生物標(biāo)志物組合物和方法
【專利摘要】可以評估生物標(biāo)志物用于診斷、治療相關(guān)方法或預(yù)后方法以鑒定表型，如病癥或疾病或者疾病的階段或進(jìn)程，選擇用于疾病、病癥、疾病階段和病癥階段的候選治療方案，和用于確定治療效果。來自體液的循環(huán)生物標(biāo)志物可以用于生理狀態(tài)的分型或確定表型。這些包括核酸、蛋白質(zhì)和循環(huán)結(jié)構(gòu)如囊泡以及核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
【專利說明】生物標(biāo)志物組合物和方法
[0001]交叉參考
[0002]本申請要求2011年8月8日提交的美國臨時專利申請N0.61/521，333 ；2011年8 月 15 日提交的 N0.61/523，763 ；2011 年 8 月 23 日提交的 N0.61/526，623 ；2011 年 8 月31 日提交的 N0.61/529，726 ;2011 年 9 月 13 日提交的 N0.61/534，352 ;2011 年 9 月 21 日提交的61/537,462 ;2011年10月3日提交的N0.61/542，639 ;2011年10月26日提交的 N0.61/551,674 ;2011 年 11 月 14 日提交的 N0.61/559，676 ;2012 年 3 月 16 日提交的N0.61/612，111 ;和2012年4月3日提交的N0.61/619，803 ;將該申請全部按引用并入本文中作為參考。
[0003]本申請是2012年6月14日提交的國際專利申請PCT/US2012/042519的部分繼續(xù)，該國際專利申請要求2011年6月16日提交的美國臨時專利申請N0.61/497,895 ；2011年 6 月 20 日提交的 N0.61/499，138 ;2011 年 6 月 27 日提交的 N0.61/501，680 ;2011年 7 月8 日提交的 N0.61/506,019 ；2011 年 7 月 11 日提交的 N0.61/506,606 ；2011 年 7 月 11 日提交的N0.61/506，598 ；2011年7月14日提交的N0.61/507,989 ；2011年7月25日提交的Νο.61/511，455 ;2011年8月15日提交的N0.61/523，763 ;和2011年8月23日提交的N0.61/526, 623的權(quán)益，將該申請全部按引用并入本文中作為參考。
[0004]本申請還是2012年6月7日提交的國際專利申請PCT/US2012/041387的部分繼續(xù)，該國際專利申請要求2011年6月7日提交的美國臨時專利申請N0.61/494，196 ；2011年6月7日提交的N0.61/494，355 ;和2011年7月14日提交的N0.61/507，989的權(quán)益；將該申請全部按引用并入本文中作為參考。
[0005]本申請還是2012年2月17日提交的國際專利申請PCT/US2012/025741的部分繼續(xù)，該國際專利申請要求美國臨時專利申請2011年2月24日提交的N0.61/446,313 ；2011年6月27日提交的N0.61/501，680 ；2011年4月4日提交的N0.61/471，417 ；2011年8月15日提交的N0.61/523，763 ;和201`1年2月22日提交的N0.61/445，273的權(quán)益；將該申請全部按引用并入本文中作為參考。
[0006]本申請還是2011年8月18日提交的國際專利申請PCT/US2011/048327的部分繼續(xù)，該國際專利申請要求美國臨時專利申請2010年8月18日提交的N0.61/374,951 ；2010年9月2日提交的N0.61/379,670 ;2010年9月9日提交的N0.61/381，305 ;2010年9月15 日提交的 N0.61/383，305 ；2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504 ；2010 年 10 月 15日提交的 N0.61/393，823 ；2010 年 11 月 9 日提交的 N0.61/411，890 ；2010 年 11 月 17 日提交的 N0.61/414,870 ;2010 年 11 月 23 日提交的 N0.61/416，560 ;2010 年 12 月 10 日提交的 N0.61/421，851 ;2010 年 12 月 15 日提交的 N0.61/423，557 ;2010 年 12 月 29 日提交的N0.61/428，196的權(quán)益；將該申請全部按引用并入本文中作為參考。
[0007]本申請還是2011年3月I日提交的國際專利申請PCT/US2011/026750的部分繼續(xù)，該申請聲稱是2009年11月12日提交的美國專利申請系列N0.12/591,226的部分繼續(xù)申請，其要求美國臨時申請2008年11月12日提交的N0.61/114,045 ;2008年11月12 日提交的 N0.61/114，058 ；2008 年 11 月 13 日提交的 N0.61/114，065 ；2009 年 2 月 9 日提交的 N0.61/151，183 ；2009 年 10 月 2 日提交的 N0.61/278，049 ；2009 年 10 月 9 日提交的N0.61/250，454;和2009年10月19日提交的N0.61/253，027的權(quán)益；并且該申請還要求美國臨時申請2010年3月I日提交的N0.61/274，124 ;2010年6月22日提交的N0.61/357，517 ；2010年7月15日提交的N0.61/364，785的權(quán)益；將所有申請全部按引用并入本文中作為參考。
[0008]本申請還是2011年4月6日提交的國際專利申請PCT/US2011/031479的部分繼續(xù)，該國際專利申請要求美國臨時專利申請2010年4月6日提交的N0.61/321,392 ；2010 年 4 月 6 日提交的 N0.61/321，407 ;2010 年 5 月 6 日提交的 N0.61/332，174 ；2010年 5 月 25 日提交的 N0.61/348，214 ；2010 年 5 月 26 日提交的 N0.61/348,685 ；2010 年6 月 11 日提交的 N0.61/354，125 ；2010 年 6 月 16 日提交的 N0.61/355，387 ；2010 年 6月 21 日提交的 N0.61/356，974 ;2010 年 6 月 22 日提交的 N0.61/357，517 ;2010 年 7 月8 日提交的 N0.61/362，674 ；2010 年 11 月 12 日提交的 N0.61/413，377 ；2010 年 4 月 9日提交的 N0.61/322，690 ;2010 年 5 月 13 日提交的 N0.61/334，547 ;2010 年 7 月 15 日提交的 N0.61/364，785 ；2010 年 8 月 2 日提交的 N0.61/370, 088 ；2010 年 9 月 2 日提交的 N0.61/379，670 ；2010 年 9 月 9 日提交的 N0.61/381，305 ；2010 年 9 月 15 日提交的 N0.61/383，305 ;2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504 ;2010 年 10 月 15 日提交的Νο.61/393，823 ;2010 年 11 月 9 日提交的 N0.61/411，890 和 2010 年 11 月 23 日提交的N0.61/416，560的權(quán)益；將所有申請全部按引用并入本文中作為參考。
[0009]發(fā)明背景
[0010]用于諸如癌癥的狀況和疾病的生物標(biāo)志物包括生物分子，如蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、RNA、DNA和它們的變體及修飾`。
[0011]特定生物標(biāo)志物(例如DNA、RNA和蛋白質(zhì))的鑒定可以提供用于診斷、預(yù)后或治療診斷(theranosis)狀況或疾病的生物印記。生物標(biāo)志物可在體液中檢測，包括循環(huán)DNA、RNA、蛋白質(zhì)和囊泡。循環(huán)生物標(biāo)志物包括蛋白質(zhì)(諸如PSA和CA125)以及核酸(諸如SEPT9DNA和PCA3信使RNA (mRNA))。循環(huán)生物標(biāo)志物可以與循環(huán)囊泡相關(guān)。囊泡是從細(xì)胞上脫落的膜包封的結(jié)構(gòu)，并且可見于多種體液中，包括血液、血漿、血清、乳汁、腹水、支氣管肺泡灌洗液和尿液。囊泡可作為蛋白質(zhì)、RNA、DNA、病毒和朊病毒的運(yùn)送載體而參與細(xì)胞之間的通訊。微RNA是調(diào)控信使RNA轉(zhuǎn)錄和降解的短RNA。微RNA已經(jīng)在體液中發(fā)現(xiàn)并且已經(jīng)觀察到其作為從腫瘤細(xì)胞上脫落的囊泡內(nèi)的組分。對與疾病相關(guān)的循環(huán)生物標(biāo)志物(包括囊泡和/或微RNA)的分析可有助于檢測疾病或其嚴(yán)重程度、確定疾病的易感性以及進(jìn)行治療決策。
[0012]生物樣品中存在的囊泡提供了生物標(biāo)志物的來源，例如，所述標(biāo)志物存在于囊泡內(nèi)(囊泡有效負(fù)載)或存在于囊泡的表面上。囊泡的特征(例如尺寸、表面抗原、細(xì)胞源的確定、有效負(fù)載)還可提供診斷、預(yù)后或治療診斷的結(jié)果輸出。仍然存在對可用于檢測和治療疾病的生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒定的需求。與囊泡相關(guān)的微RNA、蛋白質(zhì)和其它生物標(biāo)志物以及囊泡的特征可提供診斷、預(yù)后或治療診斷。
[0013]本發(fā)明提供了用于通過檢測作為疾病或疾病進(jìn)展的指征的生物標(biāo)志物而表征表型的方法和系統(tǒng)。所述生物標(biāo)志物可以是循環(huán)生物標(biāo)志物，包括但不限于囊泡標(biāo)志物、蛋白質(zhì)、核酸、mRNA或/和微RNA。生物標(biāo)志物可以是核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物。[0014]發(fā)明概述
[0015]本文公開了用于通過分析循環(huán)生物標(biāo)志物(諸如生物樣品中存在的囊泡、微RNA或蛋白質(zhì))來表征表型的方法和組合物。表征受試者或個體的表型可以包括但不限于疾病或狀況的診斷、疾病或狀況的預(yù)后、疾病階段或狀況階段的確定、藥物效力、生理狀況、器官危困或器官排斥、疾病或狀況進(jìn)展、與疾病或狀況的治療相關(guān)關(guān)聯(lián)性或者特定的生理或生物狀態(tài)。
[0016]在一個方面中，本發(fā)明提供了一種方法，其包括:(a)將生物樣品與一種或多種試劑接觸，其中所述一種或多種試劑特異性地結(jié)合表5中的一種或多種生物標(biāo)志物；(b)基于生物樣品與所述一種或多種試劑的接觸檢測所述生物樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的存在或水平；和(C)鑒定包括所述生物樣品中檢測的所述一種或多種生物標(biāo)志物的存在或水平的生物印記。該方法可以進(jìn)一步包括將所述生物印記與參照生物印記相比較，其中將該比較用于表征癌癥。所述參照生物印記可以來自未患癌癥的受試者。參照生物印記可以來自該受試者。例如，參照生物印記可以來自受試者的非惡性樣品，如正常的鄰近組織，或在一段時間過程中取自受試者的不同樣品。表征可以包括鑒定受試者中癌癥的存在或風(fēng)險(xiǎn)，或鑒定受試者中的癌癥是轉(zhuǎn)移性的或侵襲性的。所述比較步驟可以包括確定生物印記是否相對于參照生物印記有所改變，由此提供癌癥的預(yù)后、診斷或治療診斷確定。
[0017]在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自以下的蛋白質(zhì):A33、ABL2、ADAMlO、AFP、ALA、ALIX、ALPL、ApoJ/CLU、ASCA、ASPH(A-10)、ASPH(DOIP)、AURKB、B7H3、B7H3、B7H4、BCNP、BDNF、CA125(MUC16)、CA-19-9, C-Bir, CD10、CD151、CD24、CD41、CD44、CD46、CD59 (MEM-43)、CD63、CD63、CD66eCEA、CD81、CD81、CD9、CD9、CDA, CDADCU CRMP-2、CRP、CXCLl2, CXCR3、CYFRA21-1、DDX-1、DLL4、DLL4、EGFR、Epcam、EphA2、ErbB2、ERG、EZH2、FASL、FLNA、FRT、GAL3、GATA2、GM-CSF, Gro- a、HAP、HER3 (ErbB3)、HSP70、HSPB1、hVEGFR2、iC3b、IL-1B、IL6R、IL6Unc、IL7Ra/CD127、IL8、INSIG-2、整聯(lián)蛋白、KLK2、LAMN、乳腺珠蛋白、M-CSF、MFG-E8、MIF、MI`SRI1、MMP7、MMP9、MUCl、Mucl、MUC17、MUC2、Ncam、NDUFB7、NGAL, NK-2R (C-21)、NT5E (CD73)、p53、PBP、PCSA、PCSA、PDGFRB, PIMl、PRL, PSA、PSA、PSMA,PSMA, RAGE、RANK、ReglV、RUNX2、S100-A4、s印rase/FAP、SERPINB3、SIM2 (C-15)、SPARC、SPC、SPDEF、SPPU STEAP、STEAP4、TFF3、TGM2、--ΜΡ-1、TMEM211、Trail_R2、Trail_R4、TrKB (poly)、Trop2、TsglOl、TWEAK、UNC93A、VEGFA, wnt_5a(C_16)及其組合。所述一種或多種生物標(biāo)志物可以進(jìn)一步包含選自⑶9、⑶63、⑶81、PCSA、MUC2、MFG-E8及其組合的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述生物印記用于表征癌癥，例如，前列腺癌。
[0018]在其他實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物包括一種或多種選自以下的微 RNA:miR-148a、miR-329、miR-9、miR-378*、miR-25、miR-614、miR_518c*、miR-378、miR-765、let_7f_2*、miR-574_3p、miR-497、miR-32、miR-379、miR_520g、miR-542_5p、miR-342-3p、miR-1206、miR-663、miR-222及其組合。所述一種或多種生物標(biāo)志物還可以選自 hsa-miR-877*、hsa-miR-593、hsa-miR-595、hsa-miR-300、hsa-miR-324_5p、hsa-miR-548a~5pΛ hsa-miR-329、hsa-miR-550、hsa-miR-886_5p、hsa-miR-603、hsa-miR-490_3p、hsa-miR-938、hsa-miR-149、hsa-miR-150、hsa-miR-1296、hsa-miR-384、hsa-miR-487a、hsa-miRPlus-C1089、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-525-5p 及其組合。在實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物選自 miR-588、miR-1258、miR-16-2*、miR-938、miR-526b、miR_92b*、let_7d、miR-378*、miR-124、miR_376c、miR_26b、miR-1204、miR-574_3p、miR-195、miR-499-3p、miR-2110、miR-888及其組合。所述生物印記可以用于表征癌癥，例如，前列腺癌。
[0019]在再其他的實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自以下的蛋白質(zhì):A33、ADAMlO, AMACR、ASPH(A-1O)、AURKB, B7H3、CA125、CA-19-9, C-Bir, CD24、CD3、CD41、CD63、CD66e CEA、CD81、CD9、CDADCl、CSA、CXCLl2, DCRN、EGFR、EphA2、ERG、FLNA, FRT,GAL3、GM-CSF、Gro- a、HER3 (ErbB3)、hVEGFR2、IL6Unc、整聯(lián)蛋白、乳腺珠蛋白、MFG-E8、MMP9、MUCl、MUC17、MUC2、NGAL、NK-2R (C-21)、NY-ESO-1、PBP、PCSA、PMl、PRL、PSA、PS IP I/LEDGF、PSMA、RANK、S100-A4、s印rase/FAP、SIM2(C-15)、SPDEF、SSX2、STEAP、TGM2、--ΜΡ-1、Trail-R4、TsglOl、TWEAK、UNC93A、VCAN、XAGE-1及其組合。所述一種或多種生物標(biāo)志物可以進(jìn)一步包括選自EpCAM、⑶81、PCSA, MUC2、MFG-E8及其組合的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述生物印記用于表征前列腺癌。
[0020]在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物選自let-7d、miR-148a、miR_195、miR-25、miR_26b、miR-329、miR_376c、miR-574_3p、miR-888、miR-9、miR1204、miR-16-2*、miR-497、miR-588、miR-614、miR-765、miR92b*、miR-938、let_7f_2*、miR-300、miR-523、miR-525_5p、miR-l182、miR_l244、miR-520d_3p、miR-379、Iet-7b、miR-125a_3p、miR-1296、miR-134、miR-149、miR-150、miR-187、miR-32、miR-324_3p、miR-324_5p、miR-342_3p、miR-378、miR-378*、miR-384、miR-451、miR-455_3p、miR-485_3p、miR_487a、miR-490_3p、miR-502_5p、miR-548a_5p、miR-550、miR-562、miR-593、miR-593*、miR-595、miR-602、miR-603、miR-654_5p、miR-877*、miR-886_5p、miR-125a_5p、miR-140_3p、miR-192、miR-196a、miR-2110、miR-212 、miR-222, miR-224*、miR_30b*、miR-499_3p、miR-505* 及其組合。所述生物印跡可以用于表征前列腺癌，如用于區(qū)分前列腺癌的存在與其他前列腺病癥。
[0021]在再其他實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自以下的蛋白質(zhì):A33、ADAMlO、ALIX、AMACR、ASCA、ASPH (A-1O)、AURKB、B7H3、BCNP、CA125、CA-19-9、C_Bir (鞭毛蛋白)、CD24、CD3、CD41、CD63、CD66e CEA、CD81、CD9、CDADCl、CRP、CSA、CXCLl2, CYFRA21-1、DCRN、EGFR、EpCAM、EphA2、ERG、FLNA, GAL3、GATA2、GM-CSF, Gro a、HER3 (ErbB3)、HSP70、hVEGFR2、iC3b、IL-1B、IL6Unc、IL8、整聯(lián)蛋白、KLK2、乳腺珠蛋白、MFG-E8、MMP7、MMP9、MS4A1、MUC1、MUC17、MUC2、NGAL, NK_2R(C_21)、NY-ESO-l、p53、PBP、PCSA、PMl、PRL、PSA、PSMA, RANK、RUNX2、S100-A4、s印rase/FAP、SERPINB3、SIM2(C-15)、SPC、SPDEF、SSX2、SSX4、STEAP、TGM2、TIMP-U TRAIL R2、Trail_R4、TsglOU TWEAK、VCAN、VEGF A、XAGE 及其組合。所述一種或多種生物標(biāo)志物可以進(jìn)一步包括選自EpCAM、⑶81、PCSA, MUC2、MEG-E8及其組合的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述生物印記用于表征癌癥，例如，前列腺癌。
[0022]所述一種或多種生物標(biāo)志物可以是選自hsa-miR-451、hsa-miR-223、hsa-miR-593*、 hsa-miR-1974、 hsa-miR-486~5p> hsa_miR-19b、 hsa_miR-320b、hsa_miR-92a、hsa-miR-21、hsa-miR-675*、hsa-miR-16、hsa-miR-876_5p、hsa-miR-144、hsa-miR-126、hsa-miR-137、hsa-miR-1913、hsa-miR-29b_l*、hsa_miR-15a、hsa-miR-93、hsa-miR-1266及其組合的微RNA。所述生物印記可以用于表征前列腺癌，如用于區(qū)分癌癥與非癌樣品，如區(qū)分前列腺癌與非前列腺癌病癥。[0023]在一個實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物包括一種或多種選自⑶9、⑶63、⑶81、MMP7、EpCAM及其組合的蛋白質(zhì)。所述一種或多種生物標(biāo)志物可以是選自STAT3、EZH2、p53、MACCU SPDEF、RUNX2、YB-U AURKA, AURKB 及其組合的蛋白質(zhì)。所述一種或多種生物標(biāo)志物可以是選自PCSA、Muc2、AdamlO及其組合的蛋白質(zhì)。所述一種或多種生物標(biāo)志物可以包括MMP7。所述生物印記用于檢測癌癥，例如，乳腺癌或前列腺癌。
[0024]在另一個實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自堿性磷酸酶(AP)、CD63、MyoDl、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、MAP IB, CNPase、抑制素(Prohibitin)、CD45R0、熱休克蛋白27、膠原蛋白I1、層粘連蛋白Bl/bl、Gail、CDw75、bcl_XL、層粘連蛋白-S、鐵蛋白、CD21、ADP-核糖基化因子(ARF-6)及其組合的蛋白質(zhì)。所述一種或多種生物標(biāo)志物可以包括選自 CD56/NCAM-1、熱休克蛋白 27/hsp27、CD45R0、MAPlB、MyoDl、CD45/T200/LCA、CD3 ζ、層粘連蛋白-S、bcl-XL、Radl8、Gail、胸苷酸合成酶、堿性磷酸酶(AP)、CD63、MMP-16/MT3-MMP、細(xì)胞周期蛋白C、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、SIRP al、層粘連蛋白Bl/bl、淀粉狀蛋白β (APP)、SODD(死亡結(jié)構(gòu)域的沉默子)、CDC37、Gab-1、E2F-2、CD6、肥大細(xì)胞糜蛋白酶、Y谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)及其組合的蛋白質(zhì)。例如，所述一種或多種生物標(biāo)志物可以包括選自堿性磷酸酶(AP)、⑶56 (NCAM)、⑶-3 ζ ,Map Ib ,14.3.3Dan、細(xì)絲蛋白、血小板反應(yīng)蛋白及其組合的蛋白質(zhì)。所述生物印記可以用于表征癌癥。例如，所述生物印記可以用于區(qū)分前列腺癌和其他前列腺病癥。所述生物印記還可以用于區(qū)分前列腺癌和其他癌癥，例如，肺癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌和腦癌。
[0025]所述一種或多種生物標(biāo)志物可以包括Ago2。所述一種或多種生物標(biāo)志物可以進(jìn)一步包括一種或多種微RNA。在一個實(shí)施方案中,所述一種或多種微RNA可以是表5中的一種或多種微RNA。例如，所述一種或多種微RNA可以選自miR-22、miR-16、miR-148a、miR-92a、miR-451、let7a及其組合。所述微RNA可以與Ago2復(fù)合。所述生物印記可以用于表征前列腺癌，如用于區(qū)分前列腺癌和非癌樣品。 [0026]在另一個實(shí)施方案中，所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自ADAM-10、BCNP,⑶9、EGFR、EpCam, IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、PCSA、SERPINB3、SPDEF、SSX2、SSX4 及其組合的蛋白質(zhì)。例如，所述一種或多種生物標(biāo)志物可以包括選自EGFR、EpCAM, KLK2、PBP、SPDEF,SSX2、SSX4及其組合的蛋白質(zhì)。所述一種或多種生物標(biāo)志物還可以包括選自EpCAM、KLK2、PBP、SPDEF、SSX2、SSX4及其組合的蛋白質(zhì)。
[0027]在另一個方面中，本發(fā)明提供了一種方法，其包括:(a)將生物樣品與一種或多種試劑接觸，其中所述生物樣品包括一種或多種微囊泡，并且進(jìn)一步其中所述一種或多種試劑包括特異性結(jié)合表5中的一種或多種生物標(biāo)志物的第一試劑和第二試劑；(b)基于生物樣品與所述第一和第二試劑的接觸檢測所述一種或多種微囊泡的存在或水平；和(C)鑒定包括所述生物樣品中檢測的所述一種或多種微囊泡的存在或水平的生物印記。該方法可以進(jìn)一步包括將所述生物印記與參照生物印記相比較，其中將該比較用于表征癌癥。所述參照生物印記可以來自未患癌癥的受試者。參照生物印記可以來自該受試者。例如，參照生物印記可以來自受試者的非惡性樣品，如正常的鄰近組織，或在一段時間過程中取自受試者的不同樣品。表征可以包括鑒定受試者中癌癥的存在或風(fēng)險(xiǎn)，或鑒定受試者中的癌癥是轉(zhuǎn)移性的或侵襲性的。所述比較步驟可以包括確定生物印記是否相對于參照生物印記有所改變，由此提供癌癥的預(yù)后、診斷或治療診斷確定。[0028]在一個實(shí)施方案中，所述第一試劑包括捕獲劑，而第二試劑包括檢測劑。所述第一和第二試劑可以包括抗體、適體或其組合。在一個實(shí)施方案中，所述捕獲劑栓系于基底,例如，微滴定平板的孔、平面陣列、微珠、柱填充材料等。可以將所述檢測劑進(jìn)行標(biāo)記以促進(jìn)其檢測。所述標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記等。所述檢測劑可以直接或間接標(biāo)記。本文中將進(jìn)一步描述用于捕獲和檢測的技術(shù)。
[0029]捕獲劑和檢測劑可以選自表38、40-44、50、51、55-67和72-74任一個中的一個或多個捕獲劑和檢測劑對。本發(fā)明還考慮使用多個捕獲劑和檢測劑對。在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括乳腺珠蛋白-MFG-E8、SIM2-MFG-E8和NK-2R-MFG-E8的結(jié)合劑對。在另一個實(shí)施方案中，一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括整聯(lián)蛋白-MFG-E8、NK-2R-MFG-E8和Gal3_MFG_E8的結(jié)合劑對。在再另一個實(shí)施方案中，一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括AURK3、A33、CD63、Gro- α和整聯(lián)蛋白的捕獲劑；和MUC2、PCSA和CD81的檢測劑。所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對還可以包括AURKB、CD63、FLNA, Α33、Gro-α、整聯(lián)蛋白、CD24、SSX2和SM2的檢測劑；及MUC2、PCSA、CD81、MFG_E8和EpCam的檢測劑。所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對可以包括EaCam-MMP7、PCSA-MMP7和EpCam-BCNP的結(jié)合劑對。所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對可以包括EpCam-MMP7、PCSA-MMP7、EpCam-BCNP,PCSA-ADAM10和PCSA-KLK2的結(jié)合劑對。在另一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括 EpCam-MMP7、PCSA-MMP7、EpCam-BCNP, PCSA-ADAM10、PCSA-KLK2、PCSA-SPDEF,CD81-MMP7、PCSA-EpCam、MFGE8-MMP7和PCSA-1L-8的結(jié)合劑對。在再另一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-MMP7、PCSA-MMP7、EpCam-BCNP、PCSA-ADAM10和CD81-MMP7的結(jié)合劑對。除非另外指出，本文中公開的結(jié)合劑對可以包括“捕獲劑的靶標(biāo)“檢測劑的靶標(biāo)”和“檢測劑的靶標(biāo)“捕獲劑的靶標(biāo)”。
[0030]在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括ADAM-10、BCNP,⑶9、EGFR、EpCam、IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、PCSA、SERPINB3、SPDEF、SSX2 和 SSX4 中一種或多種的捕獲劑。所述對可以進(jìn)一步包括EpCam的檢測劑。所述對還可以包括PCSA的檢測劑。所述生物印記可以用于表征前列腺癌，如用于檢測從前列腺癌細(xì)胞脫落的微囊泡、用于區(qū)分前列腺癌和非癌樣品、用于將`癌癥分期或分級，或用于提供診斷、預(yù)后或治療診斷。
[0031]在另一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括選自EpCAM-EpCAM、EpCAM-KLK2、EpCAM-PBP、EpCAM-SPDEF, EpCAM_SSX2、EpCAM_SSX4、EpCAM-ADAM-lO、EpCAM-SERPINB3、EpCAM-PCSA、EpCAM_p53、EpCAM-MMP7, EpCAM-1LlB、EpCAM-EGFR,EpCAM-CD9、EpCAM-BCNP、KLK2_EpCAM、KLK2-KLK2、KLK2-PBP、KLK2-SPDEF、KLK2-SSX2、KLK2-SSX4、 KLK2-ADAM-10、 KLK2-SERPINB3、 KLK2-PCSA、 KLK2_p53、 KLK2-MMP7、KLK2-1L1B、 KLK2-EGFR、 KLK2-CD9、 KLK2-BCNP、 PBP-EpCAM、 PBP-KLK2、 PBP-PBP、PBP-SPDEF、PBP-SSX2、PBP-SSX4、PBP-ADAM-1O、PBP-SERPINB3、PBP-PCSA、PBP_p53、PBP-MMP7、PBP-1L1B、PBP-EGFR, PBP-CD9、PBP-BCNP, SPDEF-EpCAM、SPDEF-KLK2、SPDEF-PBP, SPDEF-SPDEF、SPDEF-SSX2、SPDEF-SSX4、SPDEF-ADAM-1O、SPDEF-SERPINB3、SPDEF-PCSA、SPDEF-p53、SPDEF-MMP7、SPDEF-1L1B、SPDEF-EGFR, SPDEF-CD9、SPDEF-BCNP,SSX2-EpCAM、SSX2-KLK2、SSX2-PBP、SSX2-SPDEF、SSX2-SSX2、SSX2-SSX4、SSX2-ADAM-10、SSX2-SERPINB3、SSX2-PCSA、SSX2_p53、SSX2-MMP7、SSX2-1L1B、SSX2-EGFR、SSX2-CD9、SSX2-BCNP、SSX4-EpCAM、SSX4-KLK2、SSX4-PBP、SSX4-SPDEF、SSX4-SSX2、SSX4-SSX4、SSX4-ADAM-10、SSX4-SERPINB3、SSX4-PCSA、SSX4_p53、SSX4-MMP7、SSX4-1L1B、SSX4-EGFR、SSX4-CD9、SSX4-BCNP、ADAM-10-EpCAM、ADAM-10-KLK2、ADAM-10-PBP, ADAM-10-SPDEF,ADAM-10-SSX2、ADAM-10-SSX4、ADAM-10-ADAM-10、ADAM-10-SERPI NB 3、ADAM-10-PCSA,ADAM-10-p53、ADAM-10-MMP7、ADAM-10-1L1B、ADAM-1O-EGFR、ADAM-10-CD9、ADAM-10-BCNP,SERPINB3-EpCAM、 SERPINB3-KLK2、 SERPINB3-PBP、 SERPINB3-SPDEF、 SERPINB3-SSX2、SERPINB3-SSX4, SERPINB3-ADAM-10, SERPINB3-SERPINB3、SERPINB3-PCSA、SERPINB3_p53、SERPINB3-MMP7、 SERPINB3-1L1B、 SERPINB3-EGFR、 SERPINB3-CD9、 SERPINB3-BCNP、PCSA-EpCAM、PCSA-KLK2、PCSA-PBP, PCSA-SPDEF, PCSA-SSX2、PCSA-SSX4、PCSA-ADAM-1O、PCSA-SERPINB3、PCSA-PCSA, PCSA_p53、PCSA-MMP7、PCSA-1L1B、PCSA-EGFR, PCSA-CD9、PCSA-BCNP、p53-EpCAM、p53_KLK2、p53_PBP、p53_SPDEF、p53_SSX2、p53_SSX4、p53_ADAM_10、P53-SERPINB3、p53_PCSA、p53_p53、p53_MMP7、p53_ILlB、p53_EGFR、p53_CD9、p53_BCNP、MMP7-EpCAM、MMP7-KLK2、MMP7-PBP、MMP7-SPDEF、MMP7-SSX2、MMP7-SSX4、MMP7-ADAM-10、MMP7-SERPINB3、MMP7-PCSA、MMP7_p53、MMP7-MMP7、MMP7-1L1B、MMP7-EGFR、MMP7-CD9、MMP7-BCNP、 ILlB-EpCAM、 IL1B-KLK2、 ILlB-PBP,IL1B-SPDEF、 IL1B-SSX2、 IL1B-SSX4、IL1B-ADAM-10、IL1B-SERPINB3、IL1B-PCSA、ILlB_p53、IL1B-MMP7、IL1B-1L1B、IL1B-EGFR、IL1B-CD9、IL1B-BCNP、EGFR-EpCAM、EGFR-KLK2、EGFR-PBP, EGFR-SPDEF、EGFR-SSX2、EGFR-SSX4、EGFR-ADAM-10、EGFR-SERPINB3、EGFR-PCSA、EGFR-p53、EGFR-MMP7、EGFR-1L1B、EGFR-EGFR、EGFR-CD9、EGFR-BCNP、CD9_EpCAM、CD9-KLK2、CD9-PBP、CD9-SPDEF、CD9-SSX2、CD9-SSX4、CD9-ADAM-10、CD9-SERPINB3、CD9-PCSA、CD9_p53、CD9-MMP7、CD9-1L1B、CD9-EGFR、CD9-CD9、CD9-BCNP、BCNP-EpCAM、BCNP-KLK2、BCNP-PBP、BCNP-SPDEF、BCNP-SSX2、BCNP-SSX4、BCNP-ADAM-10、BCNP-SERPINB3、BCNP-PCSA、BCNP_p53、BCNP-MMP7、BCNP-1L1B、BCNP-EGFR、BCNP-CD9、BCNP-BCNP及其組合的結(jié)合劑對。如該段中所列的，所述對包括“捕獲劑的靶標(biāo)“檢測劑的靶標(biāo)”。所述生物標(biāo)記可以用于表征前列腺癌。
[0032]在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCAM、KLK2、PBP、SH)EF、SSX2、SSX4、EGFR中一個或多個的捕獲劑；和EpCam的檢測劑。所述生物印記可以用于表征前列腺癌。
[0033]如所述的，可以使用多個捕獲劑和檢測劑對檢測所述的一種或多種微囊泡。在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括多種選自以下的捕獲劑:SSX4和EpCAM ；SSX4 和 KLK2 ；SSX4 和 PBP ；SSX4 和 SPDEF ；SSX4 和 SSX2 ；SSX4 和 EGFR ；SSX4 和 MMP7 ；SSX4 和 BCNPl ；SSX4 和 SERPINB3 ；KLK2 和 EpCAM ；KLK2 和 PBP ；KLK2 和 SPDEF ；KLK2 和 SSX2 ；KLK2 和 EGFR ；KLK2 和 MMP7 ；KLK2 和 BCNPl ；KLK2 和 SERPINB3 ；PBP 和 EGFR ；PBP 和 EpCAM ；PBP 和 SPDEF ；PBP 和 SSX2 ；PBP 和 SERPINB3 ；PBP 和 MMP7 ；PBP 和 BCNPl ；EpCAM 和 SPDEF ；EpCAM 和 SSX2 ;EpCAM 和 SERPINB3 ;EpCAM 和 EGFR ;EpCAM 和 MMP7 ;EpCAM 和 BCNPl ;SPDEF 和SSX2 ;SPDEF和 SERPINB3 ;SPDEF和 EGFR ;SPDEF和MMP7 ;SPDEF和 BCNPl ;SSX2 和 EGFR ；SSX2和 MMP7 ；SSX2 和 BCNPl ；SSX2 和 SERPINB3 ；SERPINB3 和 EGFR ；SERPINB3 和 MMP7 ；SERPINB3和BCNPl ；EGFR和MMP7 ；EGFR和BCNPl ；MMP7和BCNPl及其組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述檢測劑包括EpCAM檢測劑。在一些實(shí)施方案中，所述檢測劑識別四跨膜蛋白、⑶9、⑶63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、膜聯(lián)蛋白 V、MFG_E8 或表 3 中的蛋白質(zhì)中的一種或多種。在另一個實(shí)施方案中，所述檢測劑識別⑶9、⑶63、⑶81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、ADAM-10、BCNP、EGFR、IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、SERPINB3、SPDEF、SSX2 和 SSX4 中的一種或多種。使用多種捕獲劑時，所述試驗(yàn)可以使用單一檢測劑復(fù)用。或者，各種捕獲劑可以與不同檢測劑配對。所述生物印記可以用于表征前列腺癌。
[0034]在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括選自EpCam-EpCam、EpCam-KLK2、EpCam-PBP, EpCam-SPDEF, EpCam_SSX2、EpCam_SSX4、EpCam-EGFR 及其組合的結(jié)合劑對。EpCAM可以是檢測劑的靶標(biāo)。所述生物印記可以用于表征前列腺癌。
[0035]在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-EpCam的結(jié)合劑。
[0036]在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam_KIK2的結(jié)合劑。
[0037]在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-PBP的結(jié)合劑。
[0038]在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-SroEF的結(jié)合劑。
[0039]在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam_SSX2的結(jié)合劑。
[0040]在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam_SXX4的結(jié)合劑。
[0041]在一個實(shí)施方案中，所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-EGFR的結(jié)合劑。
`[0042]在本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，所述生物樣品包括體液。合適的體液包括但不限于外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper’ s fluid)或預(yù)射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛發(fā)、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、膽汁、間質(zhì)液、經(jīng)血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管抽吸液、囊胚腔液、臍帶血，或其任何衍生物。例如，生物樣品可以包括尿液、血液或血液衍生物(例如，血清或血衆(zhòng))，或其任何衍生物。
[0043]在本發(fā)明方法的一些實(shí)施方案中，所述生物樣品包括組織樣品、來自組織樣品的細(xì)胞或從這些細(xì)胞釋放的一種或多種循環(huán)生物標(biāo)志物，或其任何衍生物。例如，可以進(jìn)行本發(fā)明的方法來鑒定針對組織樣品的生物印記。所述生物樣品可以包括細(xì)胞培養(yǎng)物樣品，例如，所述樣品可以包括培養(yǎng)的細(xì)胞和/或包含從這些培養(yǎng)的細(xì)胞釋放的循環(huán)生物標(biāo)志物的培養(yǎng)基。所述組織樣品或培養(yǎng)物樣品可以是癌樣品，或可以包括腫瘤樣品或腫瘤細(xì)胞。
[0044]在本發(fā)明的方法中，所述生物樣品可以包括一種或多種微囊泡。所述生物樣品也可以由一種或多種微囊泡組成。在一些實(shí)施方案中，一種或多種生物標(biāo)志物與一種或多種微囊泡相關(guān)。一種或多種微囊泡可以具有IOnm至2000nm的直徑,例如，20nm至1500nm,20nm 至 1000nm, 20nm 至 500nm,或 20nm 至 200nm。
[0045]可以使用本文中公開的或本領(lǐng)域已知的方法從樣品中分離一種或多種微囊泡。在實(shí)施方案中，一種或多種微囊泡經(jīng)受尺寸排阻色譜、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和純化、親和捕獲、親和選擇、免疫分析、ELISA、微流體分離、流式細(xì)胞分析或其組合。
[0046]可以將一種或多種微囊泡接觸一種或多種試劑。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種試劑包含核酸、DNA分子、RNA分子、抗體、抗體片段、適體、類肽、zDNA、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、凝集素、肽、枝狀物、膜蛋白標(biāo)記劑、化學(xué)化合物或其組合。例如，結(jié)合劑可以是抗體或適體。一種或多種結(jié)合劑可以用于捕獲和/或檢測一種或多種微囊泡。在一個實(shí)施方案中，一種或多種結(jié)合劑結(jié)合一種或多種微囊泡上的一種或多種表面抗原。一種或多種表面抗原可以包含一種或多種蛋白質(zhì)。
[0047]該一種或多種蛋白質(zhì)可以是目標(biāo)囊泡上的任何有用的生物標(biāo)志物，如本文中公開的那些。在一個實(shí)施方案中，一種或多種蛋白質(zhì)包括一種或多種細(xì)胞特異性或癌癥特異性的囊泡標(biāo)志物，例如，CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA, B7H3、EpCam或者表4或5中的蛋白質(zhì)。一種或多種蛋白質(zhì)還可以包括一般囊泡標(biāo)志物，例如，四跨膜蛋白(tetraspanin)、⑶9、CD63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD52、Rab-5b、膜聯(lián)蛋白 V、MFG_E8 或表 3 的蛋白質(zhì)中的一種或多種。在一個實(shí)施方案中，一種或多種蛋白質(zhì)包括表3-5任一中的一種或多種蛋白質(zhì)。例如，所述一種或多種蛋白質(zhì)可以包括0)9、0)63、0)81、？5獻(xiàn)、？05六、87!133?0&111、ADAM-10、BCNP、EGFR、IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、SERPINB3、SPDEF、SSX2 和 SSX4 中的一種或多種。
[0048]所述一種或多種試劑可以用于捕獲一種或多種微囊泡。捕獲的微囊泡可以用于進(jìn)一步的評估。例如，可以評價(jià)微囊泡內(nèi)的有效負(fù)載。微囊泡有效負(fù)載包括一種或多種核酸、肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。所述核酸可包含一種或多種DNA、mRNA、微 RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA 或 shRNA。在一個實(shí)施方案中，一種或多種生物標(biāo)志物包括一種或多種捕獲的微囊泡內(nèi)的有效負(fù)載。例如，一種或多種生物標(biāo)志物可以包括mRNA有效負(fù)載。一種或多種生物標(biāo)志物還可以包括微RNA有效負(fù)載。一種或多種生物標(biāo)志物還可以包括蛋白質(zhì)有效負(fù)載，例如，內(nèi)膜蛋白質(zhì)或可溶性蛋白質(zhì)。
[0049]本發(fā)明的方法可以在體外進(jìn)行，例如，使用體外生物樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物樣品。
[0050]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所分析的癌癥可以是肺癌，包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌(包括小細(xì)胞癌(燕麥細(xì)胞癌)、混合小細(xì)胞/大細(xì)胞癌和復(fù)合性小細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰癌(pancreas cancer)、腦癌、腎癌、卵巢癌、胃癌(stomachcancer)、皮膚癌、骨癌、胃癌(gastric cancer)、乳腺癌、胰腺癌(pancreatic cancer)、膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、乳頭狀腎癌、頭頸鱗狀上皮細(xì)胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或?qū)嶓w腫瘤。
[0051]在實(shí)施方案中，通過本發(fā)明方法表征的癌癥包括急性成淋巴細(xì)胞性白血??；急性骨髓性白血??；腎上腺皮質(zhì)癌；AIDS相關(guān)癌癥；AIDS相關(guān)淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細(xì)胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細(xì)胞癌；膀胱癌；腦干膠質(zhì)瘤；腦腫瘤(包括腦干膠質(zhì)瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎性瘤、星形細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和成松果體細(xì)胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發(fā)部位不明的癌癥；類癌瘤；原發(fā)部位不明的癌瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌癥；脊索瘤；慢性淋巴細(xì)胞性白血?。宦怨撬栊园籽。宦怨撬柙鲋澄蓙y；結(jié)腸癌；結(jié)直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細(xì)胞淋巴瘤；內(nèi)分泌胰島細(xì)胞瘤；子宮內(nèi)膜癌；成室管膜母細(xì)胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺 神經(jīng)細(xì)胞瘤（esthesioneuroblastoma);尤文氏肉瘤；頡外生殖細(xì)胞瘤；性腺外生殖細(xì)胞腫 瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的（胃）癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤；胃腸道間 質(zhì)瘤（GIST);妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；毛細(xì)胞白血?。活^頸癌；心臟癌；霍奇金淋 巴瘤；喉咽癌；眼內(nèi)黑色素瘤；胰島細(xì)胞瘤；卡波濟(jì)氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞 增生癥；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維組織細(xì)胞瘤骨癌；髓母細(xì)胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤； Merkel細(xì)胞癌；Merkel細(xì)胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發(fā)性的轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發(fā) 性內(nèi)分泌腫瘤綜合征；多發(fā)性骨髓瘤；多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發(fā)育 異常綜合征；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色 素瘤皮膚癌；非小細(xì)胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌； 卵巢上皮癌；卵巢生殖細(xì)胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤??；副鼻竇癌； 甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤；成松果體細(xì)胞瘤；垂體 瘤；漿細(xì)胞腫瘤/多發(fā)性骨髓瘤；胸膜肺母細(xì)胞瘤；原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)淋巴瘤；原 發(fā)性肝細(xì)胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細(xì)胞（腎）癌；腎細(xì)胞癌；呼吸道癌；視網(wǎng)膜 母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌癥；S6zary綜合征；小細(xì)胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗 狀細(xì)胞癌；鱗狀頸癌?’胃(胃的）癌；幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤；T細(xì)胞淋巴瘤；睪丸癌；咽 喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細(xì)胞癌；腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌；滋養(yǎng)細(xì)胞腫 瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstr6m巨球蛋白血癥； 或Wilm’ s腫瘤。例如，所述癌癥可以是前列腺癌、肺癌、腦癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌或卵巢 癌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥是前列腺癌。
[0052]本發(fā)明的方法可以在體外進(jìn)行，例如，使用體外生物樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物樣品。
[0053]在一個方面中，本發(fā)明提供了進(jìn)行本發(fā)明任一方法的試劑。例如，本發(fā)明提供使用 試劑來進(jìn)行所述方法。在一個相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含進(jìn)行本發(fā)明任一 方法的試劑。試劑可以是結(jié)合試劑，包括但不限于一種或多種生物標(biāo)志物的抗體或適體。 例如，試劑可以是能夠結(jié)合表 3-5、9-11、16-27、29、31-32、37-38、40-47、49-52、54-67 和 69-74任一個中的至少一種生物標(biāo)志物的結(jié)合劑。在一些實(shí)施方案中，將結(jié)合劑直接標(biāo)記或 配置成進(jìn)行間接標(biāo)記。
[0054]在另一個方面中，本發(fā)明提供了分離的PCSA+、Muc2+、Adaml0+囊泡。在相關(guān)的 方面中，本發(fā)明提供了 MMP7+囊泡。本發(fā)明進(jìn)一步提供了 Ag02+囊泡。該囊泡可以含有有 效負(fù)載，其包含一種或多種選自表5的微RNA。例如，所述微RNA可以選自miR-22、let7a、 miR-14KmiR-182^miR-663^miR-155^mirR-125a-5p^miR-548a-5p^miR-628-5p^miR-517;!<^ miR_450a、miR-920、hsa-miR-619、miR-1913、miR-224*、miR-502_5p、miR-888、miR_376a、 miR-542-5p、miR-30b*、miR-1179及其組合。該囊泡還可以含有有效負(fù)載，其包含選自表5 中的一種或多種信使RNA(mRNA)。例如，所述mRNA可以選自表20-24。
[0055]通過引用并入
[0056]本說明書中提及的所有公開、專利和專利申請均以引用方式并入本文，其引用的 程度如同各單個公開、專利或?qū)＠暾埦囟ǖ厍覇为?dú)地表明以引用的方式并入一般。
[0057]附圖簡述
[0058]圖1A描述了鑒定包含核酸的生物印記以表征表型的方法。圖1B描述了鑒定囊泡或囊泡群體的生物印記以表征表型的方法。
[0059]圖2A-F詳細(xì)描述了通過評估囊泡生物印記而表征表型的方法。圖2A為涂敷有捕獲抗體的平面基底的簡圖，所述的捕獲抗體捕獲表達(dá)該蛋白質(zhì)的囊泡。所述捕獲抗體是針對囊泡蛋白質(zhì)(其對源自病變細(xì)胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特異性)的。所述檢測抗體與捕獲的囊泡結(jié)合并提供熒光信號。所述檢測抗體可檢測通常與囊泡相關(guān)的抗原，或檢測與細(xì)胞源或疾病(如癌癥)相關(guān)的抗原。圖2B為涂敷有捕獲抗體的珠的簡圖，所述捕獲抗體捕獲表達(dá)該蛋白質(zhì)的囊泡。所述的捕獲抗體是針對囊泡蛋白質(zhì)(其對于源自病變細(xì)胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特異性)的。所述檢測抗體與捕獲的囊泡結(jié)合并提供熒光信號。所述檢測抗體可檢測通常與囊泡相關(guān)的抗原，或檢測與細(xì)胞源或疾病(如癌癥)相關(guān)的抗原。圖2C為篩選方案的實(shí)例，其可以通過使用如圖2B中所示的珠以多重方式實(shí)施。圖2D示出了捕獲或檢測囊泡以表征表型的說明性示意圖。圖2E示出了用于評估囊泡有效負(fù)載以表征表型的說明性方案。圖2F示出了用于捕獲和檢測囊泡以及任選評估有效負(fù)載來表征表型的說明性方案。
[0060]圖3詳細(xì)說明了可以在本發(fā)明的一些示例性實(shí)施方案中使用的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。
[0061]圖4詳細(xì)說明了使用檢測來自受試者的囊泡的基于珠的方法描述結(jié)果的方法。在給定強(qiáng)度下捕獲的珠的數(shù)量為囊泡以怎樣的頻率在所述強(qiáng)度下表達(dá)檢測蛋白質(zhì)的指示。對于給定的珠而言，信號的強(qiáng)度越強(qiáng)，則檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)越多。該圖顯示了通過將正常的患者組合到一條曲線中而將癌癥患者組合到另一條曲線中，并使用生物統(tǒng)計(jì)分析區(qū)分所述曲線而得到的歸一化的圖。對由各個個體得到的數(shù)據(jù)歸一化以考慮由檢測儀器所讀取的珠的數(shù)量的差異，將這些數(shù)據(jù)加和，然后再次歸一化以考慮各群體中的不同樣品數(shù)。
[0062]圖5說明了通過評估TMPRSS2-ERG表達(dá)使用EpCam對來自血漿的前列腺癌細(xì)胞源囊泡的捕獲。將VcaP純化的囊泡摻入到正常血漿中，然后與涂敷有EpCam或同種型對照抗體的Dynal磁珠一起孵育。由Dynal珠上直接分離RNA。使用來自各樣品的等體積RNA來進(jìn)行RT-PCR以及隨后的Taqman分析。
`[0063]圖6描述了使用⑶9珠捕獲的miR-21或miR-141表達(dá)的柱狀圖。將得自前列腺癌患者的Iml血漿、250ng/ml的LNCaP或正常的純化囊泡與⑶9涂敷的Dynal珠孵育。由所述的珠和珠上清液中分離RNA。此外，對一個樣品(#6)不進(jìn)行捕獲以用于比較。使用qRT-PCR測量微RNA的表達(dá)，并比較各樣品的平均CT值。CD9捕獲改善了前列腺癌樣品中miR-21 和 miR-141 的檢測。
[0064]圖7A說明了使用MoFlo XDP進(jìn)行的囊泡分離和鑒定。圖7B說明了 VCaP細(xì)胞的FACS分析和用⑶9、B7H3、PCSA和PSMA抗體染色外來體。圖7C說明了與總體囊泡群體相t匕，在流式分選B7H3+或PSMA+囊泡群體中獲得了 miR表達(dá)的不同模式。
[0065]圖8A-H是檢測樣品中的囊泡，其中使用微球平臺評估所希望的囊泡的存在或水平。圖8A是使用基于柱的過濾方法從血漿中分離囊泡的示意圖，其中所述分離的囊泡隨后使用微球平臺進(jìn)行評估。圖8B是由于諸如超離心這樣的高速離心而導(dǎo)致囊泡膜壓縮的示意圖。圖8C是使用激光檢測對結(jié)合于微球的囊泡進(jìn)行檢測的示意圖。圖8D表示檢測結(jié)合基底的前列腺源囊泡的實(shí)例。用栓系于基底的PCSA、PSMA或B7H3特異性捕獲劑捕獲微囊泡。用熒光標(biāo)記的⑶9、⑶63和⑶81特異性的檢測劑來標(biāo)記由此捕獲的囊泡。圖8E說明了使用微球平臺(Y-軸)或流式細(xì)胞術(shù)(X-軸)檢測的CD9陽性囊泡的相關(guān)性。為了計(jì)算中值熒光強(qiáng)度(MFI)，用栓系于微球的抗-CD9抗體捕獲囊泡，并且使用熒光標(biāo)記的CD9、CD63和CD81特異性的檢測抗體檢測。圖8F說明了使用微球平臺(Y-軸)或BCA蛋白分析(X-軸)檢測的PCMA、PCSA或B7H3陽性囊泡的相關(guān)性。為了計(jì)算MFI，用栓系于微球的B7H3.PSMA或PCSA的抗體捕獲囊泡，并且使用熒光標(biāo)記的⑶9、⑶63和⑶81特異性的檢測抗體檢測。圖8G說明了以單重或多重方式使用微球分析檢測⑶81陽性囊泡的類似平臺。囊泡使用栓系于微球的抗⑶81抗體捕獲，并且使用熒光標(biāo)記的⑶9、⑶63和⑶81特異性的檢測抗體檢測。圖8H說明了以單重或多重方式使用微球分析檢測B7H3、⑶63、⑶9或EpCam的相似性能。用栓系于微球的B7H3、CD63、CD9或EpCam的抗體捕獲囊泡，并且使用熒光標(biāo)記的⑶9、⑶63和⑶81特異性的檢測抗體檢測。
[0066]圖9A詳細(xì)說明了囊泡生物印記區(qū)分正常前列腺和PCa樣品的能力。癌癥標(biāo)志物包括EpCam和B7H3。一般囊泡標(biāo)志物包括⑶9、⑶81和⑶63。前列腺特異性標(biāo)志物包括PCSA。PSMA可以與PCSA—樣使用。據(jù)發(fā)現(xiàn)所述測試對于PCa對比正常樣品具有96%的靈敏度和95%的特異性。圖9B在Y軸上示出了正常和前列腺癌患者中圖9A的囊泡標(biāo)志物的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
[0067]圖10是用于囊泡前列腺癌分析的決策樹的示意圖，以用于確定樣品對于前列腺癌是否為陽性。
[0068]圖11顯示了根據(jù)所述決策樹針對前列腺癌的囊泡檢測分析相對于使用提高的PSA水平進(jìn)行檢測的結(jié)果。
[0069]圖12說明了從對照和PCa樣品分離的囊泡中的miR-145的水平。
[0070]圖13A-13E詳細(xì)說明了使用微RNA確認(rèn)來自基于囊泡的前列腺癌診斷分析的假陰性。圖13A詳細(xì)說明了使用囊泡中的miR分析以將假陰性轉(zhuǎn)換成真陽性的示意圖，由此改善了靈敏度。圖13B詳細(xì)說明了使用囊泡中的miR分析以將假陽性轉(zhuǎn)換成為真陰性的示意圖，由此改善特異性。miR-107(圖13C)和miR-141 (圖13D)的歸一化水平在Y軸上針對所述囊泡診斷分析所得的真陽性(TP)、所述囊泡診斷分析所得的真陰性(TN)、所述囊泡診斷分析所得的假陽性(FP)和所述囊泡診斷分析所得的假陰性(FN)示出。miR-107和miR-141可以用于圖13A和圖13B中所示的方案中。圖13E顯示了使用不同的樣品群組，與未患前列腺癌的患者相比，前列腺癌患者的血漿cMV中提高的miR-107的Taqman qRT_PCR驗(yàn)證。
[0071]圖14A-D說明了結(jié)腸直腸癌(CRC)細(xì)胞系和患者樣品中的KRAS測序。樣品包括從細(xì)胞系(圖14B)或從患者的組織樣品(圖14D)獲得的基因組DNA，或從細(xì)胞系(圖14A)或患者的血漿樣品(圖14C)脫落的囊泡內(nèi)的RNA有效負(fù)載獲得的cDNA。
[0072]圖15A-B說明了來自人血漿的微RNA的免疫沉淀。圖15A顯示了人血漿的各種部分中檢測到的平均miR-16量。“(Beads) ”是使用針對Argonaute2 (Ago2)、阿樸脂蛋白Al (ApoAl)、GW182和IgG對照的抗體共同免疫沉淀的miR-16的含量?！癉yna”是指使用Dynabead蛋白G的免疫沉淀，而“Magna”是指Magnabind蛋白G珠?！皊upemt”是免疫沉淀反應(yīng)的上清液中檢測的miR-16的量。對于詳細(xì)內(nèi)容，參見實(shí)施例。圖15B與圖15A相同，除了檢測了 miR-92a。
[0073]圖16說明了用PE標(biāo)記的抗-PCSA抗體和FITC標(biāo)記的抗_Ago2抗體染色的復(fù)合物的流式分選。
[0074]圖17A-D說明了人血漿樣品中PCSA/Ago2陽性復(fù)合物中微RNA的檢測。血漿樣品來自患有前列腺癌(PrC)的受試者或正常對照(正常)。圖17A顯示了來自人血漿的總循環(huán)微囊泡群體中的miR-22拷貝數(shù)。圖17B顯示了使用針對PCSA和Argonaute2(Ago2)的抗體來分選血漿源的復(fù)合物。分離RNA且miR-22的拷貝數(shù)在PCSA/Ago2雙陽性事件的群體中測定。圖17C顯示了對于每個血漿樣品通過流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)的PCSA/Ago2雙陽性事件的數(shù)目。圖17D對于每個血漿樣品顯示miR-22拷貝數(shù)除以PCSA/Ago2陽性事件總數(shù)的結(jié)果。這獲得了每個PCSA/Ago2雙陽性復(fù)合物的miR-22拷貝數(shù)。
[0075]圖18A-D說明了用抗-⑶9和/或抗-PCSA染色的循環(huán)微囊泡(cMV)的流式細(xì)胞分析。圖18A說明了使用⑶9和PCSA的標(biāo)記抗體分析血漿源的cMV。圖18B說明了使用抗-⑶9和抗-PCSA的雙重免疫沉淀后雙陽性⑶9/PCSA cMV的富集。比較圖18A和圖18B之間區(qū)域R7中的雙陽性群體。圖18C說明了使用針對PCSA的標(biāo)記抗體分析血漿源的cMV。圖18D說明了使用抗PCSA的抗體的單一免疫沉淀后PCSA陽性事件的富集。比較圖18C和圖18D之間區(qū)域R4中的群體。
[0076]圖19A-G說明了各種不同血漿部分中miR-22的水平。圖19A說明了如通過ABITaqman檢測試劑盒(Assay ID#000398)測定的未改變血漿中的miR-22拷貝數(shù)。圖19B說明了如通過ABI Taqman檢測試劑盒測定的從患者血衆(zhòng)濃縮的總循環(huán)微囊泡群體中的miR-22拷貝數(shù)。圖19C說明了使用從抗-CD9柱釋放的起始材料在抗-PCSA柱上保留的miR-22拷貝數(shù)。圖19D說明了如使用基于珠的分析測定的相對于樣品匹配PCSA MFI的miR-22拷貝數(shù)。用于雙重免疫沉淀的癌癥和正常輸入血漿的平均PCSA MFI信號分別是161.67和729.17。圖19E說明了輸入血漿中的miR-22拷貝數(shù)。圖19F說明了來自圖19E的輸入血漿的保留在抗-PCSA柱上的cMV的miR-22拷貝數(shù)。圖19G說明了如使用基于珠的分析測定的相對于樣品匹配PCSA MFI的miR-22拷貝數(shù)。用于單一 IP的癌癥和正常血漿的平均PCSA MFI信號分別是69.17和526.5。
[0077]圖20A-C說明了使用 源自PCSA和PSMA蛋白的水平以及與分離自血漿的cMV相關(guān)的miR-22和let7a微RNA的評分來區(qū)分PCa和正常(非PCa)樣品。圖20A顯示了對于正常和癌癥樣品計(jì)算的評分的曲線圖。圖20B顯示了圖20A的數(shù)據(jù)，其中將正常分成正常組(無前列腺病癥)、非典型組、炎癥組和高等級前列腺上皮內(nèi)瘤組(高等級PIN，或HGPIN)，并且將癌癥分成確定為觀察等待(WW)或癌癥的組。圖20C顯示了用該數(shù)據(jù)產(chǎn)生的ROC曲線。AUC 為 0.77。
[0078]圖2IA-B顯示了用于不同樣品群體中miR-920(圖21A)和miR_450a(圖21B)的差異表達(dá)的曲線圖。樣品包含從血漿分離的PCSA表達(dá)cMV中的微RNA。與前列腺癌(“癌癥”)和正常(“正?！?相比，miR-920在混雜疾病(即，高等級PIN( “hgpin”)和炎性疾病(“炎癥”))中過表達(dá)。與其他相比，miR-450在癌癥中下調(diào)。
[0079]圖22A-F說明了來自囊泡mRNA有效負(fù)載水平的微陣列譜分析的選定mRNA的減去原始背景的熒光值的點(diǎn)圖。在每個圖中，Y軸顯示了減去原始背景的熒光值(原始BGsub熒光)。X軸顯示了四個正常對照血漿和四個來自前列腺癌患者的血漿的點(diǎn)圖。所示的mRNA為 A2ML1 (圖 22A)、GABARAPL2 (圖 22B)、PTMA (圖 22C)、RABACl (圖 22D)、SOXl (圖 22E)和ETFB (圖 22F)。
[0080]圖23A-23B說明了從非復(fù)發(fā)前列腺癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌樣品分離的囊泡中miR-141 (圖23A)和miR-375 (圖23B)的水平，如X軸上所示。使用Taqman分析檢測了從囊泡分離的miR。P值顯示于曲線下方。Y軸顯示了檢測的miR的拷貝數(shù)。
[0081]圖24A-24B說明了使用患者血樣來區(qū)分肺癌和正常(非肺癌)的微RNAmiR-497。Y-軸顯示了 0.1ml樣品中的miR-497拷貝數(shù)。在圖24A中，水平線表示1154個拷貝的拷貝數(shù)。在圖24B中，水平線表示1356的拷貝數(shù)。圖24C是用于通過檢驗(yàn)循環(huán)微囊泡(cMV)中的miR-497水平區(qū)分非-小細(xì)胞肺癌和正常血漿樣品的受試者工作特征(ROC)曲線。數(shù)據(jù)對應(yīng)于圖24B。
[0082]圖25A是結(jié)合于載玻片的Vcap-衍生微囊泡的電子顯微照片。圖25B是Vcap-衍生的微囊泡的掃描電子顯微照片，而圖25C是結(jié)合于用聚-L-賴氨酸涂覆的聚苯乙烯珠的Vcap微囊泡的掃描電子顯微照片。圖2?說明了按照樣品收集實(shí)驗(yàn)方案中詳細(xì)說明的處理成血漿的血液。
[0083]圖26A-E說明了微RNA功能分析。圖26A顯示了標(biāo)記的合成RNA分子261-266和含有感興趣的目標(biāo)微RNA267的核蛋白復(fù)合物。圖26B證明了在被核蛋白復(fù)合物267識別時，在目標(biāo)識別位點(diǎn)263處的合成RNA分子的切割，由此釋放標(biāo)記265-266。圖26C-E說明了來自各種來源的輸入核蛋白復(fù)合物。
[0084]圖27A-B顯示了用于區(qū)分前列腺癌的囊泡標(biāo)志物的組。在圖27A中，使用各自栓系于不同微珠群體的乳腺珠蛋白、SM2和NK-2R的抗體來捕獲囊泡。用PE-標(biāo)記的抗MFG-E8抗體來檢測捕獲的囊泡。圖27A顯示了通過基于所檢測的囊泡的水平區(qū)分61個前列腺癌和68個非前列腺癌樣品產(chǎn)生的ROC曲線。AUC為0.90。在圖上通過箭頭所示的點(diǎn)處，靈敏度為0.85，而特異性為0.84。在圖27B中，使用各自栓系于不同微珠群體的整聯(lián)蛋白、NK-2R和Gal3的抗體來捕獲囊泡。用PE-標(biāo)記的抗MFG-E8抗體來檢測捕獲的囊泡。圖27B顯示了通過基于所檢測的囊泡的水平區(qū)分61個前列腺癌和32個良性前列腺樣品(例如，患有BPH但沒有重度炎癥的男 性)產(chǎn)生的ROC曲線。AUC為0.84。在圖上通過箭頭所示的點(diǎn)處，靈敏度為0.82，而特異性為0.75。
[0085]圖28A-G顯示了來自所示樣品組中的患者血漿的微囊泡中檢測的miR水平。在圖28A-G中，y-軸是來自miR的TR-PCR測量的Ct值，而X-軸集合了以下樣品組中的miR水平，從左至右:1)前列腺癌；2)高等級pin (HGPIN) ；3)炎癥;和4)良性前列腺病癥(例如，BPH)。圖28A顯示了 miR-614的水平。圖28B顯示了 miR-211的水平。圖28C顯示了miR-136的水平。圖28D顯示了 miR-149的水平。圖28E顯示了 miR-221*的水平。圖28F顯示了 miR-329的水平。圖28G顯示了 miR_26b的水平。
[0086]圖29A-B顯示了證明不同囊泡捕獲劑和檢測劑區(qū)分前列腺的能力的ROC曲線。在圖29A中，捕獲劑識別AURKB、A33、CD63、Gro-α和整聯(lián)蛋白，而檢測劑識別MUC2、PCSA和⑶81。ROC曲線的AUC為0.8306，與PSA的僅0.59相比較。在表示囊泡標(biāo)志物的最外側(cè)ROC上所標(biāo)示點(diǎn)處，靈敏度為0.815，而特異性為0.737。在圖29Β中，捕獲劑識別AURKB、⑶63、FLNA, Α33、Gro- α、整聯(lián)蛋白、CD24、SSX2 和 SM2，而檢測劑識別 MUC2、PCSA, CD81、MFG-E8和EpCam。在該樣品組中，ROC曲線的AUC為0.835，與PSA的僅0.60相比較。在表示囊泡標(biāo)志物的最外側(cè)ROC上所標(biāo)示點(diǎn)處，靈敏度為0.823，而特異性為0.737。
[0087]圖30A-C證明了區(qū)分血漿樣品中的前列腺癌的cMV的檢測。用珠栓系的PCSA、PSMA或B7H3特異性的抗體捕獲囊泡。用PE-標(biāo)記的PSMA、PCSA, B7H3或四跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81的抗體標(biāo)記捕獲的cMV。對于PCSA捕獲，結(jié)果顯示于圖30A中，對于PSMA捕獲，結(jié)果顯示于圖30B中，對于B7H3捕獲，結(jié)果顯示于圖30C中。在圖中，Y-軸顯示了所檢測抗體的平均中值熒光強(qiáng)度(MFI)。X-軸上顯示的樣品包括PCa陽性池(“l(fā)Pos Pool”)、來自未患PCa的患者的陰性對照池(“2Neg Pool”)和對照空白(“Blank”)。X-軸上標(biāo)示的檢測劑包括單獨(dú)的PSMA、PCSA或B7H3的標(biāo)記抗體，PSMA, PCSA, B7H3的抗體的混合物(“混合物”)或四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81的抗體的混合物(“Vl-tets”)。
[0088]圖31A-F顯示了證明3-標(biāo)志物組囊泡捕獲劑和檢測劑區(qū)分前列腺的能力的ROC曲線。顯示了使用3-標(biāo)志物組合區(qū)分前列腺癌(PCa+)樣品與所有其他樣品(PCA-)(SM表53)的說明性結(jié)果。深灰色線(向左更加鋸齒形的線)相當(dāng)于重代入性能，而使用10-折交叉驗(yàn)證產(chǎn)生了更平滑的黑線。顯示了使用對角線線性判別分析產(chǎn)生的ROC曲線(圖31A ;重代入AUC = 0.87 ;交叉驗(yàn)證AUC = 0.86)，線性判別分析(圖31B ;重帶入AUC = 0.87 ；交叉驗(yàn)證AUC = 0.86)，支持向量機(jī)(圖31C ;重代入AUC = 0.87 ;交叉驗(yàn)證AUC = 0.86)；基于樹的梯度提升(圖31D ;重代入AUC = 0.89 ;交叉驗(yàn)證AUC = 0.84);套索(圖31E ;重代入AUC = 0.87 ;交叉驗(yàn)證AUC = 0.86)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(圖31F ;重代入AUC = 0.87 ;交叉驗(yàn)證 AUC = 0.72)。
[0089]圖32A-C說明了由以下標(biāo)志物組成的三標(biāo)志物組的性能:I) Epcam檢測劑-MMP7捕獲劑；2)PCSA檢測劑-MMP7捕獲劑；3)Epcam檢測劑-BCNP捕獲劑。樣本群組是其中患者年齡< 75，血清PSA < 10ng/ml，并且之前沒有進(jìn)行活檢的限制集(N = 127)。在該情形中使用對角線線性判別分析產(chǎn)生的ROC曲線顯示于圖32A中。在該圖中，箭頭表示沿著曲線的域值點(diǎn)，其中靈敏度等于90%和特異性等于80%。該域值的另一個圖解顯示于圖32B中，其顯示了落在所示域值線任一側(cè)上的PCA+和PCA-樣品的分布。Epcam檢測劑-MMP7捕獲劑標(biāo)志物的單獨(dú)影響顯示于圖32C中?！癙CA，當(dāng)前活檢”指的是第一次活檢陽性的男性，而“PCA，之前活檢”指的是觀察等待群組。
[0090]圖33A-B顯示了證明不同囊泡捕獲劑和檢測劑區(qū)分前列腺癌的能力的ROC曲線。使用線性判別分析和10-折交叉驗(yàn)證或重代入方法，在兩種情況中測定5-標(biāo)志物組的性能。模型A情況(即，所有PCa vs.所有其他患者樣品)的ROC曲線顯示于圖33A中。該情況中的標(biāo)志物組由以下組成:I)Epcam檢測劑-MMP7捕獲劑；2)PCSA檢測劑-MMP7捕獲劑；3) Epcam檢測劑-BCNP捕獲劑；4)PCSA檢測劑-AdamlO捕獲劑；和5) PCSA檢測劑-KLK2捕獲劑。在圖33A中，上部更鋸齒化的線對應(yīng)于重代入方法。AUC為0.90。使用交叉驗(yàn)證，計(jì)算的AUC為0.87。在實(shí)心箭頭所指的點(diǎn)處，使用交叉驗(yàn)證的模型獲得了 92%靈敏度和50%特異性。在實(shí)心箭頭所指的點(diǎn)處，使用使用交叉驗(yàn)證的模型獲得了 82%靈敏度和80%特異性。模型C情況(即，如下針對表53所述的限制樣品集)的ROC曲線顯示于圖33B中。該情況中的標(biāo)志物組由以下組成:I) Epcam檢測劑-MMP7捕獲劑；2)PCSA檢測劑-MMP7捕獲劑；3) Epcam檢測劑-BCNP捕獲劑；4) PCSA檢測劑-AdamlO捕獲劑；和5) CD81檢測劑-MMP7捕獲劑。在圖33B中，上部更鋸齒化的線對應(yīng)于重代入方法。AUC為0.91。使用交叉驗(yàn)證，計(jì)算的AUC為0.89。在箭頭所指的點(diǎn)處，交叉-驗(yàn)證的模型獲得了 95%的靈敏度和60%的特異性。
[0091 ] 圖34A-D顯示了來自患前列腺癌和良性前列腺病癥男性的血漿的PCSA+循環(huán)微囊泡中的微RNA物質(zhì)的水平。在圖34A中，在各種池中顯示了來自針對miR-1974(其重疊線粒體tRNA)的Exiqon卡的Ct。前列腺癌樣品具有高于其他樣品的這種miR的水平。圖34B顯示了池中miR的拷貝數(shù)，如通過使用ABI7900的taqman分析測量的。在圖34C中，在各種池中顯示了來自針對miR_320b的Exiqon卡的Ct。前列腺癌樣品具有比其他樣品低的這種miR的水平。圖34D顯示了池中miR-320b的拷貝數(shù)，如通過使用ABI7900的taqman分析測量的。
[0092]圖35顯示了合成miR16標(biāo)準(zhǔn)品(IO6-1O1)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測和來自人血漿樣品的一式三份的miR16檢測。如圖例所不，使用48.48Dynamic Array? IFC,96.96DynamicArray? IFC,或使用 ABI7900HT Taqman 試驗(yàn)(Applied Biosystems, Foster City, CA),從Fluidigm Biomark (Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA)獲取數(shù)據(jù)。所有水平在多重條件下測定。
[0093]圖36A-D顯示了使用流式細(xì)胞術(shù)的來自前列腺癌和良性對照(即，非前列腺癌)男性的血漿的cMV分析。用標(biāo)記的抗-四跨膜蛋白抗體(⑶9、⑶63、⑶81)的混合物標(biāo)記后，首先門控血漿樣品中的cMV。接著用PE-標(biāo)記的抗-MMP7抗體和FITC-標(biāo)記的抗-EpCAM抗體標(biāo)記所鑒定的cMV。圖36顯示了兩個前列腺癌(圖36C-D)和兩個對照(圖36A-B)的說明性結(jié)果。Y-軸表示MMP7的檢測水平，而X-軸表示EpCAM的檢測水平。
[0094]圖37A-G顯示了與來自正常(非癌)對照個體、乳腺癌患者、腦癌患者、肺癌患者、結(jié)腸直腸癌患者、結(jié)腸腺瘤患者、BPH患者(良性)、炎性前列腺患者(炎癥)、HGPIN患者和前列腺癌患者的微囊泡相關(guān)的堿性磷酸酶(腸)(圖37A)、⑶-56(圖37B)、⑶-3 ζ (圖37C)、maplb (圖37D)、14.3.3pan (圖37E)、細(xì)絲蛋白(圖37F)和血小板反應(yīng)蛋白(圖37G)的水平，如圖中所示。將囊泡濃縮，然后用抗體陣列孵育。將與各種蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合的囊泡進(jìn)行突光檢測。
[0095]圖38A-F顯示了 CD81、Ago2、IgG和BrdU的免疫沉淀的結(jié)果。分析沉淀物的微RNA的存在，所述微RNA包括let-7a(圖38A和圖38B)、miR-16 (圖38C和圖38D)和mir-451 (圖38E和圖38F)。如下使用ABI miRNA分析來評價(jià)miRNA:Hsa-Let_7a，試驗(yàn)ID377, Hsa-miR-16 試驗(yàn)，試驗(yàn) ID391 和 miR-451，試驗(yàn) IDl 141。
[0096]圖39A-C顯示了使用裂解的或完整的濃縮血漿cMV的Ago2ELISA的結(jié)果。圖39A顯示了 PBS (無裂解)或裂解緩沖液(裂解的cMV)中基于板的ELISA的重組Ago2檢測。圖39B顯示了針對完整或裂解的濃縮血漿(cMV)的內(nèi)源性Ago2的平均0D450nm。圖39C顯示了完整或裂解的濃縮血漿(cMV)中估算的內(nèi)源性Ago2 (ng/mL)。
[0097]圖40A-B顯示了前列腺癌陽性池和前列腺癌陰性池中的Argonaute2表達(dá)。圖40A顯示了使用樣品和檢測劑稀釋劑1% BSA+1% F68的基于Ago2板的ELISA中封閉劑F127的滴定。圖40A顯示了使用樣品和檢測劑稀釋劑1% BSA+1% F127的基于Ago2板的ELISA中封閉劑F127的滴定。
[0098]圖41顯示了使用實(shí)驗(yàn)方案來檢測來自前列腺癌和正?；颊叩耐庵苎腸MV的實(shí)例。使用抗-MMP7-FITC抗體偶聯(lián)物(Millipore抗-MMP7單克隆抗體7B2)檢測cMV。該圖顯示了檢測的事件的頻率vs.檢測抗體濃度。
[0099]圖42A-J說明了囊泡的流式分選和miR的檢測。使用Beckman Coulter MoFloXDP，針對與膜相關(guān)的蛋白，如四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、Ago2和/或GW182，將cMV染色。圖42A中列出了流式細(xì)胞術(shù)方法。圖42B說明了針對四跨膜蛋白(Tet)+/Ago+/GW182-或Tet+/Ago2+/GW182+進(jìn)行流式分選的來自正常、前列腺和膀胱癌患者的血漿濃縮物。圖42C-E顯示了來自圖42B中所示的流式分析的所示級分的樣品池中檢測的miR-22的水平。圖42C顯示了未分選血漿濃縮物中各種樣品的miR-22水平，其輸入流式分選中。圖42D顯示了 Ago2+Tet+GW182-分選群體中各種樣品中的miR-22水平。圖42D顯示了Ago2+Tet+GW182+分選群體中各種樣品中的miR-22水平。接著，針對Tet+/Ago2+、Tet+/Ag02-、Tet-/Ag0+分選來自正常和各種癌癥患者的血漿濃縮物。圖42F說明了用于從所示樣品捕獲各種cMV群體的分選門控。圖42G-1說明了針對所示的cMV群體在各種樣品中檢測的流事件。圖42G顯示了使用四跨膜蛋白檢測劑檢測的囊泡，其將檢測樣品中的所有cMV。圖42H顯示了使用Ago2檢測劑檢測的囊泡。圖421顯示了使用四跨膜蛋白和Ago2檢測劑檢測的囊泡。從濃縮物和分選的群體中提取RNA，并且評價(jià)miR。圖42J顯示了相對于6個正常對照樣品來說，10個PCa樣品中檢測的每囊泡的所示miR的相對拷貝數(shù)。在圖42J中，沿著X-軸顯示分選的囊泡群體，如下:b)Tet+Ago2+c)Tet-Ago2+d)Tet+Ago2_e)輸入濃縮物(未富集)。
[0100]圖43A-G說明了 GW182與人體液中的循環(huán)微囊泡和Ago2的關(guān)聯(lián)性。圖43A顯示了針對Dul45裂解物和純化VCaP外來體中的Ago2的Western印跡分析。圖43B顯示了來自人 血漿的GW182的免疫沉淀。這些數(shù)據(jù)通過Western印跡證明了 Ago2與GW182的共免疫沉淀。圖43C-D說明了來自人外周血的微RNA的免疫沉淀(IP)。將抗-AG02 (abcam，ab57113，批號GR29117-1)、抗-GW182(Bethyl Labs，A302-330A)和抗-1gG(Santa Cruz sc-2025)捕獲抗體與Magnabind蛋白G珠(Thermo Scientific Cat.#21349)偶聯(lián)。用人血衆(zhòng)孵育偶聯(lián)的珠。使用ABI Taqman檢測試劑盒(ABI_391和ABI_431)分別針對選擇的微RNA (miR-16和miR-92a)分離和篩選RNA。將RNA針對合成標(biāo)準(zhǔn)品定量，并且相對于IgG對照標(biāo)準(zhǔn)化。圖43C顯示了 miR-92a的水平，而圖43D顯示了檢測的miR-16的水平。圖43E-F說明了證明GW182與人血漿中Ago2相關(guān)性的夾心ELISA。圖43E顯示了使用抗-GW182作為捕獲劑(GW182 (Bethyl Labs, A302-330A))和生物素化抗 _Ago2 (abcam，ab57113，批號 GR29117-1)作為檢測劑，通過基于平板的ELISA使用純化微囊泡和原始血漿的樣品輸入的滴定。將所顯示的信號相對于無樣品(NS)對照標(biāo)準(zhǔn)化。圖43F顯示七個患者樣品的調(diào)查，表明來自不同患者的人血漿中GW182:Ago2結(jié)合的檢測。圖43G說明了 GW182與人尿液中Argonaute的相關(guān)性。使用微珠檢測系統(tǒng)研究了尿液中人GW182與Argonaute蛋白家族之間的關(guān)系。使用五名患者尿樣，用抗-GW182抗體捕獲顆粒,接著用抗-pan Argonaute抗體檢測。條件包括原始vs.細(xì)胞+高速離心(hard spun)尿液。
[0101]圖44說明了使用抗-EpCAM適體(適體4 ；SEQ ID N0.1)檢測微囊泡群體。使用針對所示微囊泡表面抗原的珠偶聯(lián)抗體來捕獲患者血衆(zhòng)樣品中的囊泡。將突光標(biāo)記的適體4用作微珠分析中的檢測劑。該圖顯示了各圖中三個前列腺癌(C1-C3)和三個正常樣品(N1-N3)的平均中值熒光值(MFI值)。在各圖中，從左至右的樣品依次為:C1、C2、C3、N1、N2、N3。
[0102]發(fā)明詳述
[0103]本文公開了用于表征生物樣品(如，來自細(xì)胞培養(yǎng)物、生物體或受試者的樣品)的表型的方法和系統(tǒng)?？赏ㄟ^評估一種或多種生物標(biāo)志物表征所述表型。所述生物標(biāo)志物可與囊泡或囊泡群體關(guān)聯(lián)，其為存在的囊泡表面抗原或囊泡有效負(fù)載。如本文所使用的，囊泡有效負(fù)載包含封裝于囊泡內(nèi)的實(shí)體。囊泡相關(guān)的生物標(biāo)志物可包含膜結(jié)合的和可溶的生物標(biāo)志物。所述生物標(biāo)志物還可以是循環(huán)生物標(biāo)志物，諸如在體液中評估的核酸(例如，微RNA)或蛋白質(zhì)/多肽，或其功能性片段。除非另行說明，本文中提及囊泡或生物標(biāo)志物組分而使用的術(shù)語“純化的”或“分離的”指的是這些組分從細(xì)胞或生物體中部分或完全地純化和分離。此外，除非另行說明，所稱的使用結(jié)合劑進(jìn)行的囊泡分離包括將囊泡與所述結(jié)合劑結(jié)合，無論該結(jié)合是否使得所述囊泡與起始材料中的其它生物實(shí)體完全分離。
[0104]通過分析循環(huán)生物標(biāo)志物(如核酸生物標(biāo)志物)而表征表型的方法描述于圖1A的方案6100A中，其為非限制性說明實(shí)例。在第一步驟6101中獲得生物樣品，如體液、組織樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物。從所述樣品中分離核酸6103。所述核酸可以是DNA或RNA，如微RNA。對這些核酸的評估可提供該表型的生物印記。通過對與目標(biāo)表型(如疾病對比健康、治療前和治療后)相關(guān)的核酸取樣，可測定作為表型的指示的一種或多種核酸標(biāo)志物。本發(fā)明的各個方面涉及通過評估在所述樣品中存在的一種或多種核酸分子(如微RNA)而確定生物印記6105，其中所述生物印記對應(yīng)于預(yù)定的表型6107。圖1B詳細(xì)說明了使用囊泡確定生物印記和/或表征表型的方案6100B。在一個實(shí)施例中，獲得了生物樣品6102，并且從所述樣品中分離一種或多種目標(biāo)囊泡6104，例如，所有囊泡，或來自特定細(xì)胞源的囊泡和/或與特定疾病狀態(tài)相關(guān)的囊泡。所述囊泡可以通過表征與所述囊泡關(guān)聯(lián)的表面抗原和/或測定所述囊泡中存在的組分(“有效負(fù)載”)的存在或水平而分析6106。除非另行說明，本文所使用的術(shù)語“抗原”通常指的是可被結(jié)合劑結(jié)合的生物標(biāo)志物，無論所述結(jié)合劑是抗體、適體、凝集素或用于所述生物標(biāo)志物的其它結(jié)合劑，并且無論這些生物標(biāo)志物是否在宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答。囊泡有效負(fù)載包括但不限于蛋白質(zhì)(包括肽和多肽)、核酸(如DNA和RNA)、脂質(zhì)和/或碳水化合物。RNA有效負(fù)載包括信使RNA(mRNA)和微RNA(本文中亦稱為miRNA或miR)。根據(jù)所述囊泡的生物印記表征表型6108。在本發(fā)明的另一個說明性方法中，方案6100A和6100B —起實(shí)施以表征表型。在這樣的方案中，評估了囊泡和核酸(如微RNA)，從而表征所述表型。
[0105]根據(jù)本發(fā)明的方法，可以順序或同時評估多種生物標(biāo)志物來表征表型。例如，可以通過同時檢測兩種囊泡表面抗原，例如，使用同時捕獲囊泡和檢測囊泡的結(jié)合劑，來評估囊泡的亞群。在另一個實(shí)例中，可`以通過順序檢測囊泡表面抗原來評估囊泡亞群，例如，捕獲囊泡，并且隨后針對有效負(fù)載(如，mRNA、微RNA或可溶性蛋白質(zhì))來評估所捕獲的囊泡。在一些實(shí)施方案中，表征表型包括同時評估一種或多種生物標(biāo)志物和順序評估一種或多種其他生物標(biāo)志物。作為非限制性實(shí)例，可以將使用對于超過一種表面抗原的結(jié)合劑檢測的囊泡亞群進(jìn)行分選，并且隨后可以評估有效負(fù)載，例如，一種或多種miR。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到順序或同時的生物標(biāo)志物評估的許多變化可以用于表征表型。
[0106]在另一個相關(guān)的方面，本文提供了用于發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的方法，其包括評估一個樣品中的囊泡表面標(biāo)志物或有效負(fù)載標(biāo)志物以及將所述標(biāo)志物與另一樣品進(jìn)行比較。在所述樣品之間區(qū)分的標(biāo)志物可用作本發(fā)明的生物標(biāo)志物。這些樣品可以來自受試者或受試者組。例如，所述組可以是，例如，患病的vs.正常的(未患病的)，對于給定疾病或失調(diào)的給定治療的已知反應(yīng)者和非反應(yīng)者。發(fā)現(xiàn)區(qū)分所述已知反應(yīng)者和非反應(yīng)者的生物標(biāo)志物提供了關(guān)于患者是否可能對治療(諸如治療劑，如藥物或生物制品)有反應(yīng)的生物印記。
[0107]表型
[0108]本文公開了通過分析囊泡(諸如膜囊泡)來表征個體的表型的產(chǎn)品和方法。表型可以為患者的任何可觀察的特征或性狀，例如疾病或狀況、疾病階段或狀況階段、疾病或狀況的易感性、疾病階段或狀況的預(yù)后、生理狀態(tài)或?qū)χ委煹姆磻?yīng)。表型可以由受試者的基因表達(dá)及環(huán)境因素的影響以及這二者之間的相互作用引起，以及由對核酸序列的外遺傳修飾引起。
[0109]受試者中的表型可以通過從受試者獲得生物樣品并分析所述樣品中的一種或多種囊泡來表征。例如，表征受試者或個體的表型可以包括檢測疾病或狀況(包括癥狀前的早期階段檢測)，確定疾病或狀況的預(yù)后、診斷或治療診斷，或者確定疾病或狀況的階段或進(jìn)程。表征表型還可以包括鑒定針對特定疾病、狀況、疾病階段或狀況階段的適當(dāng)治療或治療效力、疾病進(jìn)展的預(yù)測和可能性分析，特別是疾病重新發(fā)生、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散或疾病復(fù)發(fā)。表型還可以為狀況或疾病(例如癌癥或腫瘤)的臨床上獨(dú)特的類型或亞型。表型的確定還可以為生理狀況的確定、器官危境或器官排斥(例如移植后)的評估。本文所述的產(chǎn)品和方法允許在個體的基礎(chǔ)上評估受試者，其可以提供在治療中的更有效和更經(jīng)濟(jì)的決策的益處。
[0110]在一個方面，本發(fā)明涉及生物樣品的分析以鑒定生物印記，從而預(yù)測受試者是否可能對疾病或失調(diào)的治療有反應(yīng)。表征表型包括預(yù)測所述受試者的響應(yīng)者/無響應(yīng)者狀態(tài)，其中響應(yīng)者對疾病的治療有反應(yīng)而無響應(yīng)者對所述治療無反應(yīng)?？稍谒鍪茉囌咧蟹治瞿遗莶⑴c已知對治療有反應(yīng)或沒有反應(yīng)的先前受試者的囊泡分析進(jìn)行比較。如果所述受試者中的囊泡生物印記與已知對所述治療有反應(yīng)的先前受試者更為接近，則所述受試者可表征或預(yù)測為所述治療的響應(yīng)者。類似地，如果所述受試者中的囊泡生物印記與對所述治療無反應(yīng)的此前受試者更為接近，則所述受試者可表征或預(yù)測為所述治療的無響應(yīng)者。所述治療可以針對任意適當(dāng)?shù)募膊?、失調(diào)或其它狀況。所述方法可用于其中與響應(yīng)者/無響應(yīng)者狀態(tài)相關(guān)的囊泡生物印記已知的任意疾病情況中。
[0111]本發(fā)明所使用的術(shù)語“表型”可以指貢獻(xiàn)于囊泡生物印記的任何性狀或特征，該生物印記使用本發(fā)明的方法而鑒定。例如，表型可以是患者可能對治療有反應(yīng)的標(biāo)識，或更廣義地其可為基于針對獲自受試者的樣品鑒定的生物印記的診斷、預(yù)后或治療診斷確定。
[0112]在一些實(shí)施方案中`，所述的表型包括疾病或狀況，如表1中所列的那些。例如，所述的表型可包括腫瘤、贅生物或癌癥的存在或發(fā)生腫瘤、贅生物或癌癥的可能性。通過本文所述的產(chǎn)品或方法檢測或評估的癌癥包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、增生性息肉、腺瘤、結(jié)腸直腸癌、高度異型增生(high grade dysplasia)、低度異型增生(lowgrade dysplasia)、前列腺增生、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、腦癌(例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)、血液惡性腫瘤、肝細(xì)胞癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、頭頸癌、食管癌、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、腎細(xì)胞癌(RCC)或胃癌。所述的結(jié)腸直腸癌可以為CRC Dukes B或CRC Dukes C-D。所述的血液惡性腫瘤可以為B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病、B細(xì)胞淋巴瘤-DLBCL、B細(xì)胞淋巴瘤-DLBCL-生發(fā)中心樣、B細(xì)胞淋巴瘤-DLBCL-活化B細(xì)胞樣以及伯基特氏淋巴瘤。
[0113]所述表型可以是惡變前狀況，諸如光化性角化病、萎縮性胃炎、白斑病、增殖性紅斑、淋巴瘤樣肉芽腫病、白血病前期、纖維癥、宮頸非典型增生、子宮頸非典型增生、著色性干皮病、巴雷特食管、結(jié)腸直腸息肉或有可能發(fā)展成為惡性腫瘤的其它異常組織生長或病灶。諸如HIV和HPV的轉(zhuǎn)化型病毒感染也提供了可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行評估的表型。
[0114]通過本發(fā)明的方法表征的癌癥可包括但不限于，癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病、生殖細(xì)胞瘤、胚細(xì)胞瘤或其它癌癥。癌瘤包括但不限于，上皮腫瘤、鱗狀細(xì)胞腫瘤鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞腫瘤基底細(xì)胞癌、移行細(xì)胞乳頭狀瘤和癌、腺瘤和腺癌(腺體)、腺瘤、腺癌、革囊胃胰島瘤(linitis plastica insulinoma)、高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性腸肽瘤、膽管癌、肝細(xì)胞癌、囊性腺樣癌、闌尾類癌瘤、泌乳素瘤、大嗜酸粒細(xì)胞瘤、許特萊氏細(xì)胞腺瘤(hurthle cell adenoma)、腎細(xì)胞癌、格拉維茨瘤(grawitz tumor)、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤、子宮內(nèi)膜腺瘤、附件和皮膚附件腫瘤、粘液表皮樣腫瘤、囊性、粘液性和漿液性腫瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、導(dǎo)管、小葉和髓質(zhì)腫瘤、腺泡細(xì)胞腫瘤、復(fù)合上皮腫瘤、沃辛腫瘤(warthin' s tumor)、胸腺瘤、特化生殖腺腫瘤、性索間質(zhì)瘤、泡膜細(xì)胞瘤、粒膜細(xì)胞瘤、卵巢含睪丸母細(xì)胞瘤、支持細(xì)胞睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤、血管球瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、血管神經(jīng)肌瘤、痣與黑色素瘤、黑素細(xì)胞痣、惡性黑色素瘤、黑色素瘤、結(jié)節(jié)性黑色素瘤、發(fā)育不良痣、惡性痣性黑色素瘤、淺表擴(kuò)散性黑色素瘤以及惡性肢端著色斑性黑色素瘤。肉瘤包括但不限于，Askin’ s腫瘤、葡萄狀肉瘤(botryodies)、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤、惡性神經(jīng)鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤，其包括:腺泡狀軟組織肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、皮膚纖維肉瘤、硬纖維瘤、促結(jié)締組織增生性小圓形細(xì)胞瘤、上皮樣肉瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管肉瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括但不限于，慢性淋巴細(xì)胞性白血病/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴衆(zhòng)細(xì)胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)(諸如Waldenstrom巨球蛋白血癥)、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、衆(zhòng)細(xì)胞骨髓瘤、衆(zhòng)細(xì)胞瘤、單克隆免疫球蛋白沉積病、重鏈病、亦稱為malt淋巴瘤的結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(nmz I)、濾泡性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細(xì)胞淋巴瘤、血管內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、T細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、T細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞白血病、侵襲性NK細(xì)胞白血病、成人T細(xì)胞性白血病/淋巴瘤、結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤，鼻型、腸病型T細(xì)胞淋巴瘤、肝脾T細(xì)胞淋巴瘤、母細(xì)胞性NK細(xì)胞淋巴瘤、蕈樣霉菌病/塞澤里綜合征(sezary syndrome)、原發(fā)性皮膚⑶30陽性T細(xì)胞淋巴組織增生性疾病、原 發(fā)性皮膚間變性大細(xì)胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、非指定、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、典型霍奇金淋巴瘤(結(jié)節(jié)性硬化、混合細(xì)胞性、富淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞耗盡或非耗盡)以及結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型霍奇金淋巴瘤。生殖細(xì)胞腫瘤包括但不限于，生殖細(xì)胞瘤、無性細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、非生殖細(xì)胞瘤性生殖細(xì)胞瘤、胚胎癌、內(nèi)胚竇腫瘤、絨毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成性腺細(xì)胞瘤。胚細(xì)胞瘤包括但不限于，腎母細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。其它癌癥包括但不限于，唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲狀腺癌(延髓和乳頭狀甲狀腺癌)、腎癌、腎實(shí)質(zhì)癌、子宮頸癌、子宮體癌、子宮內(nèi)膜癌、絨毛膜癌、睪丸癌、泌尿系癌、黑色素瘤、腦腫瘤(如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、腦膜瘤、髓母細(xì)胞瘤和外周神經(jīng)外胚層腫瘤)、膽囊癌、支氣管癌、多發(fā)性骨髓瘤、基底細(xì)胞癌、畸胎瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、脈絡(luò)膜黑色素瘤、精原細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、盧頁咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、軟骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、尤文氏肉瘤和漿細(xì)胞瘤。
[0115]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，進(jìn)行分析的癌癥可以是肺癌，其包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌(包括小細(xì)胞癌(燕麥細(xì)胞癌)、小細(xì)胞/大細(xì)胞混合癌以及復(fù)合性小細(xì)胞癌)、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、腦癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、皮膚癌、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、乳頭狀癌腎癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或?qū)嶓w腫瘤。
[0116]在實(shí)施方案中，所述癌癥包括急性成淋巴細(xì)胞性白血病；急性骨髓性白血病；腎上腺皮質(zhì)癌；AIDS相關(guān)癌癥；AIDS相關(guān)淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細(xì)胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細(xì)胞癌；膀胱癌；腦干膠質(zhì)瘤；腦腫瘤(包括腦干膠質(zhì)瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎樣瘤、星形細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和成松果體細(xì)胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發(fā)部位不明癌；類癌瘤；原發(fā)部位不明腫瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌癥；脊索瘤；慢性淋巴細(xì)胞性白血?。宦怨撬栊园籽。宦怨撬柙鲋澄蓙y；結(jié)腸癌；結(jié)腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細(xì)胞淋巴瘤；內(nèi)分泌胰島細(xì)胞瘤；子宮內(nèi)膜癌；成室管膜母細(xì)胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺神經(jīng)細(xì)胞瘤；尤文氏肉瘤；顱外生殖細(xì)胞瘤；性腺外生殖細(xì)胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤；胃腸道間質(zhì)瘤(GIST);妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；毛細(xì)胞白血??；頭頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內(nèi)黑色素瘤；胰島細(xì)胞瘤；卡波濟(jì)氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維組織細(xì)胞瘤骨癌；髓母細(xì)胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細(xì)胞癌；Merkel細(xì)胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發(fā)性的轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征；多發(fā)性骨髓瘤；多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發(fā)育異常綜合征；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細(xì)胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細(xì)胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤?。桓北歉]癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤；成松果體細(xì)胞瘤；垂體瘤；漿細(xì)胞腫瘤/多發(fā)性骨髓瘤；胸膜肺母細(xì)胞瘤；原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋 巴瘤；原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細(xì)胞(腎)癌；腎細(xì)胞癌；呼吸道癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌癥；S6zary綜合征；小細(xì)胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細(xì)胞癌；鱗狀頸癌；胃(胃的)癌；幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤；T細(xì)胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細(xì)胞癌；腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌；滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstr5m巨球蛋白血癥或腎母細(xì)胞瘤。本發(fā)明的方法可用于表征這些及其它癌癥。因此，對表型的表征可提供本文公開的癌癥之一的診斷、預(yù)后和治療診斷。
[0117]所述的表型還可以為炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。例如，所述的疾病可以為炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(⑶)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、盆腔炎癥、脈管炎、銀屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、I型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、橋本甲狀腺炎、格雷夫斯病、強(qiáng)直性脊柱炎、Siogrens病、CREST綜合征、硬皮病、風(fēng)濕病、器官排斥反應(yīng)、原發(fā)性硬化性膽管炎或膿毒癥。
[0118]所述的表型還可以包括心血管疾病，例如動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、易損斑塊、中風(fēng)或局部缺血。所述的心血管疾病或狀況可以為高血壓、狹窄癥、血管阻塞或血栓形成事件。
[0119]所述的表型還可以包括神經(jīng)疾病，例如多發(fā)性硬化癥(MS)、帕金森氏病(PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、精神分裂癥、雙相型障礙、抑郁癥、孤獨(dú)癥、朊病毒病、皮克病、癡呆、亨廷頓病(HD)、唐氏綜合征、腦血管疾病、Rasmussen腦炎、病毒性腦膜炎、神經(jīng)精神性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(NPSLE)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、傳染性海綿狀腦病、缺血再灌注損傷(例如中風(fēng))、腦外傷、微生物感染或慢性疲勞綜合征。所述的表型還可以為諸如纖維肌痛、慢性神經(jīng)病理性疼痛或周圍神經(jīng)病理性疼痛的狀況。
[0120]所述的表型還可以包括感染性疾病，例如細(xì)菌、病毒或酵母菌感染。例如，所述的疾病或狀況可以為惠普爾氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、腦膜炎、瘧疾、結(jié)核病或流行性感冒?？梢栽u估囊泡中的病毒蛋白質(zhì)(例如HIV或HCV樣顆粒)從而表征病毒狀況。
[0121]所述的表型還可以包括圍產(chǎn)期或妊娠相關(guān)的狀況(例如先兆性子癇或早產(chǎn))、代謝疾病或狀況(例如與鐵代謝有關(guān)的代謝疾病或狀況)。例如，可以測定在囊泡中的鐵調(diào)素(hepcidin)從而表征鐵缺乏。所述的代謝疾病或狀況還可以為糖尿病、炎癥或圍產(chǎn)期狀況。
[0122]本發(fā)明的方法可以用于表征這些疾病和失調(diào)和表征可通過包含一個或多個生物標(biāo)志物的候選生物印記評價(jià)的其他疾病和失調(diào)。因此，表征表型可以提供本文中公開的疾病和失調(diào)之一的診斷、預(yù)后或治療診斷。
[0123]在本發(fā)明的各個實(shí)施方案中，用于本文中公開的任何病癥或疾病的生物印記可以包含幾個不同的標(biāo)志物類別之一中的一種或多種生物標(biāo)志物，其中所述類別包括以下的一種或多種:1)疾病特異性標(biāo)志物；2)細(xì)胞-或組織-特異性生物標(biāo)志物；3)囊泡-特異性標(biāo)志物(例如，一般囊泡生物標(biāo) 志物)；4.血管生成-特異性生物標(biāo)志物；和5)免疫調(diào)節(jié)生物標(biāo)志物。本文中公開了所有這些標(biāo)志物的實(shí)例，并且它們是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。此外，鑒定為在特定疾病或病癥中具有作用的本領(lǐng)域已知的生物標(biāo)志物適于用作本發(fā)明的組合物和方法中的靶標(biāo)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，這樣的生物標(biāo)志物可以全部是所有囊泡表面標(biāo)志物，或囊泡表面標(biāo)志物和囊泡有效負(fù)載標(biāo)志物(即，囊泡包裹的分子)的組合。此外，如本文中所述，所評估的生物樣品可以是任何生物流體，或可以包含這樣的生物流體內(nèi)存在的單個組分(例如，囊泡、核酸、蛋白質(zhì)或其復(fù)合物)。
[0124]受試者
[0125]可通過分析從受試者獲得的生物樣品中的一種或多種囊泡(如多種囊泡)來確定受試者的一種或多種表型。受試者或患者可以包括但不限于哺乳動物，例如牛、鳥、犬、馬、貓、綿羊、豬或靈長動物(包括人及非人靈長動物)。受試者還可以包括:由于瀕危而變得重要的哺乳動物，例如西伯利亞虎；或者具有經(jīng)濟(jì)意義的動物(例如用于人消費(fèi)的農(nóng)場飼養(yǎng)動物)，或?qū)θ祟惗跃哂猩鐣饬x的動物(例如作為寵物或在動物園中飼養(yǎng)的動物)。此類動物的實(shí)例包括但不限于:食肉動物，例如貓和狗；豬，包括畜養(yǎng)豬、食用豬和野豬；反芻動物或有蹄類動物，例如牛、公牛、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛、駱駝或馬。此外，還包括瀕危的或在動物園中飼養(yǎng)的鳥；以及禽類，和更特別的是家養(yǎng)的禽類，即，家禽，例如火雞和雞、鴨、鵝、珍珠雞。還包括家養(yǎng)的豬和馬(包括賽馬)。此外，與商業(yè)活動有關(guān)的任何動物種類也都被包括在內(nèi)，例如與農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)業(yè)和其它活動有關(guān)的動物，所述行業(yè)中為了經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)率和/或食物鏈的安全而常規(guī)實(shí)施疾病監(jiān)測、診斷和療法的選擇。[0126]所述的受試者可以患有先前存在的疾病或狀況，例如癌癥。或者，所述的受試者可以并未患任何已知的先前存在的狀況。所述的受試者還可以對現(xiàn)有或過去的治療是非反應(yīng)性的，例如對癌癥的治療是非反應(yīng)性的。
[0127]樣品
[0128]得自所述受試者的生物樣品可以為任何體液或生物流體。例如，所述的生物樣品可以為任何生物流體包括但不限于外周血、血清、血漿、腹水、尿、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、考珀液或預(yù)射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛發(fā)、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、膽汁、間質(zhì)液、經(jīng)血、膿液、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管肺抽吸液或其它灌洗液。生物樣品還可以包括囊胚腔、臍帶血或母體循環(huán)血(其可以為胎兒來源或母體來源的)。所述的生物樣品還可以為組織樣品或組織活檢樣品，從中可獲得囊泡和其它循環(huán)生物標(biāo)志物。例如，可以培養(yǎng)得自樣品的細(xì)胞，并且從所述培養(yǎng)物中分離囊泡(參見實(shí)施例)。在各個實(shí)施方案中，可由這些生物樣品直接評估本發(fā)明公開的生物標(biāo)志物和/或生物印記(如，對核酸或者多肽生物標(biāo)志物或其功能性片段的存在或水平的鑒定)，其使用各種方法，諸如，從血液、血漿、血清或任意前述生物樣品中提取核酸分子，使用蛋白質(zhì)或抗體陣列鑒定多肽(或功能性片段)生物標(biāo)志物，以及本領(lǐng)域中已知用于鑒定和評估核酸和多肽分子的其它陣列、測序、PCR和蛋白質(zhì)組技術(shù)。此外，可以首先分離或富集這些樣品中存在的一種或多種成分，并且進(jìn)一步處理以評估選定生物標(biāo)志物的存在或水平，例如，評估給定的生物印記。例如，可以在針對蛋白質(zhì)和/或核酸生物標(biāo)志物對微囊泡進(jìn)行分型之前，從樣品分離微囊泡。
[0129]表1列出了疾病、狀況或生物學(xué)狀態(tài)的說明性實(shí)例，以及可以對其中的囊泡進(jìn)行分析的生物樣品的相應(yīng)列表。
[0130]表1:針對各種疾病、狀況或生物學(xué)狀態(tài)，用于囊泡分析的生物樣品的實(shí)例
[0131]
【權(quán)利要求】
1.一種方法，其包括: (a)將生物樣品接觸一種或多種試劑，其中所述一種或多種試劑特異性地結(jié)合表5中的一種或多種生物標(biāo)志物； (b)基于所述生物樣品與所述一種或多種試劑的接觸檢測生物樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的存在或水平；和 (C)鑒定包含所述生物樣品中檢測的所述一種或多種生物標(biāo)志物的存在或水平的生物印記。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自A33、ABL2、ADAMlO,AFP、ALA、ALIX、ALPL, ApoJ/CLU、ASCA、ASPH(A-1O)、ASPH (DOlP)、AURKB, B7H3、B7H3、B7H4、BCNP、BDNF、CA125(MUC16)、CA-19-9, C-Bir, CD10、CD151、CD24、CD41、CD44、CD46、CD59 (MEM-43)、CD63、CD63、CD66eCEA、CD81、CD81、CD9、CD9、CDA, CDADCU CRMP-2、CRP,CXCLl2、CXCR3、CYFRA21-1、DDX-U DLL4、DLL4、EGFR、Epcam、EphA2、ErbB2、ERG、EZH2、FASL、FLNA、FRT、GAL3、GATA2、GM-CSF, Gro- a、HAP、HER3 (ErbB3)、HSP70、HSPB1、hVEGFR2、iC3b、IL-1B、IL6R、IL6Unc、IL7Ra/CD127、IL8、INSIG-2、整聯(lián)蛋白、KLK2、LAMN、乳腺珠蛋白、M-CSF、MFG-E8、MIF、MISRI1、MMP7、MMP9、MUC1、MucU MUC17、MUC2、Ncam、NDUFB7、NGAL, NK-2R (C-21)、NT5E (CD73)、p53、PBP、PCSA, PCSA, PDGFRB, PIMl、PRL, PSA、PSA、PSMA,PSMA, RAGE、RANK、ReglV、RUNX2、S100-A4、s印rase/FAP、SERPINB3、SIM2 (C-15)、SPARC、SPC、SPDEF、SPPU STEAP、STEAP4, TFF3、TGM2、--ΜΡ-1、TMEM211、Trai 1-R2, Trail_R4、TrKB(poly)、Trop2、TsglOl、TWEAK、UNC93A、VEGFA、wnt-5a(C-16)及其組合的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物進(jìn)一步包括選自⑶9、⑶63、CD81、PCSA、MUC2、MFG-E8及其組合的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1的方法,其中所述一種或多種生物標(biāo)志物選自miR-148a、miR-329、miR-9、miR-378*、miR-25、miR`-614、miR-518c*、miR-378、miR-765、let-7f-2*、miR-574_3p、miR-497、miR-32、miR-379、miR_520g、miR-542_5p、miR-342_3p、miR-1206、miR-663、miR-222及其組合。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物選自hsa-miR-877*、hsa-miR-593、hsa-miR-595、hsa-miR-300、hsa-miR-324_5p、hsa-miR-548a_5p、hsa-miR-329、 hsa-miR-550、 hsa-miR-886_5p、 hsa-miR-603、 hsa-miR-490_3p、hsa-miR-938、hsa-miR-149、hsa-miR-150、hsa-miR-1296、hsa-miR-384、hsa_miR-487a、hsa-miRPlus-C1089、hsa-miR-485_3p、hsa-miR-525_5p 及其組合。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物選自miR-588、miR-1258、miR-16-2*、miR-938、miR-526b、miR-92b*、let-7d、miR-378*、miR-124、miR-376c、miR-26b、miR-1204、miR-574_3p、miR-195、miR-499_3p、miR-2110、miR-888 及其組合。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自A33、ADAMlO、AMACR、ASPH(A-1O)、AURKB, B7H3、CA125、CA-19-9, C-Bir, CD24、CD3、CD41、CD63、CD66e CEA,CD81、CD9、CDADCl、CSA、CXCLl2、DCRN、EGFR、EphA2、ERG、FLNA、FRT、GAL3、GM-CSF、Gro- a、HER3 (ErbB3)、hVEGFR2、IL6Unc、整聯(lián)蛋白、乳腺珠蛋白、MFG-E8、MMP9、MUC1、MUC17、MUC2、NGAL, NK-2R(C-21)、NY-ESO-U PBP、PCSA、PIMl、PRL, PSA、PSIP1/LEDGF、PSMA, RANK、S100-A4、s印rase/FAP、SIM2(C-15)、SPDEF、SSX2、STEAP、TGM2、--ΜΡ-1、Trai1-R4,TsglOl、TWEAK、UNC93A、VCAN、XAGE-1 及其組合的蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物進(jìn)一步包括選自EpCAM、⑶81、PCSA、MUC2、MFG-E8及其組合的蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物選自let-7d、miR-148a、miR-195、miR-25、miR_26b、miR-329、miR_376c、miR-574_3p、miR-888、miR-9、miR1204、miR-16-2*、miR-497、miR-588、miR_614、miR-765、miR92b*、miR_938、let_7f-2*、miR-300、miR-523、miR-525_5p、miR-l 182、miR_l244、miR-520d_3p、miR-379、let-7b、miR-125a_3p、miR-1296、miR-134、miR-149、miR-150、miR-187、miR-32、miR-324_3p、miR-324_5p、miR-342_3p、miR-378、miR-378*、miR-384、miR-451、miR-455_3p、miR-485_3p、miR_487a、miR-490_3p、miR-502_5p、miR-548a_5p、miR-550、miR-562、miR-593、miR-593*、miR-595、miR-602、miR-603、miR-654_5p、miR-877*、miR-886_5p、miR-125a_5p、miR-140_3p、miR-192、miR_196a、miR-2110、miR-212、miR-222、miR-224*、miR_30b*、miR-499_3p、miR-505*及其組合。
10.權(quán)利要求1的方法,其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自A33、ADAM10、ALIX、AMACR、ASCA、ASPH(A-1O)、AURKB, B7H3、BCNP, CA125、CA-19-9, C-Bir (鞭毛蛋白)、CD24、CD3、CD41、CD63、CD66e CEA、CD81、CD9、CDADCl、CRP、CSA、CXCLl2, CYFRA21-1、DCRN、EGFR、EpCAM、EphA2、ERG、FLNA, GAL3、GATA2、GM-CSF, Gro a、HER3 (ErbB3)、HSP70、hVEGFR2、iC3b、IL-1B、IL6Unc、IL8、整聯(lián)蛋白、KLK2、乳腺珠蛋白、MFG-E8、MMP7、MMP9、MS4A1、MUC1、MUC17、MUC2、NGAL, NK_2R(C_21)、NY-ESO-U p53、PBP、PCSA、PIMU PRL, PSA、PSMA, RANK、RUNX2,S100-A4,seprase/FAP,SERPINB3,SIM2(C-15)、SPC、SPDEF、SSX2、SSX4、STEAP、TGM2、TIMP-U TRAIL R2、Trail_R4、IsglO1、TWEAK、VCAN、VEGF A、XAGE 及其組合的蛋白質(zhì)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物進(jìn)一步包括選自EpCAM、CD81、PCSA、MUC2、MFG-`E8及其組合的蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物選自hsa-miR-451、hsa-miR-223、 hsa-miR-593*、 hsa-miR-1974、 hsa-miR-486_5p、 hsa_miR-19b、hsa_miR-320b、hsa_miR-92a、hsa-miR-21、hsa-miR-675*、hsa-miR-16、hsa-miR-876_5p、hsa-miR-144、hsa-miR-126、hsa-miR-137、hsa-miR-1913、hsa-miR-29b_l木、hsa_miR-15a、hsa-miR-93、hsa-miR-1266 及其組合。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括一種或多種選自CD9、CD63、CD81、MMP7、EpCAM及其組合的蛋白質(zhì)。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自STAT3、EZH2、p53、MACCl、SPDEF、RUNX2、YB-1、AURKA、AURKB 及其組合的蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求1的方法,其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自PCSA、Muc2、AdamlO及其組合的蛋白質(zhì)。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自堿性磷酸酶(AP)、⑶63、1^001、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、獻(xiàn)?18、0冊&86、抑制素、^451?0、熱休克蛋白27、膠原蛋白I1、層粘連蛋白Bl/bl、Gail、CDw75、bcl-XL、層粘連蛋白-S、鐵蛋白、CD21、ADP-核糖基化因子(ARF-6)及其組合的蛋白質(zhì)。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自⑶56/NCAM-1、熱休克蛋白 27/hsp27、CD45R0、MAP IB, MyoDl、CD45/T200/LCA、CD3 ζ、層粘連蛋白 _s、bcl-XL、Radl8、Gail、胸苷酸合成酶、堿性磷酸酶(AP)、CD63、MMP-16/MT3-MMP、細(xì)胞周期蛋白C、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、SIRP al、層粘連蛋白Bl/bl、淀粉樣蛋白β (APP)、SODD(死亡結(jié)構(gòu)域的沉默子)工0037、6&13-142?-2、^6、肥大細(xì)胞糜蛋白酶、￥谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)及其組合的蛋白質(zhì)。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自堿性磷酸酶(AP)、⑶56 (NCAM)、⑶-3 ζ、MapIb、14.3.3pan、細(xì)絲蛋白、血小板反應(yīng)蛋白及其組合的蛋白質(zhì)。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括Ago2。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物進(jìn)一步包括一種或多種微RNA。
21.權(quán)利要求1的方法,其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括MMP7。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自ADAM-10、BCNP、⑶9、EGFR、EpCam, IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、PCSA、SERPINB3、SPDEF、SSX2、SSX4 及其組合的蛋白質(zhì)。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括選自EGFR、EpCAM、KLK2、PBP、SPDEF、SSX2、SSX4及其組合的蛋白質(zhì)。
24.—種方法,其包括: (a)將生物樣品接觸一種或多種試劑，其中所述生物樣品包含一種或多種微囊泡，并且進(jìn)一步其中所述一種或多種試劑包括特異性結(jié)合表5中的一種或多種生物標(biāo)志物的第一試劑和第二試劑； (b)基于所述生物樣品與所述第一和第二試劑的接觸檢測所述一種或多種微囊泡的存在或水平； (C)鑒定包括所述生物樣品中檢測的所述一種或多種微囊泡的存在或水平的生物印記。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述第一試劑包括捕獲劑和所述第二試劑包括檢測劑，其選自表38、40-44、50、51、55-67和72-74任一個中的一個或多個捕獲劑和檢測劑對。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括乳腺珠蛋白-MFG-E8、SIM2-MFG-E8 和 NK-2R-MFG-E8 的結(jié)合劑對。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括整聯(lián)蛋白-MFG-E8、NK-2R-MFG-E8 和 Gal3_MFG_E8 的結(jié)合劑對。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括AURKB、A33、CD63、Gro-a和整聯(lián)蛋白的捕獲劑；以及MUC2、PCSA和CD81的檢測劑。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括AURKB、⑶63、FLNA、A33、Gro-a、整聯(lián)蛋白、CD24、SSX2 和 SM2 的捕獲劑；以及 MUC2、PCSA、CD81、MFG_E8和EpCam的檢測劑。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-MMP7、PCSA-MMP7 和 EpCam-BCNP 的結(jié)合劑對。
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-MMP7、PCSA-MMP7、EpCam-BCNP, PCSA-ADAM10 和 PCSA-KLK2 的結(jié)合劑對。
32.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-MMP7、PCSA-MMP7、EpCam-BCNP, PCSA-ADAM10、PCSA-KLK2、PCSA-SPDEF、CD81-MMP7、PCSA-EpCam,MFGE8-MMP7 和 PCSA-1L-8 的結(jié)合劑對。
33.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-MMP7、PCSA-MMP7、EpCam-BCNP, PCSA-ADAM10 和 CD81-MMP7 的結(jié)合劑對。
34.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括ADAM-10、BCNP,CD9、EGFR、EpCam、IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、PCSA、SERPINB3、SPDEF、SSX2 和 SSX4 中一個或多個的捕獲劑以及EpCam或PCSA的檢測劑。
35.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括選自以下的結(jié)合劑對:EpCAM-EpCAM、EpCAM_KLK2、EpCAM-PBP、EpCAM-SPDEF、EpCAM_SSX2、EpCAM_SSX4、EpCAM-ADAM-10、EpCAM_SERPINB3、EpCAM-PCSA、EpCAM_p53、EpCAM_MMP7、EpCAM-1LlB、EpCAM-EGFR、EpCAM_CD9、EpCAM-BCNP、KLK2_EpCAM、KLK2-KLK2、KLK2-PBP、KLK2-SPDEF、KLK2-SSX2、KLK2-SSX4、KLK2-ADAM-10、KLK2-SERPINB3、KLK2-PCSA、KLK2_p53、KLK2-MMP7、KLK2-1L1B、KLK2-EGFR、KLK2-CD9、KLK2-BCNP、PBP-EpCAM、PBP-KLK2、PBP-PBP, PBP-SPDEF、PBP-SSX2、PBP-SSX4、PBP-ADAM-10, PBP-SERPINB3、PBP-PCSA、PBP-p53、PBP-MMP7、PBP-1L1B、PBP-EGFR、PBP-CD9、PBP-BCNP, SPDEF-EpCAM、SPDEF-KLK2、SPDEF-PBP, SPDEF-SPDEF、SPDEF-SSX2、SPDEF-SSX4、SPDEF-ADAM-1O、SPDEF-SERPINB3、SPDEF-PCSA、SPDEF-p53、SPDEF-MMP7、SPDEF-1L1B、SPDEF-EGFR、SPDEF-CD9、SPDEF-BCNP、SSX2-EpCAM、SSX2-KLK2、SSX2-PBP、SSX2-SPDEF、SSX2-SSX2、SSX2-SSX4、SSX2-ADAM-10、SSX2-SERPINB3、SSX2-PCSA、SSX2_p53、SSX2-MMP7、SSX2-1L1B、SSX2-EGFR、SSX2-CD9、SSX2-BCNP、 SSX4-EpCAM、 SSX4-KLK2、 SSX4-PBP、 SSX4-SPDEF、 SSX4-SSX2、 SSX4-SSX4、SSX4-ADAM-10、SSX4-SERPINB3、SSX4-PCSA、SSX4_p53、SSX4-MMP7、SSX4-1L1B、SSX4-EGFR、SSX4-CD9、SSX4-BCNP、ADAM-10-`EpCAM、ADAM-10-KLK2、ADAM-10-PBP, ADAM-10-SPDEF,ADAM-10-SSX2、ADAM-10-SSX4、ADAM-10-ADAM-10, ADAM-10-SERPINB3、ADAM-1O-PCSA、ADAM-10-p53、ADAM-10-MMP7、ADAM-10-1L1B、ADAM-1O-EGFR、ADAM-10-CD9、ADAM-10-BCNP,SERPINB3-EpCAM、 SERPINB3-KLK2、 SERPINB3-PBP、 SERPINB3-SPDEF、 SERPINB3-SSX2、SERPINB3-SSX4、SERPINB3-ADAM-10、SERPINB3-SERPINB3、SERPINB3-PCSA、SERPINB3_p53、SERPINB3-MMP7、 SERPINB3-1L1B、 SERPINB3-EGFR、 SERPINB3-CD9、 SERPINB3-BCNP、PCSA-EpCAM、PCSA-KLK2、PCSA-PBP, PCSA-SPDEF, PCSA-SSX2、PCSA-SSX4、PCSA-ADAM-1O、PCSA-SERPINB3、PCSA-PCSA、PCSA_p53、PCSA-MMP7、PCSA-1L1B、PCSA-EGFR、PCSA-CD9、PCSA-BCNP、p53-EpCAM、p53_KLK2、p53_PBP、p53_SPDEF、p53_SSX2、p53_SSX4、p53_ADAM_10、P53-SERPINB3、p53_PCSA、p53_p53、p53_MMP7、p53_ILlB、p53_EGFR、p53_CD9、p53_BCNP、MMP7-EpCAM、MMP7-KLK2、MMP7-PBP、MMP7-SPDEF、MMP7-SSX2、MMP7-SSX4、MMP7-ADAM-10、MMP7-SERPINB3、MMP7-PCSA、MMP7_p53、MMP7-MMP7、MMP7-1L1B、MMP7-EGFR、MMP7-CD9、MMP7-BCNP、 ILlB-EpCAM、 IL1B-KLK2、 ILlB-PBP,IL1B-SPDEF、 IL1B-SSX2、 IL1B-SSX4、IL1B-ADAM-10、IL1B-SERPINB3、IL1B-PCSA、ILlB_p53、IL1B-MMP7、IL1B-1L1B、IL1B-EGFR、IL1B-CD9、IL1B-BCNP、EGFR-EpCAM、EGFR-KLK2、EGFR-PBP, EGFR-SPDEF、EGFR-SSX2、EGFR-SSX4、EGFR-ADAM-10、EGFR-SERPINB3、EGFR-PCSA、EGFR-p53、EGFR-MMP7、EGFR-1L1B、EGFR-EGFR、EGFR-CD9、EGFR-BCNP、CD9_EpCAM、CD9-KLK2、CD9-PBP、CD9-SPDEF、CD9-SSX2、CD9-SSX4、CD9-ADAM-10、CD9-SERPINB3、CD9-PCSA、CD9_p53、CD9-MMP7、CD9-1L1B、CD9-EGFR、CD9-CD9、CD9-BCNP、BCNP-EpCAM、BCNP-KLK2、BCNP-PBP、BCNP-SPDEF、BCNP-SSX2、BCNP-SSX4、BCNP-ADAM-10、BCNP-SERPINB3、BCNP-PCSA、BCNP_p53、BCNP-MMP7、BCNP-1L1B、BCNP-EGFR、BCNP-CD9、BCNP-BCNP,及其組合。
36.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCAM、KLK2、PBP、SPDEF、SSX2、SSX4、EGFR中一種.或多種的捕獲劑和EpCam的檢測劑。
37.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括多種選自以下的檢測劑:SSX4 和 EpCAM ；SSX4 和 KLK2 ；SSX4 和 PBP ；SSX4 和 SPDEF ；SSX4 和 SSX2 ；SSX4 和EGFR ；SSX4 和 MMP7 ；SSX4 和 BCNPl ；SSX4 和 SERPINB3 ；KLK2 和 EpCAM ；KLK2 和 PBP ；KLK2 和SPDEF ；KLK2 和 SSX2 ；KLK2 和 EGFR ；KLK2 和 MMP7 ；KLK2 和 BCNPl ；KLK2 和 SERPINB3 ；PBP 和EGFR ；PBP 和 EpCAM ；PBP 和 SPDEF ；PBP 和 SSX2 ；PBP 和 SERPINB3 ；PBP 和 MMP7 ；PBP 和 BCNPl ；EpCAM 和 SPDEF ;EpCAM 和 SSX2 ;EpCAM 和 SERPINB3 ;EpCAM 和 EGFR ;EpCAM 和 MMP7 ;EpCAM 和BCNPl ；SPDEF 和 SSX2 ；SPDEF 和 SERPINB3 ；SPDEF 和 EGFR ；SPDEF 和 MMP7 ；SPDEF 和 BCNPl ；SSX2 和 EGFR ；SSX2 和 MMP7 ；SSX2 和 BCNPl ；SSX2 和 SERPINB3 ；SERPINB3 和 EGFR ；SERPINB3和 MMP7 ；SERPINB3 和 BCNPl ；EGFR 和 MMP7 ；EGFR 和 BCNPl ；MMP7 和 BCNPl ;及其組合。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述檢測劑包括EpCAM檢測劑。
39.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括選自EpCam-EpCam,EpCam_KLK2、EpCam-PBP、EpCam-SPDEF、EpCam_SSX2、EpCam_SSX4、EpCam-EGFR及其組合物的結(jié)合劑對。
40.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-EpCam的結(jié)合劑。
41.權(quán)利要求25的方`法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-KLK2的結(jié)合劑。
42.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-PBP的結(jié)合劑。
43.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-SroEF的結(jié)合劑。
44.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-SSX2的結(jié)合劑。
45.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-SSX4的結(jié)合劑。
46.權(quán)利要求25的方法，其中所述一個或多個捕獲劑和檢測劑對包括EpCam-EGFR的結(jié)合劑。
47.權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的方法，其中所述第一和第二試劑包括抗體和/或適體。
48.權(quán)利要求25-46任一項(xiàng)的方法,其中所述捕獲劑栓系于基底。
49.權(quán)利要求25-46任一項(xiàng)的方法，其中所述檢測劑是標(biāo)記的。
50.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，進(jìn)一步包括將所述生物印記與參照生物印記進(jìn)行比較，其中所述比較用于表征癌癥。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述參照生物印記來自未患癌癥的受試者。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述表征包括鑒定受試者中癌癥的存在或風(fēng)險(xiǎn)，或鑒定受試者中癌癥是轉(zhuǎn)移性的或侵襲性的。
53.權(quán)利要求50的方法，其中所述比較步驟包括確定生物印記是否相對于參照生物印記有改變，由此提供癌癥的預(yù)后、診斷或治療診斷確定。
54.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述生物樣品包括體液。
55.權(quán)利要求50的方法，其中所述體液包括外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或預(yù)射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛發(fā)、淚液、囊液、胸腔積液和腹水液、心包液、淋巴、食物糜、乳糜、膽汁、間質(zhì)液、經(jīng)血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支氣管抽吸液、囊胚腔液、臍帶血或其任一種的衍生物。
56.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述生物樣品包括尿液、血液、血液衍生物或其任一種的衍生物。
57.權(quán)利要求1-53任一項(xiàng)的方法，其中所述生物樣品包括細(xì)胞培養(yǎng)物或其衍生物。
58.權(quán)利要求1-53任一項(xiàng)的方法，其中所述生物樣品包括組織樣品或其衍生物。
59.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述生物樣品包含一種或多種微囊泡。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述生物樣品由所述一種或多種微囊泡組成。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物與所述一種或多種微囊泡相關(guān)。
62.權(quán)利要求59的方法，其中所述一種或多種微囊泡具有IOnm至2000nm的直徑。
63.權(quán)利要求59的方法，其中所述一種或多種微囊泡具有20nm至200nm的直徑。
64.權(quán)利要求59的方法，其中所述一種或多種微囊泡經(jīng)受尺寸排阻色譜、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和純化、親和捕獲、免疫分析、微流體分離、流式細(xì)胞分析或其組合。
65.權(quán)利要求59的方法，其中將所述一種或多種微囊泡接觸所述一種或多種試劑。
66.權(quán)利要求65的方法,其中所述一種或多種試劑包括核酸、DNA分子、RNA分子、抗體、抗體片段、適體、類肽、zDNA、肽核酸(PM)、鎖核酸(LNA)、凝集素、肽、枝狀物、膜蛋白標(biāo)記劑、化學(xué)化合物或其組合。
67.權(quán)利要求65的方法，其中所述一種或多種試劑用于捕獲和/或檢測所述一種或多種微囊泡。
68.權(quán)利要求65的方法，其中所述一種或多種試劑結(jié)合所述一種或多種微囊泡上的一種或多種表面抗原。
69.權(quán)利要求68的方法,其中所述一種或多種表面抗原包括一種或多種蛋白質(zhì)。
70.權(quán)利要求69的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)包括⑶9、⑶63、⑶81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam, ADAM-10, BCNP, EGFR、IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、SERPINB3、SPDEF、SSX2 和SSX4中的一種或多種。
71.權(quán)利要求69的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)包括四跨膜蛋白、⑶9、⑶63、CD81、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、膜聯(lián)蛋白 V、MFG_E8 或表 3 中的蛋白質(zhì)中的一種或多種。
72.權(quán)利要求69的方法,其中所述一種或多種蛋白質(zhì)包括表3-5任一個中的一種或多種蛋白質(zhì)。
73.權(quán)利要求65的方法，其中所述一種或多種試劑用于捕獲所述一種或多種微囊泡。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括所述一種或多種捕獲的微囊泡內(nèi)的有效負(fù)載。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述有效負(fù)載包含一種或多種核酸、肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。
76.權(quán)利要求75的方法，其中所述核酸包括一種或多種DNA、mRNA、微RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、si RNA、hnRNA 或 shRNA。
77.權(quán)利要求74的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志物包括mRNA。
78.權(quán)利要求50的方法，其中所述癌癥包括急性成淋巴細(xì)胞性白血??；急性骨髓性白血??；腎上腺皮質(zhì)癌；AIDS相關(guān)癌癥；AIDS相關(guān)淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細(xì)胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細(xì)胞癌；膀胱癌；腦干膠質(zhì)瘤；腦腫瘤(包括腦干膠質(zhì)瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎性瘤、星形細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和成松果體細(xì)胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發(fā)部位不明的癌癥；類癌瘤；原發(fā)部位不明的癌瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌癥；脊索瘤；慢性淋巴細(xì)胞性白血??；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊亂；結(jié)腸癌；結(jié)腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細(xì)胞淋巴瘤；內(nèi)分泌胰島細(xì)胞瘤；子宮內(nèi)膜癌；成室管膜母細(xì)胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺神經(jīng)細(xì)胞瘤；尤文氏肉瘤；顱外生殖細(xì)胞瘤；性腺外生殖細(xì)胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤；胃腸道間質(zhì)瘤(GIST);妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；毛細(xì)胞白血?。活^頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內(nèi)黑色素瘤；胰島細(xì)胞瘤；卡波濟(jì)氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維組織細(xì)胞瘤骨癌；髓母細(xì)胞瘤；髓上`皮瘤；黑色素瘤；Merkel細(xì)胞癌；Merkel細(xì)胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發(fā)性的轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征；多發(fā)性骨髓瘤；多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞腫瘤；蕈樣肉芽腫；骨髓發(fā)育異常綜合征；骨髓增生性腫瘤；鼻腔癌；鼻咽癌；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細(xì)胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細(xì)胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤??；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實(shí)質(zhì)腫瘤；成松果體細(xì)胞瘤；垂體瘤；漿細(xì)胞腫瘤/多發(fā)性骨髓瘤；胸膜肺母細(xì)胞瘤；原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤；原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細(xì)胞(腎)癌；腎細(xì)胞癌；呼吸道癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌癥；S6zary綜合征；小細(xì)胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細(xì)胞癌；鱗狀頸癌；胃(胃的)癌；幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤；T細(xì)胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細(xì)胞癌；腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌；滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstr6m巨球蛋白血癥；*Wilm’ s腫瘤。
79.權(quán)利要求50的方法，其中所述癌癥包括前列腺癌。
80.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述方法在體外進(jìn)行。
81.所述一種或多種試劑用于實(shí)施前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法的用途。
82.—種包含權(quán)利要求1-80所述的一種或多種試劑的試劑盒。
83.權(quán)利要求82的試劑盒，其中所述試劑能夠結(jié)合表3-5、9-11、16-27、29、31-32、37-38、40-47、49-52、54-67和69-74任一個中的至少一種生物標(biāo)志物。
84.權(quán)利要求82或83的試劑盒，其中所述試劑包括抗體或適體。
85.分離的PCSA+，Muc2+，AdamlO+ 囊泡。
86.分離的MMP7+囊泡。
87.分離的Ago2+囊泡。
88.權(quán)利要求85-87任一項(xiàng)的囊泡，其中所述分離的囊泡包含一種或多種選自表5的微RNA。
89.權(quán)利要求85-87任一項(xiàng)的囊泡，其中所述分離的囊泡包含一種或多種選自表5或20-24 任一個的信使 RNA (mR`NA)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103874770SQ201280049340
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月8日
【發(fā)明者】K·布朗, T·波洛斯基, D·斯佩特茨勒 申請人:卡里斯生命科學(xué)盧森堡控股有限責(zé)任公司