外源雙鏈rna導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法和組合物的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供了一種通過將一種特異性雙鏈RNA應(yīng)用在植物外表面上以沉默植物中內(nèi)源靶標(biāo)基因表達(dá)的方法。在不損傷植物組織和細(xì)胞（諸如，機(jī)械型損傷、粒子轟擊或用病毒載體進(jìn)行機(jī)械感染）的情況下，諸如通過用雙鏈RNA噴涂或刷涂植物進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明使調(diào)節(jié)植物中的基因表達(dá)成為可能。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，該雙鏈RNA針對植物病原體或有害生物的一種必需基因，由此控制病原體和/或有害生物的損害，從而導(dǎo)致令人希望的農(nóng)藝性能?！緦＠f明】外源雙鏈RNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法和組合物[0001]相關(guān)申請的交叉引用[0002]本申請聲明了2011年8月16日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/523，877在美國法典119(e)標(biāo)題35項(xiàng)下的優(yōu)先權(quán)權(quán)益。發(fā)明領(lǐng)域[0003]本發(fā)明涉及RNA的方法和組合物，這些方法和組合物包括應(yīng)用于外部植物部分，優(yōu)選地為葉片的RNA配制品，其中該雙鏈RNA被吸收至植物細(xì)胞中。[0004]發(fā)明背景[0005]許多食物來源是由作物產(chǎn)生的。環(huán)境條件諸如干旱和高溫經(jīng)常對作物生長和產(chǎn)量產(chǎn)生不利的影響。有害生物的壓力也有實(shí)質(zhì)性的負(fù)面影響。因此，能夠抵御環(huán)境壓力和/或有害生物挑戰(zhàn)的植物是令人希望的。通過選擇育種或者通過基因修飾能夠得到對非生物和生物脅迫有耐性或抗性的植物。RNA干擾15(RNAi)能被用于生產(chǎn)耐或抗非生物和生物脅迫的經(jīng)遺傳改性的植物。[0006]在過去的十年里，RNAi已經(jīng)在多種植物、真菌、線蟲、水螅、以及人類的生物體內(nèi)被描述和表征。[0007]Zamore(扎穆爾)和Haley(哈利)(2005)Science(《科學(xué)》)309，1519-24。在植物中的RNA干擾通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNA沉默，并且在真菌中稱為壓制(quelling)。轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程被認(rèn)為是一種進(jìn)化保守的細(xì)胞防御機(jī)制，該機(jī)制被用來防止外來基因的表達(dá)并且通常由不同的植物(flora)和動物(phyla)共享。Fire(菲爾)(1999)TrendsGenet.(《遺傳學(xué)趨勢》)15，358-363。[0008]當(dāng)一種生物體識別雙鏈RNA分子并且水解它們時，RNA干擾發(fā)生。[0009]所產(chǎn)生的水解產(chǎn)物是19-24個核苷酸長度的小RNA片段，這些小RNA片段被叫做小干擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。然后這些siRNA擴(kuò)散或被攜帶至整個生物體，包括越過細(xì)胞膜，在那里它們與mRNA(或其他的RNA)雜交并且導(dǎo)致RNA的水解。大多數(shù)植物miRNA顯示了與它們的靶標(biāo)mRNA的廣泛堿基配對，并且引導(dǎo)它們的靶標(biāo)mRNA的切害I]。Jones-Rhoades(瓊斯-羅茲)等(2006)Annu.Rev.PlantBiol.(《植物生物學(xué)年鑒》)57,19-53；Llave(拉弗)等(2002)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學(xué)院院刊》)97，13401-10406。在其他例子中，干擾RNA可以結(jié)合至具有不完全互補(bǔ)性的靶標(biāo)RNA5分子上，導(dǎo)致在沒有mRNA降解的情況下的翻譯阻抑。[0010]通常，沉默植物基因的作用方式包括與切丁酶相關(guān)聯(lián)的雙鏈RNA(dsRNA)，該切丁酶將dsRNA切成19-24bps長度的雙鏈片段(siRNA)?？梢杂卸嘤谝环N切丁酶，這取決于該生物體。Meister(麥斯特)和Tuschl(布施)，2004)。該siRNA典型地被降解為兩條單鏈RNA(ssRNA)，這兩條單鏈RNA被稱作過客鏈和引導(dǎo)鏈。RNA干擾沉默復(fù)合體(RISC復(fù)合體)載有引導(dǎo)鏈。RISC復(fù)合體與靶標(biāo)mRNA相關(guān)聯(lián)，該靶標(biāo)mRNA與引導(dǎo)鏈具有部分的或完全的同源性。催化性RISC組分argonaute引起祀標(biāo)mRNA的切割，以預(yù)防該祀標(biāo)mRNA被用作翻譯模板。AhlquistP(斯特P)(2002)RNA依賴性RNA聚合酶、病毒、以及RNA沉默，《科學(xué)》296(5571):1270-3。通過使用重組技術(shù)，RNAi途徑在植物中被采用，該RNAi途徑要求用載體轉(zhuǎn)化植物，該載體包括DNA，當(dāng)該DNA表達(dá)時產(chǎn)生與靶標(biāo)基因同源或幾乎同源的雙鏈RNA。該靶標(biāo)基因可以與內(nèi)源植物基因或昆蟲基因同源。如果該靶標(biāo)基因是一種昆蟲基因，該昆蟲食用植物，由此攝入雙鏈RNA，于是該昆蟲的RNAiRISC復(fù)合體引起切割，并且靶向同源mRNA，導(dǎo)致致命性昆蟲過程的破壞。[0011]至今，植物重組技術(shù)是遞送靶標(biāo)基因的基因沉默的工具，無論是內(nèi)源植物靶標(biāo)基因還是植物有害生物體的靶標(biāo)基因。一般地，植物是用DNA轉(zhuǎn)化的，該DNA被合并入植物基因組，并且當(dāng)表達(dá)時，該DNA產(chǎn)生雙鏈RNA，該雙鏈RNA與感興趣的基因互補(bǔ)，該感興趣的基因可以是內(nèi)源植物基因或植物有害生物的必需基因。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因和有益的植物特性的植物重組技術(shù)要求有重大的研究投入和發(fā)展，并且形成重大的障礙調(diào)控。通過對植物外部(諸如葉片、莖、和/或根表面)的外源應(yīng)用，遞送雙鏈RNA至植物細(xì)胞中以調(diào)控外源基因表達(dá)的方法和配制品在本領(lǐng)域是未知的。此類方法和配制品代表了基因沉默技術(shù)的重大的進(jìn)步。[0012]遞送外源雙鏈RNA至植物細(xì)胞的已知的方法是通過粒子轟擊或通過損傷植物組織(例如，煙草和水稻葉片組織)的病毒RNA感染。通過噴涂或刷涂RNA分子，或其他的非-組織規(guī)避技術(shù)(non-tissueevasivetechnique)的應(yīng)用，導(dǎo)致外源RNA分子吸收入植物組織，由此引起內(nèi)源和/或有害生物基因沉默，還未被報道過。[0013]本發(fā)明針對多種方法和配制品，這些方法和配制品通過應(yīng)用于植物的一個或多個外部組織表面，將外源RNA并入植物細(xì)胞中，引起一個或多個植物內(nèi)源靶標(biāo)基因或植物有害生物的靶標(biāo)基因的沉默。[0014]本發(fā)明不針對任何具體的RNAi機(jī)制或基因沉默作用方式，并且不應(yīng)該解釋為對任何已知的或未知的此類機(jī)制的限制。[0015]發(fā)明概述[0016]本發(fā)明披露了一種雙鏈RNA滲透入植物細(xì)胞，并且隨后通過雙鏈RNA在植物結(jié)構(gòu)表面(例如，葉片表面)的應(yīng)用誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因沉默的新途徑。更有意義地，基因沉默在作物種類(玉米)而不是模式植物(擬南芥屬等)中取得成功。因此，本發(fā)明建立了外部應(yīng)用雙鏈RNA可以被用于沉默或否則調(diào)制內(nèi)源植物基因表達(dá)。[0017]本發(fā)明披露了一種植物激素介導(dǎo)的雙鏈RNA滲透入植物細(xì)胞，并且隨后通過雙鏈RNA在植物結(jié)構(gòu)表面(例如，葉片表面)的應(yīng)用誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因沉默的新途徑?；虺聊谧魑锓N類(玉米)而不是模式植物(擬南芥屬等)中取得成功。因此，本發(fā)明建立了外部應(yīng)用雙鏈RNA可以被用于沉默或否則調(diào)制內(nèi)源植物基因表達(dá)。[0018]本發(fā)明披露了一種植物激素介導(dǎo)的雙鏈RNA滲透入植物細(xì)胞，并且隨后通過一種配制品中的雙鏈RNA在植物結(jié)構(gòu)表面(例如，葉片表面)的應(yīng)用誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因沉默的新途徑。基因沉默在作物種類(玉米)而不是模式植物(擬南芥屬等)中取得成功。因此，本發(fā)明建立了外部應(yīng)用雙鏈RNA可以被用于沉默或否則調(diào)制內(nèi)源植物基因表達(dá)。[0019]本發(fā)明包括一種將RNA整合至一種植物細(xì)胞中的方法，該方法包括:提供一種配制品，該配制品包括:一種基因特異性雙鏈RNA、H20、和一種植物激素油菜素類固醇以及將該配制品應(yīng)用于一種活體植物的葉片表面，其中該RNA是單鏈RNA，并且是從該植物葉片的外部葉片表面被吸收至該植物葉片的細(xì)胞中。[0020]本發(fā)明的配制品和方法中的用以協(xié)助雙鏈RNA進(jìn)入植物細(xì)胞以沉默植物內(nèi)源基因的植物激素也是可以理解并且是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。[0021]本發(fā)明的一個方面針對將RNA整合至一種植物細(xì)胞中，該方面包括:提供一種配制品，該配制品包括:一種基因特異性雙鏈RNA、H20、和一種植物激素油菜素類固醇以及將該配制品應(yīng)用于一種活體植物的外部表面，其中該雙鏈RNA是從該植物的外部葉片表面被吸收至該植物的細(xì)胞中。[0022]本發(fā)明的一個方面針對將RNA整合至一種植物細(xì)胞中，該方面包括:提供一種配制品，該配制品包括:一種基因特異性雙鏈RNA、H20、和一種植物激素油菜素類固醇以及將該配制品應(yīng)用于一種活體植物的外部葉片表面，其中該雙鏈RNA是從該植物葉片外部葉片表面被吸收至該植物葉片的細(xì)胞中。[0023]本發(fā)明的一個方面針對將RNA整合至一種植物細(xì)胞中，該方面包括:提供一種配制品，該配制品包括:一種基因特異性雙鏈RNA、H20、和一種植物激素，以及將該配制品應(yīng)用于一種活體植物的外部表面，其中該雙鏈RNA是從該植物外的部表面被吸收至該植物細(xì)胞中。[0024]本發(fā)明的另一方面包括一種配制品，該配制品包括一種濃度為約250ng/ul的雙鏈RNA和配制品中的一種油菜素類固醇植物激素，該油菜素類固醇植物激素是在約0.8微摩爾至約1.6微摩爾的范圍內(nèi)。[0025]本發(fā)明的另一方面包括使用配制品中的雙鏈RNA，該雙鏈RNA的濃度約為250ng/Ulo[0026]本發(fā)明的另一個方面包括使用配制品中的油菜素類固醇植物激素，該油菜素類固醇植物激素是在約0.8微摩爾至約1.6微摩爾的范圍內(nèi)。`[0027]本發(fā)明進(jìn)一步包括一種配制品，該配制品包括一種雙鏈RNA、H20、以及一種植物激素，用于自發(fā)芽起約12天的活體植物。本發(fā)明的一個方面包括將該配制品應(yīng)用于雙子葉植物、玉米植物或煙草植物。[0028]本發(fā)明的另一方面是應(yīng)用于植物外表面的一種配制品，該配制品包括雙鏈RNA、H2O,以及一種植物激素油菜素類固醇。[0029]本發(fā)明的另一方面是一種配制品，其中，該配制品中的油菜素類固醇是在0.8微摩爾至約1.6微摩爾。[0030]本發(fā)明的又一方面是一種配制品，在該配制品中的雙鏈RNA濃度約為250ng/ul。[0031]本發(fā)明的一個方面是生產(chǎn)植物、植物部分、或植物細(xì)胞的方法，該方法包括用以調(diào)制至少一種植物靶標(biāo)內(nèi)源基因的RNAi。[0032]本發(fā)明的一個方面是生產(chǎn)植物、植物部分、或植物細(xì)胞的方法，該方法包括用以調(diào)制至少一種植物靶標(biāo)內(nèi)源基因的RNAi。[0033]本發(fā)明包括多種方法和組合物，這些方法和組合物通過阻抑、延遲、或否則減少具體有害生物內(nèi)的基因表達(dá)提供了對有害生物侵?jǐn)_的控制。[0034]序列簡述[0035]SEQIDNOl:描述了ZsGreen基因序列的600個核苷酸喊基。[0036]SEQIDN02:描述了玉蜀黍(Zeamays)谷氨酰胺合成酶cDNA序列的1071個核苷酸堿基。[0037]SEQIDN03:描述了普通煙草(Nicotianatabacum)葉綠體FtsH蛋白酶cDNA序列的395個核苷酸堿基。[0038]SEQIDN04:描述了普通煙草八氫番爺紅素脫氫酶cDNA序列的1761個核苷酸堿基。[0039]發(fā)明詳細(xì)說明[0040]本說明不意在是一個本發(fā)明以其而實(shí)施的所有不同方式，或可以加入本發(fā)明中的所有特征的詳細(xì)目錄。例如，關(guān)于一個實(shí)施例所說明的特征可以結(jié)合入其他實(shí)施例中，并且關(guān)于一個具體實(shí)施例所說明的特征可以從那個實(shí)施例刪除。另外，鑒于本披露內(nèi)容，對在此建議的不同實(shí)施例的眾多變體以及附加對于本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員是明顯的，這不脫離本發(fā)明。因此，以下說明意在闡述本發(fā)明的一些具體實(shí)施例，并且并沒有窮盡地敘述其所有變更、組合與變體。[0041]除非另外定義，在此所使用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明屬于的領(lǐng)域之內(nèi)的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意思。在此處的本發(fā)明的說明中使用的術(shù)語是僅用于描述具體實(shí)施例的目的并且不意在限制本發(fā)明。[0042]在此提及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)通過引用以其全文結(jié)合在此。[0043]如在此使用的，“一種/一個(a/an)”或“該(the)”可以表示一或多于一。例如，一個細(xì)胞可以意指單個細(xì)胞或多個細(xì)胞。[0044]如在此使用的，“和/或”指并且涵蓋一個或多個相關(guān)的列出項(xiàng)的任何及全部可能組合，連同當(dāng)以可替代性(或)解釋時組合的缺少。[0045]另外，當(dāng)提及可計量值(例如化合物或試劑、劑量、時間、溫度等等的量)時，如在此使用的，術(shù)語“約(about)”意圖包括所指值的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的變化。[0046]如在此使用的，過渡短語“基本上由……組成”意指一項(xiàng)權(quán)利要求的范圍將要解釋為包括該權(quán)利要求中所提到的指定材料或步驟以及不實(shí)質(zhì)上影響要求保護(hù)的發(fā)明的基本特征和新特征的那些材料或步驟。因此，當(dāng)用于本發(fā)明的權(quán)利要求中時，術(shù)語“基本上由……組成”并不意在解釋為等同于“包括(comprising)”。[0047]應(yīng)當(dāng)理解:盡管術(shù)語“第一(first)”、“第二(second)”等等在此可以用來描述不同要素，但是這些要素不應(yīng)該受這些術(shù)語限制。這些術(shù)語僅用以將一個要素與另一個要素進(jìn)行區(qū)分。因此，在此描述的“第一”要素(例如，第一啟動子序列)還可以稱作“第二”要素(例如，第二啟動子序列)，這不背離本發(fā)明的傳授內(nèi)容。[0048]術(shù)語“RNA”包括任何含有至少一個核糖核苷酸殘基的分子，包括具有以下堿基的一個或多個天然核糖核苷酸的那些:腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、以及尿嘧啶；分別地縮寫為A、C、G、和U，經(jīng)修飾的核糖核苷酸，以及非核糖核苷酸?！昂颂呛塑账帷笔侵冈贒-呋喃核糖部分的2’位置上有羥基的核苷酸。[0049]如在此使用的，術(shù)語以及短語“RNA”、“RNA分子”、以及“RNA序列”可互換使用，以便指代介導(dǎo)RNA干擾的RNA。這些術(shù)語和短語包括單鏈RNA、雙鏈RNA、分離的RNA、部分純化的RNA、基本上純的RNA、合成RNA、重組RNA、細(xì)胞內(nèi)的RNA，以及也包括通過添加、刪除、置換、和/或改變天然發(fā)生的RNA的一個或多個核苷酸而與天然發(fā)生的RNA不同的RNA。[0050]“干擾RNA”(例如SiRNA和miRNA)是能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默或抑制、RNA沉默、和/或減少基因表達(dá)的RNA分子。干擾RNA通過與靶標(biāo)核酸的mRNA序列的堿基配對而影響動物和植物中的序列特異性的、轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。因此，SiRNA至少部分地與沉默基因互補(bǔ)。部分互補(bǔ)的siRNA可以包括一個或多個錯配、凸起、內(nèi)部環(huán)、和/或非沃森-克里克堿基對(即G-U搖擺堿基對)。[0051]術(shù)語“沉默”和“抑制”可互換使用以便一般地描述在細(xì)胞中可獲得的由核糖體結(jié)合并解碼的靶標(biāo)mRNA實(shí)質(zhì)地和可測量地減少量。經(jīng)轉(zhuǎn)錄的RNA可以處于有義方向而發(fā)揮作用，稱為共抑制，處于反義方向而發(fā)揮作用，稱為反義抑制，或在兩個方向上產(chǎn)生雙鏈RNA而發(fā)揮作用，稱為RNA干擾。“沉默”基因包括其本身定義內(nèi)的基因，該基因是指經(jīng)受由基因編碼的mRNA的沉默或抑制的基因。[0052]微RNA由基因編碼，該基因被轉(zhuǎn)錄但是不被翻譯成蛋白(非-編碼DNA)，盡管一些miRNA是由與蛋白編碼基因部分重疊的序列編碼的。通過背景的方法，miRNA從稱為初級mirna(pri_miRNA)的初級轉(zhuǎn)錄本被加工為被稱為前miRNA(pre_miRNA)的短的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該前miRNA進(jìn)一步由一種或多種切丁酶作用進(jìn)行加工，以產(chǎn)生功能性siRNA/miRNA。典型地，前體miRNA的一部分被切割以產(chǎn)生最終的miRNA分子。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的范圍可以是從例如約50至約80個核苷酸、或約60個核苷酸至約70個核苷酸(包括miRNA殘基，與miRNA配對的那些、以及任何介入?yún)^(qū)段)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)不是完全堿基配對的；錯配、凸起、內(nèi)部環(huán)、非沃森-克里克堿基配對(即G-U搖擺堿基對)、以及其他的特征頻繁地在前miRNA中觀察到，并且認(rèn)為此類特征對于加工是重要的。成熟的miRNA分子與一個或多個mRNA分子部分地互補(bǔ)，并且它們作用是調(diào)芐基因表達(dá)。本發(fā)明的siRNA具有內(nèi)源miRNA的結(jié)構(gòu)和功能特性(即，基因沉默和抑制功能)。因此，本發(fā)明的多方面中，本發(fā)明的siRNA能從miRNA、從靶標(biāo)基因序列信息得到，或能基于本領(lǐng)域已知的預(yù)測模型合成地生產(chǎn)。[0053]短語“靶標(biāo)特異性小干擾RNA”、“靶標(biāo)特異性siRNA”、“靶標(biāo)特異性微RNA”、“靶標(biāo)特異性miRNA”、“靶標(biāo)特異性amiRNA”、以及“靶標(biāo)特異性核苷酸序列”是指已經(jīng)被設(shè)計為選擇性地與靶標(biāo)生物中但不是非靶標(biāo)生物(例如宿主生物-表達(dá)或產(chǎn)生miRNA的生物)，或者宿主生物的消費(fèi)者中的核酸雜交的干擾RNA。因此，“靶標(biāo)特異性siRNA”僅僅在靶標(biāo)生物中產(chǎn)生表型而在非靶標(biāo)生物中不產(chǎn)生表`型。在本發(fā)明中，靶標(biāo)特異性siRNA選擇地與對于宿主生物體而言是內(nèi)源的核酸雜交,該宿主生物體是植物。[0054]微RNA(miRNA)是非蛋白編碼RNA，一般地在約19至約25個核苷酸之間(通常地在植物中約20-24個核苷酸)。miRNA直接反式切割靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本，以調(diào)節(jié)涉及各種調(diào)節(jié)和發(fā)育途徑的基因表達(dá)(Bartel(巴特爾)，Cell(《細(xì)胞》)，116:281-297(2004);Zhang(張)等?Dev.Biol.(《發(fā)育生物學(xué)》)289:3-16(2006))。已經(jīng)顯示miRNA涉及植物生長和發(fā)育以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白降解中的不同方面。另外，日益增長的證據(jù)說明:小內(nèi)源mRNA(包括miRNA)還可以參與生物脅迫響應(yīng)，比如寄生體襲擊。自從第一個miRNA在植物中被發(fā)現(xiàn)(Reinhart(萊因哈特))等GenesDev.(《基因和發(fā)育》)16:1616-1626(2002)，Park(帕克)等.Curr.Biol.(《當(dāng)代生物學(xué)》)12:1484-1495(2002))，成千上萬的miRNA已經(jīng)被鑒定。此外，許多植物miRNA已經(jīng)顯示出跨十分趨異的分類群的高度保守性。(Floyd(弗洛伊德)等，Nature(《自然》)428:485-486(2004);張等，PlantJ.(《植物學(xué)雜志》)46:243-259(2006))。許多微RNA基因(MIR基因)已經(jīng)被鑒定并且在數(shù)據(jù)庫("miRBase,"可在以下網(wǎng)站獲得，microrna.sanger.ac.uk/sequences)中公開地可獲得。miRNA還在美國專利公開2005/0120415和2005/144669A1中被描述，其全部內(nèi)容通過引用被結(jié)合在此。[0055]如在此使用的，“異源的”指一種核苷酸序列，該序列來源于另一種物種或來自相同物種或生物體，但是對其原初形式或在細(xì)胞中表達(dá)的初始形式進(jìn)行了修飾。因此，衍生自與將其引入的細(xì)胞所屬的有機(jī)體或物種不同的有機(jī)體或物種的核苷酸序列相對于那個細(xì)胞或細(xì)胞的子代而言是異源的。另外，異源核苷酸序列包括這樣的一種核苷酸序列，它衍生自或插入相同的天然原初細(xì)胞類型，但是卻以非天然狀態(tài)存在，例如，以不同拷貝數(shù)目存在，和/或處于與在自然界中天然發(fā)現(xiàn)的那些所不同的調(diào)節(jié)序列的控制下。[0056]如在此使用的，術(shù)語“增力卩(increase)”、“增加的(increased)”、“增強(qiáng)(enhance)”、“增強(qiáng)的(enhanced)”、“增強(qiáng)的(enhancing)”以及“增強(qiáng)(enhancement)”(及其語法上的變體)描述了一種植物對一種寄生體抗性的增加(例如,對大豆胞囊線蟲具有增加的抗性的大豆植物)，這是通過將本發(fā)明的異源miRNA核苷酸序列引入該植物來進(jìn)行的，由此產(chǎn)生一種對該寄生體具有增加的抗性的轉(zhuǎn)基因植物。這一增加可以通過將經(jīng)本發(fā)明的異源miRNA核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物的抗性與未經(jīng)本發(fā)明的異源miRNA核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物(例如，大豆)相比較而觀察到(例如，經(jīng)異源miR164核苷酸序列轉(zhuǎn)化的大豆植物與未經(jīng)異源miR164核苷酸序列轉(zhuǎn)化的大豆植物相比較)。[0057]如在此使用的，術(shù)語“核酸(nucleicacid)”、“核苷酸分子(nucleicacidmolecule)”和/或“核苷酸序列(nucleotidesequence)”指核一種核苷酸雜聚物或來自一種核酸分子的5'至3'末端的這些核苷酸的序列并且包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段、基因組DNA、合成(例如，化學(xué)合成)的DNA、質(zhì)粒DNA、mRNA以及反義RNA，其中的任一項(xiàng)都可以是單鏈或雙鏈的。術(shù)語“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在此也可互換用來指核苷酸的雜聚物。在此提供的核酸序列以5’至3’方向、從左至右存在，并且使用如在美國專利商標(biāo)局(U.S.PatentandTrademarkOffice),37CFR§§1.821-1.825以及世界知識產(chǎn)權(quán)組織標(biāo)準(zhǔn)ST.25(WorldIntellectualPropertyOrganization(WIPO)StandardST.25)中所闡明的用于表示核苷酸字符的標(biāo)準(zhǔn)編碼來示出。[0058]如在此使用的，術(shù)語“基因”指能夠用來產(chǎn)生mRNA、反義RNA、miRNA等的核酸分子。基因可以能或不能使用來產(chǎn)生功能蛋白或基因產(chǎn)物。基因可以包括編碼與非編碼的區(qū)域(例如，內(nèi)含子、調(diào)節(jié)元件、啟動子、增強(qiáng)子、終止序列和/或5'以及3'非翻譯區(qū)域)?；蚩梢允恰胺蛛x的”，這意指一種核酸，其實(shí)質(zhì)上或基本地不含正常情況下發(fā)現(xiàn)的在其天然狀態(tài)下與這種核酸結(jié)合的組分。此類組分包括其他細(xì)胞物質(zhì)、來自重組生產(chǎn)的培養(yǎng)基和/或在化學(xué)合成所述核酸時所用的各種化學(xué)品。[0059]如在此使用的，術(shù)語“互補(bǔ)的(complementary)”或“互補(bǔ)性(complementarity)”指多核苷酸在容許性鹽條件和溫度條件下通過堿基配發(fā)生天然結(jié)合。例如，序列“A-G-T”與互補(bǔ)序列“T-C-A”結(jié)合。兩單鏈分子之間的互補(bǔ)性可以是“部分的(partial)”，其中這些核苷酸中僅一些結(jié)合，或者當(dāng)這些單鏈分子之間存在完全互補(bǔ)性時，這種互補(bǔ)性可以是完全的。核酸鏈之間的互補(bǔ)性程度對核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度具有明顯影響。[0060]術(shù)語“核酸片段(nucleicacidfragment)”應(yīng)理解為意為一種相對于參考核酸或核苷酸序列長度減少的核苷酸序列并且包括與該參考核酸或核苷酸序列一致或幾乎一致(例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、98%,99%同一性)的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或基本上由其組成和/或由其組成。根據(jù)本發(fā)明，在適宜的情況下，這種核酸片段可以包含于它作為組分的較大多核苷酸內(nèi)。在一些實(shí)施例中，此類片段可以包含具有根據(jù)本發(fā)明的核酸或核苷酸序列的至少大約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、或1000個連續(xù)核苷酸長度的寡核苷酸，或基本上由其組成和/或由其組成。[0061]本發(fā)明的“分離的”核酸大體上沒有該核酸衍生自其中的生物體的基因組DNA中的該感興趣的核酸的側(cè)翼核酸序列(比如存在于5'或3'末端的編碼序列)。然而，本發(fā)明的該核酸可以包括一些另外的堿基或部分，它們不會有害地影響該核酸的堿基結(jié)構(gòu)和/或功能特征。“分離”不意指制備物在技術(shù)上是純的(同質(zhì)的)。[0062]因此，“分離的核酸”以一種不同于其在自然界中發(fā)現(xiàn)的那樣的形式或背景存在并且并不與它在其中衍生自的生物體的天然發(fā)生的基因組中緊密連續(xù)(一個在5'末端并且一個在3'末端)的核苷酸序列緊密連續(xù)。因此，在一個實(shí)施例中，一個分離的核酸包括一些或全部的5'非編碼(例如，啟動子)序列，這些序列緊接編碼序列。該術(shù)語因此包括，例如，一種重組核酸，它結(jié)合進(jìn)入一種載體、進(jìn)入一種自我復(fù)制的質(zhì)粒或病毒、或進(jìn)入一種原核生物或真核生物的基因組DNA，或者它作為獨(dú)立于其他序列的一種單獨(dú)分子(例如，一種cDNA或一種利用PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理所得到的基因組DNA片段)而存在。因此，在自然界中發(fā)現(xiàn)的、從其原生環(huán)境中移除并且轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物的核酸仍被認(rèn)為是“分離的”，甚至當(dāng)其結(jié)合進(jìn)入所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的基因組中的時候。它還包括重組核酸，該重組核酸是編碼額外多肽或肽序列的雜交核酸的部分。[0063]術(shù)語“分離”可以進(jìn)一步指基本上不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)和/或培養(yǎng)基(例如，通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時)或化學(xué)前體或其他化學(xué)品(例如，化學(xué)合成時)的核酸、核苷酸序列、多肽、肽或片段。此外，“分離的片段”是核酸、核苷酸序列或多肽的片段，該片段不天然地作為片段存在并且不會按照原樣以天然狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)?！胺蛛x”不意指制備物在技術(shù)上是純的(同質(zhì)的)，但它充分純，以提供處于一種可以用于預(yù)期目的之形式的多肽或核酸。[0064]術(shù)語“多肽(polypeptide)”、“蛋白(protein)”和“肽(peptide)”指一種共價地連接的氨基酸鏈?？傮w上，術(shù)語“(P印tide)”可以指更短的氨基酸鏈(例如，2-50個氨基酸)；然而，所有三個術(shù)語在該氨基酸鏈長度方面重疊。如在此所用，術(shù)語“蛋白”與“多肽”是互換地使用并且包括肽，除非另外說明。多肽、蛋白以及肽可以包括自然發(fā)生的氨基酸、非自然發(fā)生的氨基酸、或兩者的一種組合。這些多肽、蛋白以及肽可以分離自它們自然發(fā)生于其中的來源(例如細(xì)胞或組織)，可以在活體內(nèi)或體外細(xì)胞中或者在體外試管中進(jìn)行重組生產(chǎn)，或者進(jìn)行化學(xué)合成。此類技術(shù)對于該領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的，參見舉例，Sambrook(薩姆布魯克)等，MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndEd.(《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊第二版》)(ColdSpringHarbor,NY,1989(冷泉港，紐約，1989)));Ausubel(奧蘇貝爾)等，CurrentProtocolsinMolecularBiology(《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)(GreenPublishingAssociates,Inc.andJohnffiley&Sons,Inc.,NewYork(格林出版聯(lián)合公司以及約翰威利父子公司，紐約))。[0065]術(shù)語“片段(fragment)”，如適用于多肽，應(yīng)理解為意為一種相對于參考多肽或氨基酸序列長度減少的氨基酸序列并且包含與該參考多肽或氨基酸序列一致的連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，或基本上由其組成和/或由其組成。根據(jù)本發(fā)明，在適宜的情況下，這種多肽片段可以包含于它作為組分的較大多多肽內(nèi)。在一些實(shí)施例中，這類片段可以包含以下肽、基本上由其組成和/或由其組成，其中所述肽具有本發(fā)明的多肽或氨基酸序列的至少約4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200或更多個連續(xù)氨基酸的長度?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法與路徑來產(chǎn)生多肽或蛋白的片段，比如，通過天然發(fā)生的肽或多肽的酶切或其他切割或者通過熟知的合成方案。[0066]多肽片段可以是生物活性片段?！吧锘钚云巍被颉盎钚云巍敝副Ａ魠⒖级嚯牡囊环N或多種生物活性的片段?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域所述的方法(這些方法是用于測試多肽活性的例行方法)和/或根據(jù)本領(lǐng)域已知和例行的用于鑒定這類活性的任何方法測試這類片段的生物活性。多肽的生物活性片段的產(chǎn)生與鑒定測試會很好地處在本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員的范圍之內(nèi)并且會是常規(guī)的。如此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了多肽(比如感興趣的多肽)的生物活性片段以及編碼此類生物活性多肽片段的多核苷酸。[0067]如在此使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指在植物、動物或其他有機(jī)體的轉(zhuǎn)化中使用的任何核酸序列。因此，轉(zhuǎn)基因可以是編碼序列、非編碼序列、cDNA、基因或其片段或部分、基因組序列、調(diào)節(jié)元件等?！稗D(zhuǎn)基因”有機(jī)體，例如轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物、或轉(zhuǎn)基因動物，是已經(jīng)向其中遞送或?qū)朕D(zhuǎn)基因的有機(jī)體并且該轉(zhuǎn)基因可以在這種轉(zhuǎn)基因有機(jī)體中表達(dá)以產(chǎn)生一種產(chǎn)物，該產(chǎn)物的存在可以在這種有機(jī)體中賦予一種效果和/或表型。[0068]具有同源性的不同核酸或多肽在此稱作“同源物”。術(shù)語“同源物”包括來自相同物種和其他物種的同源序列和來自相同物種和其他物種的直向同源序列?！巴葱浴敝妇臀恢猛恍?即，序列相似性或同一性)而言，兩個或更多個核酸和/或氨基酸序列之間的相似性水平。同源性也指不同核酸或蛋白質(zhì)之間相似功能特性的概念。[0069]如在此使用的，“序列同一性”指兩個最佳比對的多核苷酸或多肽序列在比對整個組分(例如核苷酸或氨基酸)的窗口范圍內(nèi)不變動的程度?！巴恍?identity)”可以通過已知方法容易地計算出，這些方法包括但不限于描述于以下文獻(xiàn)中那些ComputationalMolecularBiology(《計算分子生物學(xué)》)(Lesk,A.M.(萊克斯，A.M.)編著)OxfordUniversityPress(牛津大學(xué)出版社)，NewYork(紐約)(1988)；Biocomputing:1nformaticsandGenomeProjects(《生`物計算信息與基因組預(yù)測》)(Smith,D.ff.(史密斯，D.W.)編著)AcademicPress(《學(xué)術(shù)出版社》)，NewYork(紐約)(1993);ComputerAnalysisofSequenceData,PartI(《序列數(shù)據(jù)的計算分析,部分I》)(Griffin,A.M.(格里芬，A.M.),以及Griffin,H.G.(格里芬，H.G.)編著)HumanaPress(Humana出版社),NewJersey(新澤西州)(1994);SequenceAnalysisinMolecularBiology(《分子生物學(xué)中的序列分析》)(vonHeinje,G.(馮海杰，G.)編著)AcademicPress(學(xué)術(shù)出版社)(1987);以及SequenceAnalysisPrimer(《序列分析引物》)(Gribskov,M.(哥博斯科夫，M.)以及Devereux,J.(德福羅，J.)編著)StocktonPress(Stockton出版社)，NewYork(紐約)(1991)。[0070]檢驗(yàn)序列和參比序列的所比對節(jié)段的同一性分?jǐn)?shù)摂是由這兩個比對序列共有的相同組分的數(shù)目除以參比序列節(jié)段(即完整的參比序列或參比序列的更小限定的部分)中組分的總數(shù)目。如在此使用的，術(shù)語“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指在兩個序列最佳比對(在比較窗口范圍內(nèi)具有總計小于參考序列20%的適當(dāng)核苷酸插入、缺失或空位)時，與檢驗(yàn)(“對象”)多核苷酸分子(或其互補(bǔ)鏈)相比，參比(“查詢”)多核苷酸分子(或其互補(bǔ)鏈)的直鏈多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。在一些實(shí)施例中，“同一丨I"生百分比”可以指氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。[0071]用于比對比較窗口的最佳序列比對是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且可以由以下工具實(shí)施:如Smith(史密斯)和Waterman(沃特曼)的局部同源性算法、Needleman(尼德曼)和WunschWunsch(翁施)的同源性比對算法、Pearson(皮爾森)和Lipman(利普曼)的相似性搜索方法，并且任選地由這些算法的計算機(jī)化執(zhí)行，如作為GCG⑧WisconsinPackage?(AccelrysInc.(材料科學(xué)軟件公司)，Burlington(伯靈頓)，Mass.(馬薩諸塞州))的部分可獲得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。檢驗(yàn)序列和參比序列的所比對節(jié)段的“同一性分?jǐn)?shù)”是由這兩個比對序列共有的相同組分的數(shù)目除以參比序列節(jié)段(即完整的參比序列或參比序列的更小限定的部分)中組分的總數(shù)目。序列同一性百分?jǐn)?shù)表述為同一性分?jǐn)?shù)乘以100。一個或多個多核苷酸序列的比較可以是相對于全長多核苷酸序列或其部分，或相對于較長的多核苷酸序列。出于本發(fā)明的目的，還可以使用針對翻譯的核苷酸序列的BLASTX2.0版以及針對多核苷酸序列的BLASTN2.0版，確定“同一性百分比”。[0072]可以使用序列分析軟件包?(版本10;GeneticsComputerGroup,Inc.(基因計算集團(tuán)公司)，Madison(麥迪遜)，Wis.(威斯康辛州))的“BestFit”或“Gap”程序確定序列同一性百分比?！癎ap”使用Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施)算法(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施)，JMol.Biol.(《分子生物學(xué)雜志》)48:443-453,1970)來找到兩個序列的使匹配數(shù)最大化并使空位數(shù)最小化的比對結(jié)果?！癇estFit”執(zhí)行兩個序列之間最佳相似性區(qū)段的最佳比對并且使用Smith(史密斯)和Waterman(沃特曼)的局部同源性算法插入空位以使匹配數(shù)最大化(Smith(史密斯)和Waterman(沃特曼)，Adv.Appl.Math.(《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》)，2:482-489，1981，Smith(史密斯)等，NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)11:2205-2220，1983)。[0073]用于確定序列同一1丨生的有用方法也在GuidetoHugeComputers(《大型計算機(jī)指南》)(MartinJ.Bishop(馬丁J.畢夏普)編著，AcademicPress(學(xué)術(shù)出版社)，圣迭戈(1994))以及Carillo,H.(卡里略，H.)和Lipton,D.(立頓，D.)(AppliedMath(《應(yīng)用數(shù)學(xué)》)48:1073(1988))中披露。更具體地，優(yōu)選的用于確定序列同一性的電腦程序包括但不局限于:公共可獲得的來自國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterBiotechnologyInformation,NCBI)的基本局部比對搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool,BLAST)，該NCBI是在美國國立衛(wèi)生研究院(貝塞斯達(dá)，馬里蘭州，20894)的國家醫(yī)學(xué)庫中；參見BLAST手冊，Altschul(阿爾丘爾)等，NCBI,NLM,NIH;(Altschul(阿爾丘爾)等，J.Mol.Biol.(《分子生物學(xué)期刊》)215:403-410(1990))；2.0版本或更高版本的BLAST程序允許缺口(缺失或插入)引入比對中；對于妝序列可以使用BLASTX對序列同一性進(jìn)行確定；并且對于多核苷酸序列可以使用BLASTN對序列同一性進(jìn)行確定。[0074]因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了與本發(fā)明的核苷酸序列具有顯著序列同一性的核苷酸序列。顯著的序列相似性或同一性意為與另一個核苷酸序列至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、96%、97%、98%、99%和/或100%的相似性或同一丨I"生。[0075]在上下文中，所感興趣的一種核苷酸序列(例如，miR164)的“引入(introducing)”意為將該感興趣的核苷酸序列提供給該植物、植物部分和/或植物細(xì)胞，其方式為該核苷酸序列進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。在有待引入一種以上的核苷酸序列的情況下，這些核苷酸序列可以作為一種單一的多核苷酸或核酸構(gòu)建體的部分、或者作為分開的多核苷酸或核酸構(gòu)建體而進(jìn)行組裝，并且可以位于相同的或不同的轉(zhuǎn)化載體上。因此，可以在單一的轉(zhuǎn)化事件中、在分開的轉(zhuǎn)化事件中，或作為育種方案的一部分，將這些多核苷酸引入到植物細(xì)胞中。因此，如在此使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將異源核酸導(dǎo)入細(xì)胞中。細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以是穩(wěn)定或瞬時的。[0076]如此，在一些具體實(shí)施例中，向植物、植物部分和/或植物細(xì)胞中的引入是通過細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、粒子轟擊轉(zhuǎn)化、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、環(huán)糊精介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的核酸遞送、須介導(dǎo)的核酸遞送、微注射、聲處理、浸潤、聚乙烯二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、以及其他的致使核酸引入該植物、植物部分和/或其細(xì)胞的電的、化學(xué)的、物理的和/或生物的機(jī)制，或其組合。[0077]如在此使用的，術(shù)語“減少(reduce)”、“減少的(reduced)”、“減少(reducing)”、“減少(reduction)”、“減小(diminish)”以及“降低(decrease)”(及其語法上的變體)描述了一種植物上(例如，大豆)的大豆胞囊線蟲胞囊形成的降低，這是通過將本發(fā)明的miRNA引入該植物來進(jìn)行的，由此產(chǎn)生一種在該轉(zhuǎn)基因植物上具有降低的或減少的胞囊形成的轉(zhuǎn)基因植物?？梢酝ㄟ^將經(jīng)該異源miR164核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物上形成的胞囊數(shù)目與未經(jīng)該異源miR164核苷酸序列轉(zhuǎn)化的大豆植物上形成的胞囊數(shù)目進(jìn)行比較來觀察胞囊形成方面的這一降低。[0078]在被引入細(xì)胞中的多核苷酸的背景下，“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化(stablyintroducing)”或“穩(wěn)定引入(stablyintroduced)”意在指穩(wěn)定地結(jié)合進(jìn)入該細(xì)胞的基因組的被引入的多核苷酸，并且由此該細(xì)胞經(jīng)該多核苷酸進(jìn)行了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。如在此使用的，“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化(Stabletransformation)”或“被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的(stablytransformed)”意為一種被引入細(xì)胞并且整合進(jìn)入該細(xì)胞的基因組的核酸。按照這樣，該整合的核酸能夠被其子代遺傳，更具體地，被多個連續(xù)世代的子代遺傳。如在此使用的，“基因組(genome)”還包括核基因組與質(zhì)?；蚪M，并且因此包括該核酸整合進(jìn)入例如葉綠體基因組。如在此使用的，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化也可以指以染色體外方式(例如，作為微型染色體)維持的轉(zhuǎn)基因。[0079]瞬時轉(zhuǎn)化可以通過例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或蛋白質(zhì)印跡來檢測，它們可以檢測由一個或多個導(dǎo)入有機(jī)體的轉(zhuǎn)基因編碼的肽和多肽的存在。細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化可以通過例如細(xì)胞的基因組DNA與多種核酸序列(這些序列與導(dǎo)入有機(jī)體(例如,植物)的轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列特異性雜交)的DNA印記雜交測定法檢測。細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化可以通過例如細(xì)胞的RNA與多種核酸序列(這些序列與導(dǎo)入植物或其他有機(jī)體的轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列特異性雜交)的RNA印跡雜交測定法檢測。細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化還可以通過例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或本領(lǐng)域內(nèi)熟知的其他擴(kuò)增反應(yīng)來進(jìn)行檢測，這些反應(yīng)采用與轉(zhuǎn)基因的一個或多個靶標(biāo)序列雜交的特異性引物序列，從而導(dǎo)致該轉(zhuǎn)基因序列的擴(kuò)增，這種擴(kuò)增可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測。轉(zhuǎn)化也可以通過直接測序和/或本領(lǐng)域熟知的雜交方案進(jìn)行檢測。[0080]核酸(例如，ZsGreen)可以通過任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法導(dǎo)入細(xì)胞中。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，細(xì)胞轉(zhuǎn)化包括細(xì)胞核的轉(zhuǎn)化。在其他實(shí)施例中，細(xì)胞的轉(zhuǎn)化包括質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如，葉綠體轉(zhuǎn)化)。[0081]用于轉(zhuǎn)化植物的程序是熟知的并且在本領(lǐng)域內(nèi)是常規(guī)的并且在文獻(xiàn)中普遍描述。用于植物轉(zhuǎn)化的方法的非限制性實(shí)例包括:通過以下的轉(zhuǎn)化:細(xì)菌介導(dǎo)的核酸遞送(例如，經(jīng)由農(nóng)桿菌)，病毒介導(dǎo)的核酸遞送，碳化硅或核酸須介導(dǎo)的核酸遞送，脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸遞送，微注射，微粒轟擊，磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，環(huán)糊精介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，電穿孔，納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，聲處理，浸潤，PEG介導(dǎo)的核酸吸收，以及任何其他的致使核酸引入該植物細(xì)胞的電的、化學(xué)的、物理的(機(jī)械的)和/或生物的機(jī)制，包括其任何組合。在本領(lǐng)域內(nèi)已知的不同的植物轉(zhuǎn)化方法的一般指南包括Miki(米琪)等("ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants"inMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology(在《植物分子生物學(xué)與生物技術(shù)》的方法中“用于將外來DNA引入植物的程序”)，Glick,B.R.(克里克，B.R.)與Thompson,J.E.(湯普森，J.E.)編著(CRCPress,Inc.，(CRC出版公司)BocaRaton(波卡拉頓)，1993),67-88頁)以及Rakowoczy-Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.(《細(xì)胞分子生物學(xué)通訊》)7:849-858(2002))。[0082]因此，在一些具體實(shí)施例中，向植物、植物部分和/或植物細(xì)胞中的引入是通過細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、粒子轟擊轉(zhuǎn)化、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、環(huán)糊精介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、納米顆粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的核酸遞送、須介導(dǎo)的核酸遞送、微注射、聲處理、浸潤、聚乙烯二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、以及其他的致使核酸引入該植物、植物部分和/或其細(xì)胞的電的、化學(xué)的、物理的和/或生物的機(jī)制，或其組合。[0083]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是用于轉(zhuǎn)化植物，尤其是雙子葉植物的一種普遍使用的方法，因?yàn)樗母咿D(zhuǎn)化效率以及它對于許多不同物種的廣泛實(shí)用性。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化典型地涉及將攜帶感興趣的外來DNA的二元載體轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)霓r(nóng)桿菌菌株，這可能取決于由宿主農(nóng)桿菌菌株或者在共同存在的Ti質(zhì)體上或染色體地攜帶的vir基因的互補(bǔ)(Uknes(烏肯斯)等，(1993)PlantCell(《植物細(xì)胞》)5:159-169)。將該重組二元載體轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌可以利用攜帶該重組二元載體的大腸桿菌、一種輔助大腸桿菌的菌株(該輔助菌株攜帶一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒能夠?qū)⒃撝亟M二元載體移動到IE標(biāo)農(nóng)桿菌菌株中)通過一種三親本交配程序?qū)崿F(xiàn)。可替代地，可以通過核酸轉(zhuǎn)化將該重組二元載體轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中(Hofgen&ffillmitzer(1988),NucleicAcidsRes.(《核酸研究》)16:9877)。[0084]通過重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物通常涉及該農(nóng)桿菌與來自該植物的外植體的共培養(yǎng)，并且遵循本領(lǐng)域中熟知的方法。將轉(zhuǎn)化的組織在攜帶有位于這些二元質(zhì)粒T-DNA邊界之間的抗生素或除草劑抗性標(biāo)記的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行再生。[0085]另一種用于轉(zhuǎn)化植物、植物部分以及植物細(xì)胞的方法涉及在植物組織和細(xì)胞上推進(jìn)惰性的或生物學(xué)活性的粒子。參見，例如，美國專利號4，945，050;5，036，006和5，100,792。總體上，這種方法涉及在有效穿透該細(xì)胞的外表面并提供結(jié)合進(jìn)入其內(nèi)部中的條件下在植物細(xì)胞處推進(jìn)惰性的或生物學(xué)活性的粒子。當(dāng)使用惰性粒子時，可以通過用含有感興趣的核酸的載體包被這些粒子而將該載體引入該細(xì)胞中。可替代地，一個或多個細(xì)胞可以被該載體圍繞使得該載體通過該粒子的激發(fā)而被帶入該細(xì)胞中。也可以將生物活性粒子(例如，干燥的酵母細(xì)胞、干燥的細(xì)菌或噬菌體，各自含有一個或多個力圖導(dǎo)入的核酸)推入植物組織中。[0086]因此，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，植物細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法或如在此描述地進(jìn)行轉(zhuǎn)化并且可以使用多種已知技術(shù)中的任一種來從這些經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生出完整的植物。從植物細(xì)胞、植物組織培養(yǎng)物和/或培養(yǎng)的原生質(zhì)體的植物再生被描述于，例如，Evans(埃文斯)等,HandbookofPlantCellCultures(《植物細(xì)胞栽培手冊》)第I卷,MacMilan出版公司，紐約(1983);和Vasil1.R.(瓦西爾1.R.)(編著)CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants(《植物細(xì)胞培養(yǎng)和體細(xì)胞遺傳》),Acad.Press(學(xué)術(shù)出版社)，Orlando(奧蘭多)，第I卷，(1984)，和第II卷(1986))。選擇轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞和/或植物組織培養(yǎng)物的方法是本領(lǐng)域常規(guī)的，并且可以用于在此提供的本發(fā)明方法中。[0087]同樣地，工程化進(jìn)入以上描述的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子與植物、植物部分和/或植物細(xì)胞中的遺傳特性可以通過有性生殖或營養(yǎng)生長被傳遞，并且因此可以在子代植物中被維持和遺傳。總體而言，維持和繁殖利用了已知的農(nóng)業(yè)方法，這些方法被開發(fā)為適合特定目的(如收獲、播種或耕作)。[0088]實(shí)例1:轉(zhuǎn)基因玉米棺物中ZsGreen的沉默[0089]制造了ZsGreen-轉(zhuǎn)基因玉米載體15779,并且顯不在圖1中。在名稱為Reef-Coralproteinsasvisual,non-destructivereportersforplanttransformation(珊瑚礁蛋白，植物轉(zhuǎn)化的直觀的、無損的報告者)的公開中更全面描述了該ZsGreen熒光蛋白。PlantCellRep(《植物細(xì)胞報告》)(2003)22:244-251。該載體被轉(zhuǎn)化入卸甲根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，該根癌農(nóng)桿菌菌株含有輔助質(zhì)粒pSBl。[0090]雙鏈RNA從已知的ZsGreen的序列產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明可以使用從靶標(biāo)基因衍生的各種不同長度的雙鏈RNA。僅以舉例的方式，下列序列被用于本發(fā)明的配制品中。這個序列是編碼序列SEQIDNOI的DNA的雙鏈RNA版本(version)。[0091]【權(quán)利要求】1.一種將雙鏈RNA整合至植物細(xì)胞中的方法，該方法包括:a)提供一種配制品，該配制品包括:一種基因特異性雙鏈RNA、H20、以及一種植物激素油菜素類固醇，b)將該配制品應(yīng)用于一種活體植物的葉片表面，其中該雙鏈RNA從該外部葉片表面被吸收至該植物葉片的細(xì)胞中。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在該配制品中的油菜素類固醇是在0.8微摩爾至約1.6微摩爾。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該雙鏈RNA約為250ng/ul。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，應(yīng)用該配制品的步驟是對于從發(fā)芽起約12天的活體植物而言的。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該植物是一種雙子葉植物。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該植物是一種玉米植物。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該植物是一種煙草植物。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該基因特異性雙鏈RNA是由選自下組的基因衍生的，該組由以下各項(xiàng)組成:谷氨酰胺合成酶；八氫番茄紅素脫氫酶；FtsH蛋白酶。9.應(yīng)用于植物外表面的一種配制品，該配制品包括雙鏈RNA、H20、以及一種植物激素油菜素類固醇。10.如權(quán)利要求9所述的配制品，其中在該配制品中的油菜素類固醇是在0.8微摩爾至約1.6微摩爾。11.如權(quán)利要求9所述的配制品，其中該雙鏈RNA約為250ng/ul。12.—種將雙鏈RNA整合至一種植物細(xì)胞中的方法，該方法包括:a)提供一種配制品，該配制品包括:一種基因特異性雙鏈RNA、H20、以及一種植物激素，b)將該配制品應(yīng)用于一種活體植物的葉片表面，其中該雙鏈RNA從該外部葉片表面被吸收至該植物葉片的細(xì)胞中?！疚臋n編號】C12N15/87GK103748230SQ201280039977【公開日】2014年4月23日申請日期:2012年8月14日優(yōu)先權(quán)日:2011年8月16日【發(fā)明者】湯國慶申請人:先正達(dá)參股股份有限公司