于GTP4倍過量)11.2mM帽或GTP)的情況下使用標(biāo)準(zhǔn)的(相等的)和序列優(yōu)化的(seqopt)NTP混合物的非編碼的免疫刺激RNAR2025的理論和實(shí)際RNA產(chǎn)量的比較。白條：實(shí)際產(chǎn)量。黑條：理論產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例4中描述的進(jìn)行。顯示一式三份的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖10：在存在額外的核苷酸(13.45mM總NTP濃度；對于相等的混合物(相對于GTP4倍過量)13.45mM帽或GTP；對于序列優(yōu)化的NTP混合物(相對于GTP4倍過量)13.7mM帽或GTP)的情況下使用標(biāo)準(zhǔn)的(相等的)和序列優(yōu)化的NTP比率的編碼智人前列腺干細(xì)胞抗原(HsPSCA)(R1871)的mRNA的理論和實(shí)際RNA產(chǎn)量的比較。白條：實(shí)際產(chǎn)量。黑條：理論產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例4中描述的進(jìn)行。圖11：在存在各自添加的鹽(NaCl；Tris/HCl，pH7.5)的情況下使用Na-NTP或Tris-NTP的序列優(yōu)化的NTP混合物的轉(zhuǎn)錄效率。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例5中描述的進(jìn)行。圖12：通過測量產(chǎn)生的RNA的量和核苷酸混合物的消耗監(jiān)測序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例6中描述的進(jìn)行。圖13：取決于帽濃度的編碼螢火蟲熒光素酶(PpLuc)(R2988)的mRNA的RNA產(chǎn)量。在存在不同濃度的帽類似物的情況下，通過使用4mM和13.45mM的總NTP濃度的PpLuc序列優(yōu)化的NTP混合物的體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例7中描述的進(jìn)行。(A)實(shí)際RNA[mg/ml]。(B)相對RNA產(chǎn)量[％]。圖14：取決于帽濃度的編碼智人前列腺干細(xì)胞抗原(HsPSCA)(R1871)的mRNA的RNA產(chǎn)量。在存在不同濃度的帽類似物的情況下，通過使用2mM、4mM和13.45mM的總NTP濃度的HsPSCA序列優(yōu)化的NTP混合物的體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例7中描述的進(jìn)行。(A)實(shí)際RNA產(chǎn)量[mg/ml]。(B)相對RNA產(chǎn)量[％]。圖15：取決于GTP起始核苷酸濃度的編碼智人前列腺干細(xì)胞抗原(HsPSCA)(R1871)的mRNA的RNA產(chǎn)量。通過使用13.45mM的總NTP濃度的HsPSCA序列優(yōu)化的NTP混合物——向其添加高至20mM濃度的GTP起始核苷酸——體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例8中描述的進(jìn)行。(A)實(shí)際RNA產(chǎn)量[mg/ml]。(B)相對RNA產(chǎn)量[％]。圖16：取決于GTP起始核苷酸濃度的編碼螢火蟲熒光素酶(PpLuc)(R2988)的mRNA的RNA產(chǎn)量。通過使用13.45mM的總NTP濃度的PpLuc序列優(yōu)化的NTP混合物——向其添加高至20mM濃度的GTP起始核苷酸——體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例8中描述的進(jìn)行。(A)實(shí)際RNA產(chǎn)量[mg/ml]。(B)相對RNA產(chǎn)量[％]。圖17：取決于GTP起始核苷酸濃度的編碼EGFR/Mucin-1(R1626)的mRNA的RNA產(chǎn)量。通過使用13.45mM的總NTP濃度的EGFR/Mucin-1序列優(yōu)化的NTP混合物——向其添加高至20mM濃度的GTP起始核苷酸——體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例8中描述的進(jìn)行。(A)實(shí)際RNA產(chǎn)量[mg/ml]。(B)相對RNA產(chǎn)量[％]。圖18：示意圖示的生物反應(yīng)器，其包括用于連續(xù)或半分批工藝的模塊，具有樹脂-固定化的線性DNA作為轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。圖19：與標(biāo)準(zhǔn)的等摩爾NTP混合物相比，利用序列優(yōu)化的NTP混合物合成的RNA的減小的免疫刺激。如實(shí)施例10中描述的測量細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子和趨化因子水平。圖20：編碼來自甲型H1N1流感(荷蘭2009)的HA的G/C優(yōu)化的mRNA序列，其對應(yīng)于SEQIDNO：6(實(shí)施例11)。圖21：編碼HA的mRNA隨時間的RNA產(chǎn)量(實(shí)施例11)。對于分別通過在生物反應(yīng)器中使用標(biāo)準(zhǔn)NTP混合物的體外轉(zhuǎn)錄(TS(1))、通過在生物反應(yīng)器中沒有進(jìn)料的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄(TS(2))、通過在生物反應(yīng)器中具有進(jìn)料的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄(TS(3))、或通過在生物反應(yīng)器中具有減小的T7RNA聚合酶濃度和減小的模板濃度的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄(TS(4))獲得的RNA，顯示不同時間點(diǎn)處的RNA產(chǎn)量。圖22：如通過使用流式細(xì)胞分析測定的HA蛋白的表面表達(dá)(實(shí)施例11)。對于轉(zhuǎn)染有分別通過在生物反應(yīng)器中使用標(biāo)準(zhǔn)NTP混合物的體外轉(zhuǎn)錄(TS(1))、通過在生物反應(yīng)器中沒有進(jìn)料的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄(TS(2))、通過在生物反應(yīng)器中具有進(jìn)料的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄(TS(3))、或通過在生物反應(yīng)器中具有減小的T7RNA聚合酶濃度和減小的模板濃度的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄(TS(4))獲得的RNA的細(xì)胞，測定熒光強(qiáng)度的幾何平均值(GMFI)。圖23：分別通過在生物反應(yīng)器中使用標(biāo)準(zhǔn)NTP混合物的體外轉(zhuǎn)錄(TS(1))、通過在生物反應(yīng)器中沒有進(jìn)料的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄(TS(2))、通過在生物反應(yīng)器中具有進(jìn)料的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄(TS(3))、或通過在生物反應(yīng)器中具有減小的T7RNA聚合酶濃度和減小的模板濃度的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄(TS(4))合成的RNA的免疫刺激。如實(shí)施例11中描述的測量細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子和趨化因子水平。實(shí)施例下列顯示的實(shí)施例僅是說明性的并且應(yīng)當(dāng)以進(jìn)一步的方式描述本發(fā)明。這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)解釋為將本發(fā)明限制于此。實(shí)施例1：mRNA的制備1.DNA和mRNA構(gòu)建體的制備對于本實(shí)施例，制備編碼智人前列腺干細(xì)胞抗原(HsPSCA)mRNA(R1871)、螢火蟲熒光素酶(PpLuc)mRNA(R2988)和Mucin-1信號肽/表皮生長因子受體/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1)(R1626)的DNA序列并且用于隨后的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)第一制備，構(gòu)建用于體外轉(zhuǎn)錄的載體，其包含T7啟動子，接著是編碼上述蛋白質(zhì)的序列。該構(gòu)建體通過修飾野生型編碼基因制備，所述修飾通過引入用于穩(wěn)定的GC-優(yōu)化的序列，接著源自α-珠蛋白-3’-UTR(muag(突變的α-珠蛋白-3’-UTR))的穩(wěn)定序列、64個腺苷的一段序列(聚-A-序列)、30個胞嘧啶的一段序列(聚-C-序列)和組蛋白莖環(huán)。此外，構(gòu)建用于體外轉(zhuǎn)錄的載體，其包含T7啟動子，接著是編碼免疫刺激RNA(R2025)的序列，其不編碼蛋白質(zhì)。RNA構(gòu)建體和其核苷酸組成分別列在表1和表2中。表1：RNA描述標(biāo)識符(R數(shù)字)序列SEQIDNo.HsPSCAmRNAR1871圖11PpLucmRNAR2988圖22EGFR/Mucin-1mRNAR1626圖33非編碼RNAR2025圖44表2：RNA的核苷酸組成2.體外轉(zhuǎn)錄使用T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄根據(jù)第1段制備的各自的DNA質(zhì)粒。隨后使用(CureVac，Tübingen，德國；WO2008/077592A1)純化mRNA。標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積是20ul。對于隨后的mRNA的HPLC純化，例如用于帽分析，建立1ml的反應(yīng)。線性化DNA質(zhì)粒模板(50μg/ml)在80mMHEPES/KOH，pH7.5、24mMMgCl2、2mM亞精胺、40mMDTT、5U/ml焦磷酸酶(ThermoFisherScientific)、200U/mlRibolockRNase抑制劑(ThermoFisherScientific)、5000U/mlT7RNA聚合酶(ThermoFisherScientific)中在37℃下轉(zhuǎn)錄三小時(或根據(jù)指示的)。分別根據(jù)下面的部分3至7添加核糖核苷三磷酸(NTP)。在轉(zhuǎn)錄之后，通過DNaseI消化(Roche)(100U/ml，1mMCaCl2，37℃下30分鐘)去除DNA模板。RNA在-20℃下在3.45倍反應(yīng)體積中的2.86MLiCl中沉淀16小時，接著離心(30分鐘，16.000g，4℃)。沉淀物在五個轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積的75％乙醇中洗滌(顛倒管，離心5分鐘，16.000g，4℃)，干燥并且在2.5個轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積的H2O中再溶解。使用分光光度計經(jīng)由260nm下的吸光度測量測定RNA產(chǎn)量。260nm下的一個吸光度單位對應(yīng)于40ng/μl的RNA(1A260＝40ng/μlRNA)。為了測定并入的核苷酸的數(shù)目，產(chǎn)生的RNA的總量被轉(zhuǎn)換為通過除以分子質(zhì)量產(chǎn)生的分子數(shù)目。乘以序列中存在的各種核苷酸的數(shù)目得到并入的核苷酸。為了測定轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束時保留的核苷酸(in％)，根據(jù)以下方程式，將該數(shù)目除以可獲得的核苷酸的數(shù)目：方程式(1)：RNA產(chǎn)量指示每個反應(yīng)產(chǎn)生的分子的數(shù)目(nmol)。NTP起始濃度[NTP(起始)]以mM指示，反應(yīng)體積以μl指示。為了計算各種核苷酸的保留濃度，根據(jù)以下方程式，將反應(yīng)開始時可獲得的NTP乘以轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束時保留的NTP的百分比(參見上面)：方程式(2)：3.帽類似物存在的情況下的標(biāo)準(zhǔn)體外轉(zhuǎn)錄對于使用帽類似物生產(chǎn)5′-加帽的RNA，利用5.8mMm7G(5′)ppp(5′)G帽類似物、4mMATP、4mMCTP、4mMUTP和1.45mMGTP(均是ThermoFisherScientific的)(參見表3)實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄。帽類似物和GTP以4∶1的比率使用。表3：標(biāo)準(zhǔn)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的核苷酸濃度(mM)RNACAPGCAUHsPSCA5.81.45444PpLuc5.81.45444EGFR/Mucin-15.81.45444表4：標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束時保留的核苷酸的量(2.5小時后，以反應(yīng)開始時核苷酸的百分?jǐn)?shù)計)表5：標(biāo)準(zhǔn)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束時(2.5小時后)保留的核苷酸濃度(mM)RNACAPGCAUHsPSCA5，790，252，362，773，36PpLuc5，800，242，723，093，43EGFR/Mucin-15，800，242，543，193，51標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄中RNA轉(zhuǎn)錄物的典型產(chǎn)量是大約1.5mg/ml反應(yīng)。4.使用雙倍濃度的帽類似物和NTP(2×CapNTP)的帽類似物存在的情況下的體外轉(zhuǎn)錄帽類似物和NTP濃度與標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄條件相比加倍，使得反應(yīng)在11.6mMm7G(5′)PPP(5′)G帽類似物、8mMATP、8mMCTP、8mMUTP和2.9mMGTP(均是ThermoFisherScientific的)(參見表3)中實(shí)施。帽類似物和GTP以4∶1的比率使用。表6：2×CapNTP體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的核苷酸濃度(mM)RNACAPGCAUHsPSCA11.62.9888PpLuc11.62.9888EGFR/Mucin-111.62.9888表7：2×CapNTP轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束時保留的核苷酸的量(2.5小時后，以反應(yīng)開始時核苷酸的百分?jǐn)?shù)計)RNACAPGCAUHsPSCA99，8723，4562，0871，5185，20PpLuc99，9617，9368，5377，7086，09EGFR/Mucin-199，9920，1565，0780，7288，39使用雙倍濃度的帽類似物和NTP的轉(zhuǎn)錄的典型產(chǎn)量是大約3mg/ml反應(yīng)。5.帽類似物存在的情況下的序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄對于序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，根據(jù)序列的核苷酸組成(表2)計算每個單獨(dú)的序列的核糖核苷三磷酸(NTP)的濃度，使得所有NTP的總濃度是13.45mM，如在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的。帽類似物的濃度比GTP的計算濃度高四倍，使得獲得4∶1的帽/GTP比率。表8：序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄的核苷酸濃度(mM)RNACAPGCAUHsPSCA13.63.44.73.51.8PpLuc16.44.14.33.11.9EGFR/Mucin-116.44.15.02.71.7表9：序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄結(jié)束時保留的核苷酸的量(2.5小時后，以反應(yīng)開始時核苷酸的百分?jǐn)?shù)計)RNACAPGCAUHsPSCA99，8614，8314，7114，5714，83PpLuc99，9614，6214，7214，7614，85EGFR/Mucin-199，9914，6014，8214，5115，04表10：序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束時(2.5小時后)保留的核苷酸濃度(mM)RNACAPGCAUHsPSCA13，580，510，690，510，27PpLuc16，390，600，640，450，29EGFR/Mucin-116，400，600，740，400，25使用序列優(yōu)化的帽類似物和NTP的轉(zhuǎn)錄的典型RNA產(chǎn)量是大約3.9mg/ml反應(yīng)。6.具有NTP進(jìn)料的帽類似物存在的情況下的序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄對于序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，根據(jù)序列的核苷酸組成(表2)計算每個單獨(dú)的序列的核糖核苷三磷酸(NTP)的濃度，使得所有NTP的總濃度是13.45mM，如在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的。帽類似物的濃度比GTP的計算濃度高四倍，使得獲得4∶1的帽/GTP比率(參見表7)。對于NTP進(jìn)料，不具有帽類似物的13.45mMNTP在2.5小時后添加(以2.69μl的體積)至反應(yīng)混合物。因?yàn)樵诖藭r間點(diǎn)處，＞99％的帽類似物仍存在于轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，可以保留4∶1的帽/GTP比率。表11：具有NTP進(jìn)料的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄結(jié)束時保留的核苷酸的量(5小時后，以反應(yīng)開始時核苷酸的百分?jǐn)?shù)計)RNACAPGCAUHsPSCA99，7526，326，226，126，3PpLuc99，9426，126，226，226，3EGFR/Mucin-199，9826，126，326，026，5使用序列優(yōu)化的帽類似物和NTP接著NTP進(jìn)料的轉(zhuǎn)錄的典型RNA產(chǎn)量是大約6.75mg/ml反應(yīng)。7.非加帽的RNA的標(biāo)準(zhǔn)體外轉(zhuǎn)錄對于非加帽的5′三磷酸RNA的生產(chǎn)，轉(zhuǎn)錄在存在4mM的每種ATP、GTP、CTP和UTP(均是ThermoFisherScientific的)的情況下實(shí)施。非加帽的RNA被用作加帽分析試驗(yàn)中的對照(圖7)。8.mRNA的酶促加帽根據(jù)制造商的說明使用ScriptCapTMm7G加帽系統(tǒng)(Cellscript，Madison，WI，USA)進(jìn)行酶促加帽。簡言之，每個反應(yīng)，60μg的非加帽的RNA在68.5μl的體積中熱變性(10分鐘，65℃)并且在冰上立即冷卻(5分鐘)。在添加反應(yīng)組分(1×ScriptCap加帽緩沖液、1mMGTP、0.1mMSAM、1000U/mlScripGuardRNase抑制劑、400U/mlScriptCap加帽酶)至100μl的最終體積之后，反應(yīng)在37℃下培育1小時。RNA在-20℃下在3.45倍反應(yīng)體積中的2.86MLiCl中沉淀16小時，接著離心(30分鐘，16.000g，4℃)。沉淀物在0.5倍反應(yīng)體積的75％乙醇中洗滌(顛倒，離心5分鐘，16.000g，4℃)，干燥并且在H2O中再溶解。酶促加帽的RNA被用作加帽分析試驗(yàn)中的對照(圖7)。9.結(jié)果如上面描述的，在限定的時間點(diǎn)處測定標(biāo)準(zhǔn)的和序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的RNA產(chǎn)量持續(xù)多至兩小時(第2段)。如圖5A可見，標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的RNA產(chǎn)量在大約30分鐘后達(dá)到大約1.4mg/mlRNA(對于編碼EGFR/Mucin-1(R1626)的5337個核苷酸長的RNA)和大約1.8mg/mlRNA(對于編碼HsPSCA(R1871)的589個核苷酸長的RNA)的平臺。如圖5B可見，序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的RNA產(chǎn)量與標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相比顯著地更高。分別在60分鐘(R1626)和120分鐘(R1626)后，兩種RNA均達(dá)到大約3.9mg/mlRNA的類似的平臺。如圖6可見，在五小時后，不同長度的三種不同的RNA分子的RNA產(chǎn)量對于每種類型的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是粗略地相同的。標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄(相等的NTP濃度)產(chǎn)生大約1.5mg/mlRNA，利用兩倍濃縮的Cap-NTP混合物(2×CapNTP)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大約3.0mg/mlRNA，序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大約3.9mg/mlRNA并且具有NTP進(jìn)料的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大約6.75mg/mlRNA。因而，與標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相比，序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)導(dǎo)致RNA產(chǎn)量的大約三倍的增加。通過為反應(yīng)補(bǔ)充NTP(NTP進(jìn)料)，此產(chǎn)量可以進(jìn)一步增加大約兩倍。實(shí)施例2：CAP分析試驗(yàn)1.試驗(yàn)的原理錘頭核酶HHNUH2d(5’-GCAUGGCUGAUGAGGCCUCGACCGAUAGGUCGAGGCCGAAAAGCUUUCUCCC-3’)(SEQIDNO：5)與實(shí)施例1的體外轉(zhuǎn)錄的RNA一起培育并且通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(dPAGE)分離裂解產(chǎn)物。2.核酶裂解反應(yīng)每個反應(yīng)，10pmol的HHNUH2d和10pmol的各自生成4種RNA在6μl的總體積中的0.625mMEDTA中退火(95℃下2分鐘，0.1℃/秒至25℃，25℃下10分鐘)。在添加4μl的100mMMgCl2、125mMTris/HCl，pH7.5(最終濃度40mMMgCl2，50mMTris/HCl)后，反應(yīng)在25℃下培育一小時。對于經(jīng)由PAGE的分析，利用30μl95％甲酰胺、20mMEDTA終止1×反應(yīng)。3.裂解產(chǎn)物的凝膠分離、定量和加帽程度的計算終止的反應(yīng)被熱變性(加熱至80℃持續(xù)2分鐘，立即放置在冰上持續(xù)5分鐘)并且在10cm×8cm×1.0mm20％變性聚丙烯酰胺凝膠(8M脲(AppliChem)，20％丙烯酰胺：雙丙烯酰胺19∶1(AppliChem)，1×TBE，1％APS(AppliChem)，0.1％TEMED(AppliChem)；180V，2小時，TetraCell(BioRad))上分離。凝膠在TBE中的1∶10,000SYBRGold(Invitrogen)中染色10分鐘并且在具有312nm-UV透照儀(Peqlab)(SYBRGold的最大激發(fā)：～300nm，發(fā)射：～537nm)的E-BOXVX2凝膠成像系統(tǒng)上成像。為了測定mRNA制劑中加帽的比例，使用QuantityOne1-D分析軟件(BioRad)定量各自的13-mer(源自非加帽的部分)或14-mer(源自加帽的部分)裂解產(chǎn)物的條帶。根據(jù)以下方程式分別計算加帽的和非加帽的RNA的程度：方程式(4)：方程式(5)：4.結(jié)果如圖7中可見，對于用于螢火蟲熒光素酶(PpLuc)mRNA的標(biāo)準(zhǔn)的和序列優(yōu)化的NTP混合物，取得可比較的加帽效率。實(shí)施例3：在序列優(yōu)化的核苷酸混合物中使用UTP和假-UTP的RNA產(chǎn)量的比較可以通過將四種核苷酸ATP、GTP、CTP和UTP中的一種或多種用核苷酸類似物替換來進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這樣的修飾的NTP的實(shí)例是假尿苷(psU或Ψ)三磷酸和5-甲基胞苷(5mC)三磷酸。修飾的核苷酸在混合物中的百分比可以從其替換的天然核苷酸的0％至100％變化。為了測試是否可能在序列優(yōu)化的核苷酸混合物中使用修飾的核苷酸比如假尿苷(psU)三磷酸，UTP被10％和100％的假尿苷三磷酸替換。在對照反應(yīng)中，使用100％的UTP。帽類似物存在的情況下的序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄對于序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，根據(jù)序列的核苷酸組成(表2)計算每個單獨(dú)的序列的核糖核苷三磷酸(NTP)的濃度，使得所有NTP的總濃度是13.45mM，如在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的。帽類似物的濃度比GTP的計算濃度高四倍，使得獲得4∶1的帽/GTP比率。結(jié)果如圖8中可見，在具有帽類似物的序列優(yōu)化的核苷酸混合物(CapNTP混合物)中使用UTP和假-UTP導(dǎo)致獨(dú)立于序列優(yōu)化的核苷酸混合物中的假-UTP百分比的可比較的RNA產(chǎn)量。這分別針對編碼Mucin-1信號肽/表皮生長因子受體/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1)(R1626)和前列腺干細(xì)胞抗原(HsPSCA)mRNA(R1871)的兩種不同的mRNA進(jìn)行了證明。實(shí)施例4：使用標(biāo)準(zhǔn)的和序列優(yōu)化的核苷酸混合物的理論和實(shí)際RNA產(chǎn)量的比較轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如實(shí)施例1部分2中描述的安排(assemble)。NTP相等地分配(等摩爾)或根據(jù)如實(shí)施例1部分5中描述的產(chǎn)生的RNA的序列分配。對于一些反應(yīng)，以相對于GTP4∶1的比率添加額外的核苷酸(GTP或帽類似物)。結(jié)果如圖9中可見，與標(biāo)準(zhǔn)NTP混合物(相等的NTP混合物)相比，對于序列優(yōu)化的NTP混合物，R2025的實(shí)際RNA產(chǎn)量可以增加。如圖10中可見，與標(biāo)準(zhǔn)NTP混合物(相等的NTP混合物)相比，對于序列優(yōu)化的NTP混合物，編碼智人前列腺干細(xì)胞抗原(HsPSCA；R1871)的mRNA的實(shí)際RNA產(chǎn)量可以增加。實(shí)施例5：NTP平衡離子對RNA產(chǎn)量的影響使用編碼智人Mucin-1信號肽/表皮生長因子受體/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1，R1626)的mRNA作為實(shí)例，研究NTP平衡離子對RNA產(chǎn)量的影響。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如實(shí)施例1部分2中描述的安排，使用序列優(yōu)化的NTP比率和13.45mM的總NTP濃度。NTP包含Na+或Tris+(均是ThermoScientific的)作為平衡離子。此外，Na-NTP反應(yīng)補(bǔ)充有不同濃度的NaCl，Tris-NTP反應(yīng)補(bǔ)充有Tris/HCl。在2.5小時的反應(yīng)時間后，RNA被純化并且如實(shí)施例1部分2中描述的測定其濃度。結(jié)果如圖11中可見，使用序列優(yōu)化的NTP混合物的智人Mucin-1信號肽/表皮生長因子受體/Mucin-1融合蛋白(EGFR/Mucin-1，R1626)的RNA產(chǎn)量在多至150mMTris-HCl的濃度粗略地保持相同。相比之下，RNA產(chǎn)量在75mM以上的NaCl濃度下開始下降。已經(jīng)描述了高NaCl濃度對RNA產(chǎn)量的負(fù)面影響(例如Kern等，1997.Biotechnol.Prog.，13，747-756；US6,586,218B2)。高濃度的Na-NTP——尤其是作為遵循NTP進(jìn)料策略時的結(jié)果——可能因此導(dǎo)致降低的RNA產(chǎn)量。利用Tris-NTP應(yīng)當(dāng)規(guī)避此限制，這是因?yàn)榫酆厦富钚圆皇芨逿ris/HCl濃度影響。實(shí)施例6：監(jiān)測轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)展使用序列優(yōu)化的NTP比率和13.45mMTris-NTP的總NTP濃度，如實(shí)施例1部分2中描述的安排智人前列腺干細(xì)胞抗原(HsPSCA；R1871)的較大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(350μl)。帽類似物以相對于GTP4∶1過量存在。在限定的時間點(diǎn)(反應(yīng)開始后15/30/60/90/120分鐘)處，提取20μl樣品，純化RNA并且如實(shí)施例1部分2中描述的測定其在260nm下的吸光度。在相同的時間點(diǎn)處提取40μl的第二樣品并且通過MicroconYM10裝置(MerckMillipore，Darmstadt，德國)(16000*g，5分鐘，17℃)過濾。根據(jù)制造商(T009-TechnicalBulletinNanoDrop1000％8000；ThermoFisherScientific，Wilmington，Delaware，USA)的說明，使用分光光度計測定260nm下流通(flow-through)的吸光度，其對應(yīng)于未并入的帽類似物和NTP。結(jié)果如圖12中可見，使用序列優(yōu)化的核糖核苷酸混合物允許通過測定限定的時間點(diǎn)處保留的總核苷酸濃度測量體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)展?？侼TP濃度的降低與合成的RNA的量直接關(guān)聯(lián)。因而，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)展可以準(zhǔn)確地確定為在給定時間點(diǎn)處測量的總NTP濃度的函數(shù)并且計算消耗的NTP的摩爾數(shù)?；诖诵畔ⅲ嬎愫铣傻腞NA的量變得可能。此過程對連續(xù)地監(jiān)測轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)展——例如在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)器中——是尤其有用的。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)NTP混合物時這將是不可能的，這是因?yàn)镹TP的消耗將不能容易地反映合成的RNA的量。實(shí)施例7：作為帽濃度函數(shù)的序列優(yōu)化的核苷酸混合物的RNA產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如實(shí)施例1部分2中描述的安排，并且在如圖14和15中指示的2mM、4mM和13.45mMNTP的總NTP濃度下實(shí)施。根據(jù)如實(shí)施例1部分5中描述的產(chǎn)生的RNA的序列分配NTP(用于PpLuc和HsPSCA的序列優(yōu)化的核糖核苷酸混合物)。反應(yīng)在如圖14和15中指示的帽類似物(m7G(5′)PPP(5′)G)的多種濃度(0、0.25、2.0、10、16和20mM)下進(jìn)行。結(jié)果如圖13A中可見，利用較高的帽類似物濃度，PpLucmRNA的實(shí)際RNA產(chǎn)量增加。與4mM的總NTP濃度相比，13.45mM的總NTP濃度的實(shí)際RNA產(chǎn)量更高。圖13B顯示了PpLucmRNA的相對RNA產(chǎn)量在多至大約16mM的帽類似物濃度下增加。低NTP濃度(4mM)的相對RNA產(chǎn)量的增加比高NTP濃度(13.45mM)更強(qiáng)。如圖14A中可見，利用較高的帽類似物濃度，HsPSCAmRNA的實(shí)際RNA產(chǎn)量增加。與4mM和2mM的總NTP濃度相比，13.45mM的總NTP濃度的實(shí)際RNA產(chǎn)量更高。圖14B顯示了HsPSCAmRNA的相對RNA產(chǎn)量在多至大約16mM的帽類似物濃度下增加。對測試的最低的NTP濃度(2mM)，觀察到相對RNA產(chǎn)量的最強(qiáng)的增加。這些結(jié)果證明序列優(yōu)化的核糖核苷酸混合物的使用甚至在低的初始的總核苷酸濃度下(例如在2mM下)下導(dǎo)致加帽的RNA合成的效率增加。相比之下，先前已經(jīng)建議對于增加的RNA產(chǎn)量，高濃度的總核苷酸——大約12mM至40mM——是必需的(US6586218)。PpLucmRNA(1870個核苷酸)和HsPSCAmRNA(589個核苷酸)的比較顯示了對于限定的總NTP濃度，相對RNA產(chǎn)量獨(dú)立于RNA長度。實(shí)施例8：作為GTP起始核苷酸濃度函數(shù)的序列優(yōu)化的核苷酸混合物的RNA產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如實(shí)施例1部分2中描述的安排，并且在對于P625、P1040和P532的13.45mM的序列優(yōu)化的核苷酸混合物的總NTP濃度下實(shí)施。根據(jù)如實(shí)施例1部分5中描述的產(chǎn)生的RNA的序列分配NTP(用于PpLuc、HsPSCA和EGFR/Mucin-1的序列優(yōu)化的核糖核苷酸混合物)。如圖16至18指示的，通過添加限定濃度(0、0.25、2.0、10、16和20mM)的GTP起始核苷酸至序列優(yōu)化的NTP混合物進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果如圖15A和15B中可見，HsPSCAmRNA的實(shí)際和相對RNA產(chǎn)量在多至大約10mM的GTP起始核苷酸濃度下增加并且在更高的GTP濃度下下降。如圖16A和16B中可見，PpLucmRNA的實(shí)際和相對RNA產(chǎn)量在多至大約10mM的GTP起始核苷酸濃度下輕微地增加并且然后在更高的GTP濃度下下降。如圖17A和17B中可見，EGFR/Mucin-mRNA的實(shí)際和相對RNA產(chǎn)量在多至大約10mM的GTP起始核苷酸濃度下增加并且然后在更高的GTP濃度下下降。這些結(jié)果證明序列優(yōu)化的核糖核苷酸混合物和額外量的起始核苷酸GTP的使用在多至大約10mM的GTP起始核苷酸濃度下導(dǎo)致RNA合成的效率增加。實(shí)施例9：生物反應(yīng)器圖18以示意圖示顯示了根據(jù)本發(fā)明的生物反應(yīng)器1的優(yōu)選的實(shí)施方式。由圖18，生物反應(yīng)器1的模塊結(jié)構(gòu)變得明白。在此，生物反應(yīng)器1由數(shù)個生物反應(yīng)器模塊2、3、4、5組成。反應(yīng)模塊1是用于合成給定序列的RNA分子的連續(xù)或半分批過程的反應(yīng)容器。反應(yīng)模塊2包含樹脂固定化的DNA，其被用作RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板。在此，DNA的固定化允許模板的重復(fù)使用并且減少任何種類的殘留DNA對期望的RNA產(chǎn)物的污染。此外，DNA模板的固定化取代使用酶DNAse進(jìn)行末端DNA消化。在轉(zhuǎn)錄后，產(chǎn)生的RNA分子可以被分批地或連續(xù)地釋放入捕捉模塊3。捕捉模塊3包含樹脂/固相以捕捉RNA分子并且將RNA與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的其它可溶性組分分離。其后，RNA分子可以借助出口管線等(未顯示)從生物反應(yīng)器1分送至接收單元等，在其中可以實(shí)施進(jìn)一步的RNA洗脫和純化。洗滌液和/或洗脫緩沖液可以借助各自的洗滌和緩沖液罐31被提供至捕捉模塊3，所述洗滌和緩沖液罐31被連接至反應(yīng)模塊2和捕捉模塊3之間的轉(zhuǎn)移區(qū)域。為了能夠監(jiān)測和控制反應(yīng)模塊2中的轉(zhuǎn)錄過程，在反應(yīng)模塊2中提供超濾膜21，用于將高分子量組分比如蛋白質(zhì)和多核苷酸與低分子量組分比如核苷酸分離。該膜將在其中實(shí)施RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)核心22與在其中接收過濾的反應(yīng)混合物的過濾隔室23分隔。基于反應(yīng)模塊2的過濾隔室23中的過濾的反應(yīng)混合物中的核苷酸濃度——其被用作關(guān)鍵的工藝參數(shù)，可以借助進(jìn)料泵43控制和調(diào)節(jié)來自進(jìn)料罐24的核苷酸、緩沖液組分和/或酶進(jìn)料入反應(yīng)模塊2，其允許以產(chǎn)生高轉(zhuǎn)錄性能的最佳的穩(wěn)態(tài)條件執(zhí)行RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。提供傳感器單元41作為測量工具，用于測量反應(yīng)混合物中的反應(yīng)參數(shù)。在此，傳感器單元41在包含低分子量組分的過濾的流體中至少包括用于光度分析的傳感器，比如UV260/280nm的UV流動池，該過濾的流體從過濾隔室23提取，通過再循環(huán)泵25循環(huán)并且返回過濾隔室23。在循環(huán)管路中，提供傳感器單元41的傳感器，以便對過濾隔室23內(nèi)部的過濾的流體實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測。生物反應(yīng)器1中序列優(yōu)化的核糖核苷酸混合物的應(yīng)用使得能夠在反應(yīng)模塊2的反應(yīng)核心22中的RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)期間實(shí)時測量過濾隔室23中的核苷酸濃度。傳感器單元41是控制模塊4的一部分，所述控制模塊4進(jìn)一步包括控制器42和進(jìn)料泵43形式的致動器。傳感器單元41和進(jìn)料泵43被連接至控制器42，以便向控制器42提供測量信號并且從控制器42接收指令信號。另外，其它關(guān)鍵的工藝參數(shù)，比如過濾的流體的pH值或過濾的流體的傳導(dǎo)性，可以通過傳感器單元41的進(jìn)一步合適的傳感器分析。通過控制器42——通常是基于計算機(jī)的系統(tǒng)等的形式——的數(shù)據(jù)收集和分析允許控制作為致動器的進(jìn)料泵43——其用于反復(fù)地進(jìn)料核苷酸、緩沖液組分和/或酶進(jìn)入反應(yīng)模塊2，以及控制生物反應(yīng)器1中的進(jìn)一步的泵，以便調(diào)節(jié)最佳的穩(wěn)態(tài)反應(yīng)條件中關(guān)鍵的工藝參數(shù)。為了防止浪費(fèi)，優(yōu)選的實(shí)施方式的生物反應(yīng)器1進(jìn)一步包括連接至捕捉模塊3的回流模塊5，該回流模塊5收集未使用的原料，比如核苷酸和酶，并且借助回流泵51將其再循環(huán)返回入反應(yīng)模塊2?；亓髂K5包含固定化酶——比如焦磷酸酶——或樹脂以捕捉破壞性組分，比如磷酸鹽等。本發(fā)明的上述實(shí)施方式和附圖僅意欲是說明性的并且不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是限制性的，因?yàn)榭梢栽谒降臋?quán)利要求的范圍內(nèi)對描述的發(fā)明做出修改，而不背離所附的權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例10：RNA分子的免疫刺激活性在此實(shí)施例中，比較利用序列優(yōu)化的NTP混合物和標(biāo)準(zhǔn)的等摩爾NTP混合物合成的RNA分子的免疫刺激性質(zhì)。通過測量轉(zhuǎn)染有mRNA的細(xì)胞的上清液中的細(xì)胞因子和趨化因子水平測定免疫刺激。如實(shí)施例1中描述的進(jìn)行熒光素酶mRNA(pPluc)的標(biāo)準(zhǔn)的和序列優(yōu)化的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。隨后，通過LiCl沉淀純化mRNA。免疫刺激試驗(yàn)海拉細(xì)胞以6孔板中4×105個細(xì)胞/孔的密度接種在2ml海拉細(xì)胞培養(yǎng)基中，所述海拉細(xì)胞培養(yǎng)基由補(bǔ)充有25mMHEPES、2mML-谷氨酰胺和100IU/ml青霉素/鏈霉素(均是Lonza，Basel，瑞士)的RPMI1640培養(yǎng)基和10％胎牛血清(PerbioScience，Bonn，德國)組成。第二天，使用2000(LifeTechnologies，Darmstadt，德國，目錄號11668-027)對細(xì)胞轉(zhuǎn)染2μg的RNA或作為陰性對照的注射用水(WFI)。簡略地，試劑和RNA每個在培養(yǎng)基(LifeTechnologies)中稀釋，以1∶1.5的RNA：的比率結(jié)合并且在室溫下培育20分鐘。陰性對照包含WFI取代與混合的RNA。同時，利用補(bǔ)充有25mMHEPES和2mML-谷氨酰胺的2mlRPMI1640培養(yǎng)基(無血清和無青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基)洗滌細(xì)胞一次，并且2ml的無血清和無青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基被添加至細(xì)胞，然后添加0.5mlRNA：轉(zhuǎn)染混合物。在37℃和5％CO2下培育4小時后，包含轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基被替換為2ml的海拉細(xì)胞培養(yǎng)基。在24小時后，收集無細(xì)胞的上清液，并且使用下列試劑盒：HumanSolubleProteinMasterBufferKit(目錄號558264)、AssayDiluent(目錄號560104)、HumanIL-6FlexSet(目錄號558276)、HumanCXCL10FlexSet(目錄號558280)和HumanCCL5FlexSet(目錄號558324)(所有試劑盒都來自BDBiosciences)，根據(jù)制造商的說明(BDBiosciences)通過流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)(CytometricBeadArray)(CBA)測量IL-6、CXCL10和CCL5的濃度。使用FCAP陣列v3.0軟件(BDBiosciences)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖19中可見，與利用標(biāo)準(zhǔn)的等摩爾NTP混合物合成的相同的RNA相比，利用序列優(yōu)化的NTP混合物合成的RNA的分泌的IL-6、CXCL10和CCL5的水平更低，這指示由序列優(yōu)化的NTP混合物得到的RNA的免疫刺激活性更低。實(shí)施例11：生物反應(yīng)器中的體外轉(zhuǎn)錄用于體外轉(zhuǎn)錄的DNA(P1140)的制備：通過將下列元件插入DNA載體(pCV32(KanR))制備用于體外轉(zhuǎn)錄的DNA載體(P1140)：5′UTR：32L4(Top-UTR)ORF：來自H1N1的HA(荷蘭2009)(GC富集的)3′UTR：白蛋白7獲得的DNA載體的體外轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致具有2083nt的長度的RNA分子。各自的RNA序列(SEQIDNO：6)圖解在圖20中。RNA構(gòu)建體由下列核苷酸組成表征：G＝540(25，92％)C＝676(32，45％)A＝541(25，97％)U＝326(15，65％)G/C＝58，37％DNA載體的線性化：使用下列條件使質(zhì)粒P1140線性化：0.5μg質(zhì)粒DNA1.5μl10×反應(yīng)緩沖液1μlEcoRI添加15μlWFI(注射用水)反應(yīng)在37℃下培育3h。隨后進(jìn)行苯酚/氯仿提取和異丙醇沉淀。體外轉(zhuǎn)錄：標(biāo)準(zhǔn)帽/NTP混合物標(biāo)準(zhǔn)的帽/NTP-混合物4μL最終濃度[mM]帽(100mM)1，165.8ATP(100mM)0，84CTP(100mM)0，84UTP(100mM)0，84GTP(100mM)0，291.45WFI0，15(不具有帽的最終NTP濃度是13.45mM)NTP和帽的計算：如在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用的13.45mM的相同的總NTP濃度被用于序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄。四倍量的GTP被用于帽類似物。用于P1140的序列優(yōu)化的帽/NTP混合物的制備：5×轉(zhuǎn)錄緩沖液：400mMHEPES120mMMgCl210mM亞精胺200mMDTF25U/ml無機(jī)焦磷酸酶在生物反應(yīng)器中測試4種不同的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：使用來自Dasgip的DasBoxBioreaktor作為生物反應(yīng)器。反應(yīng)在50rpm下攪拌。在指示的時間點(diǎn)處，移出每種20μl的樣品。通過在LiCl沉淀后測定260nm下的吸收測量RNA濃度。四種不同的條件被用于體外轉(zhuǎn)錄：1.使用標(biāo)準(zhǔn)NTP混合物的轉(zhuǎn)錄試劑添加80000μL線性化質(zhì)粒DNA(P1140)[0，48μg/μL](μL)83005×轉(zhuǎn)錄緩沖液(μL)16000標(biāo)準(zhǔn)的帽/NTP-混合物(μL)16000RNAse抑制劑[40U/μL](μL)400T7RNA聚合酶[200U/μL](μL)2000WFI(μL)37300最終體積80000轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在37℃下培育3h。隨后，6μlDNAseI(1mg/ml)和0.2μlCaCl2溶液(0.1M)/μgDNA模板被添加至轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并且在37℃下培育2h。2.序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄(1.5h而沒有進(jìn)料)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在37℃下培育1.5h。隨后，6μlDNAseI(1mg/ml)和0.2μlCaCl2溶液(0.1M)/μgDNA模板被添加至轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并且在37℃下培育2h。3.具有進(jìn)料的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄試劑添加80000μl線性化質(zhì)粒DNA(P1140)[0，48μg/μl](μl)83005×轉(zhuǎn)錄緩沖液(μl)16000序列優(yōu)化的帽/NTP-混合物(μl)28000RNAse抑制劑[40U/μl](μl)400T7RNA聚合酶[200U/μl](μl)2000WFI(μl)25300最終體積80000轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在37℃下培育1.5h。在1.5h后添加12934.6μl序列優(yōu)化的帽/NTP-混合物和5×轉(zhuǎn)錄緩沖液。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在37℃下培育另外的1.5h。隨后，6μlDNAseI(1mg/ml)和0.2μlCaCl2溶液(0.1M)/μgDNA模板被添加至轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并且在37℃下培育2h。4.具有減小的T7RNA聚合酶濃度和減小的模板濃度的序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄結(jié)果：與標(biāo)準(zhǔn)條件下的轉(zhuǎn)錄相比(圖21，TS(1))，序列優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄混合物中的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致更高濃度的轉(zhuǎn)錄的RNA。核苷酸和轉(zhuǎn)錄緩沖液的額外的進(jìn)料進(jìn)一步增加轉(zhuǎn)錄的RNA的量(圖21，TS(3))。產(chǎn)量：樣品ID[RNA](mg)P1140-TS(1)130，6P1140-TS(2)317，1P1140-TS(3)656，4P1140-TS(4)312，6表達(dá)和免疫刺激：海拉細(xì)胞以6孔板中4×105個/孔的密度接種在2ml海拉細(xì)胞培養(yǎng)基中，所述海拉細(xì)胞培養(yǎng)基由補(bǔ)充有25mMHEPES、2mML-谷氨酰胺和100IU/ml青霉素/鏈霉素(均是Lonza，Basel，瑞士)的RPMI1640培養(yǎng)基和10％胎牛血清(PerbioScience，Bonn，德國)組成。第二天，使用2000(LifeTechnologies，Darmstadt，德國，目錄號11668-027)對細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同濃度的2μg的RNA或作為陰性對照的注射用水(WFI)。簡略地，Lipofectamine試劑和RNA每個在培養(yǎng)基(LifeTechnologies)中稀釋，以1∶1.5的RNA：Lipofectamine的比率結(jié)合并且在室溫下培育20min。陰性對照包含WFI取代與Lipofectamine2000混合的RNA。同時，利用補(bǔ)充有25mMHEPES和2mML-谷氨酰胺的2mlRPMI1640培養(yǎng)基(無血清和無青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基)洗滌細(xì)胞一次，添加2ml的無血清和無青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基至細(xì)胞，然后添加0.5mlRNA：Lipofectamine轉(zhuǎn)染混合物。在37℃和5％CO2下培育4小時之后，移出包含轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基并且添加2ml的海拉細(xì)胞培養(yǎng)基。在24小時后，收集上清液和細(xì)胞。蛋白質(zhì)表達(dá)：使用流式細(xì)胞分析測定HA蛋白的表面表達(dá)。利用1mlPBS洗滌貼壁的海拉細(xì)胞一次并且使用無胰蛋白酶的分離緩沖液(40mMTrisHClpH7，5；150mMNaCl、1mMEDTA)收獲。利用小鼠單克隆抗HA(H1N1)抗體(ImmuneTechnology，NewYork，USA)接著二次抗小鼠FITC綴合抗體(Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德國)與細(xì)胞一起培育。細(xì)胞在BDFACSCanto上測量并且使用FlowJo軟件版本10.6分析。使用GraphPadPrism軟件版本5.01進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果：與標(biāo)準(zhǔn)條件下轉(zhuǎn)錄的RNA相比(圖22，TS(1))，序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物(圖22，TS(2)、TS(3)、TS(4))中轉(zhuǎn)錄的RNA導(dǎo)致更高的編碼HA蛋白的表達(dá)。免疫刺激：使用下列試劑盒，根據(jù)制造商的說明(BDBiosciences)通過流式細(xì)胞小球微陣列術(shù)(CBA)在無細(xì)胞的上清液中測量IL-6、CXCL10和CCL5的濃度：試劑目錄號HumanSolubleProteinMasterBUfferKit558264AssayDiluent560104HumanIL-6FlexSet558276HumanCXCL10FlexSet558280HumanCCL5FlexSet558324使用FCAP陣列v3.0軟件(BDBiosciences)分析數(shù)據(jù)。使用GraphPadPrism軟件版本5.01進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果：與在序列優(yōu)化的反應(yīng)混合物(圖23，TS2、TS3、TS4)中轉(zhuǎn)錄的RNA相比，在標(biāo)準(zhǔn)條件(圖23，TS1)下轉(zhuǎn)錄的RNA誘導(dǎo)海拉細(xì)胞中更高水平的細(xì)胞因子IL-6、CXCL10和CCL5。當(dāng)前第1頁1 2 3