病毒載體純化系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于純化病毒載體、特別是屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒載體的新方法，其基于編碼細胞表面標記物的外源基因在產(chǎn)生此類載體的包裝細胞系中的表達。在載體的病毒包膜中摻入細胞表面標記物允許用免疫學(xué)方法進行純化。
【專利說明】病毒載體純化系統(tǒng)
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及有效純化病毒載體特別是屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒載體的方法。更具體來講，本發(fā)明涉及通過基于在包裝細胞系中表達外源性細胞表面標記物的免疫學(xué)方法純化乂乂。
[0002]背景
病毒載體通常用于將遺產(chǎn)物質(zhì)遞送入靶細胞內(nèi)?，F(xiàn)在”在基因療法應(yīng)用中用于將治療基因運送至患者。在臨床應(yīng)用中，必須發(fā)展高質(zhì)量XV以符合管理機構(gòu)規(guī)定的要求。具體來講，必須發(fā)展更安全的生產(chǎn)細胞系用于大規(guī)模制備過程以獲得大的病毒儲庫。同時，成本-效率和可擴展的純化過程是制備待給予人的臨床級病毒顆粒所必不可少的。
[0003]XV制備物的純化必須防止因載體組分、細胞和培養(yǎng)基污染物比如血清所致的毒性、炎癥或免疫反應(yīng)等，2003；等，2002)。理想地純化過程需要保證維持病毒傳染性(穩(wěn)定性)、病毒顆粒的高回收率、污染物比如0嫩、蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的去除，濃縮病毒上清液的可能性以及當然還有過程的可擴展性社18等，1999；[7況和 0’311111妨11，1998)。
[0004]今天，基于不同的技術(shù)已發(fā)展出不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體純化程序，所述技術(shù)特別是:基于離心的方法、膜 分離法、色譜或其它基于用鹽和聚合物比如沉淀的方法。目前提出的純化方案導(dǎo)致低回收率(約30%)等，2007)。所有這些方法最初發(fā)展用于蛋白質(zhì)制備，它們進一步被修改用于純化”。因病毒顆粒的獨特性和復(fù)雜性所致，必須改善純化方法以獲得高生產(chǎn)率和高通量，同時維持終產(chǎn)物的生物學(xué)活性，特別是傳染性。
[0005]又一個更近的實例報告于16代611等，2011，其中公開在條件下大規(guī)模制備慢病毒載體的方法，所述病毒載體待在試驗性基因療法臨床試驗背景中用于治療
八1辦1也綜合征。這種公開的方法包括慢病毒顆粒的制備和下游純化工藝兩者。具體來講，純化基于合并幾種色譜步驟和基于膜的工藝步驟(包括陰離子交換和分子排阻色譜)的多步驟方案。雖然在生產(chǎn)率和終制備物中不存在0嫩和蛋白質(zhì)污染物方面的結(jié)果非常好，但純化過程的最終收率在以前公開方法的范圍內(nèi)(低于30%)并且最終樣品中病毒載體的傳染性下降。
[0006]病毒和細胞蛋白質(zhì)在病毒成熟期間都被摻入病毒包膜內(nèi)，特別是在所謂的出芽過程期間從宿主細胞釋放(紅訪111'等，1992)0例如，已顯示多種內(nèi)源性宿主細胞蛋白被摻入!117-1包膜內(nèi)，包括I和II類人淋巴細胞抗原(只!^)、⑶44、補體調(diào)控蛋白等，反之比如0X^4和等蛋白被排出。根據(jù)這種發(fā)現(xiàn)，提示細胞類型特異性抗原可充當復(fù)制的細胞起點的標記物(00)361^8等，1999)0此外，發(fā)展出一種能夠區(qū)分淋巴細胞衍生的繁殖病毒和巨噬細胞衍生的繁殖病毒的免疫磁性病毒捕獲測定法仏-11等，2000)。具體來講，1^11等顯示有可能用能夠結(jié)合⑶26的抗體分離I細胞衍生的病毒，并將其與巨噬細胞衍生的01^-1病毒區(qū)分開，進而可用抗⑶36抗體捕獲巨噬細胞衍生的
病毒。⑶26和⑶36兩者是在感染期間分別在I細胞和巨噬細胞中過度表達的內(nèi)源性宿主細胞蛋白。兩種蛋白也摻入在病毒包膜中，從而允許選擇性分離病毒。1—11等測試了一組能夠結(jié)合宿主細胞特異性抗原的抗體，之后才鑒定出成功的抗體。有趣的是，幾種能夠結(jié)合由巨噬細胞高水平內(nèi)源性表達的抗原(CD32、CD64、CD88和CD89)的抗體反而不能捕獲病毒，從而顯示在宿主細胞表面上某些標記物的過度表達是捕獲病毒的必要但非充分的條件。Lawn等并未顯示由宿主表達的外源性蛋白可成功地摻入病毒包膜內(nèi)，隨后用于純化功能上有活性的病毒顆粒。
[0007]業(yè)已顯示某些修飾的細胞表面標記物可用于純化轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。具體來講，冊/9506723公開標記真核(哺乳動物)細胞的方法，其通過在這些細胞中表達編碼細胞表面受體的核酸來實現(xiàn)，所述受體進一步提呈在細胞表面。這種細胞選擇方法的特征在于使用核酸，其中編碼受體胞內(nèi)域的區(qū)域完全或部分缺失，或者被修飾以致提呈在表面的受體在與其結(jié)合配偶體結(jié)合之后不能實現(xiàn)任何信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在公開的方法中采用的細胞表面受體是截短形式的低親和力神經(jīng)生長因子受體，其中已缺失胞內(nèi)域。所得截短的細胞表面受體稱為八1^0^。八蛋白的存在允許通過使用單克隆抗體和磁珠體外免疫選擇遺傳修飾的細胞。
[0008]八是目前在基因療法中用于選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的截短細胞表面標記物。例如，它應(yīng)用于基因療法中，所述療法使單倍同一性造血干細胞移植(613(:1)能夠安全地用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤。1?療法采用攜帶自殺基因和標記基因八CD即!?兩者的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，1998)。
[0009]迄今為止，尚無八受體用于純化禮
[0010]因為必須制備純化的XV用于臨床應(yīng)用，所以已進行幾種嘗試以獲得允許良好地回收XV并且產(chǎn)生就穩(wěn)定性而言仍然具有良好質(zhì)量的充分安全的載體的有效純化方法。目前采用的方法允許獲得低回收率且在任何情況下都有一些限制，因為它們來自針對制備重組蛋白開發(fā)并適應(yīng)于”純化的下游工藝。因此，需要有效、快速且可擴展的V純化方法以用于大規(guī)模制備載體用于基因療法，所述方法允許獲得良好回收率和維持高傳染性的安全的病毒顆粒。
[0011]發(fā)明概述
本發(fā)明涉及^、特別是屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的V的純化領(lǐng)域。目前用于V純化的下游工藝基于通常用于重組蛋白的方法。XV是用于基礎(chǔ)研究和基因療法臨床試驗的特殊顆粒，在后一種情況下，該顆粒需要臨床級生產(chǎn)。因此純化是必需的，但是由于”的特殊性，有幾項要求必須滿足。純化過程必須有效和快速，因為XV對環(huán)境條件敏感；必須可擴展，因為臨床應(yīng)用需要大批量。
[0012]本發(fā)明提供一種純化病毒顆粒的新策略，其基于開發(fā)此類顆粒將嵌入細胞質(zhì)膜中的宿主細胞蛋白摻入其外部包膜內(nèi)的性質(zhì)。該純化方法在于編碼細胞表面標記物的外源基因在制備”的包裝細胞系中的表達。此類標記物暴露在包裝細胞的細胞膜上。在病毒顆粒制備過程中，在成熟期間，細胞表面標記物通過出芽過程摻入病毒包膜內(nèi)。當摻入病毒包膜時，標記物事實上是病毒表面標記物，但我們應(yīng)當繼續(xù)將所述標記物稱為“細胞表面標記物”。然后可將病毒顆粒與能夠識別此類標記物的抗體孵育，通過免疫學(xué)方法純化。所有對包裝細胞特別是包裝上皮細胞而言是外源性的細胞表面蛋白都可在本發(fā)明用作細胞表面標記物?？刹捎玫募毎砻鏄擞浳锸抢鏑D26、CD36、CD44、CD3、CD25和其中胞內(nèi)域缺失的低親和力神經(jīng)生長因子受體(八在優(yōu)選實施方案中用于純化過程的細胞表面標記物是八⑶即尺。
[0013]所開發(fā)的純化方法非常多用途，因為它適用于在成熟期間通過出芽過程摻入宿主細胞膜蛋白的任何”，比如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、0病毒[如36111111^病毒3111(111318病毒(31吣]、棒狀病毒[如水泡性口膜炎病毒037)]和正粘病毒[如甲型流感病毒]。此外，純化方法與制備方法關(guān)聯(lián)，因為它需要標記物在包裝細胞系中表達，因此允許其中制備和下游工藝以同一種原料(包裝細胞系)為基礎(chǔ)的整合方法。在這種情況下，有可能制備含有制備”必需的所有元件以及編碼純化必需的細胞表面標記物的另一外源基因的穩(wěn)定包裝細胞系。這方面對于可擴展性和效率都特別有用。
[0014]該方法基于使用能夠結(jié)合細胞表面標記物的配體，以從上清液分離I優(yōu)選配體是抗體并且通過免疫學(xué)方法獲得病毒顆粒的分離。更優(yōu)選該方法采用免疫磁性選擇。本發(fā)明的方法可以容易地按比例放大和自動化，因為存在幾種實施免疫磁性選擇的儀器。
[0015]此外提出的方法方便、非常快速且很有效:純化效率高于目前使用的方法例如色譜方法比如那些采用02八2和3%柱的色譜方法所獲得的效率。
[0016]此外，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的純化方法允許高回收率，因為已顯示在大多數(shù)小規(guī)模實驗中通過該方法純化的載體的滴度收率為至少85%或甚至更高(120%)。此外，在小規(guī)模實驗中，用本發(fā)明方法純化的慢病毒載體的傳染性已獲得相當大的增加(對瞬時和穩(wěn)定制備分別為43%和60%)。這樣的滴度收率和傳染性增加用本發(fā)明純化方法的單一主要步驟(即復(fù)合物病毒載體-配體的分離)達到，而不考慮可影響最終結(jié)果的其它步驟。
[0017]也已實施大規(guī) 模實驗并已獲得非常好的結(jié)果。事實上，使用分離復(fù)合物病毒載體-配體的單一步驟，就病毒滴度而言回收率是60%。在開始分離階段之前，通過初步過濾和離心步驟(其粗略清除污染物和轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑)并且還通過與受體的配體孵育來使病毒上清液富集其病毒滴度。在整個多步驟純化過程后的最終滴度收率(收獲病毒上清液對比最終純化產(chǎn)物)達到大于100%。鑒于在文獻中公開的整個純化過程的滴度收率為約30%(60(1:^181168^ 2007)或者在大規(guī)模制備的情況下甚至更低等2011)，這些是非常好的結(jié)果。此外，根據(jù)本發(fā)明方法大規(guī)模純化的V導(dǎo)致3倍的傳染性增加，該增加比用相同方法小規(guī)模獲得的增加還多。這是非常重要和意想不到的優(yōu)點，因為除了用常規(guī)方法進行純化以外文獻還描述傳染性的下降等2011)。
[0018]發(fā)明陳述
根據(jù)本發(fā)明第一方面，提供純化病毒載體的方法，其包括:
1.將編碼細胞表面標記物的外源基因和感興趣基因(601)引入包裝細胞系
I1.培養(yǎng)這樣獲得的生產(chǎn)細胞系
II1.收集含有在其外包膜上攜帶所述細胞表面標記物的病毒載體顆粒的上清液
將所述上清液與能夠結(jié)合所述細胞表面標記物的配體孵育
1分離復(fù)合物配體-病毒載體 VI獲得純化的病毒載體顆粒
在本發(fā)明另一方面將含有在其外包膜上攜帶細胞表面標記物的病毒載體顆粒的上清液過濾，任選濃縮然后與能夠結(jié)合所述細胞表面標記物的配體孵育。
[0019]優(yōu)選病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、0病毒載體[如從361111認1？01~68丨病毒3111(111318病毒(31吣獲得的載體]、棒狀病毒載體[如從水泡性口膜炎病毒衍生的載體]和正粘病毒載體[如從甲型流感病毒衍生的載體]。更優(yōu)選病毒載體是慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
[0020]在一個實施方案中細胞表面標記物是對包裝細胞系(其優(yōu)選為上皮包裝細胞系)而言為外源性的任何細胞表面標記物。優(yōu)選細胞表面標記物選自⑶26、⑶36、⑶44、⑶3、0)25和八⑶即尺。
[0021〕 更優(yōu)選細胞表面標記物是八
[0022]在本發(fā)明一方面細胞表面標記物的表達是瞬時的。
[0023]在本發(fā)明另一方面細胞表面標記物的表達是穩(wěn)定的。
[0024]在一個實施方案中將601和細胞表面標記物表達在同一個轉(zhuǎn)移載體中。
[0025]在另一個實施方案中將601和細胞表面標記物表達在獨立的載體中。
[0026]優(yōu)選配體是選自激動劑、拮抗劑、肽、擬肽、抗體、抗體片段、親和體(￡181130(17)的化學(xué)或生物學(xué)實體。在本發(fā)明又一方面配體連接至可從上清液分離的部分。
[0027]優(yōu)選配體是抗體。
[0028]更優(yōu)選抗體與磁珠綴合，通過對含有復(fù)合物抗體-病毒載體的溶液施加磁場獲得分離。
[0029]優(yōu)選通過除去 磁場獲得病毒載體。更優(yōu)選在柱上實施復(fù)合物抗體-病毒載體的分離，通過除去磁場并將其進一步從柱洗脫獲得病毒載體。
[0030]在一個實施方案中通過斷裂細胞表面標記物-抗體鍵從抗體分離病毒載體。
[0031〕 在本發(fā)明另一方面提供在包裝細胞系中表達的外源性細胞表面標記物，用于純化由所述包裝細胞系制備的病毒載體。
[0032]優(yōu)選病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、0病毒載體[如從361111認1？01~68丨病毒3111(111318病毒(31吣獲得的載體]、棒狀病毒載體[如從水泡性口膜炎病毒(訓(xùn)衍生的載體]和正粘病毒載體[如從甲型流感病毒衍生的載體]。更優(yōu)選病毒載體是慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
[0033]細胞表面標記物對包裝細胞系而言是外源性的，優(yōu)選對上皮包裝細胞而言是外源性的。優(yōu)選細胞表面標記物選自⑶26、⑶36、⑶44、⑶3、⑶25和八[風正尺。
[0034]更優(yōu)選細胞表面標記物是八[風正尺。
[0035]在本發(fā)明一方面細胞表面標記物的表達是瞬時的。
[0036]在本發(fā)明另一方面細胞表面標記物的表達是穩(wěn)定的。
[0037]發(fā)明詳述
將通過非限制性實例的方式描述本發(fā)明的優(yōu)選特征和實施方案的詳細說明。
[0038]本發(fā)明可由采用(除非另外說明)化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組0嫩和免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實施。所有此類技術(shù)公開和解釋于出版的文獻中。參見例如 X 8^111131-00^, ￡.和1989，1016。111已1~ 01011111^:八1^1301-81:01-7 1冊皿1 (分子克隆:實驗室手冊)，第2版，第1-3篇，(301(1 8^11-1118他1~1301~ ？1~688 ； ^11811)361, 1.等(19% 和定期增刊；？1~0七0。018
1111016(3111 犯' 01010^7 (分子生物學(xué)現(xiàn)有方案)，9、13 和 16 章，了01111 11167 & 80118,
界) ； 0111-1-6111: ？1~01:00018 111 11111111111010^7 (免疫學(xué)現(xiàn)有方案)，12 章，
了01111 11167 & 80118,界 101? ) ； 8.尺06，了.0^1^66,和八.1996，0嫩1801^1:1011 811(1 86^116110111?: ￡886111:181 16011111^1168 (0嫩分離和測序:必要技術(shù))，了(6)111111167 & 80118 ； 了.1.？。1 成和]811168 0,0.10666, 1990，III 811:11^1-111011)168 811(1 ？1~801:106 (原位雜交:原理和實施):0^^01^(1 11111^61~811:7 ？1~688 ； 1.了.6&11:(編者)，1984， 011^0111101601:1(16 87111:116818:八 ^^3,01103,1 ^1)1-08011 (寡核苷酸合成:實施途徑)，11*1 ？1~688 ；和，0.1.了.[11167 和了.￡.0^1)361-^, 1992，
161:110(18 0？ ￡1127111010^7: 0^ 81:1-1101:111-6 ？3^1 八:8711^6818 811(1 ？117810&1 ^11817818 0？0嫩161:110(18 111 2112齊01087 (酶學(xué)方法:0嫩結(jié)構(gòu)部分八:0嫩合成和物理分析，酶學(xué)中的方法)，^08(1611110 ？1~688。所有這些出版物都通過引用結(jié)合。
[0039]純化方法
本發(fā)明提供一種新的^純化方法。優(yōu)選本發(fā)明涉及用于純化XV的方法，XV包括V逆轉(zhuǎn)錄病毒(原型:莫洛尼鼠白血病病毒，10-117)、慢病毒(原型:1117)、0病毒[如361111讓1 ？0『68七病毒(咖)、義仏讓匕病毒(31吣]、棒狀病毒[如水泡性口膜炎病毒(乂^)]和正粘病毒〔甲型流感病毒]。提出的純化方法基于病毒成熟期之一。病毒顆粒通過出芽過程從宿主細胞分泌，通過該過程病毒衣殼被由病毒生產(chǎn)細胞衍生的質(zhì)膜包裹。這樣做時，病毒將幾種通常嵌入細胞質(zhì)膜中的宿主細胞蛋白摻入其外包膜中。
[0040]由瞬時或穩(wěn)定包裝系統(tǒng)制備的XV以同樣方式從包裝細胞釋放。本發(fā)明的方法基于通過使用針對外源性宿主質(zhì)膜蛋白的抗體可特異性純化巧這一假設(shè)。
[0041]根據(jù)本發(fā)明第一方面提供純化XV的方法，它基于編碼細胞表面標記物的外源基因在包裝細胞系中的表達。細胞表面標記物是對包裝細胞而言為外源性的蛋白，其表達在細胞膜上。一旦表達，此類 標記物固定在包裝細胞膜上，因此在巧成熟期間固定在由所述包裝細胞制備的”的外包膜上。根據(jù)本發(fā)明的方法，將含有在其包膜上嵌有細胞表面標記物的病毒顆粒的上清液收集并與能夠識別此類標記物的配體孵育。任選地，特別是對于其中必須處理和純化大體積的大規(guī)模XV純化，將上清液過濾和濃縮，然后再懸浮并與配體孵育。所有這些初步步驟允許粗略清除污染物和轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，因此促成在中間制備物觀察到的病毒滴度富集，從而促成純化病毒顆粒的最終滴度。除了這些初步步驟以外，將復(fù)合物配體-XV與培養(yǎng)基分離，然后獲得XV。分離階段是本發(fā)明純化方法的主要步驟?？赏ㄟ^斷裂配體與細胞表面標記物之間的鍵將V與配體分離。
[0042]在優(yōu)選實施方案中配體是抗體。
[0043]本發(fā)明的方法可概括為5個主要階段:
1)細胞表面標記物在用于”的包裝細胞系中的表達
2)病毒顆粒制備
3)與能夠識別細胞表面標記物的配體孵育
4)復(fù)合物配體-受體分離
5)純化的病毒顆粒的回收 標記物的表達和病毒顆粒的制備
本發(fā)明的純化方法基于外源性細胞表面標記物在用于巧的包裝細胞系中的表達。在優(yōu)選實施方案中細胞表面標記物對于上皮包裝細胞而言是外源性的。優(yōu)選細胞表面標記物選自⑶26、⑶36、⑶44、⑶3、⑶25和在缺失胞內(nèi)域的截短形式的低親和力神經(jīng)生長因子受體(八。在優(yōu)選實施方案中細胞表面標記物是八1^0^。細胞表面標記物的表達可通過幾種方式獲得。在本發(fā)明一方面，細胞表面標記物可以瞬時表達在包裝細胞系中。在一個實施方案中細胞表面標記物和治療基因兩者都表達在同一個轉(zhuǎn)移載體中。在另一個實施方案中細胞表面標記物和治療基因表達在獨立的載體中。
[0044]在本發(fā)明另一方面細胞表面標記物的表達是穩(wěn)定的。本發(fā)明因此提供包裝細胞系，它包含制備XV所必需的所有結(jié)構(gòu)元件比如病毒8^/1501、1*6^、任選仏1:和感興趣的包膜蛋白，以及細胞表面標記物。在一個實施方案中，所有這些基因都穩(wěn)定地整合在穩(wěn)定的包裝細胞系中。在另一個實施方案中瞬時表達制備XV所必需的元件。包裝細胞系除了可用于引入含有601的轉(zhuǎn)移載體以外還可用于制備XV。這種包裝細胞系代表含有制備XV所必需的所有元件并允許快速、安全和有效的純化方法的整合技術(shù)方案。
[0045]除了引入轉(zhuǎn)移載體以外，通過培養(yǎng)含有穩(wěn)定整合或瞬時表達的細胞表面標記物的包裝細胞系獲得產(chǎn)物。病毒顆粒在出芽過程期間將細胞表面標記物摻入其包膜中并且將它們釋放在上清液內(nèi)。純化的病毒顆?？赏ㄟ^利用如上文描述的外源性細胞表面標記物的存在而獲得。
[0046]在另一個實施方案中提供生產(chǎn)細胞系，它包含XV制備必需的所有結(jié)構(gòu)元件比如病毒1、1*6 V、任選七社、感興趣的包膜蛋白和⑶I，以及細胞表面標記物。在培養(yǎng)生產(chǎn)細胞后，含有細胞表面標記物的病毒顆粒釋放在上清液中，利用如上文描述的外源性細胞表面標記物的存在將其純化。
[0047]與配體孵育和復(fù)合物配體-細胞表面標記物的分離
可分離含有摻入其包膜的細胞表面標記物的病毒顆粒。根據(jù)本發(fā)明的純化方法，將含有巧的上清液與能夠識別細胞表面標記物的配體孵育。在另一個實施方案中將含有巧的上清液首先過濾和濃縮，然 后與配體孵育。配體連接至允許從上清液分離并因而離析配體復(fù)合物的另一種結(jié)構(gòu)?？捎糜诒景l(fā)明的配體是化學(xué)或生物學(xué)實體，包括但不限于激動劑、拮抗劑、肽、擬肽、抗體、抗體片段、親和體。
[0048]優(yōu)選配體是抗體且本發(fā)明的方法包括用于分離復(fù)合物抗體-XV的免疫選擇。在這種情況下，可根據(jù)其與抗細胞表面標記物抗體的反應(yīng)性選擇在其包膜上含有細胞表面標記物的V、。
[0049]更優(yōu)選本發(fā)明的方法包括免疫磁性選擇。免疫磁性選擇指抗體與能夠通過磁鐵與抗原結(jié)構(gòu)分離的順磁微球(珠)偶聯(lián)。例如，可將含有將細胞表面標記物摻入其包膜內(nèi)的^的上清液與初級I姊抗細胞表面受體抗體孵育。然后可將逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液與包被抗I姊次級仙的免疫磁珠孵育，并施加至磁鐵以分離攜帶所述標記物的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在從逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液分離后，可通過除去磁場回收分離的載體。作為替代，可使抗細胞表面受體抗體與磁珠直接綴合。在這種情況下，在單一孵育期后立即對溶液施加磁場。
[0050]本領(lǐng)域已知用于本發(fā)明的順磁微球，它們是聚合物顆粒，具有范圍從50 11111小尺寸比如市售獲得的組匕6即1^ 111的較大顆粒比如市售獲得的1鮮11:1~08611的順磁微球可直接或間接與能夠結(jié)合摻入，包膜的細胞表面標記物結(jié)合的感興趣的特異性抗體綴合。本領(lǐng)域已知抗體與順磁珠的綴合方法，包括例如交聯(lián)、在官能團上形成共價鍵、生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)等。通過對含有由綴合至順磁珠并與細胞表面標記物連接的抗體組成的復(fù)合物的溶液施加磁場可實現(xiàn)從病毒上清液分離I[0051]在本發(fā)明優(yōu)選方面免疫磁性選擇在柱上實施。具體來講，可將含有XV的上清液直接與能夠識別細胞表面標記物的抗體孵育，此類抗體與順磁珠綴合。在另一個實施方案中將含有巧的上清液首先過濾和任選濃縮，然后按前文描述孵育。在孵育后，將上清液或過濾和任選濃縮的溶液應(yīng)用于置于磁選機中的柱上，以除去雜質(zhì)和分離由于磁場而停留在柱中的病毒顆粒。
[0052]純化顆粒的回收
根據(jù)本發(fā)明的方法，工藝的最后階段是回收純化的病毒顆粒。通過從磁場清除病毒顆粒獲得這樣的回收。如果純化在柱上進行，則通過除去磁場獲得回收。然后可通過斷裂配體與細胞表面標記物之間的鍵將病毒載體與配體分離。本領(lǐng)域已知斷裂所述鍵的方法，包括使用置換配體或含有酶的適當溶液。根據(jù)配體和受體及其鍵的性質(zhì)采用適當?shù)姆椒ā?br> [0053]效率、擴大和自動化
本發(fā)明的方法非常有效并且簡單和快速。目前提出的純化方法允許約30%回收率。引人注目的是在大多數(shù)小規(guī)模實驗中本發(fā)明的方法允許獲得至少85%或甚至更高(120%)的滴度收率。在這種情況下，參考本發(fā)明方法的主要步驟:復(fù)合物病毒載體-配體的分離，計算滴度收率。上述滴度收率來自與外源性受體的配體孵育的未純化顆粒的滴度與純化顆粒的滴度之間的比率。在小規(guī)模實驗中的未純化顆粒通過初步過濾步驟從XV上清液獲得，然后與外源性受體的配體孵育。結(jié)果顯示用本發(fā)明方法所獲得的就病毒滴度而言的回收率非常聞。
[0054]病毒顆粒非常不穩(wěn)定且對環(huán)境條件敏感。特別是，在巧包膜上存在細胞表面標記物原則上可影響此類包膜的組成以及其結(jié)構(gòu)和病毒包膜蛋白的可用性，轉(zhuǎn)而影響載體的向性，從而引起病毒滴度和傳染性的問題。相反，通過本發(fā)明的方法，不影響或甚至增加滴度，引人注目的是用此類方法純化的慢病毒的傳染性小規(guī)模增加(對瞬時和穩(wěn)定制備分別是43%和60%)。這些結(jié)果令人驚奇，因為存在有可能負面影響載體向性和傳染性的結(jié)構(gòu)元件。
[0055]本發(fā)明又一個優(yōu)點是該方法可以簡單地擴大和自動化。鑒于其中通過使用免疫磁性選擇純化XV的情況，有可能采用能夠?qū)嵤┳詣舆x擇的機器(如111112108⑧？111811181:1-111116111:,來自1111:61171 0101:60)。此類機器必須能夠在固體支持物比如柱上實施液體交換和通過產(chǎn)生磁場實施免疫磁性選擇。自動化幫助制備大的%儲庫，因為它允許純化大量病毒上清液。用本發(fā)明方法大規(guī)模純化”允許在主要的特定分離階段獲得至少60%滴度收率(與受體的配體孵育的未純化顆粒的滴度對比純化顆粒的滴度未純化顆粒在大規(guī)模實驗中通過初步純化步驟(過濾，任選濃縮)從^上清液獲得，然后與外源性受體的配體孵育。這些步驟各自粗略清除污染物和轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，經(jīng)受分離的樣品的病毒滴度漸次富集。整個大規(guī)模過程的滴度收率(收獲病毒上清液的滴度對比純化顆粒的滴度)結(jié)果大于100%。鑒于據(jù)報告整個純化過程的滴度收率為約30% ^0(11-181168等2007)或在大規(guī)模制備的情況下甚至 更低(16代611等2011),這些是非常重要的結(jié)果。用本發(fā)明方法大規(guī)模純化允許^的傳染性增加，其導(dǎo)致在分離后傳染性為未純化顆粒的傳染性的約3倍。此外，為了使對用本發(fā)明純化方法獲得的制備物質(zhì)量有概念，有可能計算慢病毒傳染性顆粒數(shù)(從病毒滴度可推出的轉(zhuǎn)染單位)對比總物理顆粒數(shù)(可從如報告于&11111011和11*0110，2006的1叩對應(yīng)于107個物理顆粒這一常規(guī)方程獲得，)。非常有趣的是注意到通過本發(fā)明的方法，如顯示于例如表4的實驗2，從含有1個傳染性顆粒/5, 318總物理顆粒的上清液(非常差的原料)開始，有可能獲得含有1個傳染性顆粒/250個總物理顆粒的純化制備物，其在IV制劑的質(zhì)量和功能性方面都有非常好的富集。
[0056]現(xiàn)在將通過非限制性實施例和參考附圖描述本發(fā)明的其它優(yōu)選特征和實施方案，其中:
【專利附圖】

【附圖說明】。
[0057]圖1.基于抗八-仙的純化過程的示意圖?！皹?gòu)建體”表示瞬時或穩(wěn)定制備待純化V所需要的質(zhì)?；蜉d體(步驟1)?？蓪⑦x擇標記物八的盒摻入轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建體內(nèi)或在自包裝細胞瞬時或穩(wěn)定表達的不同質(zhì)粒中。將XV通過與磁珠偶聯(lián)的抗八^純化，然后其保留在磁性柱中(步驟2)并最終洗脫(步驟3〉。純化的XV可與連接的珠一起使用(步驟3.1)或者在除去連接的珠后使用(步驟3.2)。
[0058]圖2.本發(fā)明實驗程序的示意圖。將程序分為3個簡單步驟:1) XV的磁性標記，其在于將上清液與抗仙綴合的微珠混懸液在室溫下孵育30分鐘:2) ^的磁性分離，其在于將樣品應(yīng)用于放入磁選機的磁性柱內(nèi)；所有樣品組分(即污染物、蛋白質(zhì)和過量仙)流過并通過幾次洗滌進一步清除；3) XV的洗脫，其在于從磁選機移出柱和收集純化的XV。純化的XV可與連接的珠一起使用(步驟3.1)或者在清除連接的珠以后使用(步驟
3.2)。 [0059]圖3.概括小規(guī)模實驗數(shù)據(jù)的圖。將XV滴度收率計算為純化XV滴度相對于將樣品上樣至柱之前磁性標記巧的滴度的百分數(shù)。數(shù)值是5次慢病毒載體實驗的平均數(shù)，由尺02-101？%卜01111^ 14包裝克隆穩(wěn)定產(chǎn)生所述慢病毒載體，其攜帶80114-1^包膜(穩(wěn)定IV，80114-1? ；6次慢病毒載體實驗的平均數(shù)，通過瞬時轉(zhuǎn)染冊1(-2931產(chǎn)生所述慢病毒載體，其攜帶卿? 包膜(瞬時轉(zhuǎn)染V，787-6) ；5次逆轉(zhuǎn)錄病毒載體實驗的平均數(shù)，由
克隆48產(chǎn)生所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其攜帶如迪。包膜(穩(wěn)定―，八即“)。
實施例
[0060]實施例1: V的制備
醫(yī)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(⑶)的穩(wěn)定制備
在37 I在5% (?氣氛下使鼠肌??！-313衍生的64070-假型艦克隆48包裝細胞生長在補充10% ？88和2禮谷氨酰胺的腫￡1 (1)111136000
氏改良培養(yǎng)基)(^肅匕以 810 80101106 181^61-8^1116, 1110.181^61-8^1116, 10)或15 中。在轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建體版后獲得艦
克隆48，它編碼修飾形式的基因，其特征在于在0即330位核苷酸的單個沉默突變(10 2005/123912) 0通過使用八2細胞的抗-八[如服111^免疫選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，然后通過有限稀釋進行克隆(0.3個細胞/孔)?？寺?8含有2拷貝的$(:11-3 1機2載體。在滾瓶或在填充床32-升生物反應(yīng)器中在乂；170 15培養(yǎng)基中在1%谷氨酰胺、10% ？88和異亮氨酸/色氨酸/枸櫞酸鈉的存在下制備61？級逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上清液批次。
[0061]慢病毒載體(⑶的穩(wěn)定制備
使人冊1(-2931及其衍生物詘2-101？%卜0111113包裝細胞在補充10% 和的1)111136000 氏改良 2叫16 培養(yǎng)基(0121)中繁殖。^1)2-101^80^-01111113.14 和 01111113.25 克隆穩(wěn)定地制備第二代IV用于抗基因療法。用整合載體通過序貫整合包裝構(gòu)建體和轉(zhuǎn)移載體獲得克隆。簡言之，將冊[2931'細胞用編碼腺伴隨病毒(八八” 861)-78蛋白的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染，然后用雜交棒狀病毒.載體感染，其中棒狀病毒主鏈含有由湖反向末端重復(fù)(11?序列側(cè)接的表達結(jié)構(gòu)8叫、？01、調(diào)控性1*6^和七取"?？剐曰虻恼虾?國際專利申請?zhí)杻?012/028680)。這種系統(tǒng)允許III？側(cè)接的盒861)78-介導(dǎo)性整合入冊1(-293丁基因組內(nèi)，產(chǎn)生名為？1(-7的第一中間克隆。從？1(-7克隆開始，通過序貫整合表達1117-1調(diào)控仏丨和嵌合80114-11？包膜基因的31化1^和表達抗!117 VI？顯性失活轉(zhuǎn)基因⑶丨…的丁社-依賴性IV載體獲得14和(^丨….25包裝克隆(國際專利申請?zhí)?0 2012/028681 ^通過將有限稀釋度的細胞接種在96孔板(0.中獲
得克隆。關(guān)于每種細胞類型克隆實驗，通過在光學(xué)顯微鏡下目測觀察選擇至少5-10個單個克隆或更多個，并將其逐漸擴繁。通過小規(guī)模培養(yǎng)在125或175燒瓶中和通過大規(guī)模培養(yǎng)在丁162燒瓶中從詘2-101？^^-0111113獲得IV。
[0062]IV的瞬時制備
通過瞬時共轉(zhuǎn)染以下質(zhì)粒從冊1(-2931細胞獲得假型IV:包裝構(gòu)建體構(gòu)建體和2—-8611.11113轉(zhuǎn)移載體(國際專利申請?zhí)杻?012/028681)。包裝:包膜:
轉(zhuǎn)移載體的比率對應(yīng)于6.5:3.5:10 11 8 0嫩。用標準012+-904方法或？呢6116116系統(tǒng)按照制造商說明書(1)18^11081:108 0)11)01^1:1011，111(11^1^)0118，1^)實施瞬時轉(zhuǎn)染，獲得相似結(jié)果。在轉(zhuǎn)染后48小時收獲上清液，通過0.45-9 III濾器過濾。
[0063]實施例11:通過抗^小規(guī)模純化V
V、的小規(guī)模純化如下進行。 將含有XV的上清液用含有0.5% 8“的？83 1:5 (^01/^01)稀釋，然后用0.45 11111濾器過濾。將1至501稀釋的上清液與抗仙綴合的微珠混懸液(00271 微珠 1111:61171 0101:60, 011)3? 601-1118117 目錄號 130-091-330)以 1:40比率(701/^01)孵育。然后將樣品在轉(zhuǎn)臺上在室溫(奶)下孵育30分鐘。將磁性標記的樣品上樣至放入磁選機的柱(1111:61171, 13柱目錄號130-042-201)。在收集流過液用于分析和用0.5 1111洗滌緩沖液(含有2% 和0.5% 83八的？8幻洗滌3次后，從磁選機取出柱，收集純化的乂乂。
[0064]實施例1I1:滴度計算
在881: 101118, 10)的存在下通過以1，240X8達1
小時離心接種(81)1110(3111511:1011) —個周期轉(zhuǎn)導(dǎo)3111)11細胞，在3111)11細胞上計算V滴度。使用？10界了0 軟件(1^66 81:81-, 1110.,八0?，通過如描述于？01X6111 = 1 等，2009& 2010的流式細胞術(shù)分析0&1113111- 80 81080101106, &111 了086，⑶八⑶表達，監(jiān)測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。只有范圍為5至20%陽性細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)值用于根據(jù)下式計算滴度:幾=[細胞數(shù)X (%陽性細胞/100) V上清液體積(以“計)。
[0065]實施例1V:在小規(guī)模制備中純化，對比未純化，的效價分析
如表1和表2概括，使用3種類型的V實施了幾個實驗，所述V通過不同方式制備并用獨特包膜假型化。用穩(wěn)定的包裝細胞系14或通過瞬時轉(zhuǎn)染如在實施例1報告的冊1(-2931細胞制備表達0111113轉(zhuǎn)基因的第2代IV。在第一種條件下，用嵌合1^0114-11？包膜使IV假型化，所述嵌合1^0114-11？包膜由貓科內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒即114包膜的胞外域和跨膜域和八-祖^6鮮4070八的胞質(zhì)尾區(qū)(1?構(gòu)成等，2002),而在第二種條件下用水泡性口膜炎病毒糖蛋白6包膜使IV假型化。7 —用
克隆48制備，攜帶祖^ 64070包膜。
[0066]每次實驗都在以下條件進行:1)稀釋的上清液體積(101上清液用？83/2%^08/0.5% 83八1:5稀釋)；2〉上清液:微珠混懸液^1/^01)比率1:40⑶抗-[腳尺汕直接偶聯(lián)磁珠(60271微珠)。分析的輸出對應(yīng)于相對于未純化磁性標記V而言純化V滴度收率的百分數(shù)(圖3八)和純化XV的傳染性增加量的百分數(shù)(圖38)。滴度計算在3即丁1細胞上進行，詳見實施例1II。顯著地，穩(wěn)定制備的IV的收率超過100% (平均121%)，瞬時制備的IV的收率是90%。這意味著無論它們固定的包膜類型怎么樣，IV的純化在除去血清蛋白或可能降低滴度值的其它污染物方面都非常有效。7 的純化收率略低于IV (85%)。此外，用本發(fā)明方法純化的慢病毒載體的傳染性已獲得相當大的增加(對瞬時和穩(wěn)定制備分別是43%和60%)。
[0067]實施例V:通過抗仙大規(guī)模純化，
V、的大規(guī)模純化如下進行。通過在冷凍臺式離心機中在+41低速(3,400^8)離心16小時將含有IV的過濾上清液(0.45 ^ 111) (800 ^1)濃縮8倍。使，沉淀再懸浮于100“緩沖液？83/20171 0.5%人血清白蛋白(肥八)中，然后與抗仙綴合的微珠混懸液(0)271 微珠，111 七 6町1 81。七 6。，0^^ 130-091-330)^1:40^^^01/^01)^150111轉(zhuǎn)移袋(111丨61171 810^60目錄號183-01)中孵育。然后將樣品在室溫在軌道搖床上孵育30分鐘。將磁性標記的樣品上樣至？1118儀器上，啟動自動分離程序
3.2?；厥?0“純化的IV，通過效價計算評估等分試樣的純化性能。
[0068]實施例V1:在大規(guī)模制 備中純化對比未純化V效價的分析
使用從穩(wěn)定包裝細胞系1？02-101？%卜01111^ 25產(chǎn)生的表達⑶丨…轉(zhuǎn)基因的第2代IV，進行了 2個實驗。在表3和4概括結(jié)果。每個實驗如實施例V描述實施。分析的輸出對應(yīng)于相對于與綴合至磁珠的抗6結(jié)合的未純化病毒顆粒(表3)或相對于上清液(表4)而言，純化XV的滴度收率百分數(shù)和純化IV傳染性增加量的百分數(shù)兩者。滴度計算在3111)11細胞上進行，如公開于實施例1II。在復(fù)合物病毒載體-配體的單個分離步驟中大規(guī)模純化的滴度收率(表3，￡17輸入)為約60%。在開始分離階段之前，通過初步過濾和離心步驟并且還通過與受體的配體孵育使病毒上清液富集其病毒滴度，所述初步過濾和離心步驟粗略消除污染物和轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在整個多步驟純化過程后的最終滴度收率(收獲病毒上清液對比最終的純化產(chǎn)物)(表4，￡1/上清液)大于100%:實驗1為118%和實驗2為231%。最重要的是，純化顆粒的傳染性明顯增加至未純化顆粒的3倍，這與小規(guī)模實驗相比是甚至更高的富集，提示從^功能性來看大規(guī)模和自動化進一步增加該過程的收率。
【權(quán)利要求】
1.一種純化病毒載體的方法，其包括: I1.將編碼細胞表面標記物的外源基因和感興趣基因引入包裝細胞系 II1.培養(yǎng)這樣獲得的生產(chǎn)細胞系
收集含有在其外包膜上攜帶所述細胞表面標記物的病毒載體顆粒的上清液 乂.將所述上清液與能夠結(jié)合所述細胞表面標記物的配體孵育 分離復(fù)合物配體-病毒載體 VII獲得純化的病毒載體顆粒。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒載體選自逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、0病毒載體、棒狀病毒載體和正粘病毒載體。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細胞表面標記物選自⑶26、⑶36、⑶44、⑶3、⑶25或截短形式的低親和力神經(jīng)生長因子受體(八。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中所述細胞表面標記物是截短形式的低親和力神經(jīng)生長因子受體(ΔLNGFR)。
5.權(quán)利要求1至4中任一項的方法，其中所述細胞表面標記物的表達是瞬時的。
6.權(quán)利要求1至4中任一項的方法，其中所述細胞表面標記物的表達是穩(wěn)定的。
7.權(quán)利要求1至6中任一項的方法，其中感興趣的基因和外源基因在同一個轉(zhuǎn)移載體中表達。
8.權(quán)利要求1至6中任一項的方法，其中感興趣的基因和外源基因在獨立的載體中表達。
9.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述配體是選自激動劑、拮抗劑、肽、擬肽、抗體、抗體片段、親和體的化學(xué)或生物學(xué)實體。
10.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述配體連接至可從上清液分離的部分。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述配體是與磁珠綴合的抗體，通過對含有復(fù)合物抗體-病毒載體的溶液施加磁場獲得分離。
12.權(quán)利要求11的方法，其中通過除去磁場獲得純化的V！。
13.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中復(fù)合物抗體-病毒載體的分離在柱上進行。
14.一種外源性細胞表面標記物，其表達在包裝細胞系上用于純化由所述包裝細胞系制備的病毒載體。
15.權(quán)利要求14的外源性細胞表面標記物，其中所述標記物選自⑶26、⑶36、⑶44、⑶3、⑶25或截短形式的低親和力神經(jīng)生長因子受體。
16.權(quán)利要求14或15的外源性細胞表面標記物，其中所述標記物是八1^0^。
【文檔編號】C12N7/02GK103842501SQ201280049032
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年10月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月5日
【發(fā)明者】C.博沃倫塔, A.斯托奈奧洛 申請人:莫爾梅德股份有限公司